EGY48感受态细胞

EGY48酵母菌感受态细胞 注意：-70℃，避免反复冻融，影响转化效率。

北京华越洋生物

EGY48酵母菌感受态细胞

规格： 100ul

EGY48 Chemically Competent Cell 产品说明书

EGY48酵母菌感受态细胞

产品规格

EGY48： 10×100μl 保存条件：-80℃ PGADT7（control vector ）：10ng/μl 10μl 保存条件： 4℃ Carrier DNA ： 5ug/μl 120 μl 保存条件： 4℃ PEG/liAC ： 5 ml 保存条件： 4℃ DMSO ： 300 ul 保存条件： 4℃ EGY48酵母菌感受态细胞

基因型

MAT α, ura3, his3, trp1, LexAop (x6)-LEU2

产品说明

EGY48感受态细胞是实验室常用酵母双杂用菌株，MAT α型，可转化质粒或mating 操作。Transformation marker 为: his3, trp1, ura3 ，报告基因为：LEU2 。经PGADT7质粒检测转化效率为104cfu/μg DNA 。

EGY48酵母菌感受态细胞

操作方法

1. 取100 μl 冰上融化的EGY48感受态细胞，依次加入预冷的目的质粒2-5ug ，Carrier DNA （95-100度5min,快速冰浴，重复一次）12 ul ，PEG/liAC 500ul 并吸打几次混匀，30度水浴30 分钟（15 min 翻转6-8次混匀）。

2. 加入DMSO 30ul 轻轻混匀。

3. 将管放42度水浴15min （7.5 min 翻转6-8次混匀）。

4. 5000 rpm 离心 40s 弃上清，ddH2O 400ul 重悬，离心 30s 弃上清。

5. ddH2O 50ul 重悬，涂板。

EGY48酵母菌感受态细胞

注意事项

1. 感受态细胞最好在冰上融化。

2. 转化高浓度的质粒可相应减少最终用于涂板的菌量。

编码

产品名称 规格 说明 北京华越洋生物

WX1499-100S

EGY48感受态细胞 10*100ul 北京华越洋生物

WX1499-100 EGY48感受态细胞 20*100ul

3. 同时转化2-3种质粒时可增加质粒的用量。

感受态细胞的制备步骤和原理

实验目的 为了获得大量的质粒作为克隆载体，我们需要将购买来的质粒通过转化的方法导入细菌的细胞内。制备出感受态的细胞，我们就可以方便的将需克隆的质粒导入其中，使其繁殖，就能获得大量质粒。本次实验的目的就是增加质粒的数量。同时，我们能掌握大肠杆菌感受态细胞的制备及转化的基本原理和实验技术方法。 实验原理及过程 实验步骤 1挑取一个JM109单菌落于3ml LB(无抗生素)培养基中，37℃，180rpm培养过夜。 [让菌复苏，进入对数期的早中期。此时更容易制得感受态细胞。] 2取过夜培养物加入到40mL LB(无抗生素)培养基中，37℃250rpm大约小时。 [减少达到所需亮的均所需繁殖的世代数，以减少菌的变异。] 3取培养物置于40mL的灭菌离心管中，冰浴10min，4000rpm4℃离心 10min，弃上清。（将所有上清倒光，可以将离心管倒过来） [使细菌的生长停止，代谢减慢。因为这时已经没有培养基了，如果细菌仍有很高的代谢效率，则有大量细菌死亡。] 4菌体重悬于10mL100mmol/L冰冷CaCl2中，轻吹，4℃30min，4000rpm 离心5min弃上清。 [细菌处于0度，CaCl2低渗溶液中，菌细胞膨胀成球形，外源DNA形成抗DNA酶的羟基-钙磷酸盐混合物黏附于细胞表面（羟基来源于细胞壁上的糖，磷酸来源于DNA），经短时间420C热激处理，促进细胞吸收DNA复合物。（一

定要轻吹，这时细胞壁打开，十分脆弱）]5菌体重悬于1mL 100mmol/L冰冷的CaCl2中，轻吹，用于转化。 [除去所有的LB以及细胞破损后释放出来的细胞内含物。防止细胞分裂，以致大量细胞死亡。（一定要轻吹，这时细胞壁打开，十分脆弱）] 6取感受态细胞100uL，加入2uLpET-21a质粒，冰浴30 min受体菌：感受态细胞100uL，加入2 uL无菌双蒸水阴性对照：LCaCl2溶液100uL，加入2 uL阴性对照 [第一个阴性对照是为了验证LB中的抗生素有活性；第二个阴性对照是为了验证CaCl2溶液和pET-21a质粒未被污染。] [冰浴是为了降低细胞代谢率，防止细胞大量死亡。] 7热激42度，90s 【在低温处理后，热激，可以使细胞壁热胀冷缩，再低温，使细胞壁上黏附的质粒进入细胞体内。】 8冰浴2 min 9加入800 uL无抗生素的LB，37℃复苏1h 【用LB复苏细胞，使细胞恢复活力，从而使细胞中的质粒表达抗抗生素的基因，只有这样才能使转化成功的细菌在有抗生 素的LB平板上生长。】 10取100ul细胞直接在含50ug/mLCarbenicillin(羧苄西林)的LB培养基上铺平板，将平皿放置37 oC温箱30min至液体被吸收。倒置平皿37 oC培养过夜，出现菌落。 【这些菌落为转化成功的菌落，而对照组应该没有菌落。在目的菌落的旁边有可能出现卫星菌落，这是因为亩的菌落的抗性基因似的菌落周围的抗生素失效，长出了转化为成功的菌落。用羧苄西林因其对酸稳定、不易被细菌降解，所以可以降低卫星菌落的数量。

