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紫杉木霉ZJUF0986抗真菌活性代谢产物分离提取及其活性研究

M ycosystema

菌物学报15 May 2008, 27(3): 439-446

jwxt@https://www.wendangku.net/doc/825153281.html,

ISSN1672-6472 CN11-5180Q

章初龙1 王国平2 郑必强2 陈绍瑗1 林福呈1*

1浙江大学生物技术研究所杭州310029

2建德市大洋化工有限公司杭州311616

摘要：南方红豆杉Taxus chinensis var. mairei内生真菌紫杉木霉Trichoderma taxi菌株ZJUF0986发酵液对15种常见植物病原真菌具有很强的抑菌活性；用石油醚、乙酸乙酯和正丁醇对发酵液进行活性物质的提取分离，并通过硅胶柱层析和制备HPLC纯化，得到3个活性代谢产物Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ，其中主要活性代谢产物Ⅰ具有广谱高效抑制植物病原真菌的特点，特别是对灰葡萄孢Botrytis cinerea、立枯丝核菌Rhizoctonia solani、核盘菌Sclerotinia sclerotiorum具有很强的抑菌活性，其IC50为1.1mg/L。

关键词：内生真菌，发酵液，次生代谢产物

Separation and bioactive of antifungal metabolites of Trichoderma taxi ZJUF0986

ZHANG Chu-Long1 WANG Guo-Ping2ZHENG Bi-Qiang2 CHEN Shao-Yuan1 LIN Fu-Cheng1*

1Institute of Biotechnology, Zhejiang University, Hangzhou 310029, China

2Jiande Dayang Chemical CO., LTD, Hangzhou 311616, China

Abstract: Fermentation broth of endophytic fungus Trichoderma taxi ZJUF0986 has high antifungal activity to the common 15 species of phytopathogenic fungi. Three bioactive metabolites I, II and III were obtained by extracted with petroleum ether, ethyl acetate and n-butanol and subsequent silica gel column chromatography and preparative HPLC. Among them, compound I, the main metabolite, has strong broad-spectrum antifungal

基金项目：浙江省重大科技攻关项目（No. 2006C12008）

*Corresponding author. Tel: 0571-********; E-mail: fuchenglin@https://www.wendangku.net/doc/825153281.html,

收稿日期：2007-09-28，接受日期：2008-01-03

activity, especially to Botrytis cinerea, Rhizoctonia solani and Sclerotinia sclerotiorum with IC50 1.06, 1.08 and 1.13 mg/L, respectively.

Key words: endophytic fungi, fermentation broth, secondary metabolite

植物病害每年对农作物产量造成巨大损失，尽管控制植物病害的方法和措施多种多样，但杀菌剂在植物病害综合防治中仍占有重要的地位。目前常用的很多化学杀菌剂具有广谱、高效、低毒的特点，显著地提高了杀菌剂控制植物病害的效果。然而由于抗药性问题（如多菌灵等苯并咪唑类杀菌剂）以及某些化学合成农药对环境、食品累积性污染等问题比较突出，人们对生物源农药，特别是从天然植物、动物及微生物中寻找和开发新型杀菌剂抱有很大希望。

从天然产物中发现新型先导化合物，是新药创制的重要途径。微生物是自然界中天然产物的主要来源，植物内生真菌作为其中的一个重要类群，是相对较新的研究领域。植物内生真菌是一类长期生长于健康植物内部与植物相互作用的真菌，其次生代谢产物常含有多种活性物质，如ambuic acid（Li et al. 2001）、cryptocandin（Strobel et al. 1999）、cryptocin （Li et al. 2000）、hydroxy-jesterone（Li & Stroble 2001）、isopestacin（Stroble et al. 2002）、jesterone（Li & Stroble 2001）和pestacin（Harper et al. 2003）等对稻梨孢菌Pyricularia oryzae、核盘菌Sclerotinia sclerotiorum、灰葡萄孢Botrytis cinerea、终极腐霉Pythium ultimum等多种植物病原真菌有强烈的抑制作用。

