杂交瘤细胞分泌的uPA抗体对小鼠精子功能的作用

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中文摘要

第一部分uPA抗体阳性杂交瘤细胞上清的制备

目的制备可分泌uPA抗体的杂交瘤细胞，并获得含高效价uPA抗体的细胞上清。方法取6～8周龄健康BABL/C小鼠，按单克隆抗体制备技术常规免疫后取尾静脉血，利用间接ELISA检测效价，选择高效价的小鼠，加强免疫后3天取脾脏

制备细胞悬液，与骨髓瘤细胞SP2/0融合，经HAT培养基筛选后待杂交瘤细

胞克隆长至孔底面积的2/3时，取细胞上清分三个稀释度（原液、稀释2.5倍、5倍、10倍）检测效价。

结果常规免疫后的小鼠血清效价为1：12800，取脾细胞与SP2/0融合后第7天，镜下既可观察得到杂交瘤细胞呈克隆生长，第10天可见到克隆细胞团。取杂交瘤细胞上清检测效价为1：6400，抗体类型为IgG型，其中196个培养孔中有140个是阳性孔，其融合率为71.4％，杂交瘤细胞染色体数目为94±10，为亲代细胞染色体数之和。

结论通过常规免疫可得到高效价的IgG抗体，经细胞融合可获得持续分泌uPA抗体的杂交瘤细胞。

关键词尿激酶；单克隆抗体；细胞融合；杂交瘤

第二部分uPA抗体阳性克隆的细胞上清对小鼠精子功能的影响

实验一uPA抗体阳性克隆细胞的上清对小鼠精子活力和活率的影响

目的观察不同稀释度的含有uPA抗体的杂交瘤细胞上清，对小鼠精子不同时间点的活力和活率的影响。

方法取成年雄性小鼠的精子，待上游后，按处理因素不同分4组，A、C组：为阳性对照组，A组稀释度为1：5，C组稀释度为1：10；B、D组为阴性对照组，B组稀释度为1：5，D组稀释度为1：10。分别取处理后10min、20min、30min、40min、50min、60min的精子，在显微镜下计数精子活力和活率。活率计数用伊红Y染色法。对不同稀释度、相同时间点的精子活力和活率进行比较，P<0.05

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为显著性差异。

结果在细胞上清稀释5倍时，A组精子的活力在30、40、50、60min与B组比较均有降低（P<0.05），尤其是50min的精子活力（41±4.3）明显低于B组的精子

活力（65±6.7),P<0.01；A组的精子活率虽然从30min起就开始降低，但50min 时的活率（47±4.2）降低最为显著，与B组的活率（69.3±5.2）比较有统计学

意义（P<0.01）。在细胞上清稀释10倍时，C组精子活力从30min起开始下

降，此后持续一段时间，在60min的活力（45.3±7.9）与D组同时间点的活力（67±6.1）相比，有显著性差异，P<0.01；而C组精子的活率在40min、50min、60min时与D组比较降低有显著性差异（P<0.05），尤其是在60min时的活率

（50.5±5.2）明显低于D组的活率（68.3±4.1），P<0.01。虽然A组与C组相比，A组的活力和活率在相同时间点降低的幅度比C组大，但这种差别没有统计学意义。

结论杂交瘤细胞所分泌的的含uPA抗体的细胞上清可在体外明显地抑制uPA对精子活力和活率的增加，而且这种抑制是可持续的，细胞上清稀释度的不同，小鼠精子活力和活率降低的幅度不同。提示uPA抗体抗体浓度的不同对小鼠精子功能的抑制也不同。

关键词尿激酶抗体；精子；活力；活率；小鼠

实验二 uPA抗体阳性克隆细胞的上清对小鼠体外受精的影响

目的观察含uPA抗体的细胞上清对小鼠精子的受精能力的影响。

方法雄性昆明小鼠，处死取精子，待上游后，按处理因素的不同，分为3组，空白组：IVF-30，阳性对照组：抗体阳性细胞上清加IVF-30，阴性对照组：抗体阴性细胞上清加IVF-30。雌性小鼠促排卵后取卵母细胞团，分组同精子；取处理后60min的三组精子分别作用于三组卵母细胞团，使其受精，最终共有8个组，A组为精、卵空白组与抗体阳性细胞上清，B组为精、卵空白组与抗体阴性细胞上清，C组为卵空白组与精子阳性对照组，D组为卵空白组与精子阴性对照组，E组为精、卵阳性对照组，F组为卵阳性对照组与精子阴性对照组，G组

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为卵阴性对照组与精子阳性对照组，H组为卵阴性对照组和精子阴性对照组。

受精24h后，以卵母细胞内出现雌、雄双原核或者卵周隙有明确的第一、第二极体的出现为判断标准，观察其受精率。用χ2检验进行统计处理，P<0.05为显著性差异。

结果A组受精率为39.1％，B组的受精率（65.8％）经χ2检验比较两组受精率有显著性差异（P<0.05）；C组的受精率为35.6％与D组（46.4％）相比，χ2检验有显著性差异（P<0.05）；与F组的受精率（37.6％）相比，E组的受精率（19.6％）降低，经χ2检验比较，有显著性差异（P<0.05）；G组与H组相比，H组的受精率为58.5％而G组的受精率仅为36.2％，经χ2检验比较，有显著性差异（P<0.05）。

结论含uPA抗体的细胞上清可明显抑制uPA的作用，降低小鼠精子受精的能力。

其可能机制是：该细胞上清一方面降低精子的活力和活率，使到达卵子周围的精子数目减少，另一方面通过抑制卵母细胞团uPA对精子的趋化诱导作用，阻碍精卵接触前的通讯交流，从而最终使得精子受精能力降低。提示：uPA可能是影响精子受精的一个重要因子，uPA抗体可降低精子的受精能力，有望成为抗生育避孕制剂的可能。

关键词尿激酶抗体；精子；卵子；受精率；小鼠

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Abstract

Part Ⅰ

The preparation of anti-uPA antibody secreted by positive hybridoma cells Objective: To prepare supernatant containing anti-urokinase-type plasminogen activator antibody with high titer, secreted by positive hybridoma cells.