JM109,DH5a,BL21等感受态细菌特点及应用

1：DH5a菌株 DH5a是一种常用于质粒克隆的菌株。E.coliDH5a在使用pUC系列质粒载体转化时，可与载体编码的β－半乳糖苷酶氨基端实现α－互补。可用于蓝白斑筛 选鉴别重组菌株。 基因型：F-，φ80dlacZΔM15，Δ(lacZYA-argF)U169，deoR，recA1，endA1，hsdR17(rk-，mk+)，phoA，supE44，λ-，thi-1，gyrA96，relA1 2：BL21(DE3) 菌株 BL21菌株用于高效表达克隆于含有噬菌体T7启动子的表达载体（如pET系列）的基因。T7噬菌体RNA聚合酶位于λ噬菌体DE3区，该区整合于BL21 的染色体上。该菌适合表达非毒性蛋白。 基因型：F-，ompT， hsdS（rBB-mB－），gal，dcm（DE3） 3：BL21(DE3) pLysS菌株 BL21(DE3) pLysS菌株含有质粒pLysS，因此具有氯霉素抗性。PLysS含有 表达T7溶菌酶的基因，能够降低目的基因的背景表达水平，但不干扰目的蛋 白的表达。该菌适合表达毒性蛋白和非毒性蛋白。 基因型：F-，ompT hsdS（rBB-mB－），gal，dcm（DE3，pLysS ，Camr 4：JM109菌株 JM109菌株在使用pUC系列质粒载体进行DNA转化或用M13phage载体进行转染时，由于载体DNA产生的LacZa多肽和JM09编码的LacZΔM15进行α －互补，从而显示β－半乳糖苷酶活性，由此很容易鉴别重组体菌株 基因型：recA1，endA1，gyrA96，thi－1，hsdR17，supE44，relA1，Δ（lac －proAB）/F’[traD36，proAB+，lacIq，lacZΔM15] 5：TOP10菌株 TOP10菌株适用于高效的DNA克隆和质粒扩增，能保证高拷贝质粒的稳定遗传。 基因型：F- ，mcrAΔ(mrr-hsd RMS-mcrBC)，φ80，lacZΔM15，△lacⅩ74，recA1 ，araΔ139Δ(ara-leu)7697， galU，galK ，rps， (Strr) endA1， nupG 6：HB101菌株 HB101菌株遗传性能稳定，使用方便，适用于各种基因重组实验 基因型：supE44，hsdS20（rB-mB－），recA13，ara－14，proA2，lacY1，galK2，rpsL20，xyl-5，mtl-1，leuB6，thi-1

感受态细胞制备及各种感受态的特点

感受态细胞制备 制备感受态常用的方法是电击法和CaC2制备法，以下介绍 CaC2制备法： 1、可以从-80 C冰柜中，取出一支冻存菌株，于事先照过紫外的超净台中，用无菌的接种环轻轻蘸取菌种后，在无抗平板（由于 Rocetta 含有氯霉素抗性，需要涂布在氯霉素抗性的平板，后面的都是如此）上划线，并将菌种迅速放回 -80 C保存，在划线板上做好相应标记， 于37 C培养过夜。 2、从37 C培养过夜的新鲜平板上挑取一个单克隆，接种于 2mlEP管中，37 C, 220rpm 震荡培养约 6个小时至对数生长中后期；将该菌悬液以 1:100 的比例接种于 50ml LB 液体培养基（ 2瓶）中，37 C 振荡培养2.5小时至OD600=0.5 。 注意：接种比例不得大于 1:10。 3、在无菌条件下将细菌转移到一个无菌、预冷的离心管（50ml ）中,在冰上放置5~10min ；注意：划板、接种为了防止意外发生最好多划一块平板和多接一根试管,划板、接种、转接均要严格按照无菌操作。 4、4C 5000g 离心 5 分钟。用预冷的去离子水洗涤沉淀, 4C 5000g 离心 5 分钟； Note ：此步主要是为了洗去培养基中的盐等 5 、沉淀加入 2ml 预冷的 0.05mol/L CaCl 2-1 5%甘油混合溶液, 轻吹散,冰浴 5分钟, 4C5000g 离心 5 分钟； 6、沉淀加入 2ml 预冷的 0.05mol/L CaCl 2-15%甘油混合溶液,轻吹散,即成为感受态细胞 悬液。分装成50~100卩l的小份，贮存于-70 C可保存半年。 含 15%甘油的 0.05mol/L CaCl 2制备方法 : 称取0.28g CaCL（无水,分析纯），溶于50ml重蒸水中，加入15ml甘油，定容至100ml,高压灭菌。 感受态细胞的特征感受态：通过特殊处理使细胞处于能够吸收外源 DNA 的状态。感受态细胞的特征：（1 ）细胞表面暴露出一些可接受外来 DNA 的位点（以溶菌酶处理,可促使受体细胞的接 受位点充分暴露）。（2）细胞膜通透性增加（用钙离子处理,可使膜通透性增加,使DNA 直接穿过质膜进入细胞）。（ 3 ）受体细胞的修饰酶活性最高,而限制酶活性最低,使转入的 DNA 分子不易被切除或破坏。 实验室常用的感受态细胞 1. DH5 a菌株

大肠杆菌感受态细胞制备

大肠杆菌电转化感受态细胞制备 第一天： 1. 将适合菌株(如XL1-Blue, DH5α)置于LB或其他营养丰富的培养基上，在37°C下过夜培养 2. 高温灭菌大的离心瓶(250-500ml)以备第二天摇瓶用 3. 准备几瓶灭菌水(总量约1.5升)，保存于冷冻室中以备第二天重悬浮细胞用 第二天： 4. 转移0.2-1ml过夜培养物至装有500ml LB(或其他营养丰富的培养基)的1-2升挡板∑恐? 5. 37°C下剧烈振荡培养2-6小时 6. 定时监控O.D.600值(培养1小时后每半小时测定一次) 7. 当O.D.600值达到0.5-1.0时，从摇床中取出摇瓶，置于冰上冷却至少15分钟(需要的话这种方式可以存放培养液数小时) 8. 细胞在4°C 5000g下离心15分钟，弃上清液(如需要，沉淀可在4°C的10%甘油中保存一两天) 9. 用灭菌的冰水重悬浮细胞。先用涡旋仪或吸液管重悬浮细胞于少量体积中(几毫升)，然后加水稀释至离心管的2/3体积。 10. 照上面步骤重复离心，小心弃去上清液 11. 照上面步骤用灭菌的冰水重悬浮细胞 12. 离心，弃上清液 13. 用20ml灭菌的、冰冷后的10%甘油重悬浮细胞 14. 照上面步骤离心，小心弃去上清液(沉淀可能会很松散) 15. 用10%甘油重悬浮细胞至最终体积为2-3ml 16. 将细胞按150μl等份装入微量离心管，于-80°C保存 转化方法: 1. 在冰上解冻电感受态细胞添加1-10μl DNA ，冰上培育约5分钟