作者从南方红豆杉Taxus chinensis var. mairei内生真菌中分离到一种木霉：紫杉木霉Trichoderma taxi C.L. Zhang, F.C. Lin & C.P. Kubicek（Zhang et al. 2007）。前期研究已发现紫杉木霉菌株ZJUF0986具有抗真菌活性（傅科鹤等2006）。本文通过对菌株ZJUF0986发酵液的活性谱筛选确定对其敏感的病原菌，并通过活性追踪分离纯化其活性代谢产物，进一步对分离纯化的活性成分进行抑菌谱测定，可为紫杉木霉生物活性物质开发成为生物源新型杀菌剂奠定基础。

1材料与方法

1.1菌株

1.1.1试验菌株：紫杉木霉Trichoderma taxi ZJUF0986，本实验室保存。

1.1.2供试病原菌：链格孢Alternaria alternata（烟草赤星病菌）、灰葡萄孢Botrytis cinerea （灰霉病菌）、蚕豆葡萄孢Botrytis fabae（蚕豆赤斑病菌）、圆形刺盘孢Colletotrichum orbiculare（黄瓜炭疽病菌）、泻根亚隔孢壳Didymella bryoniae（甜瓜蔓枯病菌）、褐孢霉Fulvia fulva（番茄叶霉病菌）、尖孢镰刀菌黄瓜专化型Fusarium oxysporum f.sp. cucumber （黄瓜枯萎病菌）、指状青霉Penicillum digitatum（柑桔绿霉病菌）、柿盘多毛孢Pestalotia diospyri（柿叶枯病菌）、稻梨孢菌Pyricularia oryzae（稻瘟病菌）、终极腐霉Pythium ultimum （猝倒病菌）、立枯丝核菌Rhizoctonia solani（水稻纹枯病菌）、核盘菌Sclerotinia sclerotiorum（茄子菌核病菌）、齐整小核菌Sclerotium rolfsii（白绢病菌）、大丽轮枝菌

Verticillium dahliae（黄萎病菌），本实验室保存。

1.2试剂

乙腈为进口色谱纯，其它所用试剂均为国产分析纯。

1.3培养基

马铃薯葡萄糖琼脂（potato dextrose agar，PDA）；MID培养基（g/L）：蔗糖30.00g，蛋白胨1.00g，酵母粉0.25g，酒石酸铵5.00g，Ca(NO3) 2 0.28g，KNO3 0.08g，KCl 0.06g，MgSO4·7H2O0.36g，NaH2PO4·H2O 0.02g，FeCl3·6H2O 2.0mg，MnSO4·H2O 5.0mg，ZnSO4·7H2O 2.5mg，H3BO3 1.4mg，KI 0.7mg，pH 5.5。

1.4菌株ZJUF0986发酵液制备及抑菌活性测定

将生长旺盛的紫杉木霉ZJUF0986菌株接种至MID培养基中，28℃、180r/min振荡培养三周。过滤除去菌丝体及其它固体杂质，再离心收集发酵液。发酵液经0.22μm微孔滤膜过滤除菌后，采用菌丝生长速率法测定发酵液的抑菌活性。

1.5发酵液活性次生代谢产物分离提取及纯化

1.5.1活性次生代谢产物分离提取：分别将500mL发酵液与500mL石油醚、乙酸乙酯、水饱和正丁醇分三次进行萃取，收集萃取相（有机相）和萃余相（水相）。萃取相浓缩至干，用甲醇溶解后定容至5mL，采用菌丝生长速率法测定抑菌活性。萃余相在80℃/-0.08Mpa 的条件下进行蒸发，回收萃取剂后定容至500mL，经0.22μm微孔滤膜过滤，采用菌丝生长速率法测定抑菌活性。并用高效液相色谱仪（美国Waters）对萃取相和萃余相进行组分分析。分析条件：色谱柱为C18柱（sunfire C18 5μm 4.6 × 250mm），流动相为乙腈:水（V/V）=3:2，流速1.0mL/min，检测波长为193nm。

