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奥沙利铂脂质体的制备工艺研究

第30卷第9期刘小平,等:奥沙利铂脂质体的制备工艺研究532.4形态观察及粒度分析

将采用最优化方法制备的奥沙利铂脂质体用少量2%磷钨酸负染后滴加到专用铜网上,自然挥干,使粒子浓缩沉积,以透射电子显微镜进行观察,结果见图2,从图2可见,所形成脂质体分布均匀,形状较规则,隐约可见双分子层膜。用粒度分析仪测定奥沙利铂脂质体粒径大小及分布,结果见图3,从图3中可见奥沙利铂脂质体平均粒径为245.6nnl,呈正态分布。

3结论

l∞

75

25

O厅

55∞D

直径/岫

图2奥沙利铂脂质体透射图3臭沙利铂脂质体粒径分布图电镜照片(20000×)

a.用HPLC测定脂质体中奥沙利铂的含量,建立了奥沙利铂脂质体的包封率测定方法。

b.采用薄膜蒸发法、乙醇注入法、乙醚注入法、逆向蒸发法制备了奥沙利铂脂质体,以包封率为指标,得出乙醇注入法为制备奥沙利铂脂质体的最佳方法。

c.考察了用乙醇注入法制备奥沙利铂脂质体时,胆固醇一卵磷脂质量比、药物溶液浓度、反应温度对包封率的影响,确定了制备奥沙利铂脂质体的最佳工艺。

参考文献

【1]MatheG,KidaniY,SegiguchiM,eta1.Oxalato-platinumOrL-OHP,AThird-glm盯砒i∞PlatinumCamplex[J].Bian"clandPhanmcother,1989,43:237—250.

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[4]任鹏,孙坚彤,沈云玉,等.反相高效液相色谱法测定奥沙利铂的含量[J].抗感染药学,2005,2(1):24—26.

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[6]高申.现代药物新剂型与新技术[M].北京:人民军医出版社,2002.

[7]陆彬.药物新剂型和新技术[M].北京:人民卫生出版社,1998.

[8]魏铭,刘小平,李惠,等.苦参碱脂质体的研究[J].武汉理工大学学报,2006,28(8):46—49.

奥沙利铂脂质体的制备工艺研究

作者:刘小平, 耿丹清, 徐海星, 石炳光, 曹华, LIU Xiao-ping, GENG Dan-qing, XU Hai-xing, SHI Bing-guang, CAO Hua

作者单位:刘小平,耿丹清,徐海星,LIU Xiao-ping,GENG Dan-qing,XU Hai-xing(武汉理工大学化工学院,武汉,430070), 石炳光,曹华,SHI Bing-guang,CAO Hua(黄石飞云制药有限公司,黄石

,435002)

刊名:

武汉理工大学学报

英文刊名:JOURNAL OF WUHAN UNIVERSITY OF TECHNOLOGY

年,卷(期):2008,30(9)

被引用次数:2次

参考文献(8条)

1.Mathe G.Kidani Y.Segiguchi M Oxalato-platinum or L-OHP,A Third-generation Platinum Complex 1989

2.Raymond E.Feiver M.Waynarowshi J M Oxaliplatin:Mechanism of Action and Anti-meoplastic Activity 1998(02)

3.黄复生.贺俊英脂质体经皮给药研究进展[期刊论文]-中国现代应用药学 2002(06)

4.任鹏.孙坚彤.沈云玉反相高效液相色谱法测定奥沙利铂的含量[期刊论文]-抗感染药学 2005(01)

5.国家药典委员会中华人民共和国药典(二部) 2005

6.高申现代药物新剂型与新技术 2002

7.陆彬药物新剂型和新技术 1998

8.魏铭.刘小平.李惠苦参碱脂质体的研究[期刊论文]-武汉理工大学学报 2006(08)

相似文献(10条)

1.学位论文谢建峰奥沙利铂几种新型脂质体的制备及对大肠癌靶向性与药动学研究2008

奥沙利铂是一种治疗大肠癌的新药,但其毒副作用较大,并发症较多,靶向性不强,使其对大肠癌的治疗受到限制。

研究目的:以脂质体为药物载体,以大肠靶向、低毒与缓释为目标,以奥沙利铂(Oxaliplatin)为模型药物,系统研究常规脂质体、长循环脂质体、长循环热敏脂质体和长循环免疫脂质体的处方、制备工艺、性质、靶向性和药动学规律。

