宁夏马铃薯脱毒种薯生产及病毒检测技术
宁夏马铃薯脱毒种薯生产及病毒检测技术
的现状和发展途径探究
聂峰杰1*张丽1宋玉霞1 张国辉2詹红3
（1、宁夏农业生物技术重点实验室，宁夏银川 750002；2、宁夏固原市农科所，宁夏固原 750006；
3、宁夏马铃薯脱毒种薯繁育中心，宁夏平吉堡 750024）
摘要：病毒病是马铃薯的重要病害，严重影响马铃薯产量和品质，造成马铃薯种性退化。因马铃薯是无性繁殖作物，病毒病的防治无有效药剂，通过培育脱毒种薯能够有效解决由病毒积累引起的一系列问题。本文主要介绍了国内外马铃薯脱毒种薯生产的关键技术、病毒检测方法及其应用、宁夏马铃薯脱毒种薯生产和病毒检测现状；讨论了不同病毒检测方法的优缺点和应用前景，为宁夏马铃薯脱毒种薯生产及病毒检测的发展提出了建议。
关键词：马铃薯；脱毒种薯；病毒检测
中图分类号：S-1 文献标识码：A
The development way to explore and current situation of potatoes virus-free seed breeding and
virus detection technology in Ningxia
Nie Feng-jie1 Zhang Li1Song Yu-xia1Zhang Guo-hui2Zhan Hong3
(1、Key Lab of Agricultural Biotechnology of Ningxia, Yinchuan , Ningxia750002; 2、Guyuan Institute of Agricultural Sciences, Guyuan, Ningxia 756000;3、Ningxia Propagation Center of Virus-free Seed Potatoes, Pingjipu , Ningxia 750024)
Abstract: Virus disease can cause declining of the quality and production and sex degradation of Solanum tuberosum L, which is one of the important disease of the S. tuberosum L .Because of asexual reproduction, chemical control is invalid, the most effective way to control virus disease is virus-free seed breeding. This article mainly introduced the domestic and overseas key technology of potatoes virus-free seed production, the methods and applications of virus detection, the current situation of potatoes virus-free seed breeding and virus detection technology in Ningxia; discussed
基金项目：宁夏农林科学院创新先导项目NKYJ-13-14
第一作者、通讯作者：聂峰杰，女，1985年生，籍贯甘肃，职称：研究实习员，学历：研究生，学位：硕士，主要从事植物病害综合治理研究。通信地址：宁夏银川市黄河东路590号宁夏农林科学院农业生物技术研究中心，邮编：750002，Tel: 0951-*******，Email:niefengjie@https://www.wendangku.net/doc/8a6171758.html,。
收稿日期：修回日期：
the advantages and disadvantages of different methods of virus detection, prospected its application, put forward the suggestions for progress of potatoes virus-free seed production and virus detection in Ningxia.
Key words:Solanum tuberosum L; potatoes virus-free seed; virus detection
