当前位置：文档库 › 枯草芽孢杆菌B115抗菌蛋白的分离纯化及部分性质

枯草芽孢杆菌B115抗菌蛋白的分离纯化及部分性质

收稿日期:2004206207;修订日期:2004206222

基金项目:中国水产科学院科研基金资助项目(编号:20012228)

作者简介:沈锦玉(1963—

),女,浙江湖州人;硕士,副研究员;主要从事水生动物病害防治研究1本研究过程中得到浙江大学动物科学院余旭平博士和生物技术研究所陈卫良博士的帮助与指导,在此深表谢意

沈锦玉　尹文林　曹　铮　潘晓艺　吴颖蕾

(浙江省淡水水产研究所,湖州　313001)

摘要:枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis )B115分离自水产养殖池塘,对鱼类细菌性败血症致病菌具有较强的拮抗能力。除去菌体培养液用浓盐酸沉淀,乙醇抽提所得的拮抗物粗提液对热不稳定,4℃保存不能超过两周,-18℃保存不能超过45d ,对胰蛋白酶不敏感,对蛋白酶K 部分敏感,对氯仿敏感,其作用活性pH 范围较广,对pH 不敏感。粗提液经C M 柱离子交换层析和P 260柱层析,得到一个拮抗活性峰P2。粗提物经丙酮分级沉淀及高压液相色谱分离,得到较纯的LP ,经质谱仪测定分子量为80316D 。1L 发酵的细菌培养液可得到约1mg LP 纯品。关键词:枯草芽孢杆菌B115;抗菌物质;分离纯化;理化特性

中图分类号

:Q936 文献标识码:A 文章编号:100023207(2005)0620689205

水产养殖的细菌性病害是造成农业损失的主要

原因之一[1],施用化学杀菌药及抗生素等尽管有一定效果,但长期使用会增加病原菌的抗性。另外,农药的大量使用还会造成环境污染及药物残留。利用微生物来抑制动物病原细菌为细菌病害的防治提供了新的可能。近年来,已筛选了许多防治植物病害的拮抗菌如芽孢杆菌(Bacillus sp.),并阐明了其抗菌物质对植物病原菌的抑制作用,抗菌机理及抗菌物质的理化特性等[2-5]。而在水产上枯草芽孢杆菌抗菌蛋白的性质未见报道。本室从池塘土壤中分离到一株强烈抑制鱼类细菌性败血症病原菌嗜水气单胞菌(BSK 210)[1]的拮抗菌(Bacillus subtilis )B115,并从中分离到抗菌蛋白,这种物质除对鱼类出血性败血病病菌表现出强烈抑制作用外,对大黄鱼致病菌、中华绒螯蟹致病菌及金黄色葡萄球菌也有强烈的抑制作用,经同步营养,B115对BSK 210的抑菌圈为14mm ,对大黄鱼哈维氏弧菌的抑菌圈为15mm ,对中华绒螯蟹致病菌C L99920的抑菌圈为13mm ,对大黄鱼副溶血弧菌的抑菌圈为13mm ,对金黄色葡萄球菌的抑菌圈为10mm (另文报道)。本文报道B115菌株产生的一种抗菌物质的分离纯化及其部分性质初步研究。

1　材料与方法

111　菌种　供试菌种为本室分离的一株枯草芽孢杆菌(Bacillus substilis )B115.

112　主要仪器及试剂　高速低温离心机(Sigma );冷冻干燥机(G erman );层析系统(Biologic LP ,BI O 2RAD );离心真空干燥浓缩仪(SPD 111V ,Therm o Sa 2vant );C M (Econo 2Pac ,Catalog N o.73220001,BI O 2RAD );Bio 2G el P 260G el (BI O 2RAD );Waters 515;Bruker Daltonis os (esquire 3000);蛋白酶K (Merck G ermany );

胰蛋白酶为Sigma 产品,其余试剂均为国产分析纯。113　粗样品的制备　将B115菌株接种于BPY (牛肉膏5g ,蛋白胨10g ,酵母浸膏5g ,氯化钠5g ,葡萄糖5g ,水1000m L )培养基,28℃摇床培养24h ,摇床转速180r/min ,4℃离心30min ,6000r/min ,收集上清液,以