方法:以脂质体的包封率为指标综合评价,采用正交设计对制备工艺进行优化,用反相蒸发超声法制得奥沙利铂脂质体。同法制得奥沙利铂长循环脂质体、长循环热敏脂质体、长循环免疫脂质体。采用纳米粒径仪、高效液相色谱仪等检测其形态、粒径、含量等。

结果:在选定波长下高液色相色谱中各辅料、组织、血清中的物质对奥沙利铂的检测无干扰。奥沙利铂常规脂质体其最佳制备工艺为磷脂浓度为

40mg·ml-1,药脂比为1:40,超声时间为6min,磷脂与胆固醇比为4:1,其平均包封率为85.46%±2.31%。平均粒径为空白脂质体69.4nm,常规脂质体9.3nm。奥沙利铂长循环脂质体为108.1nm,12h的累积释放量不足10%。奥沙利铂长循环热敏脂质体的包封率为85.24%,粒径为118.2nm。在42℃加热30min时,药物释放率89.4%达到最高值。奥沙利铂长循环免疫脂质体的粒径为130.9nm,包封率为85.17%。奥沙利铂长循环免疫脂质体的靶向效率为57.3%,是奥沙利铂长循环热敏脂质体的1.3倍,奥沙利铂长循环脂质体的4.6倍。

结论:奥沙利铂几种新型脂质体的制备条件可行易工业化,产品稳定性较好,大肠靶向性增强,肾毒性降低,达到了本课题的预期目标。

2.学位论文陈纲奥沙利铂联合CD-Endostatin融合基因对直肠癌杀伤作用的研究2007

直肠癌是我国常见的恶性肿瘤之一,近年来发病率呈显著上升趋势。目前传统的治疗手段如放疗、化疗、手术等未能明显提高直肠癌患者的5年生存率。因为化疗、放疗等在治疗肿瘤的同时对正常组织亦存在损伤,使用剂量受到限制。且部分肿瘤出现对化疗及放疗的耐受也影响了其疗效。随着对结直肠癌基因研究的深入,直肠癌的各种基因治疗正逐渐受到重视。目前最有临床应用前景的基因治疗方法包括自杀基因治疗及抗血管生成基因治疗等。 抗血管生成基因治疗是指应用基因表达与调控等手段抑制实体瘤的血管生长,切断肿瘤的营养供给,对肿瘤采取饥饿疗法,从而达到治疗肿瘤的目的。在这方面的研究中,Endostatin(内皮抑素)是最新发现的强有力的新生血管内皮细胞生成的抑制剂,能够抑制体内多种实体瘤的生长,已显示出广阔的临床应用前景。

自杀基因系统以其多方面的优越性在肿瘤基因治疗中倍受关注,它通过直接杀伤作用及“旁观者效应”发挥抗肿瘤效应。大肠杆菌胞嘧啶脱氨酶(cytosine deaminase,CD)基因是继单纯疱疹病毒胸苷激酶基因(HSV2TK)后又一重要的自杀基因,与HSV2TK相比,CD基因具有更强的”“旁观者效应

”及存在远距离“旁观者效应”的特点,CD自杀基因治疗(亦称分子化疗)肿瘤具有广泛的应用前景,在美国被称为最有前途的基因治疗方案。

利用基因工程技术,将抗血管生成基因治疗的Endostatin基因、CD自杀基因融合,协同作用于直肠癌。鉴于脂质体转染基因具有安全性,不产生排异反应,可反复转染等优点,但不足是转染效率不如病毒载体高。如果将脂质体转染基因治疗和第三代铂类化疗药物奥沙利铂结合起来,既可以利用奥沙利铂存在的对脂质体促进转染作用,克服脂质体转染效率低下的不足,使基因治疗与化疗有机的结合起来,无疑为恶性肿瘤的治疗又增加了新的手段和方法。