马铃薯( Solanum tuberosum L.) 是世界上重要的农作物之一，种植面积仅次于小麦、水稻、玉米和大麦，居世界第 5 位。病毒病是马铃薯在生长期间的重要病害，植株感染病毒后表现出卷叶、花叶和束顶等几种类型，具体表现出叶片失绿、顶部叶片变色、卷曲坏死、卷缩、植株矮小等症状，块茎表现为龟裂、变小、变尖、内部网状坏死等症状，严重影响其种用价值，一般会引起减产20-30%，严重时减产80%以上，病情随着病毒积累逐年加重，最后块茎失去种用价值。我国发现的马铃薯病毒有7种：即X病毒（PVX）、Y病毒（PVY）、S病毒（PVS）、卷叶病毒（PLRV）、A病毒（PV A）、皱缩花叶病毒（PVM）、古巴花叶病毒（PAMV），1种类病毒：纺锤形块茎类病毒（PSTVd）。由于马铃薯系无性繁殖，一旦感染病毒无有效药剂防治，病毒在薯块内不断地积累导致马铃薯品质、产量下降。经过脱毒处理的马铃薯可以恢复原品种的生物学特性，达到复壮的目的，因此，通过培育脱毒种薯来预防病毒病，解决由病毒造成的损失是目前最快速有效的方法。
马铃薯是宁夏优势主导产业，2011年种植面积达15万hm2，其中脱毒种薯种植面积占65%，是宁夏种植面积第一大作物。“十二五”期间，宁夏将把中部干旱带和南部山区建成国家重要马铃薯种薯基地，实现种薯脱毒化率达90%，种植标准化率达到75%。现已建成农垦良种繁育中心、西吉县、海原县、固原市马铃薯改良分中心等5个脱毒快繁中心，共建设原种基地600多hm2，生产原种2万吨；建设一级种基地1万多hm2，生产一级种25万吨，马铃薯脱毒原种生产能力达到1亿粒/年。宁夏脱毒种薯生产量虽然达到一定规模，但是与国内外相比，马铃薯脱毒种薯繁育体系起步晚、底子薄、基础弱，生产中忽视了脱毒种薯的质量监测，致使种薯脱毒率低，单产水平不高，严重影响宁夏马铃薯种薯产业的发展。因此，进一步加强和引进高效准确的脱毒种薯繁育技术和病毒检测技术，从源头控制脱毒种薯生产质量、提高生产效益是宁夏马铃薯脱毒种薯生产中亟待解决的问题。
1马铃薯脱毒种薯繁育的关键技术
培育脱毒马铃薯是解决由病毒引起马铃薯种性退化的主要手段。由于植物茎尖分生区细胞增殖速度比病毒向上运输的速度快，寄主体内的病毒分布不均匀，生长点附近的病毒含量很低，分生组织内甚至不含病毒[1]。因此，剥取不含病毒的茎尖分生组织，进一步培育可以获得无病毒植株。茎尖脱毒技术是目前应用最广泛的脱毒方法，已经在马铃薯、甘蔗、甘薯
等30多种作物上广泛应用。
1.1马铃薯茎尖脱毒培养关键技术
选择田间生长健壮、品种特性典型一致的马铃薯植株块茎，自然度过休眠期或人工打破休眠后，将薯块在室内催芽、消毒；在无菌条件下，剥离茎尖分生组织，接种培养约4个月后，长成试管苗；试管苗经过病毒检测，鉴定出确实不带病毒的脱毒苗，经过切段快繁生产脱毒试管苗。经过脱毒的马铃薯既恢复了原品种的特性，达到了复壮的目的，同时也将真菌和细菌等病原物一并脱除，在一定时期内，没有病毒、细菌和真菌病害，生活力特别旺盛。
1.1.1影响茎尖脱毒的因素
1.1.1.1 茎尖大小
由于病毒仅存在于维管系统组织中，只有无维管束的分生组织内无病毒，因此，在茎尖培养中，剥取的茎尖越小，带毒可能性越小，但是茎尖的培养成活率变低，一般要求茎尖长度小于1mm。Mellor等[2]的研究结果表明，PVX病毒的脱除与茎尖大小相关，茎尖越小，病毒含量越少，脱毒率就越高，但小的茎尖在培养过程中不易成苗，影响了脱毒苗的成活率。
1.1.1.2高温处理
高温处理的原理是病毒衣壳蛋白受热变性后病毒失去活性，由于不同病毒的衣壳蛋白分子结构不同，在寄主体内正常蛋白的含量、病毒浓度、高温处理时间等外部因素的影响下，不同病毒的抗热能力不同。Kassanis[3]研究发现，将马铃薯块茎经过37.5℃高温处理20d后，部分卷叶病毒自然消失，产生了无卷叶症状的植株。部分通过单一茎尖剥离难以脱除的病毒，如PVX和PVS，经过高温处理可显著提高脱毒率。Morel等[4]研究发现，单一的茎尖组织培养对PVY和PV A的脱毒率达85%~90%，但对PVX和PVS的脱毒率却小于1%，当经过热处理后，茎尖培养PVS的脱毒率提高至11.4%。由此证明了热处理能使病毒失活，如在茎尖培养之前对取材进行热处理，可更加提高脱毒的效果。
1.1.1.3培养基成分
