DRR036A Takara PCR试剂盒说明书

Takara Code ：DRR036A

PrimeScript ?

RT Master Mix

Perfect Real Time （200次量）

宝生物工程(大连)有限公司

目录

内容页码

●制品说明 1 ●制品内容 1 ●保存 1 ●特长 1 ●RNA样品制备 1 ●使用注意 3 ●操作方法 3 ●实验例：反转录反应时间和cDNA合成量的研讨实验 6 ●引物设计说明7 ●引物设计服务说明7

●制品说明

本制品是2 Step Real Time RT-PCR用的最佳反转录反应试剂。5×PrimeScript? RT Master Mix中含有定量RT-PCR的反转录反应所需的所有试剂（PrimeScript RTase、RNase Inhibitor、Random 6 mers、Oligo dT Primer、dNTP Mixture、反应Buffer），加入模板RNA和水即可迅速进行反应。使用具有较强延伸能力的PrimeScript? RTase，与以前制品PrimeScript? RT reagent Kit（Perfect Real Time）（Takara Code：DRR037）相同，可以在较短时间内高效合成Real Time PCR用模板cDNA。

本制品合成的cDNA可以用于SYBR Green分析法和TaqMan探针分析法，可以根据实验目的与Takara Code：DRR420/DRR820/DRR091/DRR071/DR075/DRR390等试剂配合使用，能够进行高性能的基因表达分析。

●制品内容（10 μl反应×200次）

1. 5×PrimeScript? RT Master Mix（for Real Time）*1 400 μl

2. RNase Free dH2O 1 ml×2支

3. EASY Dilution（for Real Time PCR）*2 1 ml

*1 含有PrimeScript RTase、RNase Inhibitor、Random 6 mers、Oligo dT Primer、dNTP Mixture、反应Buffer。

*2 制作标准曲线时梯度稀释cDNA或RNA标准品的稀释液。模板cDNA或RNA如果用水或TE Buffer稀释时，由于受Microtube吸附作用等的影响，往往不能准确地进行稀释，导致实验结

果精度降低。使用本制品时，即使稀释至低浓度也能够进行准确地稀释，容易在宽广范围内获

得准确定量的标准曲线。EASY Dilution也可以单独购买（Takara Code：D9160）。

EASY Dilution请与本公司Real Time PCR试剂组合使用，对于其他公司的同类制品的适用性

本公司尚未进行确认。

●保存：-20℃。

●特长

1．制品为预先混好的Premix形式，只需加入模板RNA和水便可以开始反应。

2．可以在较短时间内高效合成Real Time PCR用cDNA，是进行2 Step Real Time RT-PCR反应的最佳试剂。

3．使用了Random 6 mers和Oligo dT Primer 2种反转录引物，可以合成最适的Real Time PCR用cDNA。4．制品中附加了标准曲线制作用稀释液EASY Dilution（for Real Time PCR），将Total RNA或cDNA稀释至低浓度时也能够进行准确稀释，容易在宽广范围内获得准确定量的标准曲线。

●RNA样品制备

本制品是将RNA反转录成cDNA的专用试剂。RNA的纯度会影响cDNA的合成量，而制备RNA的关键是要抑制细胞中的RNA分解酶和防止所用器具及试剂中的RNA分解酶的污染。因此，在实验中必须采取以下措施：戴一次性干净手套；使用RNA操作专用实验台；在操作过程中避免讲话等等。通过以上办法可以防止实验者的汗液、唾液中的RNA分解酶的污染。

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【使用器具】

尽量使用一次性塑料器皿，若用玻璃器皿，应在使用前按下列（1）或者（2）方法进行处理。

（1）干热灭菌（180℃，60 min）

（2）用0.1% DEPC（焦碳酸二乙酯）水溶液在37℃下处理12小时。然后在120℃下高压灭菌30分钟以除去残留的DEPC。

RNA实验用的器具和仪器建议专门使用，不要用于其它实验。

【试剂配制】

用于RNA实验的试剂，需使用干热灭菌（180℃，60 min）或用上述方法进行DEPC水处理灭菌后的玻璃容器盛装（也可使用RNA实验用的一次性塑料容器），使用的无菌水需用0.1%的DEPC处理后进行高温高压灭菌。