目的:明确奥沙利铂促进脂质体对直肠癌细胞的转染效率,探讨奥沙利铂联合CD-Endostatin对直肠癌细胞的协同杀伤作用。将奥沙利铂联合脂质体转染CD-Endostatin基因对HR-8348直肠癌荷瘤鼠治疗,观察其疗效,从而为临床治疗直肠癌提供理论依据。

方法:一、构建含融合基因pcDNA-CD-sED质粒。二、脂质体法,体外转染含有CD基因、CD-Endostatin基因的质粒于直肠癌细胞株HR-8348,用

G418(400ug/L)继续培养筛选转染阳性细胞,同时用未转染的HR-8348细胞做对照。观察对照细胞大部分死亡时,更换G418(200ug/L)维持筛选。15天后观察抗性克隆形成。获得稳定表达的克隆细胞,传染至HR-8348细胞后的阳性克隆子分别命名HR-8348CD(转染pcDNA-CD质粒),HR-8348ECD(转染pcDNA-CD-sED质粒),挑出阳性克隆,扩增培养。含绿色荧光蛋白(GFP)基因质粒转染HR-8348细胞,用奥沙利铂促转染,用GFP基因表达绿色荧光蛋白观察脂质体转染效率及奥沙利铂的促转染作用。三、Western印迹检测pcDNA-CD-sED转染不同时间后细胞裂解液中Endostatin蛋白表达。用MTT法测定转染CD-Endostatin基因阳性克隆子表达Endostatin蛋白的上清液对人脐静脉内皮细胞的抑制作用。四、MTT检测奥沙利铂联合CD-Endostmin基因对HR-8348细胞杀伤作用。五、荷瘤裸鼠的制备及分组:将HR.8348细胞0.2ml(0.5×10<'7>细胞/ml)接种于4.5周BALB/C-nu/nu裸鼠右侧后肢外侧皮下,待瘤体长至长径

对每个肿瘤于奥沙利铂作用后第0、4、8、12天多点注射(至少4个点)200ul Lipofectin-pcDNA-CD-sED复合体;第3天开始腹腔注射5*FC

500mg/kg/day,连续12天。(2)奥沙利铂联合CD基因组10只:通过尾静脉注入低剂量的奥沙利铂2.5mg.kg<'-1>,应用lml注射器对每个肿瘤于第0、4、8、12天多点注射200ul Lipofectin-pcDNA-CD复合体;第3天开始腹腔注射5-FC 500mg/kg/day,连续12天。(3)奥沙利铂组10只:通过尾静脉注入低剂量的奥沙利铂2.5mg.kg<'-1>,只注射生理盐水,200ul生理盐水于第0、4、8、12天行瘤体内多点注射。(4)空白对照组:只注射生理盐水,200ul生理盐水于第0、4、8、12天行瘤体内多点注射。于治疗后28天拉颈法处死各组裸鼠。绘制荷瘤裸鼠的肿瘤生长曲线,计算瘤体积抑制率及瘤重抑制率。免疫组化染色观察肿瘤内部的新生血管密度。六、统计学处理:均数应用x±s表示,应用SPSS10.0统计软件行x<'2>检验和方差分析,以P<0.05为统计学显著差异。

结果:一、倒置荧光显微镜观察GFP蛋白显示:经奥沙利铂作用后,脂质体转染细胞的转染效率明显增强(可提高18倍左右),可利用奥沙利铂促进脂质体转染基因治疗。二、Western印迹检测pcDNACD-sED转染不同时间后细胞裂解液中人Endostatin蛋白显示:感染细胞24h后表达人Endostatin蛋白,在120h达到高峰,并持续到180h,说明Endostatin基因在HR-8348细胞获得高效及长时间的表达。CD-Endostatin基因阳性克隆子表达Endostatin蛋白的上清液对人脐静脉内皮细胞的有明显的抑制作用。三、体外试验结果显示:联合CD基因及5-FC系统能够明显增强对HR-8348细胞的杀伤效率,用IC50浓度的奥沙利铂作用,转染CD基因的HR-8348细胞实验组细胞抑制率均值为86.2%,转染CD-Endostatin基因组与单纯转染CD基因无明显差异;未转染CD基因的HR-8348细胞对照组细胞抑制率均值为48.1%,其差异有显著性意义(p<0.05)。四、荷瘤小鼠肿瘤抑制率结果显示:奥沙利铂联合CD-Endostatin基因组,奥沙利铂联合CD基因组,奥沙利铂组肿瘤生长抑制率分别为79.69%、51.67%、37.67%,奥沙利铂联合CD-Endostmin基因组较奥沙利铂治疗组、奥沙利铂联合CD基因组差异有显著性(P<0.01)。五、癌组织病理学检查结果:奥沙利铂联合CD-Endostmin基因组的肿瘤细胞数目较其它三组明显减少,肿瘤细胞呈退行性病变,核分裂相明显减少,不见瘤巨细胞,而肿瘤细胞被大量的脂肪细胞所代替。同时,奥沙利铂联合CD-Endostatcin基因组可明显减少肿瘤内部的新生血管密度,其他治疗组较对照组减少肿瘤内部的新生血管密度不明显。