马铃薯茎尖培养的基础培养基为MS培养基，适当提高其中的铵盐和钾盐的浓度有助于提高茎尖的成活率[5]。因植物生长调节剂的种类和浓度直接影响茎尖的生长，加之马铃薯不同品种对激素反应不同，所使用的激素种类和浓度要做相应的调整。此外，张辅达[6]的研究结果表明，在适宜的培养条件，要根据马铃薯茎尖组织在培养过程中的不同生长发育类型改变生长调节剂的浓度及处理时间才能提高茎尖成活率。培养基中加入病毒抑制剂同样可提高茎尖培养的脱毒率，Wambugu F.M.等发现，在培养基中加入20 mg/L病毒唑后，89%的马铃薯茎尖再生植株排除了PVY，90%的再生植株排除了PVX。Klein R.E等[7]的研究也发现，
培养基中加入10 mg/L病毒唑后，80%的马铃薯茎尖再生植株除去了PVX。
1.1.1.4培养条件
剥离出的茎尖接种到培养基后在适宜的温度和光照下才能正常生长，通常温度控制在20-25℃最为适宜，最适光照强度为2000-3000Lx，光照时间为12h/d，自然散射光照射下培养的脱毒试管苗生长更加健壮。
1.1.2马铃薯病毒的脱毒难易程度
马铃薯不同病毒的脱除难易程度不同，同样大小的茎尖，类病毒PSTVd最难脱除，在各种病毒中以PVX和PVS最难脱除，常见病毒脱除的难易顺序为PSTVd 、PVS 、PVX、PVM 、PAMV 、PVY 、PV A 、PLRV。
1.2 宁夏马铃薯脱毒种薯生产现状
宁夏的脱毒种薯繁育主要采取单一的茎尖剥离、组织培养的方法诱导出试管苗，脱毒试管苗在无菌条件下，采用固体、液体培养基相结合的方法扩繁基础苗，在防虫网室栽植或封闭温室扦插，生产出原原种（脱毒小薯）。用原原种在自然隔离室网室隔离条件下生产原种，用原种以后逐级生产一级种和二级种。
2 马铃薯脱毒种薯的病毒检测技术
因脱毒培养各个环节存在误差，经过脱毒的马铃薯植株必须经过严格的病毒学检测，确定不带病毒后才能进一步扩繁。因此，在马铃薯病脱毒种薯培育过程中，准确可靠的病毒检测方法与高效的脱毒方法同等重要。随着植物病毒分类体系趋于完善，各种病毒鉴定技术不断发展，病毒检测先后经历了生物学检测技术、免疫学检测技术和分子生物学检测技术三个阶段。
2.1 国内外常用的病毒检测方法
2.1.1生物学检测技术
生物学检测技术主要通过寄主植物和病毒的传播方式、寄主表现出的病症对植物病毒病进行诊断，通过测定病毒寄主范围、观察鉴别寄主反应，对病毒的稀释限点、钝化温度、体外存活期等离体性状和传播途径的测定来进行病毒种类鉴定。指示植物法是利用各个病毒不同的症状和传播方式，通过媒介昆虫或摩擦将待测植株的汁液接种在对病毒敏感的指示植物上，观察指示植物症状确定待测植株内有无病毒以及带何种病毒。吴凌娟[8]等将病毒接种指示植物，经过培养对马铃薯PVX的寄主范围、症状表现从形态学角度进行了研究。
生物学检测技术不仅可以检测病毒，还可提供病毒形态学上的毒力指标是早期重要的检测方法，具有准确、直观的特点，但是某些特定鉴别寄主不易得到，样品量大时需要大面积
的温室，鉴定过程操作繁冗，所需周期长，几种病毒复合感染后会表现不同的症状，环境不同指示植物也会表现不同的症状。因此，不能作为最终鉴定结果，也无法适应生产上快速检测的需要。
2.1.2免疫学检测技术
植物病毒的核蛋白是由蛋白质和核酸组成的一种很好的抗原，抗原与特异性的抗体结合后失去活性的过程叫做免疫反应，也叫做血清反应。由于不同病毒产生的抗血清特性不同，根据血清学原理研究出了许多病毒鉴定检测的方法，目前应用最广泛的免疫学检测法是酶联免疫吸附法（Enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）。胶体金免疫层析检测法（Gold Immuno chromatography Assay，GICA）是近年来发展起来的一种将金标记代替了ELISA中的酶标记的一种快速检测方法，有着广阔的应用前景。
2.1.2.1酶联免疫吸附法（ELISA）
20世纪70年代初Clark等[9]报道了ELISA检测植物病毒的基本方法，该方法非常灵敏，病毒检出浓度为10-100ng/mL，自此ELISA被广泛应用于植物病毒检测中。其主要原理是免疫酶法与固相吸附技术相结合，使酶分子和免疫球蛋白分子在不影响其活性和反应条件下，共价结合形成酶标记抗体。酶标记抗体可直接或通过免疫桥与包被在固相支持物上待测定的抗原或抗体特异性结合，再通过酶底物作用产生有颜色或电子密度高的可溶性产物，借以显示出抗体的性质和数量[10]。近年来，在原基础上改进衍生出了一些新的检测方法，如斑点免疫吸附、伏安酶免疫分析、快速ELISA等。白艳菊等[11]分别用快速DAS-ELISA法和常规DAS-ELISA法检测了PVX、PVY、PVS、PVM、PLRV等五种病毒，比较了两种方法的实用性和准确度。刘卫平等[12]采用快速ELISA法检测了马铃薯PVX、PVY病毒。