Methods: BALB/c mice of 6 to 8 weeks were immunized by monoclonal antibody technology. After determination the titer of antibody by indirect ELISA with

tail vein blood, spleen cells suspension of the mice was fused with myeloma

cells named SP2/0 . Then the hybridoma cells were screened by the HAT

medium. Once the 2/3 areas of culture hole were occupied by them, the

supernatant was immediately tested.

Results: After routine immunization, the titer of antibody in serum was 1:12800.

Hybridoma cell clones were observed growing bigger and bigger under

microscope at the seventh day and the tenth day after cell fusion. In the

supernatant, the titer of antibody was 1:6400, and its class was IgG. by indirect

ELISA . Among of 196 holes, there were 140 positive holes, so the fusion rate

was 71.4 percent. The numbers of chromosome were 84～104, equaled to the

sum of spleen and myeloma.

Conclusion: By routine immunization process, we prepared IgG –type antibody of urokinase with high titer and hybridoma cells secreting antibody endlessly. Key words: urokinase；monoclonal antibody；cell fusion； hybridoma

Part Ⅱ

The effect of prepared anti-uPA antibody supernatant on sperm function of mice Experiment 1

The effects of prepared anti-uPA antibody supernatant on mice sperm viability and

motility rate.

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Objectives: To observe the changes of mice sperm viability and motility at different time points after adding different dilutions hybridoma cell supernatant containing

anti-uPA antibody into sperm.

Methods:The swum-up sperm of mice was divided into four groups:The group A and C were positive controls, and the group B and D were negative controls. In the

group A and B, cell supernatant with dilution of 1 / 5 was added, and in C and

D groups cells supernatant with dilution of 1 / 10. Then the changes of sperm

viability and motility at different time points ( 10min，20min，30min，40min，

50min，60min) were observed. The motility was counted under a light

microscope, and the viabilty was determined by eosin Y staining.

Results：Compared with group B, the viability and motility of group A were lower at 30min，40min，50min，60min points after anti-uPA antibody added in sperm

suspension. Especially the viability at 50min was obviously lower than that of

B. (P <0.01). Compared with group D, the viability and motility of group C

were with the same as group A. Compared with group A and B, the viability

and motility were declined from 30min to 60min, especially at 60min with a

significant difference (P <0.01). Although viabity and motility in group C were

declined, it was not obviously as that of group A, but the difference has no

statistical significance.

.

Conclusions：The viability and motility are obviously inhibited by the cell supernatant containing anti-uPA antibody,and this inhibition is sustainable. As difference of

the titer of dilution , the effects on sperm viability and motility are different .

The results show that anti-uPA antibody could obviously inhibit the fuction of

uPA in vitro.

Key words: urokinase; sperm；viability ；motility；mice

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Experiment 2

The effects of prepared anti-uPA antibody supernatant on mice sperm fertilization in ivtro

Objectives: To observe the changes of sperm fertilization rate with anti-uPA antibody secreted by hybridoma cells.

Methods: The strum up sperm was divided into three groups: the blank group,the positive control group and the negative control group. The eggs after promoting

ovulation were divided into three groups with the same as sperm . Then sperm

with eggs were fused in order to be fertilized, ultimately there were eight

groups. The groups of antibody include four groups.Group A was blank of

sperm and eggs .Group C was blank of eggs and positive sperm. Group E was

the positive control of eggs and sperm . Group G was negative eggs and

positive control of sperm. The others are opposited to the groups of antibody.

After 24 hours , the changes of their fertilization rate were obversed . Results: Compared with group A and B, there is a significant difference in their fertilization rate (P <0.05). The fertilization of A group was 39.1%, lower than

that of group B. Compared with group C and D, the fertilization of group C

was 35.6% . There are a significant difference from group D (P <0.05).

Compared with group E and F, there was a significant difference between

group E (19.6%)and group F (P <0.05). Compared with group G and H, the

difference was obvious (P <0.05), and that of group C only was 36.2%. Conclusions: Supernatant containing anti-uPA antibody could effectively inhibit the fuction of uPA , and lower the fertilization rate of mice. The mechanisms maybe: the one

hand , the supernatant could lower the the activity and motility of sperm, and

reduce the number of sperm aroud eggs.On the other hand , it could inhibit the

function of uPA to guide sperm chemotaxis and inhibits precontact sperm-egg

communication and lower the capability of sperm fertilization in vitro. So it

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maybe a new contraceptive drug in the future.

Key words:anti-uPA antibody; sperm; egg; fertilization; mice

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前言

尿激酶型纤溶酶原激活因子(urokinase-plasmingen activator, uPA)，是一种丝氨酸蛋白水解酶，分子量大约50 kDa，由两条多肽链经二硫键连接组成，C-端是蛋白酶活性区，通过水解细胞外基质，来影响纤溶活性、组织重构（如伤口愈合）、细胞黏附迁移（如肿瘤细胞浸润迁移）、细胞趋化运动（炎症细胞向感染灶的游走、胚胎干细胞的定向移动）等；N-端由kringle区和生长因子结构域组成，细胞膜上uPA受体（urokinase-plasmingen activator receptor, uPAR）与生长因子结构域结合后，发生裂解，进而调节细胞的增殖分化、运动、黏附、凋亡等多个功能。