结论:1、化疗药物奥沙利铂具有提高脂质体对直肠癌细胞HR-8348转染效率的作用,应用奥沙利铂后的转染效率能接近病毒载体转染水平。2、Endostatin在体外试验中能抑制内皮细胞增生,小鼠荷瘤试验证明了Endostatin通过抑制内皮细胞增生来控制肿瘤新生血管的形成,从而达到阻止直肠癌生长及转移。3、CD-Endostatin联合基因治疗,从肿瘤治疗的两个重要方向即肿瘤细胞内靶向化疗与抑制肿瘤新生血管形成,协同发挥CD基因、Endostatin基因对直肠癌的杀伤作用。4、利用脂质体反复转染CD-Endostmin基因联合奥沙利铂治疗HR-8348荷瘤鼠,肿瘤体积抑制率为81.5%,瘤重抑制率分别为79.69%,治疗效果显著,且无明显的毒副作用。5、本实验将融合基因治疗、化疗有机的结合起来,可产生协同作用,对直肠癌治疗疗效显著,这将为治疗恶性肿瘤提供了一个很好的思路,同时也为临床治疗癌症可能提供了理论以及实践的依据。

3.期刊论文刘小平.耿丹清.石炳光.曹华.LIU Xiao-ping.GENG Dan-qing.SHI Bing-guang.CAO Hua奥沙利铂脂质

体中奥沙利铂的含量测定-中国医药导报2007,4(25)

目的:研究奥沙利铂脂质体中奥沙利铂的含量测定方法.方法:采用反相高效液相色谱法,色谱柱为Elite C18(250 mm×4.6 mm,5 μm);流动相为甲醇-水(10:90);流速为1.0 ml/min;检测波长为250 nm;柱温25℃.结果:本法平均回收率为97.28%,RSD=1.07%(n=9).结论:本法操作简便、重复性良好,可用于奥沙利铂脂质体的质量控制.

4.学位论文耿丹清奥沙利铂脂质体的研制及药物动力学研究2008

奥沙利铂是继卡铂、顺铂后的第三代铂类药物,目前已成为治疗结肠、直肠癌的一线药物,脂质体可使药物具有靶向性和缓释性,可提高药物疗效,降低药物毒性。本研究进行了奥沙利铂脂质体的研制,以期提高其抗肿瘤活性,降低不良反应。

通过高效液相色谱测定脂质体中奥沙利铂的含量,通过该方法能准确测定脂质体中奥沙利铂的含量和脂质体的包封率。

以包封率为指标,对脂质体的工艺进行优化。首先通过薄膜蒸发法、乙醇注入法、乙醚注入法、逆向蒸发法四种不同的方法制备奥沙利铂脂质体

,结果表明乙醇注入法制得的奥沙利铂脂质体包封率最高:其次单因素考察了缓冲液、奥沙利铂用量、卵磷脂.胆固醇质量比、类脂溶液注射速度、水浴温度、无水乙醇用量对包封率的影响;最后对影响包封率的四个主要因素采用正交设计筛选出最佳工艺:卵磷脂/胆固醇的质量比为5:1(共0.375g),奥沙利铂用量为5mg,水浴温度55℃,无水乙醇用量20mL,包封率最高可达69.10%。