ELISA灵敏度高、特异强、经济简便、易于观察适合于大量样品的检测。ELISA的缺点是：抗体的制备过程复杂耗时；一次只能检测一种病毒，检测多种病毒时灵敏度和准确率降低；检测病毒时会出现假阳性反应，准确性降低；病毒浓度低当年不显症时，无法检测；无法检测类病毒。
2.1.2.2免疫胶体金技术（GICA）
免疫胶体金技术（GICA）利用抗原抗体结合的免疫学原理，以胶体金为示踪标志物，有效地检测病毒抗体，是一种快速、简便、结果容易判定的新型免疫标记技术，已经在马铃薯病毒检测中得到了应用。魏梅生等[13]研制了马铃薯PVX和PVY的胶体金免疫层试纸条，10min内可检测出病毒，与ELISA验证结果吻合。朱云芬等[14]利用免疫试纸条快速检测了马铃薯PVY，并用RT-PCR方法验证了试纸条的准确性。
利用GICA技术制成的胶体金试纸条具有以下优点：试剂和样本用量极小，可低至1~2μL，且样品无需特殊处理；操作简单，不需仪器，适用于肉眼水平的免疫检测，适于现场检测应用；敏感性和特异性高，抗原和抗体都可以检测；检测速度快，几分钟之内就可以得出检测结果；实验结果可以长期保存，这使其在马铃薯脱毒种薯的病毒检测上有很大的应用潜力。
2.1.3分子生物学检测技术
由于免疫学检测技术的检测目标是蛋白，仅检测到蛋白不能肯定病毒有无生物活性，而分子生物学检测目标是具有侵染性的核酸，因此检测结果较免疫学检测技术更为可靠。近年来，随着分子生物学技术的快速发展，很多日趋成熟的检测技术已经应用于马铃薯病毒检测中。有专为检测类病毒设计出的聚丙烯酰胺凝胶电泳法（Polyacrylamide Gel Electrophoresis, PAGE）、核酸杂交(Nucleic acid hybridization，NASH)技术、医学上病毒检测常用的指示分子-核酸序列扩增(Molecular Beacon-Nucleic acid sequence based amplification，NASBA)技术以及目前应用最广泛的反转录-聚合酶链式反应(Reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR)技术等。
2.1.
3.1聚丙烯酰胺凝胶电泳法（PAGE）
聚丙烯酰胺凝胶电泳法是检测类病毒的重要手段，其网状结构有分子筛的效应，在电泳过程中可以保持蛋白质的完整状态，根据蛋白质的分子量大小、形状、附带的电荷呈梯度分开。Morris和Pfannenstiel为了筛选马铃薯核心种薯建立了检测类病毒的聚丙烯酰胺凝胶电泳法。1986年，Schumacher建立了双向聚丙烯酰胺凝胶电泳法（R-PAGE），利用了类病毒核酸在高温条件下迁移、变性变慢的特点，提高了鉴定准确性。Singh[15、16]利用R-PAGE 法检测区分了休眠薯块中PSTVd的弱系、中间系和强系，利用该方法检测PSTVd弱株系灵敏度达到了核算杂交技术反应的水平。
PAGE可检测到800ng的类病毒，灵敏度较高，在一般试验条件下，只需一套电泳设备，操作简便，并可以区分类病毒的强系和弱系，但是一次只能检测十几个样品，不适合大量样品的检测。
2.1.
3.1 核酸杂交检测技术（NASH）
由于类病毒不具有外壳蛋白，用免疫学方法无法检测，Owens和Diener[17]1981年设计了核酸杂交检测技术用于类病毒PSTVd的检测。该方法将一段病毒核酸单链以某种方式加以标记制成探针，与互补的待测样品核酸杂交，根据互补的核酸单链可以相互结合的原理，带有探针的杂交核酸能指示病原的存在。Querci[18]用该方法成功的检测了PVX 不同分离株系。
研究发现核酸杂交检测技术中所用探针越大，灵敏度越高[19]。Yamashita等[20]研究表明NASH 灵敏度可以达到3.25kb的探针检测到5pgRNA，比ELISA更灵敏，检测结果更可靠。
NASH较之ELISA更灵敏，更可靠，更适宜于检测大量样品，在检测类病毒时灵敏度和精确性高于PAGE法，但是对探针的分离比较困难且检测过程中采用的同位素标记有放射性污染和安全问题。NASH不易检出休眠种薯中的病毒，尤其是检测休眠种薯中的PVY 和PLRV两种病毒时灵敏度不高[21]。
2.1.