2. 添加1-3μl DNA ，冰上培育约5分钟 3. 转移DNA/细胞混合物至冷却后的2mm电穿孔容器(无泡)中 4. 加载P1000，准备好300μl LB 或 2xYT 5. 对电穿孔容器进行脉冲(200 欧姆, 25μFd, 2.5 千伏)(检查时间常数，应该在3以上) 6. 立即添加300μl 的LB或2xYT至电穿孔容器中 7. 37°C下培养细胞40分钟至1小时以复原 大肠杆菌电转化感受态细胞制备及转化方法 大肠杆菌电转化感受态细胞制备 第一天： 1. 将适合菌株(如XL1-Blue, DH5α)置于LB或其他营养丰富的培养基上，在37°C下过夜培养 2. 高温灭菌大的离心瓶(250-500ml)以备第二天摇瓶用 3. 准备几瓶灭菌水(总量约1.5升)，保存于冷冻室中以备第二天重悬浮细胞用 第二天： 4. 转移0.2-1ml过夜培养物至装有500ml LB(或其他营养丰富的培养基)的1-2升挡板∑恐? 5. 37°C下剧烈振荡培养2-6小时 6. 定时监控O.D.600值(培养1小时后每半小时测定一次) 7. 当O.D.600值达到0.5-1.0时，从摇床中取出摇瓶，置于冰上冷却至少15分钟(需要的话这种方式可以存放培养液数小时) 8. 细胞在4°C 5000g下离心15分钟，弃上清液(如需要，沉淀可在4°C的10%甘油中保存一两天) 9. 用灭菌的冰水重悬浮细胞。先用涡旋仪或吸液管重悬浮细胞于少量体积中(几毫升)，然后加水稀释至离心管的2/3体积。 10. 照上面步骤重复离心，小心弃去上清液

原核表达--宿主菌株选择指南

作为原核表达地宿主，对外源基因地表达会产生一定地影响，是勿庸置疑地.每一个宿主细胞都像一个微观地小工厂，按照细胞固有地程序完成“你给它们安排地生产任务”――因为很难亲眼观察微观世界中表达是如何进行地，当出现问题时，我们需要经验判断问题所在.宿主细胞对原核表达可能会产生哪些影响呢？ 知其然还要知其所以然.比如，菌株内源地蛋白酶过多，可能会造成外源表达产物地不稳定，所以一些蛋白酶缺陷型菌株往往成为理想地起始表达菌株.堪称经典地系列就是和蛋白酶缺陷型，也是我们非常熟悉地表达菌株.大名鼎鼎地()融源菌则是添加聚合酶基因，为表达系统而设计.文档收集自网络，仅用于个人学习 真核细胞偏爱地密码子和原核系统有不同，因此，在用原核系统表达真核基因地时候，真核基因中地一些密码子对于原核细胞来说可能是稀有密码子，从而导致表达效率和表达水平很低.改造基因是比较麻烦地做法，系列就是更好地选择―― 这种携带质粒地衍生菌，补充大肠杆菌缺乏地七种（及）稀有密码子对应地，提高外源基因、尤其是真核基因在原核系统中地表达水平.（已经携带有氯霉素抗性质粒）文档收集自网络，仅用于个人学习 当要表达地蛋白质需要形成二硫键以形成正确地折叠时，可以选择衍生菌系列，()和()两条主要还原途径双突变菌株，显著提高细胞质中二硫键形成几率，促进蛋白可溶性及活性表达.（卡那霉素敏感）文档收集自网络，仅用于个人学习 ? 则是综合上述两类菌株地优点，既补充种稀有密码子，又能够促进二硫键地形成，帮助表达需要借助二硫键形成正确折叠构象地真核蛋白.（卡那霉素敏感）文档收集自网络，仅用于个人学习 是衍生自突变地菌株，这个突变能根据地浓度精确调节表达产物，使得表达产物量呈现浓度依赖性.（四环素敏感）文档收集自网络，仅用于个人学习 在决定试用这些名字古怪地菌株时，有几个小要注意地，一个是不同菌株有时已经携带某个质粒或者已经具有某种抗生素抗性，要注意自己地表达质粒是否能与之兼容.比如已经携带有氯霉素抗性质粒，不能再用氯霉素筛选等等.文档收集自网络，仅用于个人学习 现象 可能原因 改进方案 建议菌株 无蛋白表达出现截短蛋白 . 地密码子偏移性 补充稀有密码子地；将稀有密码子突变为普通大肠杆菌密码子 包涵体 二硫键形成困难 降低宿主胞质地还原性；利用促进二硫键形成地各种载体标签 表达过快，表达量过高 控制优化表达水平：降温，浓度优化