脂质体的理化性质和稳定性研究包括采用激光粒度测试仪检测奥沙利铂脂质体的粒径大小及分布,用透射电镜观察脂质体的形态。将脂质体于低温光照仪中4℃、4500Lx照度条件下保存,分别考察第5、10天的外观和渗漏率;将脂质体分别在室温(25℃)及冰箱中(4~8℃)密封避光保存1个月后考察外观和渗漏率;将制备的脂质体分别在室温(25℃)和冰箱(4~8℃)中密封避光保存,进行加速试验,分别于刚制备后及第1、2、3、6个月取样,考察外观及渗漏率变化。结果显示在避光、低温条件下密封保存,脂质体稳定性较好。

进行家兔体内奥沙利铂脂质体的药代动力学研究和小鼠体内的脂质体组织分布研究,采用高效液相测定奥沙利铂的血药浓度和组织药物浓度。结果表明,奥沙利铂脂质体在家兔体内的药代动力学符合二室模型,脂质体的T1/2α、T1/2β、K10和AUC等均高于奥沙利铂注射液,而脂质体的Vd、CL均小于奥沙利铂注射液;脂质体组心、肝、脾、肺、小肠的药物浓度-时间曲线下面积增大,而肾脏中明显下降。结果表明脂质体能延长奥沙利铂在体内的作用时间,使其具有明显的肺靶向性,有利于提高奥沙利铂对肿瘤组织的疗效。同时,奥沙利铂脂质体能明显降低奥沙利铂在肾组织中的蓄积,因而能有效降低其肾毒性。

5.期刊论文杨美燕.李煜蒙.梅兴国.YANG Mei-Yan.LI Yu-Meng.MEI Xing-Guo奥沙利铂长循环热敏脂质体的包封

率测定及体外释放考察-军事医学科学院院刊2007,31(5)

目的:建立奥沙利铂脂质体的包封率和含量测定方法,并对其体外释放进行考察.方法:采用逆相蒸发法制备奥沙利铂脂质体,用葡聚糖凝胶G-50柱分离载药脂质体和游离药物,以水为洗脱液,RP-HPLC法测定包封率,采用透析法考察脂质体在37℃和41℃的体外释放规律.结果:柱层析分离方法的药物回收率为99.25%,柱加样回收率为100.37%;药物含量测定方法的工作曲线为A =3E+06c-3290.8(n=5),r=0.9999,线性范围0.0201~2.0100 mg/ml,方法回收率为100.70%;脂质体在41℃条件下的释放规律符合一级动力学过程.结论:本方法简便、灵敏、准确,可以用于测定奥沙利铂脂质体的含量和包封率,所制得的脂质体具有明显的热敏释放特征.

6.学位论文杨美燕奥沙利铂长循环热敏脂质体研究2007

癌症目前仍然是一类常见且严重威胁人们生命和生活质量的主要疾病之一,、许多抗肿瘤药物由于毒副作用大而严重限制了其在肿瘤治疗中的应用。将脂质体应用在肿瘤的治疗研究中是一个有意义的突破,脂质体可使药物具有靶向性和缓释性,可提高药物治疗指数和疗效,降低药物毒性。长循环热敏脂质体是一种新型脂质体,将抗肿瘤药物制备成长循环热敏脂质体,不仅可延长药物在体内的循环时间,降低RES对药物的吞噬;而且还能通过在肿瘤病变部位局部加热,促使药物在肿瘤局部大量释放,并在肿瘤组织局部高度浓集,以增加药物的抑瘤效果。

本研究选取铂金属抗肿瘤药物奥沙利铂作为模型药物,制备奥沙利铂长循环热敏脂质体(OLTL),以提高疗效,降低不良反应。在建立了奥沙利铂HPLC含量测定方法的基础上,进行奥沙利铂长循环热敏脂质体的处方筛选和工艺研究。本研究所采用的薄膜蒸发.冻融法制备脂质体,将难以包封的水溶性药物奥沙利铂的包封率提高了50%,产品性能稳定,粒径小于200nm,包封率大于90%。采用透析法考察脂质体在37℃和41℃的体外释放规律。结果表明,OLTL在37℃介质中的药物释放较少,在41℃条件下释放绝大部分药物。