孔径为0145μm 的细菌滤器过滤,得无细胞培养滤

液。向上清液中加入浓盐酸,调节pH 至310,8000r/min 离心15min ,弃去上清。沉淀用80%乙醇抽提3次,抽提液直空抽干,将所得干粉悬浮在少量去离子水中,用2m ol/L NaOH 调至pH710,使其全部溶解。再次用1m ol/L 的HCl 调至pH310,8000r/min 离心10min ,收集沉淀,向沉淀中加入少量1%的碳酸氢铵溶液,使其全部溶解。将此溶液冷冻干燥,得到淡黄色粉末状粗样品。每步实验中取少量进行抗菌活性

第29卷第6期

水生生物学报

V ol.29,N o.62005年11月

ACT A HY DROBI O LOG IC A SI NIC A

N ov.,2005

检测。　114　粗提液的稳定性测定　热稳定性:粗提液在不同温度下处理30min ,100℃水浴中处理5min 、10min 、15min 及样品在4℃及-18℃冰箱放置46d (每隔2d

取样),各取50μL 进行抗菌活性测定。对蛋白酶的

稳定性:粗提液分别用胰蛋白酶和蛋白酶K,浓度为100μg/m L ,在37℃下处理1h ,取50μL 进行抗菌活性检测。对氯仿稳定性:粗提液与等量氯仿混合振荡抽提60min ,离心,分层后取上层水相,待残留氯仿

挥发后,取50μL 进行拮抗活性检测。对pH 稳定

性:粗提液的pH 分别调至不同值,取50μL 进行抗菌活性检测。

115　CM 离子交换层析　缓冲液A 为0102m ol/L 的

醋酸2醋酸钠缓冲液(pH510)加0105m ol/L 的氯化

钠,缓冲液B 为0102m ol/L 的醋酸2醋酸钠缓冲液

(pH510)加115m ol/L 的氯化钠。用缓冲液A 充分平衡层析柱(20cm ×115cm ),流速6—8m L/min 。取113制备的粗提液上样,流速1m L/min ,用缓冲液A 洗涤至出现基线,而后进行梯度洗脱,0～100%B 梯度洗脱,流速1m L/min ,按每管2m L 进行收集,收集在280nm 处光密度值高的部分,同时测定各峰抑菌活性。保留有抑菌活性的蛋白峰。

116　Bio 2G el P 260凝胶过滤层析　对115中有抑菌

活性的部分进行纯化:Bio 2G el P 260与Sephadex G 2100相当,参照郑怡等[6]方法进行,用0102m ol/L 的磷酸钠缓冲液(pH712)平衡层析柱(100cm ×115cm ),取115中经抑菌检测有活性部分合并后上样,流速为014m L/min ,使样品进入凝胶。最后用同样的缓冲液洗脱,流速014m L/min ,自动部分收集器收集,1m L/管。收集在280nm 处光密度值高的部分,同时测定各峰抑菌活性。117　高压液相色谱分离法　丙酮分级沉淀:粗样品溶解在0102m ol/L pH618磷酸缓冲液中(011g/m L ),加入6倍体积冰浴的丙酮,12000r/min ,4℃离心10min ,弃去沉淀。在上清中继续加入原体积10倍的预冷的丙酮,12000r/min 4℃离心10min ,收集沉淀,溶解于少量0102m ol/L pH618磷酸缓冲液中。高压液相色谱(HP LC )反相分析:将经丙酮沉淀得到的

样品溶液用经0102m ol/L pH618磷酸缓冲液平衡的Bio Rad Hi pore 反相柱吸附,用0～100%的乙腈梯度洗脱,流速1m L/min ,收集有抗菌活性的色谱峰,离心真空干燥浓缩,再将其冷冻干燥,即为LP 。

采用Bruker Daltonis os (esquire 3000)质谱仪测定分子量。取冷冻干燥的样品LP 少许,溶于甲醇中,用微量移液器吸取溶液,缓慢加入到质谱仪中;流动相为甲醇。

采用考马斯亮蓝染色法[7],以牛血清白蛋白为标准蛋白。测定蛋白质浓度。118　抑菌实验　选用鱼类细菌性败血症病原菌嗜水气单胞菌(BSK 210)为测定抑菌活性的指示菌,该菌由本实验室保存。将BSK 210培养于普通肉汤培养基,培养24h ,取细菌浓度为1×107个/m L 的菌悬液011m L ,均匀地铺在装有20m L LB 、直径为90mm 的培养皿上,用一个直径为415mm 的打孔器在培养