常用几种感受态区别

常用大肠杆菌感受态JM109，DH5a，BL21的区别 1：DH5a菌株 DH5a是一种常用于质粒克隆的菌株。E.coli DH5a在使用pUC系列质粒载体转化时，可与载体编码的β－半乳糖苷酶氨基端实现α－互补。可用于蓝白斑筛选鉴别重组菌株。 基因型：F-，φ80dlacZΔM15，Δ(lacZYA-argF)U169，deoR，recA1，endA1，hsdR17(rk-，mk+)，phoA，supE44，λ-，thi-1，gyrA96，relA1 2：BL21(DE3) 菌株 该菌株用于高效表达克隆于含有噬菌体T7启动子的表达载体（如pET系列）的基因。T7噬菌体RNA聚合酶位于λ 噬菌体DE3区，该区整合于BL21的染色体上。该菌适合表达非毒性蛋白。 基因型：F-，ompT， hsdS（rBB-mB－），gal， dcm（DE3） 3：BL21(DE3) pLysS菌株 该菌株含有质粒pLysS，因此具有氯霉素抗性。PLysS含有表达T7溶菌酶的基因，能够降低目的基因的背景表达水平，但不干扰目的蛋白的表达。该菌适合表达毒性蛋白和非毒性蛋白。 基因型：F-，ompT hsdS（rBB-mB－），gal， dcm（DE3，pLysS ，Camr 4：JM109菌株 该菌株在使用pUC系列质粒载体进行DNA转化或用M13 phage载体进行转染时，由于载体DNA产生的LacZa多肽和JM09编码的LacZΔM15进行α－互补，从而显示β－半乳糖苷酶活性，由此很容易鉴别重组体菌株 基因型：recA1，endA1，gyrA96，thi－1，hsdR17，supE44，relA1，Δ（lac－proAB）/F’[traD36，proAB+，lacIq，lacZΔM15] 5：TOP10菌株 该菌株适用于高效的DNA克隆和质粒扩增，能保证高拷贝质粒的稳定遗传。基因型：F- ，mcrAΔ(mrr-hsd RMS-mcrBC)，φ80 ，lacZΔM15，△lacⅩ74，recA1 ，araΔ139Δ(ara-leu)7697， galU ，galK ，rps， (Strr) endA1， nupG 6：HB101菌株 该菌株遗传性能稳定，使用方便，适用于各种基因重组实验 基因型：supE44，hsdS20（rB-mB－），recA13，ara－14，proA2，lacY1，galK2，rpsL20，xyl-5，mtl-1，leuB6，thi-1 7：M110或 SCS110 大多数大肠杆菌菌株中含有Dam甲基化酶和Dcm甲基化酶，前者可以在GATC序列中腺嘌呤N-6位上引入甲基，后者在CCA/TGC序列的第一个胞嘧啶 C-5位置上引入甲基。常用的菌株都会产生dam,dcm，从而受到甲基化的影

大肠杆菌感受态细胞的制备实验具体步骤及说明

大肠杆菌感受态细胞的制备实验具体步骤及详细说明 带有外源DNA 的重组质粒，在体外构建后，导入宿主细胞，随着细胞的大量复制、繁殖，才能够有机会获得纯的重组质粒DNA，该过程称之为转化过程。受体细胞经过一些特殊方法（如：CaCl2，RuCl 等化学试剂）的处理后，细胞膜的通透性发生变化，能容许外源DNA 的载体分子通过。 带有外源DNA 的重组质粒，在体外构建后，导入宿主细胞，随着细胞的大量复制、繁殖，才能够有机会获得纯的重组质粒DNA，该过程称之为转化过程。受体细胞经过一些特殊方法（如：CaCl2，RuCl 等化学试剂）的处理后，细胞膜的通透性发生变化，能容许外源DNA 的载体分子通过。 具体步骤 1、从37℃培养16-20 h的平板中挑取一个单菌落(直径2-3 mm)，转到一个含有100 ml LB或SOB培养基的1L烧瓶中。于37℃剧烈振摇培养3 h。一般经验，1 OD600约含有大肠杆菌DH5α 109个/mL。 2、将细菌转移到一个无菌、一次性使用的、用冰预冷的50 ml聚丙烯管中，在冰上放置10 min，使培养物冷却至0℃。 3、于4℃用Sorvall GS3特头（或与之相当的转头）以4 100 r/min离心10 min，以回收细胞。 4、倒出培养液，将管倒置1 min以使最后的痕量培养液流尽。

5、每50 ml初始培养液用30 ml预冷的0.1 mol/LCaCl2-MgCl2溶液(80 mmol/L MgCl2，20 mmol/L CaCl2)重悬每份细胞沉淀。 6、于4℃用Sorvall GS3转头（或与之相当的转头）以41 00 r/min离心10 min，以回收细胞。 7、倒出培养液，将管倒置1 min以使最后的痕量培养液流尽。 8、每50 ml初始培养物用2 ml用冰预冷的0.1 mol/L CaCl2(或TFB)重悬每份细胞沉淀。 9、此时，可以用新鲜制备的感受态细胞直接做转化实验，也可以将细胞冻存于- 70℃。 注意事项 1. 为达到高效转化，活细胞数务必少于108个细胞/mL，对于大多散大脑杆菌来说，这相当于OD值为0.4左右。为保证细菌培养物的生长密度不致过高，可每隔15-20 min测定OD600值来监测，用监测的时间及OD值列一个图表，以便预测培养物的OD600值到0.4的时间，当OD600值达到0.35时，收获细菌培养物。 2. 在菌株与菌株之间，OD值与每毫升中活细胞散间的关系变化很大，因此有必要通过漶量特定脑杆菌的生长培养物在生长周期的不同时相的OD600值，并

(完整版)大肠杆菌感受态细胞的制备

大肠杆菌感受态细胞的制备 标签： tr..,Ca..,co.. 分类：细胞技术> 感受态细胞 来源： 实验管理实验概要 大肠杆菌感受态细胞的CaCl2法制备及质粒转化 实验原理 处于对数生长期的细菌经CaCl2 处理后接受外源DNA的能力显著增加。细菌处于容易吸收外源DNA的状态叫感受态。 在自然条件下，很多质粒都可通过细菌接合作用转移到新的宿主内，但在人工构建的质粒载体中，一般缺乏此种转移所必需的mob基因，因此不能自行完成从一个细胞到另一个细胞的接合转移。如需将质粒载体转移进受体细菌，需诱导受体细菌产生一种短暂的感受态，以摄取外源DNA。 转化（Transformation）是将外源DNA分子引入受体细胞，使之获得新的遗传性状的一种手段，它是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究领域的基本实验技术。转化过程所用的受体细胞一般是限制修饰系统缺陷的变异株，即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变体 （R-,M-），它可以容忍外源DNA分子进入体内并稳定地遗传给后代。受体细胞经过一些特殊方法（如电击法，CaCl2 ，RbCl(KCl)等化学试剂法）的处理后，细胞膜的通透性发生了暂时性的改变，成为能允许外源DNA分子进入的感受态细胞（Compenent cells）。进入受体细胞的DNA分子通过复制、表达实现遗传信息的转移，使受体细胞出现新的遗传性状。将经过转化后的细胞在筛选培养基中培养，即可筛选出转化子（Transformant，即带有异源DNA 分子的受体细胞）。目前常用的感受态细胞制备方法有CaCl2和RbCl(KCl)法，RbCl(KCl)法制备的感受态细胞转化效率较高，但CaCl2法简便易行，且其转化效率完全可以满足一般实验的要求，制备出的感受态细胞暂时不用时，可加入占总体积15%的无菌甘油于-70℃保存（半年），因此CaCl2法使用更广泛。 主要试剂 (1)0.1mol/L CaCl2溶液 (2)LB液体培养基