近50余年，uPA在生殖系统中的重要作用已引起人们高度重视。首先，大量实验数据显示uPA在雄性生殖系统中广泛分布：在人精子主要分布于顶体中后段的浆膜、尾部中后段以及线粒体膜上；精浆中也含uPA，主要来源于前列腺、附睾、精囊腺和睾丸。张树成等的研究提示精子的活率和活动指数的变化与体外受精有关，不同时间、不同活力的精子，其受精率也有所差别，提示精子活力的良好是精子使卵子受精的前提。有研究表明，精子膜uPA的酶活性值与精子活率、活力之间均呈直线正相关，但精浆中的uPA 与精子的运动和活率无明显相关性，可能前者对精子活力的影响是直接的，而后者的作用是间接的。不同部位的uPA可能有不同的生理作用，位于精子顶体部位的uPA可能参与顶体反应，有助于精卵识别及精子穿过透明带；位于精子尾部的uPA可能与精子的运动有关，防止精子粘附在管腔黏膜的纤维蛋白沉积物上以及精子彼此间粘附，加速精子运行速度，确保顺利运行至输卵管壶腹部与卵子结合。对比检测受精卵与未受精卵培养液内uPA含量，发现前者培养液内的uPA明显高于后者；Huarte J等也观察到，在体外受精环境中加入uPA，可以增加卵子受精率；而体外给予抑制uPA活性的物质（如鞣酸）能使精子活力降低，并影响受精。有实验研究表明，uPA趋化后的精子受精率明显提高，提示uPA有利于精子结合和穿过透明带,提高受精成功率。进而推测uPA在哺乳动物的受精过程起作用。uPA与男性生殖系统关系密切，它的含量和酶活性异常可以影响精子的功能，故uPA可能是影响男性生育

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力的一个重要的因子。

在过去的几十年里，男性避孕药的发展主要集中在对下丘脑－垂体－性腺轴的干扰上，如发展针对精子、男性生殖道以及下丘脑水平的促性腺激素释放激素（GnRH）的特异性抗原的疫苗以及激素类药物的应用，而更为安全的方法可寄托于干扰uPA对精子的功能，使精子的受精能力降低，这可以是男性避孕的一个新的发展方向。

自1975年单克隆抗体技术诞生以来，有关uPA单克隆抗体的研究已有不少，有研究证实uPA有五个抗原表位，其中两个表位，即C端的丝氨酸蛋白酶结构域和N 端的生长因子结构域，是uPA在雄性生殖系统中发挥作用的主要部位。把针对该表位的uPA单克隆抗体用于研究，利用单克隆抗体的靶向性与uPA特异性结合，特异性抑制uPA的功能，有助于我们进一步探讨uPA在生殖系统可能的作用机制，进而可能成为一种新的避孕方法。

本研究通过单克隆技术制备可分泌uPA抗体的杂交瘤细胞，将其分泌的细胞上清作用于小鼠的精子，观察其对精子活力和活率及受精率的影响。间接地探讨uPA对小鼠精子的重要作用及可能的机制，并初步探讨uPA抗体作为新型男性避孕制剂的可行性。

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英文缩写一览表

缩写英文全称中文全称

8-AG 8-azaguanine 8-氮鸟嘌呤

BSA bovine serum albumin 牛血清白蛋白

CFA Complete Freund's adjuvant 完全福氏佐剂

DMSO Dimethyl

Sulfoxide 二甲亚砜

ELISA enzyme linked immunosorbent assay 酶联免疫吸附试验

FBS fetal bovine serum 胎牛血清

HAT Hypoxanthine,

Aminopterin,

Thymidine

次黄嘌呤, 氨基喋呤, 胸腺嘧

啶

HCG human chorionic gonadotrop(h)in 人绒毛膜促性腺激素

HRP horseradish

peroxidase, 辣根过氧化物酶

IFA Incomplete Freund's adjuvant 不完全福氏佐剂

IVF in-vitro

fertilization 体外受精

PEG Polyethylenglocol 聚乙二醇

PMSG pregnant mare serum gonadotrop(h)in 孕马血清促性腺激素

TMB Tetramethyl

benzidine 四甲基联苯胺

uPA urokinase-plasminogen

activator 尿激酶型纤溶酶原激活因子

uPAR urokinase-plasminogen

activator receptor 尿激酶型纤溶酶原激活因子受体

独创性声明

本人郑重声明，本学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果的总结。尽我所知，除文中已经标明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的研究成果。对本文的研究做出贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本人将承担本声明引起的一切法律后果。

学位论文作者签名：

日期：年月日

学位论文版权使用授权书

本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授权华中科技大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。

保密□，在_____年解密后适用本授权书。

本论文属于

不保密□。

（请在以上方框内打“√”）同

学位论文作者签名：指导教师签名：

日期：年月日日期：年月日

资助项目：国家科技部“十五”科技攻关课题（2004BA720A33-1）

项目负责人：熊承良（教授）

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第一部分 uPA抗体阳性杂交瘤细胞上清的制备

近50年，uPA与雄性生殖系统之间的密切联系已日益受关注。尿激酶型纤溶酶原激活因子（uPA）是一种胰蛋白酶样的丝氨酸蛋白水解酶，在雄性生殖系统由多种细胞分泌，并广泛存在与精子和精浆中[1.2.3.4]，它能将纤溶酶原转换成纤溶酶，后者能广泛水解细胞外基质，从而参与调节组织重塑、细胞迁移等过程[5]。uPA可通过与uPAR 的结合引起一系列的信号传导从而从多途径影响精子的多项生理功能，诸如精子排放[6]、获能、活力[7]、精液液化[8.9.10]等；在临床上uPA还被用来治疗某些男性不育，并取得了令人满意的效果[11]。uPA含量或活性的异常可引起精子功能的异常，从而影响男性的生育能力。因此uPA可能是影响男性生育的一个重要因子。