皿的中心及边缘均匀打5孔,再分别接种50μL 处理液于孔内,每处理3个培养皿,用封口膜密封后培养

在30℃,1d 后测定抑菌圈的直径。2　结　果

211　粗提物的稳定性

21111　热稳定性　粗提液分别在不同温度下处理

30min ,取50μL 检测拮抗活性,结果如表1。粗提物经60℃-100℃处理30min 后仍保持部分抗菌活性,

100℃处理时间越长,部分抗菌活性越弱,120℃处理30min 后丧失抗菌活性。样品在4℃冰箱放置15d 后,-18℃冰箱放置44d 后,抗菌活性完全消失(表2),说明该抗菌物质不具有耐高温性,4℃保存不能超过两周,-18℃保存不能超过45d 。21112　对蛋白酶的稳定性　粗提液经不同蛋白酶

处理后,取50μL 检测活性,结果如表3。粗提液对胰蛋白酶不敏感,对蛋白酶K 部分敏感。

21113　对氯仿的稳定性　粗提液经氯仿处理后,用50

μL 样品进行活性检测,结果发现抗菌圈直径为0mm ;而未经氯仿处理的粗提液抗菌圈直径为14mm 。因此粗提液对氯仿敏感。

21114　对pH 值的稳定性　粗提液在不同pH 值下

表1　B 115粗提液经不同温度热处理后的抗菌活性

T ab.1　Antag onistic activity of crude extract of B115treated with various tem peratures

处理温度(t ,℃

)煮沸时间(m in )

60708010012051015抗菌圈直径(mm )13

-12

690　水生生物学报29卷

表2　B 115粗提液经不同时间保存后的抗菌活性

T ab.2　Antag onistic activity of crude extract of B115stored in various days

天数(d )1471013151720232629323538414446

抗菌圈直径(m m )

4℃141211986---18℃

111010109986-

“-”表示没有抑菌圈

表3　处理后抗菌物质的抗菌活性

T ab.3　Antag onistic activity of crude extract of B115with various treatments

59蛋白酶K 胰蛋白酶氯仿未处理

抗菌圈直径(mm )14

-14

处理后,抗菌活性检测表明(表3),B115粗提液活性

pH 范围较宽,无论pH 值为中性或偏酸性和偏碱性,滤液均对病菌有抑制活性,且三种pH 值下的抑菌活性无差异,说明抗菌物质对pH 不敏感。212　分离纯化21211　粗样品的制备　培养上清液用浓盐酸将pH 调至3时,测定样品上清及沉淀的抑菌圈直径,证明大部分抑菌物质在沉淀中,故用调节pH 的方法可初步浓缩抑菌物质。沉淀用80%乙醇抽提3次,测定每次抽提时上清及沉淀的抑菌圈直径,证明抑菌物质全溶在乙醇中,且乙醇容易挥发。利用抑菌物质的性质得到它的粗制样品。21212　凝胶层析的纯化　取113制备的粗提液经C M 柱离子交换层析,洗脱曲线见图1,洗脱液经抑

菌活性检测,第10—14管抑菌圈最大见图2。收集C M 柱离子交换层析的活性部分(图1),上Bio 2G el P 260柱,得到两个主要吸收峰(图3)。经活性检测,约1小时后出现的是没有活性的小峰P1,约515小时出现的是有抑菌活性的峰P2

。

图1　抗菌物质的C M 柱离子交换层析洗脱曲线

Fig.1　E lution pattern of antibacterial production through C M ion 2

exchange chromatography

21213　高压液相色谱的纯化　经过两次酸沉淀后,

冷冻干燥得到淡黄色粉末状粗样品,含有很多色素物质,丙酮分级沉淀能有效地去除这些杂质。反相柱层析时,得到的几个峰,只有峰3有抑菌活性(图4)

。

图2　抑菌物质经C M 柱后的抑菌活性

Fig.2　The antibacterial activity test of production after C M ion 2exchange

chromatography

图3　图1中活性峰经P 260柱的色谱图

Fig.3　C olumn chromatography of fig.1peak on P 260

经分析峰3的含量大于80%。经质谱测定,抑菌物

质LP 的分子量为80316D (图5)。由于LP 的分子量较小,用常规的S DS 2PAGE 或者凝胶过滤色谱无法测定。

最后得到的样品LP 为白色粉末状,1L 发酵的

细菌培养液可得到约1mg LP 纯品。3　讨　论

从拮抗细菌B115菌株中分离纯化到抗菌物质。其粗提液的pH 值为中性或偏酸性和偏碱性时均对指示菌BSK 210有抑制活性。pH 为4、5、9时,滤液抑菌活性与对照组一致,而当pH 为3时,滤液中产生