CaCl2感受态细胞的制备实验步骤

CaCl2感受态细胞的制备实验步骤 ?1、从新活化的E.coli DH5α平板上挑取一单菌落，接种于3～5ml LB液 体培养中，37℃振荡培养至对数生长期(12h左右)； ? 2、将该菌悬液以1:100～1:50转接于100ml LB液体培养基中，37℃振 荡扩大培养，当培养液开始出现混浊后，每隔20～30min测一次OD600，至OD600为0.3～0.5时停止培养，并转装到1.5 mL离心管中； ? 3、培养物于冰上放置20min； ? 4、 0～4℃，4000g离心10min，弃去上清液，加入1 mL冰冷的 0.1mo1／L CaCl2溶液，小心悬浮细胞, 冰浴20分钟； ?5、0～4℃， 4000g离心10min，倒净上清培养液，再用1.0 mL冰冷的 0.1mo1／L CaCl2溶液轻轻悬浮细胞，冰浴20min； ? 6、 0～4℃， 4000g离心10min，弃去上清液，加入100 μL冰冷的 0.1mo1／L CaCl2溶液，小心悬浮细胞，冰上放置片刻后，即制成了感 受态细胞悬液； ? 7、制备好的感受态细胞悬液可直接用于转化实验，如果在4℃放置 12～24h，其转化效率可以增高4～6倍；也可加入占总体积15％左右 高压灭菌过的甘油，混匀后分装于1.5ml离心管中，置于-70℃条件下， 可保存半年至一年。

CaCl2感受态细胞的制备实验步骤 1．前夜接种受体菌（DH5α或DH10B），挑取单菌落于LB培养基中 37℃摇床培养过夜（约16小时）； 2 ．取1ml过夜培养物转接于100ml LB培养基中，在37℃摇床上剧烈振 荡培养约2.5-3小时（250-300rpm）； 3 ．将0.1M CaCl2溶液置于冰上预冷；以下步骤需在超净工作台和冰上 操作； 4 ．吸取1.5ml培养好的菌液至1.5ml离心管中，在冰上冷却10分钟； 5 ．4℃下3000 g冷冻离心5分钟； 6 ．弃去上清，加入100μl预冷0.1M CaCl2溶液，用移液枪轻轻上下吸动 打匀，使细胞重新悬浮，在冰放置20分钟； 7 ． 4℃下3000 g冷冻离心5分钟； 8 ．弃去上清，加入100μl预冷0.1M CaCl2溶液，用移液枪轻轻上下吸动 打匀，使细胞重新悬浮； 9 ．细胞悬浮液可立即用于转化实验或添加冷冻保护剂（15% - 20%甘油）后超 低温冷冻贮存备用（－70℃）。 注意事项 1．细菌的生长状态：实验中应密切注视细菌的生长状态和密度，尽量使 用对数生长期的细胞（一般通过检测OD600来控制。DH5α菌株OD600为0.5时细胞密度是5×107/ml）； 2 ．所有操作均应在无菌条件和冰上进行； 3 ．经CaCl2处理的细胞，在低温条件下，一定的时间内转化率随时间的 推移而增加，24小时达到最高，之后转化率再下降（这是由于总的 活菌数随时间延长而减少造成的）； 4 ．化合物及无机离子的影响：在Ca2+的基础上联合其他二价金属离子 （如Mn 2+或Co 2+）、DMSO或还原剂等物质处理细菌，可使转化效率大大提高（100-1000倍）； 5 ．所使用的器皿必须干净。迹量的去污剂或其它化学物质的存在可能 大大降低细菌的转化效率； 6 ．质粒的大小及构型的影响：用于转化的应主要是超螺旋的DNA； 7 ．一定范围内，转化效率与外源DNA的浓度呈正比；

TOP10 感受态细胞使用说明书

全国免费电话：400-818-1148 TOP10 感受态细胞 Cat. No. JH0102-3 保存：-80℃ 组分说明 产品简介 本产品是大肠杆菌 TOP10 菌株经特殊工艺处理得到的感受态细胞，可用于 DNA 的热击转化。TOP10 是一种常用于质粒克隆的菌株，其 φ80lacZΔM15 基因产物可与载体编码的β-半乳糖苷酶氨基端实现α互补，可用于蓝白斑筛选。使用 pUC19质粒检测，转化效率可达 108，适用于高效的质粒 DNA 克隆并能保证高拷贝质粒的稳定复制。 注意事项 1.转化所有步骤均在无菌条件下操作。 2.感受态细胞应在-80℃下保存，不可多次冻融和放置时间过长，以免降低感受态细胞的转化效率。 3.包装中有0.1 ng/μl 的pUC19DNA ，供对照试验使用。 操作步骤 1.取感受态细胞置于冰浴中。一次转化感受态细胞的建议用量为50-100 μl ，可以根据实际情况分装使用。 以下实验以100 μl 感受态细胞为例。 2.待感受态细胞融化后，向感受态细胞悬液中加入目的DNA （根据实际情况加入适量的DNA ，通常100 μl 感受态细胞能够被1 ng 超螺旋质粒DNA 所饱和），用移液器轻轻吹打混匀，冰浴30分钟。 3.42℃热击90秒，迅速将离心管转移到冰浴中，冰上静置2-3分钟。 4.向每个离心管中加入900 μl 无菌的SOC 或LB 培养基（不含抗生素），混匀后置于37℃摇床，150 rpm 振荡培养45分钟使菌体复苏。 5.取100 μl 已转化的感受态细胞，加到含相应抗生素的SOC 或LB 固体琼脂培养基上，用无菌的涂布棒将细胞均匀涂开，直至干燥，倒置平板，37℃培养12-16小时。 注意：1） 涂布用量可根据具体实验调整。若转化的DNA 总量较多，可取少量转化产物涂布平板；若转化的DNA 总量较少，可取200-300 μl 转化产物涂布平板。若预计的克隆数较少，可通过离心（4,000 rpm ，2分钟）后吸除部分培养液，悬浮菌体后将其涂布于平板中。 2） 新制备的固体培养基不易涂干，可将平板正置于37℃直至液体被吸收后再倒置培养。 3） 涂布剩余的菌液可置于4℃保存，如果次日的转化菌落数过少，可以将剩下的菌液再涂布新培养基进行培养。 Cat. No. JH0102-3 Kit Size 10×100 μl TOP10 感受态细胞 10×100 μl Control DNA pUC19，0.1 ng/μl 10 μl