1975年，Kohler和Milstein创立了单克隆抗体杂交瘤技术，不仅为医学与生物学基础研究开创了新纪元，也为临床疾病的诊、防、治提供了新的工具。因单克隆抗体与常规抗体相比有如下优点：①单一特异性，与一个抗原决定簇反应；②可重复性，能够提供完全一样的抗体制剂；③一经制出，可无限量地供应；④生产单克隆抗体，不一定需要纯的抗原；⑤能查出混合物中存在的用常规方法查不出的少量成分。

考虑到如果制备出uPA单克隆抗体，靶向作用于uPA，抑制其作用，可影响精子的发生、排放、获能、受精等过程，从而影响男性的生育能力；可以作为研究uPA功能的工具，还可将它用于作为临床不育症的诊断试剂，在不久的将来，有望成为新的男性避孕制剂。本实验的研究主要从以下几个方面进行：动物免疫、血清抗体效价检测、细胞融合、杂交瘤细胞上清的效价检测、抗体类型鉴定、杂交瘤细胞染色体分析。

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材料和方法

一试剂

试剂来源（生产地）

Cruze（USA）完全福氏佐剂 Santa 不完全福氏佐剂Santa Cruze（USA）

HMW-uPA ADI（上海船夫, USA）

uPA标准品中国药品检定所（北京，中国）注射用青霉素（160万单位）华北制药股份有限公司

牛血清白蛋白（第Ⅳ组分）Merck( Germany)

L－谷氨酰胺 Sigma（USA）

改良型RPMI-1640培养基 Hyclone（USA）

次黄嘌呤Sigma（USA）

氨基蝶呤Sigma（USA）

胸腺嘧啶Sigma（USA）

PEG4000 Merck ( Germany)

TMB Sigma（USA）

特级胎牛血清（FBS） Maverick（Australia）

8-氮鸟嘌呤Sigma（USA）

HRP-羊抗小鼠IgG（H+L） Thermo（USA）

二、主要仪器

仪器（型号）制造厂家

操净工作台上海博迅有限公司

分析天平（AE240型）上海梅特勒－托利多仪器有限公司恒温水浴箱（DK-S22型）上海精宏实验设备厂

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5% CO2培养箱（MCO-15AC型）日本三洋公司

倒置显微镜（XDS-1B型）重庆麦克光电仪器有限公司

解剖显微镜（SZ1145型）日本奥林巴斯

低速自动平衡离心机（LDZ5-2型）北京医用离心机厂

Ⅱ CIMO新苗

电热恒温干燥箱(H-GZX-600-BS-)

超低温冰箱（ULTRA－LOW）SANYO

低速常温离心机（Universal 32R）德国 Hettich 公司

自动酶标洗板机（DEM-Ⅲ型）北京拓普分析仪器有限责任公司

酶标仪（ZS-3型）北京新风机电有限公司

微量高速离心机（TG－16W）长沙平凡仪器仪表有限公司

超纯水仪ELGO

三、实验动物

本实验选用6-8周龄的纯种BALB/C小鼠，雄鼠体重 20±5g，雌鼠体重 20±3g。所用小白鼠均饲养于同济医学院动物房内，按白天 / 黑夜各12h的规律予以日光灯照明。

四、实验方法

(一) 动物免疫

1. 振摇福氏完全佐剂，使沉淀的分枝杆菌充分混匀。

2. 以500μg/ml的uPA溶液加等体积的弗氏完全佐剂混合成油包水的乳糜状，放一滴

在水面上不易马上扩散呈小滴状表明已达到油包水的状态。

3. 75%酒精消毒小鼠背部，分多点皮下注射，总量为0.2ml（免疫组：uPA 50μg/只，

对照组：生理盐水50μg/只）。

4. 间隔3周注射一次。

5. 7天后，断尾取血一滴，测抗体效价，选滴度高的小鼠做融合试验。一个月后可

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以经静脉（尾静脉）给予无佐剂uPA抗原0.3ml，3～4天后，杀死小鼠取脾做融合用。

具体免疫程序如下：

初次免疫 uPA50μg/只加福氏完全佐剂皮下多点注射(0.2ml／只)

↓3周后

第二次免疫剂量同上，加福氏不完全佐剂腹腔注射(剂量不超过0.5ml)

↓3周后

第三次免疫剂量同上，不加佐剂，腹腔注射

│7天后采血测其效价，检测免疫效果

↓2～3周后

加强免疫，剂量500μg/只，腹腔注射或尾静脉注射

↓3天后

取脾融合

(二) 免疫效价的检测

抗体检测的方法有很多，但作为杂交瘤细胞筛选的抗体检测方法必须具有一般以快速、可靠、简便、特异、敏感的方法为原则，以便于一次处理大量样品。目前广泛用于筛选和鉴定单抗的效价检测方法是ELISA，故我们选择间接ELISA来检测抗体效价。

1. 实验试剂的配制

【包被缓冲液：碳酸盐缓冲液（简称CB）0.05M pH9.6】

Na2CO3 1.59g

NaHCO3 2.93g

H2O 至1000ml

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【抗体或免疫球蛋白稀释液0.15mol/L pH7.2 PBS】

Na2HPO4·12H2O 2.9g

KH2PO40.2g

KCL 0.2g NaCl 8.0g

H2O（蒸馏水）至1000ml

【ELISA洗液及HRP标记抗体稀释液0.15mol/L PH7.4，PBST】

NaCl 8.0g

KH2PO40.2g

Na2HPO4·12H2O 2.9g

KCl 0.2g

H2O 至1000ml

0.05%吐温（Tween）20 0.5ml

【封闭液】

BSA 2.0g PBS 100ml ELISA底物缓冲液（可溶性底物）PH5.0

【磷酸-柠檬酸缓冲液pH5.0】

0.1mol/L柠檬酸（19.2g/1L) 24.3ml

0.2mol/L Na2 HPO4（28.4g/1L) 25.7ml

H2O 50ml

4°C存放备用

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【TMB使用液，新鲜配制】

TMB (3′，3′，5′，5′，-四甲基联苯胺）1mg

无水乙醇1ml

底物缓冲液10ml

0.75%H2O232μl(临用前加入)