6期沈锦玉等:枯草芽孢杆菌B115抗菌蛋白的分离纯化及部分性质

691

图4　反相柱分离的色谱图

Fig.4　Is olation of LP on reversed phase

column

图5　抗菌物质LP 的质谱图谱

Fig.5　MS profile of LP

絮凝物质,离心后取沉淀,用pH 为7的生理盐水溶解,此溶液的抑菌活性并没有减弱,说明此抗菌物质对pH 不敏感。但经煮沸处理后,抗菌物质的抗菌活性随着煮沸时间的延长而减弱,经高压灭菌后,完全失去抑菌活性;在4℃冰箱放置15d 及-18℃冰箱放置44d 后,活性也完全消失,说明该抗菌物质不具有耐高温性,4℃保存不能超过两周,-18℃保存不能超过45d 。

由于本文中抗菌物质的分离是按照蛋白质的特性进行分离纯化的,因此不排除该菌株同时产生其他非蛋白物质的可能。在进行分离物质P2的纯度及分子量的测定时,对P2进行S DS 2PAGE 电泳,结果P2在凝胶的最前缘,说明其分子量太小,不能用此电泳法测出。故改用HP LC 及质谱法测定该物质的纯度及分子量。对LP 样品用Mr 截留为1×103的超滤杯超滤浓缩后,上清液及浓缩液中均有部分

抗菌活性,说明抑菌物质的分子量(Mr )较小,不到1×103。用质谱测定其分子量仅为80316的小肽。

抗菌谱表明它是一种广谱的抗鱼类病原细菌的抗菌小肽,对许多危害严重的病原细菌都表现出很强的抗菌活性,在水产养殖中有很好的应用前景。由于

抑菌物质的含量很低,因此,本文仅进行了抗菌活性

测定、分离纯化及部分理化特性研究。至于它的组成成分、抗细菌机理等有待进一步研究。

自从1952年J 1Babad

等人从枯草芽孢杆菌培养液中分离出抗真菌肽以来,又陆续分离出多种抗真菌肽[8]。这些小肽有许多共同特征:分子量很小,仅1000D 左右。从已知的性质来看,LP 同文献报道的

各种小肽类都有一定差别。芬枯草菌素A (Fengycin

A )不溶于水,而且分子量为1447D ,同分离到的LP 有很大区别;但LP 与刘颖等[9]从枯草芽孢杆菌培养液中分离出抗真菌肽性质很相似(分子量105713),但分子量相差253;与童有仁等[12]从枯草芽孢杆菌培养液中分离出抗菌肽分子量(5013kD )相差悬殊,所以,LP 为不同于其他已发表的抗菌物质的一种抗菌小肽。参考文献:

[1]　Shen J Y,Chen Y Y,Shen Z H ,et al.S tudy on Pathogen of Outbreaks

of In fectious Disease of Fishes in Zhejiang Province :Is olation ,Pathogenicity ,Physiological and Biochem ical and Biochem ical Charac 2teristics of Aeromonas hydrophila [J ]1Bulletin o f Science and Tech 2

nology ,1993,(6):397—401[沈锦玉,陈月英,钱冬,等1浙江养

殖鱼类暴发性流行病病原的研究:嗜水气单胞菌的分离、致病性及生理生化特性.科技通报,1993,(6):397—401]

[2]　K ong J ,W ang W X ,Zhao B G,et al.The studies on the antibiotic

substances from Bacillus subtilis B 2903strain[J ].Acta Microbiologic

Sinica ,1992,32(6):445—449[孔建,王文夕,赵白鸽,等.枯草

芽孢杆菌B 2903抗菌物质的研究[J ].微生物学报,1992,

32(6):445—449]

[3]　Zhang X J ,Liu H L ,Pan X M ,et al.C ondition on antag onistic sub 2

stance production of B3used for biocontrol of sharp eyespot of Wheat [J ].Journal of Nanjing Agricultural University ,1995,18(1):26—30.[张学君,刘焕利,潘小玫,等.小麦纹枯病生防菌株B3产