感受态细胞制备及各种感受态的特点

感受态细胞制备及各种 感受态的特点 Company Document number：WUUT-WUUY-WBBGB-BWYTT-1982GT

感受态细胞制备制备感受态常用的方法是电击法和CaCl2制备法，以下介绍CaCl2制备法： 1、可以从-80℃冰柜中，取出一支冻存菌株，于事先照过紫外的超净台中，用无菌的接种环轻轻蘸取菌种后，在无抗平板（由于Rocetta含有氯霉素抗性，需要涂布在氯霉素抗性的平板，后面的都是如此）上划线，并将菌种迅速放回-80℃保存，在划线板上做好相应标记，于37℃培养过夜。 2、从37℃培养过夜的新鲜平板上挑取一个单克隆，接种于2mlEP管中，37℃， 220rpm震荡培养约6个小时至对数生长中后期；将该菌悬液以1:100的比例接种于 50ml LB液体培养基（2瓶）中,37℃振荡培养小时至OD600=。 注意：接种比例不得大于1:10。 3、在无菌条件下将细菌转移到一个无菌、预冷的离心管（50ml）中，在冰上放置 5~10min； 注意：划板、接种为了防止意外发生最好多划一块平板和多接一根试管，划板、接种、转接均要严格按照无菌操作。 4、4℃ 5000g离心5分钟。用预冷的去离子水洗涤沉淀，4℃ 5000g离心5分钟；Note：此步主要是为了洗去培养基中的盐等 5、沉淀加入2ml预冷的L CaCl2-15%甘油混合溶液，轻吹散，冰浴5分钟，4℃5000g 离心5分钟； 6、沉淀加入2ml预冷的L CaCl2-15%甘油混合溶液，轻吹散，即成为感受态细胞悬液。分装成50~100μl的小份，贮存于-70℃可保存半年。 含15%甘油的L CaCl2制备方法: 称取 CaCl2(无水,分析纯),溶于50ml重蒸水中,加入15ml甘油,定容至100ml,高压灭菌。

感受态细胞的制备步骤和原理

感受态细胞的制备步骤和原理 实验目的 为了获得大量的质粒作为克隆载体，我们需要将购买来的质粒通过转化的方法导入细菌的细胞内。制备出感受态的细胞，我们就可以方便的将需克隆的质粒导入其中，使其繁殖，就能获得大量质粒。本次实验的目的就是增加质粒的数量。同时，我们能掌握大肠杆菌感受态细胞的制备及转化的基本原理和实验技术方法。 实验原理及过程 实验步骤 1挑取一个JM109单菌落于3ml LB(无抗生素)培养基中，37℃，180rpm培养过夜。 [让菌复苏，进入对数期的早中期。此时更容易制得感受态细胞。] 2取0.4mL过夜培养物加入到40mL LB(无抗生素)培养基中，37℃250rpm大约2.5小时。 [减少达到所需亮的均所需繁殖的世代数，以减少菌的变 GAGGAGAGGAFFFFAFAF

异。] 3取培养物置于40mL的灭菌离心管中，冰浴10min，4000rpm 4℃离心10min，弃上清。（将所有上清倒光，可以将离心管倒过来） [使细菌的生长停止，代谢减慢。因为这时已经没有培养基了，如果细菌仍有很高的代谢效率，则有大量细菌死亡。] 4菌体重悬于10mL 100mmol/L冰冷CaCl2中，轻吹，4℃30min，4000rpm离心5min弃上清。 [ 细菌处于0度，CaCl2低渗溶液中，菌细胞膨胀成球形，外源DNA形成抗DNA酶的羟基-钙磷酸盐混合物黏附于细胞表面（羟基来源于细胞壁上的糖，磷酸来源于DNA），经短时间420C热激处理，促进细胞吸收DNA复合物。（一定要轻吹，这时细胞壁打开，十分脆弱）] 5菌体重悬于1mL 100mmol/L冰冷的CaCl2中，轻吹，用于转化。 [除去所有的LB以及细胞破损后释放出来的细胞内含物。防止细胞分裂，以致大量细胞死亡。（一定要轻吹，这时细 胞壁打开，十分脆弱）] GAGGAGAGGAFFFFAFAF