【2M H2SO4终止液的配制】

H2O 178.3ml

逐滴加入98%H2SO421.7ml

2. 实验步骤

[1] 包被酶标反应孔(并设置空白对照,阴性对照)

用包被液将uPA稀释到100μg /ml，以100μl/孔，即10μg/孔加入到酶标反应孔，空白孔只加蒸馏水100μl/孔，置4℃过夜，弃去孔中液体，用洗涤液满孔洗涤，3 min /次，共洗4次。

[2] 封闭酶标反应孔

用封闭液100μl/孔，封闭酶标反应孔，置37℃恒温水浴中，封闭60min。封闭时将封闭液加满各反应孔，并去除各孔中的气泡，封闭结束后用洗涤液满孔洗涤4遍，每遍3min。

[3] 加入待测抗体血清

阴性对照的稀释度：按照我们前期的试验所得，检测时采用1:200的稀释度（图1）阳性对照的稀释度：按照1:25、1:50、1:100、1:200、1:400、1:800、1:1600、1:3200、1:6400、1:12800进行倍比稀释10个浓度

空白对照孔：加入PBS

阴性对照孔：加入阴性血清

阳性对照孔：加入阳性血清

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每样品至少加双孔，每孔100μl，置于37℃恒温水浴，60min。用洗涤液满孔洗涤3遍，每遍3min。

[4] 加入HRP—酶标羊抗小鼠IgG(新鲜配制)

酶标抗体：根据提供商提供的参考工作稀释度进行，本实验选择1:100000，37℃恒温水浴，60min。每孔加100μl，洗涤5次。

[5] 加入TMB底物液(现用现配)

底物加入量:每孔100μl，置37℃水浴，避光放置30 min。

[6] 终止反应

每孔加入终止液50μl终止反应，TMB显色后2min内以空白孔调零，在全自动酶标检测仪读取OD450值。

[7] 结果判断

选择阴性对照血清的OD450值在0.2以下，阳性血清的OD450值在0.8以上，取阳性血清的OD450/阴性血清的OD450比值大于2.1时的阳性血清最大稀释度即为阳性血清抗体效价。

(三) 细胞融合

1. 主要试剂的配制

【HAT培养基的配制】

【贮备液成分】100×

次黄嘌呤（Hypoxanthine: H） 1.0×10-2 M

胸腺嘧啶核苷（Thymidine: T） 1.6×10-3 M

氨基喋呤（Amiropterin: A） 4.0×10-5 M

【HT贮备液配制】

称取136.1 mg H，38.8 mg T。

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依次溶解在100ml双蒸水中，因H难溶，可加温50~80℃促溶。

用0.22微米滤膜滤过除菌，每瓶分装2~5ml，-20℃冰箱贮存。

【A贮备液配制】

称取17.6mg A到90ml双蒸水中。

滴加1M NaOH溶液并不断摇动，直至完全溶解，再滴加等量1M HCl溶液，恢复pH在7.0左右。

补足双蒸水至最终体积100ml。

0.22微米滤膜滤过除菌，分装，-20℃冰箱贮存。使用时，每100ml培养液（含血清）加1ml HT贮备液和1ml A贮备液。

【 HAT培养液配制】

临用前，于每100ml RPMI-1640培养基中(含10%小牛血清或牛血清)加1ml HT贮备液和1 mlA贮备液。

【50%PEG（诱导剂）的配制】

取分子量4000的PEG高压蒸气灭菌（6.8kg，15min）

40℃水浴中融化后，37℃水浴中温浴

取无血清培养液37℃水浴中温浴（单独）

配50%浓度时，用刻度吸管吸0.5ml PEG和0.5ml无血清培养液以W/V混合，检查pH，用HCl或7.5%的NaHCO3调整到pH8.0～pH8.2，37℃水中温育备用。

【0.83%Tris-NH4CL】

Tris 10.3g

NH4CL 3.735g，

去离子水 500ml

华中科技大学硕士学位论文

用1mol/L的HCL,调pH 到7.0，高压灭菌，调pH为7.2～7.4。

2. 实验内容

[1] 瘤细胞的准备

本实验选择与免疫小鼠同一品系的骨髓瘤细胞SP2/0(购自华中科技大学同济医学院免疫教研室)，在融合前2周开始复苏骨髓瘤细胞，为防止出现返祖现象，在融合前，将1640培养基内加入15μg/ml 8－氮鸟嘌呤(8-AG)，取约1×107～6×107对数生长期（即培养15h－20h）的骨髓瘤细胞，在室温离心（400g）10min，弃上清，用10％FBS—1640液悬浮细胞沉淀，并计数。