1.5.2活性次生代谢产物纯化：石油醚粗提物用石油醚溶解，去离子水反萃取，有机相中加入无水硫酸钠干燥，过滤后50℃减压浓缩，得无色粘稠物备用。将0.5g无色粘稠物用氯仿溶解过滤后拌入H60型薄层层析硅胶，挥干溶剂后装柱，以不同梯度的氯仿/甲醇流动相进行洗脱。将收集的各单位洗脱液分别浓缩，并配制成甲醇溶液，采用高效薄层层析色谱（TLC）追踪斑点，氯仿-甲醇最优化展开剂系统进行分离，以紫外光（254nm）照射或碘蒸汽显迹，配合滤纸片扩散法进行抑菌活性追踪测定，将斑点位置相同并有抑菌活性的样品进行合并，分离纯化得到活性代谢产物。乙酸乙酯粗提物采用上述硅胶柱层析法进行初步分离纯化，再用反相高效液相色谱法制备纯化。色谱柱为半制备C18柱（sunfire prep C18 5μm 10 × 250mm），流动相为乙腈:水（V/V）=3:2，流速4.0mL/min，检测波长为193nm。分离收集组分，按滤纸片扩散法进行抑菌活性追踪测定。

1.6 抑菌活性测定

1.6.1菌丝生长速率法：用无菌水将供试样品稀释成5个梯度后加入到PDA中，混匀后倒入直径60mm的培养皿中制成有毒平板。每个梯度3个重复，并以无菌水为空白（CK）对照。将活化的供试病原菌菌饼（直径5mm）接种至有毒平板中央，25℃培养至对照皿菌落即将长满平皿时，用十字交叉法测量各处理皿的菌落直径。用下式计算抑制率：

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抑制率（%）=1005)

对照皿菌落平均直径()处理皿菌落平均直径对照皿菌落平均直径(×??

利用DPS 统计软件，采用剂量对数-抑菌率机值法计算求得半抑制稀释倍数（ID 50）或半抑制浓度（IC 50）及毒力回归方程。

1.6.2滤纸片扩散法：以终极腐霉、立枯丝核菌和灰葡萄孢3种病原菌作为指示菌，将活化的指示菌菌饼（直径5mm ）接种至PDA 平板上进行初步培养，待菌落生长至直径20mm 时备用。取5μL 各组分样品的甲醇溶液置于滤纸圆片（Φ5mm ）上，略微风干后，置于上述供试PDA 平板菌落边缘。以甲醇溶液作空白对照，各处理3个重复，25℃培养2-3d 后测量抑菌圈直径。

2结果与分析

2.1 紫杉木霉ZJUF0986发酵液的抑菌活性

ZJUF0986发酵液对不同病原真菌的抑菌活性见表1。ZJUF0986发酵液原液稀释5倍后对所选择的15株供试植物病原真菌的抑制率都达到70%以上，抑制率在80%以上的占93.3%，抑制率在90%以上的占53.3%，特别是对立枯丝核菌、灰葡萄孢、柿盘多毛孢、终极腐霉、核盘菌、蚕豆葡萄孢都能全部抑制，说明ZJUF0986的发酵液对植物病原菌具有抗菌活性强、抗菌范围广的特点。

表 1 紫杉木霉ZJUF0986发酵液对不同病原真菌的抑菌活性

Table 1 Inhibitory activity of Trichoderma taxi ZJUF0986 fermentation broth to phytopathogenic fungi

不同稀释倍数抑菌率（%）

Inhibition percentage of different dilution factor

病原菌

Phytopathogenic fungus

×5 ×20 ×40 ×80 ×160

半抑制稀释倍数

ID 50

链格孢Alternaria alternata 85.4 43.8 14.6 10.4 4.2 15.9 灰葡萄孢Botrytis cinerea 100 86 74 58 44 111.2 蚕豆葡萄孢B. fabae

100 57.4 40.4 31.9 21.3 33.9 圆形刺盘孢Colletotrichum orbiculare 95.3 30.2 18.6 11.6 4.7 15.1 泻根亚隔孢壳Didymella bryoniae 91.7 52.1 31.3 20.8 12.5 23.4 褐孢霉Fulvia fulva 84 38 22 14 6 15.4 尖孢镰刀菌黄瓜专化型 71.1 44.4 35.6 15.6 8.9 15.4 指状青霉Penicillum digitatum 85.4 52.1 41.7 31.3 25 28.9 柿盘多毛孢Pestalotia diospyri 100 68.9 34 24 14 32.1 稻梨孢菌Pyricularia oryzae 83.7 34.9 23.3 18.6 11.6 15.2 终极腐霉Pythium ultimum 100 60.5 41.9 27.9 14 9.3 立枯丝核菌Rhizoctonia solani 100 89.4 78.7 61.7 46.8 135.5 核盘菌Sclerotinia sclerotiorum 100 83.7 71.4 53.1 38.8 96.5 齐整小核菌Sclerotium rolfsii 83.3 32.6 23.3 18.6 11.6 14.6 大丽轮枝菌Verticillium dahliae