RNA实验用的试剂和无菌水都应专用，避免混用后交叉污染。

【制备方法】

使用简单的RNA纯化方法即可获得满足于RT-PCR反应的RNA（只需少量的RNA便可进行RT-PCR 反应）。但为了保证实验的成功率，建议使用GTC法（异硫氰酸胍法）制备的高纯度RNA。

从培养细胞、组织中提取时，使用RNAiso Plus（Takara Code: D9108）。

【Total RNA中混有基因组DNA的对策】

提取的Total RNA中常常混有基因组DNA，而基因组DNA可以直接作为PCR模板进行扩增，造成解析结果不准确。为了避免这种情况发生，我们必须采取如下两种措施：1、引物设计时避免基因组DNA扩增；2、使用DNase I处理除去基因组DNA。

1. 引物设计时避免基因组DNA扩增

我们可以利用基因组DNA具有外显子和内含子的结构，在引物设计上下工夫，使PCR反应时不能扩增基因组DNA。此时我们首先应确认目的基因的基因组结构，选择较长的内含子。然后，在这个内含子两侧的外显子上分别设计上、下游引物。Real Time PCR反应时通常扩增的目的DNA片段长度都比较短，设置的条件也是适合短片段DNA的扩增，超过500 bp就很难扩增了。所以，当内含子足够长时，基因组DNA来源的扩增就不能发生；当内含子较短时，基因组DNA来源的扩增可能发生，但基因组DNA来源的扩增产物比mRNA来源的扩增产物长，可通过分析融解曲线的方法加以区分。但是，此种方法不适合具有单个外显子的基因、或者不具有内含子的生物种以及基因组情报没被解析的生物种等，此时必须采取2、的方法解决。

2. 使用DNase I处理除去基因组DNA

使用常规方法提取Total RNA后，再使用DNase I分解混入的基因组DNA，最后进行苯酚/氯仿抽提、乙醇沉淀等纯化Total RNA。

◆操作流程

①按下列组份配制反应液。

②37℃20 min。

③使用以下两种方法使DNase I失活。

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A．热处理

（1）加入2.5 μl 0.5 M EDTA 80℃2 min。

（2）用RNase Free dH2O定容至100 μl。

B．苯酚/氯仿抽提

（1）用50 μl RNase Free dH2O定容至100 μl后加入等体积的苯酚/氯仿/异戊醇（25：24：1）混匀。

（2）室温，13,500 rpm 5 min离心，取上清。

（3）加入等体积的氯仿/异戊醇（24：1）混匀。

（4）室温，13,500 rpm 5 min离心，取上清。

④加入10 μl 3 M醋酸钠，250 μl冷乙醇，冰上放置10 min。

⑤4℃，13,500 rpm 15 min离心，弃上清。

⑥加入500 μl 70%冷乙醇洗净，4℃，13,500 rpm 5 min离心，弃上清。

⑦沉淀干燥。

⑧加入适量RNase Free dH2O溶解。

【基因组DNA确认方法】

不进行反转录反应，通过Real Time PCR确认基因组DNA混入量。此实验使用从基因组DNA和mRNA 中都能进行扩增的Primer。DNase I处理后的基因组DNA处理情况也可以通过此方法进行确认。另外，使用跨内含子对基因组DNA不能进行扩增的Primer也有扩增产物时，怀疑有伪基因存在，这种情况也可以用此方法进行确认。

●使用注意

以下为使用本试剂盒时的注意事项，使用前一定认真阅读。

1．5×PrimeScript?RT Master Mix在使用前要小心地离心收集到反应管底部。由于5×PrimeScript?RT Mix粘度高，用移液枪慢慢反复吸打充分混匀后使用。

2．分装试剂时务必使用新的枪头（Tip），以防止样品间污染。

3．本制品中已经加入了反转录Primer（Oligo dT Primer 和Random 6 mers），想使用Gene Specific Primer进行反转录反应时不能使用本制品。

●操作方法

1. 反转录反应。

①按下列组份配制RT反应液（反应液配制请在冰上进行）。

* 反应体系可按需求相应放大，10 μl反应体系可最大使用500 ng的Total RNA。

②反转录反应条件如下:

37℃ 15 min（反转录反应）

85℃ 5 sec（反转录酶的失活反应）

4℃

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③将得到的RT反应液加入到下一步的Real Time PCR反应体系中，其加入量不要超过Real Time

PCR反应体积的1/10（V/V）量。

2. Real Time PCR反应。

以下是使用本制品进行反转录反应后，选择SYBR?Premix Ex Taq TM II（Perfect Real Time）（Takara Code：DRR081）进行Real Time PCR反应的操作方法。采用TaqMan?探针法进行检测时，请选择Premix Ex Taq TM（Probe qPCR）（Takara Code：DRR390）。

◆应用Thermal Cycler Dice? Real Time System扩增仪的操作方法

请按照Thermal Cycler Dice? Real Time System（Takara Code：TP800）的使用说明书要求进行实验操作。

*1 通常引物终浓度为0.4 μM可以得到较好结果。反应性能较差时，可以在0.2～1.0 μM 范围内调整引物浓度。

*2 建议在25 μl反应液中使用相当于10 pg～100 ng Total RNA量的cDNA为模板。反转录反应液的加入量不能超过PCR反应液总体积的10%。

②进行Real Time PCR反应。

建议采用下列图表显示的两步法PCR反应程序。退火/延伸时间可在20～30秒范围内进行调整，推荐使用30秒的条件。由于使用Tm值较低的引物等原因，两步法PCR反应扩增性能较差时，可以尝试进行三步法PCR扩增反应。

两步法PCR扩增标准程序：

Stage 1：预变性

Repeat：1

95℃ 30秒

Stage 2：PCR反应

Repeat：40

95℃ 5秒

60℃ 30秒

Stage 3：Dissociation*

* 使用SYBR? Green I时进行。

◆特别提示：

本制品中使用的TaKaRa Ex Taq HS是利用抗Taq抗体的Hot Start用DNA聚合酶，与其他公司的化学修饰型Hot Start用DNA聚合酶相比，不需要PCR反应前的95℃、5～15分钟的酶的活性化反应。如果高温处理时间过长，会使酶的活性下降，其PCR的扩增效率、定量精度等都会受到影响。如果在PCR反应前进行模板的预变性，通常设定为95℃、30秒。

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③实验结果分析。

反应结束后确认Real Time PCR的扩增曲线和融解曲线（使用SYBR? Green I时），进行PCR定量时制作标准曲线等。

◆应用ABI PRISM? 7000/7700/7900HT，7300/7500/7500 Fast Real-Time PCR System的操作方法

请按照Life Technologies公司的仪器使用说明书要求进行实验操作。

①按下列组份配制PCR反应液（反应液配制请在冰上进行）。

*1 通常引物终浓度为0.4 μM可以得到较好结果。反应性能较差时，可以在0.2～1.0 μM范围内调整引物浓度。

*2 建议在20 μl反应液中使用相当于10 pg～100 ng Total RNA量的cDNA为模板。反转录反应液的加入量不能超过PCR反应液总体积的10%

*3 R OX Reference Dye II（50×）比ROX Reference Dye（50×）浓度低，使用7500 Real-Time PCR System 和7500 Fast Real-Time PCR System时，请使用ROX Reference Dye II

（50×）。与使用ROX Reference Dye（50×）相比，校正后的荧光信号值高，但解析结果

完全相同。使用ABI PRISM7000/7700/7900HT及7300 Real-Time PCR System时，请

使用ROX Reference Dye（50×）

*4 96孔板、Single-Tube、8联Tube采用50 μl反应体系，384孔板、96-well Fast Thermal Cycling plate采用20 μl反应体系。

②进行Real Time PCR反应。

建议采用下列图表显示的两步法PCR反应程序，如果该程序得不到良好的实验结果时，再进行PCR 条件的优化。由于使用Tm值较低的引物等原因，两步法PCR反应扩增性能较差时，可以尝试进行三步法PCR扩增反应。