3.2 指示分子NASBA技术
NASBA技术是医学上检测RNA病毒的主要方法，适宜于马铃薯病毒的常规检测，其原理是以RNA转录为基础的等温扩增方法，适用于RNA分子扩增，在有双链DNA存在的情况下也可实现对单链RNA的特异扩增，一般可通过分子杂交判断扩增结果，具有高度的特异性。Klerks等[22]利用NASBA技术检测马铃薯块茎上PVY和PLRY病毒，最低检出量为10μg。
NASBA检测技术不但可以实现病毒的检测，还可以对样品中病毒浓度进行分析，可同时对不同病毒和同种病毒的不同株系进行检测[23]，具有检测效率高，特异性好的特点。
2.1.
3.3 RT-PCR检测技术
RT-PCR技术基于大部分植物病毒、类病毒的遗传物质是RNA，以待检测病毒RNA的全部或部分序列为基础，设计合成一对特异性引物(也可用随机引物)，将待测RNA反转录成cDNA再进行PCR扩增的反应。该方法可以用于检测不同植物感染的各种病原物，包括真菌、细菌、病毒、类病毒、植原体、线虫等，是目前应用最广泛的、最有发展前景的病毒检测技术。自二十世纪九十年代起，国内外相继用RT-PCR方法检测了多种马铃薯病毒（类病毒）[24-26]。多重RT-PCR技术体系的建立，实现了多种病毒同时检测，提高了检测效率的同时，降低了检测成本。王中康[27]根据马铃薯病毒CP 和P1基因序列设计了特异性引物对，建立了可以同时检测PVX、PVS、PVY、PLRV和PV A的多重RT-PCR快速检测体系，灵敏度比ELISA提高至少100倍。董代幸[28]根据PVX、PVY、PV A、PLRV的CP基因序列设计了4对特异性引物，建立了能够同时检测这四种病毒的一步多重RT-PCR检测方法。
RT-PCR检测技术灵敏度高，特异性强，在基因水平上仅用微量植物感病组织液即检测出含量极低的病毒RNA。同时作为病毒鉴定的重要依据，该方法可以结合核酸序列分析基因序列中的分子变异，检测不同病毒株系间的序列同源性，比较其亲缘关系。多重RT-PCR 分子检测技术的建立，可以同时检测多种病毒，降低检测成本，简化操作程序，进一步推进了该方法的广泛应用。
2.2 宁夏马铃薯脱毒种薯病毒检测现状
宁夏马铃薯脱毒种薯生产中的病毒检测主要采用生物学检测技术中的指示植物鉴定、免疫学检测技术中的酶联免疫吸附试验法（ELISA）、分子生物学检测技术中的双向聚丙烯酰胺凝胶电泳方法鉴定马铃薯多种病毒及类病毒，经鉴定无主要病毒及类病毒的试管苗可定为脱毒试管苗。
3结语
脱毒种薯的推广种植可有效地提高马铃薯的产量和品质。茎尖分生组织培养脱毒试管苗在马铃薯脱毒种薯生产中已经取得了长足的发展，但是宁夏的马铃薯脱毒生产在实际操作中人工剥离茎尖存在一定误差，这为种薯产业化种植留下一定的隐患，有必要在脱毒过程中结合其他方法探寻更加快速，有效，便于大规模生产的脱毒方法。
本文总结归纳了国内外马铃薯病毒检测的常用方法，每种方法根据原理和检测目标不同，都有其各自的优缺点。其中，RT-PCR法特异性强，准确率高，随着相关技术、仪器的普及推广，其应用范围必将越来越广泛。GICA法操作简便，快速准确，适宜于现场快速检测，具有很好的应用前景。宁夏目前采用的病毒检测方法在实际操作过程中存在灵敏度低、所需时间长，费时费力、不经济实用等弊端，而一些快速高效的检测方法还未在我区的脱毒马铃薯检测工作中开展。因此有必要根据宁夏马铃薯脱毒生产中待测病毒类型、技术掌握程度、设备条件、检测目的和要求，将传统生物学技术、免疫学检测技术和分子生物学技术因地适宜地、有机地结合起来，形成一套完善的高精度、高标准、规范化的脱毒种薯质量检测体系，为指导宁夏马铃薯产业的快速、健康发展提供技术支撑。
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