85.4 41.7 22.9 16.7 8.3

16.8

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2.2 紫杉木霉菌株ZJUF0986次生代谢产物提取纯化

500mL 发酵液用石油醚、乙酸乙酯、水饱和正丁醇萃取分别得浸膏为0.11g （淡黄色特殊气味）、0.185g （淡黄色香味）、0.532g （棕黄色刺激性气味）。萃取物对灰葡萄孢的抑菌活性测定结果如表2所示：抑菌活性物质均能被石油醚、乙酸乙酯和正丁醇所提取，乙酸乙酯萃取相的抑菌活性相对较强，但是从半抑制稀释倍数来看它们之间也没有明显的差别；石油醚萃余相抑菌活性略高于用乙酸乙酯和正丁醇萃取后的活性，表明发酵液中可能含有少部分高极性的抑菌活性物质。通过液相色谱检测分析，发现三种溶剂的萃取物中均含有保留时间11.384min 的主要吸收峰，石油醚萃取相（图1）中其它成分较少，乙酸乙酯和正丁醇的萃取相中其它成分较多，且三种溶剂的萃余相中几乎检测不到11.384min 的吸收峰（图2）。结合活性测定表明：保留时间11.384min 的吸收峰即是其主要活性成分。

表2 发酵液用3种有机溶剂萃取的效果

Table 2 Extracting effect of Trichoderma taxi ZJUF0986 fermentation broth by three organic solvent

抑制率（%）

Inhibition percentage

半抑制稀释倍数

ID 50 稀释倍数 Dilution Factor

Petroleum ether

Ethyl acetate

N-butanol

Petroleum ether

Ethyl acetate

N-butanol

200 100.0 100.0 100.0 400 100.0 100.0 100.0

800 93.2 95.2 93.9 1600 85.0 86.4 85.7 3200 73.5 75.5 74.2

7890.6 8341.5

8030.8

图1石油醚提取物HPLC 图谱

Fig. 1 HPLC chromatography of petroleum ether extracts.

图2石油醚萃余相HPLC图谱

Fig. 2 HPLC chromatography of fermentation broth after extraction by petroleum ether.

石油醚粗提物用去离子水反萃取后为特殊气味无色粘稠状，按极性从小到大顺序，用不同梯度的氯仿/甲醇=（1/0.2-1）为洗脱剂进行梯度洗脱，以50mL为单位收得30份洗脱液。各组份的测试结果为：1-10号及23-30号紫外光或碘蒸汽显迹均无斑点，对所选用的指示菌未表现出任何抑菌活性；11-15号、19-22号均只有1个具有紫外吸收的斑点，11-15号对三种指示菌都具有很强的抑菌活性，但19-22号却没有表现出抑菌活性；16-18号有显色较弱的两条斑点、同时也都对指示菌有较弱的抑菌活性。11-15号合并浓缩并在-0.085MPa真空干燥器中抽滤24h后得无色粘稠油状物0.35g，用色谱纯的乙腈溶解样品，HPLC检测。从HPLC图谱（图3）可以看出，合并后的11-15号组分在目标检测波长下

只有保留时间为11.384min的一个吸收峰，因此11-15号组分是其主要活性物质Ⅰ。

Fig. 3 HPLC chromatography of purified bioactive metabolite Ⅰ.

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乙酸乙酯粗提物柱层析时，以50mL 为单位收集40份洗脱液，1-10号、23-28号、34-40

号紫外光或碘蒸汽显迹均无斑点，对所选用的指示菌未表现出任何抑菌活性；11-15号、

19-22号、29-33号均有紫外吸收的斑点，并具有抑菌活性；16-18号有显色较弱的斑点，也有较弱的抑菌活性。11-15号、19-22号和29-33号以乙腈:水=3:2（V/V ）为流动相，用

Waters Sunfire C18 柱制备纯化，分别得活性物质Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ。活性物质Ⅰ都能被石油醚、乙酸乙酯萃取，且粗提物中Ⅰ的含量基本相同，可见两种