[2] 饲养细胞的准备

1) 拉颈处死小鼠。

2) 75％酒精浸泡消毒皮毛5min。

3) 用手术剪将小鼠腹部剪开一小口，剥开皮肤，露出腹腔。

4) 用注射器将4ml 无血清1640培养基溶液注入腹腔，用手指轻揉1min仍用该

注射器回抽腹腔液体，加入10ml离心管。

5) 400g离心10min。

6) 弃上清，以HAT选择培养液将细胞制成悬液，用台盼蓝染色法计数活细胞，

使每ml含4×105个活细胞。

7) 以1ml吸管将细胞种入96孔培养板，每孔50μl，含2X104个细胞，放入CO2

培养箱培养，供细胞融合和克隆化之用。

[3] 脾细胞的制备

取最后一次加强免疫3天后的脾脏。其步骤如下：

1) 取已经免疫过的血清抗体滴度高的BALB/c小鼠，摘除眼球采血，并分离血

清作为抗体检测时的阳性对照血清，同时拉颈处死小白鼠。

2) 将小鼠放于75％酒精中浸泡5min消毒毛皮，取出固定于板上，掀开左侧腹部

皮肤，可看到脾脏，换眼科剪镊，在超净工作台中用无菌手术剪开腹膜，取

出脾脏置于已盛有10ml不完全培养基的平皿中。

抗体的制备方法与原理

抗体的制备方法与原理－单克隆抗体的制备 1975年Kohler和Milstein发现将小鼠骨髓瘤细胞与和绵羊红细胞免疫的小鼠脾细胞进行融合，形成的杂交瘤细胞既可产生抗体，又可无性繁殖，从而创立了单克隆抗体杂交瘤技术。这一技术上的突破使血清学的研究进入了一个高度精确的新纪元。 免疫细胞化学的技术关键之一是制备特异性强、亲合力大、滴度高的特异性抗体，由于每种抗原都有几个抗原决定簇，用它免疫动物将产生对各个决定簇的抗体，即多克隆抗体。单克隆抗体则是由一个产生抗体的细胞与一个骨髓瘤细胞融合而形成的杂交廇细胞经无性繁殖而来的细胞群所产生的，所以它的免疫球蛋白属同一类型，质地纯一，而且它是针对某一抗原决定簇的，因此特异性强，亲合性也一致。单克隆抗体（McAb）的特性和常规血清抗体的特性比较见2-3。 表2—3 单克隆抗体（McAb）和常规免疫血清抗体的特性比较 单克隆抗体的制备方法如下。 （一）动物的选择与免疫 1．动物的选择纯种BALB/C小鼠，较温顺，离窝的活动范围小，体弱，食量及排污较小，一般环境洁净的实验室均能饲养成活。目前开展杂交瘤技术的实验室多选用纯种BALA/C小鼠。

2．免疫方案选择合适的免疫方案对于细胞融合杂交的成功，获得高质量的McAb 至关重要。一般在融合前两个月左右根据确立免疫方案开始初次免疫，免疫方案应根据抗原的特性不同而定。 （1）可溶性抗原免疫原性较弱，一般要加佐剂，半抗原应先制备免疫原，再加佐剂。常用佐剂：福氏完全佐剂、福氏不完全佐剂。 初次免疫抗原1～50μg加福氏完全佐剂皮下多点注射或脾内注射（一般0.8～ 1ml,0.2ml/点） ↓3周后 第二次免疫剂量同上，加福氏不完全佐剂皮下或ip（腹腔内注射）（ip剂量不宜超过0.5ml） ↓3周后 第三次免疫剂量同一，不加佐剂，ip（5～7天后采血测其效价） ↓2～3周 加强免疫，剂量50～500μg为宜，ip或iv（静脉内注射） ↓3天后 取脾融合 目前，用于可溶性抗原（特别是一些弱抗原）的免疫方案也不断有所更新，如：①将可溶性抗原颗粒化或固相化，一方面增强了抗原的免疫原性，另一方面可降低抗原的使用量。 ②改变抗原注入的途径，基础免疫可直接采用脾内注射。③使用细胞因子作为佐剂，提高机体的免疫应答水平，增强免疫细胞对抗原的反应性。 （2）颗粒抗原免疫性强，不加佐剂就可获得很好的免疫效果。以细胞性抗原为例，免疫时要求抗原量为1～2×107个细胞。

记忆细胞能直接产生抗体吗细胞周期能缩短吗

记忆细胞能直接产生抗体吗？细胞周期能缩短吗？ 主题：记忆细胞能直接产生抗体吗？细胞周期能缩短吗？ 2008jiaoss 第一.我们知道浆细胞能直接产生抗体，而记忆B细胞能直接产生抗体吗？还是记忆B细胞通过形成浆细胞，然后再由浆细胞产生抗体的呢？ 第二.人教版教材上描述记忆细胞产生抗体时，是这么描述的：“记忆细胞可以在抗原消失后很长时间内保持对这种抗原的 记忆，当再接触这种抗原时，能【迅速】增殖分化，快速产生大量的抗体。”——问题是：这里的“迅速”怎么理解？是指“记忆细胞”这种细胞的“细胞周期”能够缩短？还是其它呢？. 不知道各位老师是怎么理解的？欢迎提出高见，谢谢！ ty200202_0 1.记忆B细胞通过形成浆细胞，然后再由浆细胞产生抗体. 2.记忆细胞可以在抗原消失后很长时间内保持对这种抗原的记忆，当再接触这种抗原时，能迅速增殖分化成浆细胞（效应B细胞），浆细胞快速产生大量的抗体。记忆细胞和浆细 胞的细胞周期都缩短体现了迅速和高效。

2008jiaoss 谢谢答复，还是有疑问： 1、这么说，除了浆细胞和杂交瘤细胞外，没有其它细胞能直接产生抗体了？ 2、如果记忆细胞的细胞周期可以缩短，是指相对原来的B 细胞或者T细胞的细胞周期来说的？还是针对记忆细胞本身来说的呢？细胞周期到底能否变短？为什么？ lichenyun@126 细胞周期变短的说法有违定义，应细胞周期是相对于连续分裂的细胞而言。 2008jiaoss 没错，在人教版必修1中，已经定义了“细胞周期”，而且细胞的细胞周期，是不会变的，除非外来物质，导致基因突变。 各为又是怎么理解的呢？ 遗失的美好 记忆B细胞通过形成浆细胞，然后再由浆细胞产生抗体. 也就是说记忆细胞不能直接产生抗体，需要在同一抗原的刺激下进行分化形成相应的浆细胞才可以产生抗体。记住：产生抗体是浆细胞工作，不要让记忆细胞抢人家的饭碗！（开