采用SD大鼠进行药动学考察。结果表明,OLTL在大鼠体内的药动学符合三室模型,OLTL的t<,1/2α>、t<,1/2β>、K10和AUC分别是奥沙利铂注射液的5.2、3.2、2.7和16.9倍。而后者的Vd和CL分别是前者的40.0和15.6倍。药效学试验建立小鼠Lewis肺癌模型,静注给药,考察抑瘤率。结果表明,同生理盐水对照组相比,OLTL组的抑瘤率高达77.83%。

本研究所采用的制备工艺的稳定性好,产品符合要求。OLTL不仅可延长药物在体内的循环时间,并在肿瘤组织局部浓集,具有良好的热敏靶向性

,增加了药物的抑瘤效果。

7.期刊论文许尤琪.罗毅.Xu You-qi.Luo Yi紫杉醇脂质体联合奥沙利铂治疗晚期非小细胞癌临床观察-中国医药

导刊2010,12(4)

目的:观察紫杉醇脂质体联合奥沙利铂治疗晚期非小细胞癌的临床疗效.方法:26例病理证实的晚期非小细胞癌患者用紫杉醇脂质体联台奥沙利铂治疗.紫杉醇脂质体135mg/m2静滴,第1天,奥沙剩铂总量130mg/m2静滴,分第1、8天用.每例患者均完成2周期以上.化疗后予以疗效评定及毒副反应评定.结果

:化疗后总有效率为44.1%,其中初治患者有效率为54.5%,复治患者总有效率为33.3%,两组比较有统计学意义.两组均无治疗相关性死亡,总的不良反应较轻.结论:紫杉醇脂质体联合奥沙利铂治疗晚期非小细肺癌,近期疗效确切,有效率较高,毒副作用较轻,患者可耐受.

8.期刊论文刘君.陶敏.Liu Jun.Tao Min紫杉醇脂质体联合奥沙利铂和卡培他滨一线治疗晚期胃癌临床观察-现

代中西医结合杂志2011,20(3)

目的 评价紫杉醇脂质体联合奥沙利铂和卡培他滨一线治疗晚期胃癌的疗效和毒性.方法 回顾性分析36例接受紫杉醇脂质体联合奥沙利铂和卡培他滨化疗的晚期胃癌患者的临床资料.结果 总有效率为61%,中位疾病进展时间为6.8个月,中位生存时间为11.3个月.主要不良反应为血液学毒性,Ⅲ/Ⅳ级白细胞减少、中性粒细胞减少、贫血及血小板减少发生率分别为14%,19%,3%和0%;非血液学毒性较轻,多为Ⅰ/Ⅱ级.结论 紫杉醇脂质体联合奥沙利铂和卡培他滨治疗晚期胃癌安全、有效.

9.期刊论文盛华明.吴丹.王琼紫杉醇脂质体联合奥沙利铂和5-Fu治疗中晚期胃癌52例临床观察-临床和实验医学

杂志2009,8(12)

胃癌是世界第四大常见恶性肿瘤和第二大癌症死亡原因,而胃癌患病率位居我国常见肿瘤之首.由于早期胃癌症状无特异性,诊断时往往已经是中晚期,即使可行根治性手术切除,仍有60%的患者最终会出现局部复发或远处转移.

10.期刊论文孙中英.吴小涛.张自强.李战.张朝晖阳离子交换树脂分离-高效液相色谱法测定奥沙利铂脂质体包封

率-西北药学杂志2009,24(5)

目的 建立奥沙利铂脂质体包封率的测定方法 .方法 用阳离子交换树脂分离游离药物和被包封药物,采用高效液相色谱法测定奥沙利铂含量,计算包封率.结果 阳离子树脂对溶液中游离奥沙利铂的吸附率大于93%,对载药后的脂质体无吸附;HPLC含量测定方法 的线性范围为1~100 mg·L-1(R2=0.999 9),精密度RSD<2%.结论 阳离子树脂-HPLC法简便快捷,成本较低,且无空白干扰,方法 学稳定,适用于奥沙利铂脂质体包封率的测定.

引证文献(1条)

1.孙欣欣.金楠脂质体研究进展[期刊论文]-医学研究杂志 2009(12)

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