< ABI PRISM? 7000/7700/7900HT，7300/7500 Real-Time PCR System >

两步法PCR扩增标准程序：

Stage 1：预变性

Reps：1

95℃ 30秒

Stage 2：PCR反应

Reps：40

95℃ 5秒

60℃ 30～34秒*

Dissociation Stage

* 使用7700和7900HT时请设定在30秒。

使用7000和7300时请设定在31秒。

使用7500时请设定在34秒。

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◆特别提示：

本制品中使用的TaKaRa Ex Taq HS 是利用抗Taq 抗体的Hot Start 用DNA 聚合酶，与其他公司的化学修饰型Hot Start 用DNA 聚合酶相比，不需要PCR 反应前的95℃、5～15分钟的酶的活性化反应。如果高温处理时间过长，会使酶的活性下降，其PCR 的扩增效率、定量精度等都会受到影响。如果在PCR 反应前进行模板的预变性，通常设定为95℃、30秒。

③ 实验结果分析。

反应结束后确认Real Time PCR 的扩增曲线和融解曲线（使用SYBR ? Green I 时），进行PCR 定量时制作标准曲线等。

● 实验例：反转录反应时间和cDNA 合成量的研讨实验

1. 反转录反应。

试 剂： PrimeScript ? RT Master Mix （Perfect Real Time ） 模 板： Human Placenta Total RNA 2 pg ～2 μg 反应体积：

20 μl

反应条件： 37℃ 15、30、60 min 反应后85℃ 5 sec 热变性，4℃保存

2. Real Time PCR 反应。

试 剂： SYBR ? Premix Ex Taq TM （Perfect Real Time ） 模 板： 上述反转录反应液2 μl 反应体积： 25 μl

Target Gene ： Human Actb

Primer ： 使用Takara 已设计完成的引物库中该基因的引物 反应条件：

Thermal Cycler Dice ? Real Time System 标准反应条件

3. Real Time PCR 反应结果。 Real Time PCR 扩增曲线图及标准曲线图如下：

扩增曲线图

标准曲线图

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15 min （紫色） 30 min （红色） 60 min （茶色）

15 min （紫色） Rsq: 0.999 Eff ＝99％ Y ＝-3.346LOG （X ）+34.52 30 min （红色） Rsq: 1.000 Eff ＝98.9％ Y ＝-3.349LOG （X ）+34.46 60 min （茶色） Rsq: 0.999 Eff ＝100.9％ Y ＝-3.301LOG （X ）+34.24

以上Real Time RT-PCR扩增结果显示，不同反转录反应时间（15、30、60 min）在宽广模板量范围内都可以得到同等的扩增效率

●引物设计说明

进行Real Time PCR反应时，设计反应性能良好的PCR引物非常重要。根据以下原则，可以设计PCR 扩增效率高，反应特异性强的良好引物。

◆PCR扩增产物长度：80～150 bp最为合适（可以延长至300 bp）。

◆设计引物要求如下：

*1 OLIGO: Primer Analysis Software。

*2 Primer3: （https://www.wendangku.net/doc/874352970.html,/ftp/distribution/software/）

*3 https://www.wendangku.net/doc/874352970.html,/BLAST/

●引物设计服务说明：本公司提供用于基因表达定量分析的引物设计及合成服务

本公司以美国NCBI Data Base上登录的Human、Mouse、Rat、Cow、Dog、Chicken的RefSeq为对象，已经设计完成了各基因用于定量表达分析的Real Time RT-PCR用高特异性Primer Set，此Primer Set 最适于本制品使用，可省略PCR反应条件优化实验。具体情况如下：

可提供1～3对合适的引物，由客户自己选择。

1. 从3’ 端开始的1,500 Base内的引物候补序列。

2. 从5’ 端开始的1,500 Base内的引物候补序列。

3. 针对Target基因全长的引物候补序列。

注）本公司只对在本公司合成的引物/探针提供免费设计服务，恕不受理不在本公司合成的引物/探针的设计委托！

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?SYBR? is a trademark of Molecular Probes Inc.

?ABI PRISM? is registered trademark of Applera Corporation. ?TaqMan? is a trademark of Roche Molecular Probes Inc.

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Memo

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宝生物工程（大连）有限公司

Takara Biotechnology (Dalian) Co., Ltd.

辽宁省大连经济技术开发区东北二街19号（116600）

No.19 Dongbei 2nd Street, Development Zone, Dalian, China

电话：0411-******** 87641683

传真：0411-******** 87621675

E.mail：service@https://www.wendangku.net/doc/874352970.html,

网址：https://www.wendangku.net/doc/874352970.html,

V2012.01