单克隆抗体的制备及应用

单克隆抗体的制备及应用 单克隆抗体是由淋巴细胞杂交瘤产生的、只针对复合抗原分子上某一单个抗原决定簇。单克隆抗体技术(monoclonal antibody technique)：一种免疫学技术，将产生抗体的单个B淋巴细胞同骨髓肿瘤细胞杂交，获得既能产生抗体，又能无限增殖的杂种细胞，并以此生产抗体。是仅由一种类型的细胞制造出来的抗体，对应于多克隆抗体、多株抗体——由多种类型的细胞制造出来的一种抗体。 1 单克隆抗体的优点与局限性： 单克隆抗体的优点：(1)杂交瘤可以在体外“永久”地存活并传代，只要不发生细胞株的基因突变，就可以不断地生产高特异性、高均一性的抗体。(2)可以用相对不纯的抗原，获得大量高度特异的、均一的抗体。(3)由于可能得到“无限量”的均一性抗体，所以适用于以标记抗体为特点的免疫学分析方法，如IRMA和ELISA等。(4)由于单克隆抗体的高特异性和单一生物学功能，可用于体内的放射免疫显像和免疫导向治疗。 总体来说，即：高特异性、高纯度、重复性好、敏感性强、成本低和可大量生产等。 单克隆抗体的局限性：(1)单克隆抗体固有的亲和性和局限的生物活性限制了它的应用范围。由于单克隆抗体不能进行沉淀和凝集反应，所以很多检测方法不能用单克隆抗体完成。 (2)单克隆抗体的反应强度不如多克隆抗体。(3)制备技术复杂，而且费时费工，所以单克隆抗体的价格也较高。 2 单克隆抗体的制备： 单克隆抗体的制备原理：应用细胞杂交技术使骨髓瘤细胞与免疫的淋巴细胞二者合二为一，得到杂种的骨髓瘤细胞。这种杂种细胞继承两种亲代细胞的特性，它既具有B淋巴细胞合成专一抗体的特性，也有骨髓瘤细胞能在体外培养增殖永存的特性，用这种来源于单个融合细胞培养增殖的细胞群，可制备抗一种抗原决定簇的特异单克隆抗体。 单克隆抗体的制备过程：抗原准备、动物的选择与免疫、细胞融合、选择杂交瘤细胞及抗体检测、杂交瘤的克隆化、杂交瘤细胞的冻存与复苏、单克隆抗体的纯化等步骤。 抗原准备 抗原，是指能够刺激机体产生（特异性）免疫应答，并能与免疫应答产物抗体和致敏淋巴细胞在体外结合，发生免疫效应（特异性反应）的物质。抗原的基本特性有两种，一是诱导免疫应答的能力，也就是免疫原性，二是与免疫应答的产物发生反应，也就是抗原性。很多物质都可以成为抗原，抗原的具体分类可以参见抗原，在进行单克隆抗体制备过程中，很多物质都可以成为抗原，在常规的科研实验中，科研者经常选用每只小鼠/大鼠每次注射10~50ug 重组蛋白、偶联多肽、偶联小分子等作为抗原产生特异性的单克隆抗体。 动物的选择与免疫

细胞毒性药物配制方法及使用时注意事项

抗肿瘤药物的用药顺序及溶媒选择 原则 （1）药物相互作用原则 有的化疗药物之间会发生相互作用，从而改变药物的体内过程，可能影响疗效或毒性。 如顺铂影响紫杉醇的清除率，先用紫杉醇再用顺铂。 （2）刺激性原则 使用非顺序依赖性化疗药物时，应先用对组织刺激性较强的药物，后用刺激性小的药物。由于治疗开始时静脉尚未损伤，结构稳定性好，药业渗出机会少，药物对静脉引起的不良 反应较小如长春瑞滨和顺铂合用时，长春瑞滨刺激性强，宜先给药。 （3）细胞动力学原则 生长较慢的实体瘤处于增殖期的细胞较少，G0期细胞较多，先用周期非特异性药物杀 灭一部分肿瘤细胞，使肿瘤细胞进入增殖期再用周期特异性药物。顺铂和依托泊苷合用时，先用顺铂后用VP-16。 生长快的肿瘤先用周期特异性药物大量杀灭处于增殖周期的细胞，减少肿瘤负荷，随后用周期非特异性药物杀灭残存的肿瘤细胞。 用药顺序 1、联用顺铂化疗 化疗方案联用药物用药顺序原因 GP 吉西他滨先用GEM 顺铂会影响吉西他滨的体内过程，加重骨髓抑制。TP 紫杉醇先用PTX 顺铂对细胞色素P450酶有调节作用，可使PTX清除 率大约降低33%,产生更为严重的骨髓抑制 FP 5-FU 先用DDP 小剂量DDP能够增加细胞内蛋氨酸, 使细胞内活性叶酸生成增加, 从而增加5-FU的抗肿瘤作用。 PP 培美曲塞先用Alimta，30min后用顺铂说明书 2、联合长春新碱化疗 化疗方案联用药物用药顺序原因 CHOP 环磷酰胺先用VCR，6-8小时后在给CTX VCR具有同步化作用，使细胞停滞在M期，约6~8h后细胞同步进入G1期，再用CTX可增效 VCM 甲氨蝶呤先用VCR VCR阻止甲氨蝶呤从细 胞内渗出而提高细胞内浓度 VDLP 门冬酰胺酶先用VCR 合用加重神经系统血液系统毒性，先于门冬12~24小时给药 3、甲氨蝶呤 化疗方案联用药物用药顺序原因 CMF 5-FU 用MTX4～6h后用5-FU 序贯抑制 MTX----二氢叶酸还原酶抑制 剂 5-FU-----胸腺嘧啶合成酶抑制剂