实验室常用的细菌作用及其选择

第一篇：JM109，DH5a，BL21这些感受态有何区别 1：DH5a菌株 DH5a是一种常用于质粒克隆的菌株。E.coli DH5a在使用pUC系列质粒载体转化时，可与载体编码的β－半乳糖苷酶氨基端实现α－互补。可用于蓝白斑筛选鉴别重组菌株。 基因型：F-，φ80dlacZΔM15，Δ(lacZYA-argF)U169，deoR，recA1，endA1，hsdR17(rk-，mk+)，phoA，supE44，λ-，thi-1，gyrA96，relA1 2：BL21(DE3) 菌株 该菌株用于高效表达克隆于含有噬菌体T7启动子的表达载体（如pET系列）的基因。T7噬菌体RNA聚合酶位于λ噬菌体DE3区，该区整合于BL21的染色体上。该菌适合表达非毒性蛋白。 基因型：F-，ompT， hsdS（rBB-mB－），gal， dcm（DE3） 3：BL21(DE3) pLysS菌株 该菌株含有质粒pLysS，因此具有氯霉素抗性。PLysS含有表达T7溶菌酶的基因，能够降低目的基因的背景表达水平，但不干扰目的蛋白的表达。该菌适合表达毒性蛋白和非毒性蛋白。 基因型：F-，ompT hsdS（rBB-mB－），gal， dcm（DE3，pLysS ，Camr 4：JM109菌株 该菌株在使用pUC系列质粒载体进行DNA转化或用M13 phage载体进行转染时，由于载体DNA产生的LacZa多肽和JM09编码的LacZΔM15进行α－互补，从而显示β－半乳糖苷酶活性，由此很容易鉴别重组体菌株 基因型：recA1，endA1，gyrA96，thi－1，hsdR17，supE44，relA1，Δ（lac －proAB）/F’[traD36，proAB+，lacIq，lacZΔM15] 5：TOP10菌株 该菌株适用于高效的DNA克隆和质粒扩增，能保证高拷贝质粒的稳定遗传。 基因型：F- ，mcrAΔ(mrr-hsd RMS-mcrBC)，φ80 ，lacZΔM15，△lacⅩ74，recA1 ，araΔ139Δ(ara-leu)7697， galU ，galK ，rps， (Strr) endA1， nupG 6：HB101菌株 该菌株遗传性能稳定，使用方便，适用于各种基因重组实验

感受态细胞的制备步骤和原理

感受态细胞的制备步骤和原理 实验目的为了获得大量的质粒作为克隆载体，我们需要将购买来的质粒通过转化的方法导入细菌的细 胞内。制备出感受态的细胞，我们就可以方便的将需克隆的质粒导入其中，使其繁殖，就能 获得大量质粒。本次实验的目的就是增加质粒的数量。同时，我们能掌握大肠杆菌感受态细 胞的制备及转化的基本原理和实验技术方法。实验原理及过程实验步骤 1挑取一个JM109单菌落于3ml LB（无抗生素）培养基中，37C, 180rpm培养过夜。［让菌复苏， 进入对数期的早中期。此时更容易制得感受态细胞。］ 2取0.4mL过夜培养物加入到40mL LB（无抗生素）培养基中，37C 250rpm大约2.5小时。 ［减少达到所需亮的均所需繁殖的世代数，以减少菌的变异。］ 3取培养物置于40m L的灭菌离心管中，冰浴10min , 4000rpm 4C离心10min，弃上清。（将所 有上清倒光，可以将离心管倒过来） ［使细菌的生长停止，代谢减慢。因为这时已经没有培养基了，如果细菌仍有很高的代谢效率，则有大量细菌死亡。］ 4菌体重悬于10mL 100mmol/L 冰冷CaCl2中，轻吹，4 C 30min , 4000rpm离心5min弃上 ［细菌处于0度，CaCl2低渗溶液中，菌细胞膨胀成球形，外源DNA形成抗DNA酶的羟基 -钙磷 酸盐混合物黏附于细胞表面（羟基来源于细胞壁上的糖，磷酸来源于DNA ）,经短时 间420C热激处理，促进细胞吸收DNA复合物。（一定要轻吹，这时细胞壁打开，十分脆弱）］ 5 菌体重悬于1mL 100mmol/L冰冷的CaCl2中，轻吹，用于转化。 ［除去所有的LB以及细胞破损后释放出来的细胞内含物。防止细胞分裂，以致大量细胞死亡。 （一定要轻吹，这时细胞壁打开，十分脆弱）］ 6取感受态细胞100uL,加入2uLpET-21a质粒，冰浴30 min受体菌：感受态细胞100uL, 加入2 uL 无菌双蒸水阴性对照：0.1mol/LCaCl2溶液100uL,加入2 uL阴性对照 ［第一个阴性对照是为了验证LB中的抗生素有活性；第二个阴性对照是为了验证CaCl2溶 液和pET-21a质粒未被污染。］［冰浴是为了降低细胞代谢率，防止细胞大量死亡。］ 7热激42度，90s 【在低温处理后，热激，可以使细胞壁热胀冷缩，再低温，使细胞壁上黏附的质粒进入细胞体内。】8冰浴2 min 9加入800 uL无抗生素的LB, 37 C复苏1h 【用LB复苏细胞，使细胞恢复活力，从而使细胞中的质粒表达抗抗生素的基因，只有这样才能使 转化成功的细菌在有抗生素的LB平板上生长。】 10取100ul细胞直接在含50ug/mL Carbenicillin（短节西林）的LB培养基上铺平板，将平皿放置 37 oC温箱30min至液体被吸收。倒置平皿37 oC培养过夜，出现菌落。 【这些菌落为转化成功的菌落，而对照组应该没有菌落。在目的菌落的旁边有可能出现卫星菌落，这是因为亩的菌落的抗性基因似的菌落周围的抗生素失效，长出了转化为成功的菌 落。用短节西林因其对酸稳定、不易被细菌降解，所以可以降低卫星菌落的数量。 因为抗生素高温易失活，所以应等到LB600C时（热而不烫），加入抗生素。】

实验室离心机的选择和分类

实验室离心机的选择和分类 离心机是一种结构复杂的高速旋转机械，它是利用离心力，不同物质在离心场中沉淀速度的差异，对混合溶液进行快速分离的专门设备，是一种将装有样品溶液的离心管、瓶或袋韵转头置于离心轴上，利用转头绕轴高速旋转所产生的强大离心力，使样品中不同性质颗粒相互分离的特殊装置。，可以实现样品的分析、分离。 离心机自问世以来，历经低速、调整、超速的变迁，其进展主要体现在离心机设计和离心技术两方面，二者相辅相成。由于台式离心机结构简单，造价低，体积小，很快成为实验室的常规仪器，国内外知名离心机厂商几乎都生产台式离心机，如近几年来在我国比较活跃的德国Hheraeus，eppendof，Sigma，Hettich，Hermle，法国的Jouran，美国的Beckman，Sorvall，IEC，日本的Hitachi，Kukna，Sanyo／Mse等，国内的北京医用离心机厂、湖南凯达科学仪器有限公司、上海安亭科学仪器厂等。从转速看，台式离心机基本属于低速、高速离心机的范畴，因此，具有低速、高速离心机的特点。与落地式离心机相比，只不过只是尺寸和容量小一些。 离心机的式样和型号很多，有国产的和进口的，按用途可分为分析式离心机和制备式离心机；按转速可划分为： 普通离心机(低速)<8000r／min； 高速离心机8000 ～30000r／rain； 超速离心机30000 ～80000r／min； 超高速离心机>80000r／min； 按生物高分子量来选用离心机： 分子量>10。，用普通离心机和高速离心机；