有机溶剂对活性物质Ⅰ的提取效果相当，但乙酸乙酯粗提物除了活性物质Ⅰ外，还有Ⅱ和Ⅲ两种不同的物质，但是含量比较少，且对所选指示菌的抑制作用也没有活性物质Ⅰ强。2.3 活性物质Ⅰ对病原真菌的抑菌性

活性物质Ⅰ对供试的15种植物病原真菌都具有很强的抑制作用，对立枯丝核菌、灰葡萄孢和核盘菌三种病原真菌的活性最强，半抑制浓度IC 50分别为1.1μg/mL （表3）

，结果与发酵液抑菌性测试结果相似，也说明发酵液中主要的抑菌成分就是活性物质Ⅰ。

表3 活性代谢产物Ⅰ对不同病原真菌的抑菌活性

Table 3 Inhibitory activity of metabolite Ⅰ to phytopathogenic fungi

病原菌

Phytopathogenic fungus

回归方程

Regression

equation

相关系数

半抑制浓度

IC 50/ (mg/L)

95%置信限

95% Fiducial limit / (mg/L)

链格孢Alternaria alternata y =

6.6430-0.8260x 0.9946 41.0 18.2-75.5 灰葡萄孢Botrytis cinerea y =

9.9645-1.3885x 0.9933 1.1 0.4-2.2 蚕豆葡萄孢B. fabae

y =

9.5728-1.5959x 0.9718 5.5 0.2-30.8 圆形刺盘孢Colletotrichum orbiculare y =

10.5655-2.28840.9856 14.8 3.6-38.3 泻根亚隔孢壳Didymella bryoniae y =9.1253-1.5451x 0.9951 8.6 3.0-18.9 褐孢霉Fulvia fulva y =

9.1805-1.6293x 0.9966 10.9 4.9-20.5 尖孢镰刀菌黄瓜专化型

Fusarium oxysporum f. sp. cucumerinum y =7.5428-1.0762x 0.9613 7.3 0.2-97.6 指状青霉Penicillum digitatum y =

8.1849-1.4930x 0.9967 29.4 17.1-46.1 柿盘多毛孢Pestalotia diospyri y =8.7242-1.133510.9713 6.5 1.3-39.3 稻梨孢菌Pyricularia oryzae y =

8.4123-1.4252x 0.9776 16.1 1.5-59.6 终极腐霉Pythium ultimum y =

11.1785-2.34400.9949 9.3 3.9-18.3 立枯丝核菌Rhizoctonia solani y =9.2046-1.2471x 0.9725 1.1 0.07-9.9 核盘菌Sclerotinia sclerotiorum y =

9.6309-1.3043x 0.9885 1.1 0.3-3.2 齐整小核菌Sclerotium rolfsii y =

8.8382-1.5698x 0.9525 14.4 0.2-84.1 大丽轮枝菌Verticillium dahliae

y =8.9973-1.5924x

0.9963 12.4

5.5-23.4

3讨论

植物内生真菌是一类非常丰富的资源，其代谢产物涉及到多方面的应用价值。红豆杉

是第四纪冰川后遗留下来的世界珍稀濒危植物，红豆杉内生真菌除了产生紫杉醇（Stierle et al. 1993）以外，通过抗真菌、抗肿瘤活性筛选（Huang et al. 2001），发现了一种产生新细胞毒素Brefeldin A的内生真菌（Wang et al. 2002）。傅科鹤等（2006）对南方红豆杉内生真菌的抗植物病原真菌的活性进行了筛选，获得一些具有抗菌活性的菌株。

木霉是一个很重要的生防真菌，生防机制包括重寄生、抗生、竞争等方面，其产生的抗生物质在生防中有很重要的作用。本研究从紫杉木霉菌株ZJUF0986分离纯化获得3个具有抑菌活性的代谢产物，其中活性代谢产物Ⅰ对多种植物病原真菌有较强的抑制作用，而且在发酵液中含量最高，分离提取较简单，因此具有很好的开发和利用价值，进一步明确这些活性代谢产物的化学结构，可为开发和利用紫杉木霉产生的抗生活性物质进行工业化发酵生产提供理论依据。

[REFERENCES]

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[附中文参考文献]

傅科鹤，章初龙，刘树蓬，陈绍瑗，林福呈，2006. 南方红豆杉内生真菌的抗菌活性. 植物保护学报，33(3)：268-272