生抗菌物质条件的研究[J ].南京农业大学学报,1995,18(1):

26—30]

[4]　Handelsman J ,S tabb E V.Biocontrol of s oilborne plant pathogens

[J ].The plant cell ,1996,8:1855—1869

[5]　W ils on C L ,Chalutz E.P ostharvest biological control of Penicillium

rots of citrus with antag onist yeast sand bacteria[J ].Sci.Horticult.,1989,40:105—112

[6]　Zheng Y,Y U P and LIU Y R.Purification and Partial Characteriza 2

tion of Chlorella pyrenoidosa Lectin[J ].Acta Hydrobiologica Sinica.2003,27(1):36—40.[郑怡,余萍,刘艳如.蛋白核小球藻凝集

素的分离纯化及部分性质研究.水生生物学报,2003,27(1):

36—40]

[7]　Li J W ,X iao N G,Y u R Y.Principle and M ethods of Biochem ical Ex 2

periment[M].Beijing :Beijing University Press ,1994.[李建武,萧

能庚,余瑞元,等.生物化学实验原理和方法[M].北京:北京大学出版社.1994]

692　水生生物学报29卷

[8]　K ajimura Y,Sugiyama M ,K aneda M ,Bacillopetins ,newcyclic lipope 2

tide antibiotics from Bacillus subtillis FR 22.J Antibiotics ,1995,48(10):1095—1103

[9]　Liu Y,Xu ,Q ,Chen Z L.Purification and Characterization of Antifun 2

gal Peptide LP 21[J ].Acta Microbiologic Sinica.1999,39(5):441—447.[刘颖,徐庆,陈章良.抗真菌肽LP 21的分离纯化及特性

分析[J ].微生物学报,1999,39(5):441—447]

[10]　T ong Y R ,M a Z C ,Chen W L et al.Purification and Partial Charac 2

terization of Antag onistic Proteins from Bacillus Subtilis B034[J ].Ac 2

ta Microbiologic Sinica.1999,39(4):339—343.[童有仁,马志超,

陈卫良,李德葆.枯草芽孢杆菌B034拮抗蛋白的分离纯化及特性分析[J ].微生物学报,1999,39(4):339—343]

PURIFICATION AN D PARTIA L CH ARACTERIZATION OF ANTAG ONISTIC

SUBSTANCE FR OM BACILLUS SUB TILUS B115

SHE N Jin 2Y u ,Y IN W en 2Lin ,C AO Zheng ,PAN X iao 2Y i and W U Y ing 2Lei

(Zhejiang Institute o f Freshwater Fisheries ,Huzhou 313001)

Abstract :Bacillus subtilis B115,an antag onistic bacteria isolated from the mud of aquaculture pond ,strongly inhibited the grow th of Aeromonas hydrophila which caused the bacterial septicem ia disease of freshwater fish.B115bacteria were cultured in BPY medium for 24h at 28℃.The supernatant was collected by centrifugation at 6000r/m in for 30m in at 4℃,then filtered by a

0145μm filter.Crude extract of Antag onistic Substance was obtained by precipitation of the cell free supernatant of B115w ith HC l

and then extracted by alcohol.Assays for crude extract inhibiting bacteria activity were done on agar plates.The results showed that crude extract strongly inhibited Aeromonas hydrophila BSK 210and other pathogens of fish and river crab ,and it was thermal 2unstable ,resistant to trypsin ,partial sensitive to proteinase K,sensitive to chloroform and stable in various pH.Its active pH range was w ide ,from 4to m ore than 9.The activity of Antag onistic Substance w ould lost when it kept in 4℃m ore than 15d and in -18℃m ore than 45d.One antag onistic peak P2was obtained from the crude extract of B115by C M iron exchange chro 2matography ,followed by P 260column chromatography.An antibacterial peptide LP was purified by acetone precipitation and re 2versed phase column chromatography.The m olecular weight of LP is 80316D determ ined by mass spectrometry.1mg pure LP could be obtained from 1L supernatant of B115.

K ey w ords :Bacillus subtilis B115;Antag onistic substance ;Purification ;Characterization

6期沈锦玉等:枯草芽孢杆菌B115抗菌蛋白的分离纯化及部分性质

693