分子量10 ～10。，用超速离心机； 分子量<10 ，用离心和超离心分离效果不好，必须采用另外的分离方法。 可以根据实验目的和实验需要，选择不同容量、不同转速、不同温度控制的离心机。例如，需要常温、微量、快速离心时，可使用手掌型离心机(LX—100型，江苏海门麒麟医用仪器厂生产)和微型离心机(DW一41型，韩国KOREA)；如需要的转速不大于16000rpm，可使用台式离心机(德国Hettich，MIKRO12—24型；做质粒DNA少量提取、cDNA提取实验，蛋白提取，及从植物中提取RNA时，转速需要12000—140000rpm，经常使用高速冷冻台式离心机(德国Hettich，16R型和32R型)、台式高速离心机(德国HettichMIKRO12—24型)及高速冷冻离心机(法国JOURN BR4i型)；在制备感受态细胞和大量提取质粒DNA时，经常使用到自动高速冰冻离心机(日本HITACHI，日立工机株式会社，20PR-52D型)和超高速冷冻离心机(美国Beckman A vantU一301)型；如需要大量离心，例50mL、100mL或100mL以上，且转速需要20000～70000rpm，则可以使用自动超速冰冻离心机(日本HITACHI，日立工机株式会社，70P一72型)。在上述离心机当中，比较先进的是美国Beckman A vanti J一301型超高速冷冻离心机，其性能较优越，集真空、高速和冷却于一身，可以用于大量的细胞、亚细胞、细菌、病菌的快速分离，是常见的实验室设备，通常将转速在5000 ～30000RPM(转／分钟)范围内的离心机称为高速离心机，Beckman A vanti J一301型离心机的最高转速是30000RPM，因此属于高速离心机的范围。

常用大肠杆菌感受态JM109,DH5a,BL21等的区别-用途-特征

常用大肠杆菌感受态JM109，DH5a，BL21等的区别 1：DH5a菌株 DH5a是一种常用于质粒克隆的菌株。E.coli DH5a在使用pU C系列质粒载体转化时，可与载体编码的β－半乳糖苷酶氨基端实现α－互补。可用于蓝白斑筛选鉴别重组菌株。 基因型：F-，φ80dlacZΔM15，Δ(lacZYA-argF)U169，deoR，recA1，endA1，hsdR17(rk-，mk+)，phoA，supE44，λ-，thi-1，gy rA96，relA1 2：BL21(DE3) 菌株 该菌株用于高效表达克隆于含有噬菌体T7启动子的表达载体（如pET系列）的基因。T7噬菌体RNA聚合酶位于λ 噬菌体DE3区，该区整合于BL21的染色体上。该菌适合表达非毒性蛋白。 基因型：F-，ompT，hsdS（rBB-mB－），gal，dcm（DE3） 3：BL21(DE3) pLy sS菌株 该菌株含有质粒pLy sS，因此具有氯霉素抗性。PLy sS含有表达T7溶菌酶的基因，能够降低目的基因的背景表达水平，但不干扰 目的蛋白的表达。该菌适合表达毒性蛋白和非毒性蛋白。 基因型：F-，ompT hsdS（rBB-mB－），gal，dcm（DE3，pLy sS ，C amr 4：JM109菌株 该菌株在使用pU C系列质粒载体进行DNA转化或用M13 phage载体进行转染时，由于载体DNA产生的LacZa多肽和JM09编码的La cZΔM15进行α－互补，从而显示β－半乳糖苷酶活性，由此很容易鉴别重组体菌株 基因型：recA1，endA1，gy r A96，thi－1，hsdR17，supE44，re lA1，Δ（lac－proA B）/F’[traD36，proAB+，lacIq，lacZΔM15] 5：TO P10菌株 该菌株适用于高效的DNA克隆和质粒扩增，能保证高拷贝质粒的稳定遗传。 基因型：F- ，mcr AΔ(mrr-hsd RMS-mcrBC)，φ80 ，lacZΔM15，△lacⅩ74，recA1 ，araΔ139Δ(ara-leu)7697，galU，galK ，rps，(Strr) endA1，nupG 6：HB101菌株 该菌株遗传性能稳定，使用方便，适用于各种基因重组实验 基因型：supE44，hsdS20（rB-mB－），recA13，ara－14，proA2，lacY1，galK2，rpsL20，xy l-5，mtl-1，le uB6，thi-1 7：M110或SCS110 大多数大肠杆菌菌株中含有Dam甲基化酶和Dcm甲基化酶，前者可以在GA TC序列中腺嘌呤N-6位上引入甲基，后者在CCA/TGC 序列的第一个胞嘧啶C-5位置上引入甲基。常用的菌株都会产生dam,dcm，从而受到甲基化的影响. 部分限制性内切酶对甲基化的DNA不能切割，如F baI和MboI等，一般生物公司提供的内切酶说明中均有说明。 大多数酶切位点的甲基化不影响切割，而有些会影响，如XbaI, BclI等。而且甲基化只发生在特定序列，以XbaI为例，只有在位点序列旁出现GA或TC，该XbaI位才会被甲基化。 而要解除这种限制修饰作用通常有两种方法： （1）选用上述酶的同功酶，如Sau3AI，DNA识别切割位点与MboI相同；但不受甲基化影响； （2）利用甲基化酶缺失的受体细胞进行DNA的制备，如E.coli JM110和链霉菌等，前者Dam和Dcm甲基化酶已敲出，而后者细胞内本就没有甲基化酶，从这些细胞中抽提的DNA就能被上述酶切割。 8：E.coli JM110 要排除dam,dcm甲基化的影响，需要用特定的dam-,dcm-的菌株，如JM110 如果由JM110或SCS110等甲基化缺失的菌株产生的质粒，则不会被甲基化. 各种感受态细胞的区别用途特征 Xl1-Blue菌株