CDC ADCC细胞毒性

1 Antibody-dependent cellular cytotoxicity (ADCC)抗体依赖的细胞介导的细胞毒性作用 In antibody-dependent cellular cytotoxicity (ADCC), Fc gamma receptors (FcγR or FCGR) on the surface of immune effector cells bind the Fc region of an antibody, itself specifically bound to a target cell. The cells that can mediate ADCC are nonspecific cytotoxic cells such as natural killer cells, macrophages, monocytes and eosinophils. Upon FCGR binding to the antibody, the FCGR ITAM is phosphorylated, which triggers the activation of the effector cell and the secretion of various substances (lytic enzymes, perforin, granzymes, TNF) that mediate the destruction of the target cell. The level of ADCC effector function is high for human IgG1 and IgG3, low for IgG2 and IgG4, and for these last two subclasses, the level of binding depends on the FCGR isotype and on the cell type. 2 Complement-dependent cytotoxicity (CDC) 补体依赖的细胞毒性作用 In complement-dependent cytotoxicity (CDC), the C1q binds the antibody and this binding triggers the complement cascade which leads to the formation of the membrane attack complex (MAC) (C5b to C9) at the surface of the target cell, as a result of the classical pathway complement activation.

单克隆抗体制备中筛选杂交瘤细胞的原理

单克隆抗体制备过程中筛选杂交瘤细胞的原理和方法单克隆抗体制备过程中，有两次筛选过程，第一次是选出杂交瘤细胞（用选择培养基），第二次是进一步选出能产生我们需要的抗体的杂交瘤细胞。 第一次筛选的原理和方法： 细胞融合后，杂交瘤细胞的选择性培养是第一次筛选的关键。普遍采用的HAT选择性培养液是在普通的动物细胞培养液中家次黄嘌呤、氨基蝶呤和胸腺嘧啶核苷酸。其一居室细胞中的DNA合成油两条途径： 一条途径是生物合成途径（“D途径”），即由氨基酸及其其他小分子化合物合成氨基酸，为DNA分子的合成提供原料。再此合成过程中，叶酸作为重要的辅酶参与这一过程，而HAT培养液中氨基蝶呤是一种叶酸的拮抗物，可以阻断DNA合成的D途径。 另一条途径是应急途径（“S途径”），她是利用次黄嘌呤——鸟嘌呤磷酸核苷转移酶和胸腺嘧啶核苷激酶催化次黄嘌呤和胸腺嘧啶生成相应的核苷酸，两种酶缺一不可。 因此，在HAT培养液中，未融合的效应B 细胞核两个效应B细胞融合的D途径被氨基蝶呤阻断，随S途径正常，但因缺乏在体外培养液中增殖的能力，一般10天左右会死亡。对于骨髓瘤细胞以及自身融合细胞而言，由于通常采用的骨髓瘤细胞是次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核苷转移酶缺陷型细胞，因此自身没有S途径，且D途径又被氨基蝶呤阻断，所有在HAT培养液中也不能增殖而很快死亡。只有骨髓瘤细胞与效应B细胞相互融合形成的杂交瘤细胞，既具有效应B细胞的S途径，又具有骨髓瘤细胞在体外培养液中长期增殖的特性，因此能在HAT培养液中选择性存活下来，并不断增殖。 第二次筛选的原理和方法： 在单克隆抗体的生产过程中，由于效应B细胞的特异性是不同的，经HAT培养液第一次筛选出的杂交瘤细胞产生的抗体存在差异，必须对杂交瘤细胞进行第二次筛选，

小鼠在免疫抗原后机体产生的特异性免疫应答研究

实验目的：验证小鼠在接受抗原之后机体产生了特异性免疫反应，并观察小鼠各项生理指标以及免疫器官的反应状况，再观察T细胞和B细胞在此应答的反应状况。 实验假设：小鼠免疫灭活疫苗之后，机体会逐渐产生特异性免疫应答，一方面T 细胞在接受抗原刺激之后，经过阳性和阴性选择，T细胞从CD4，CD8双阳性选择为单阳性T细胞，并逐步转移，最终到达淋巴结等组织产生效应；另一方面，B细胞也会发育分化为浆细胞和记忆细胞，相应的浆细胞产生抗体以应对抗原。由于小鼠在接受抗原之后，免疫细胞在胸腺和脾脏内的数量和种类将发生变化，另外小鼠血清中也会产生相应的抗体。 因此假设，在排出其他偶然因素引起的误差的情况下，有以下结果： 1. 免疫后的小鼠胸腺大小比对照组更小，脾脏大小比对照组更大；另外免疫后小鼠的淋巴结比对照组更大。 2. 免疫后的小鼠胸腺免疫细胞数量小于对照组，脾脏免疫细胞数量大于对照组。 3. 免疫后小鼠胸腺中的单阳性淋巴细胞比对照组单阳性淋巴细胞更多，双阳性淋巴细胞比对照组更少；免疫后小鼠的脾脏中单阳性淋巴细胞数量多于对照组单阳性淋巴细胞数量。 4. 免疫后小鼠血清里面的抗体检测呈阳性，对照组小鼠血清抗体检测呈阴性。预期结果： 预计结果与假设一致，即： 1. 免疫后的小鼠胸腺大小比对照组更小，脾脏大小比对照组更大；另外免疫后小鼠的淋巴结比对照组更大。 2. 免疫后的小鼠胸腺免疫细胞数量小于对照组，脾脏免疫细胞数量大于对照组。 3. 免疫后小鼠胸腺中的单阳性淋巴细胞比对照组单阳性淋巴细胞更多，双阳性淋巴细胞比对照组更少；免疫后小鼠的脾脏中单阳性淋巴细胞数量多于对照组单阳性淋巴细胞数量。 4. 免疫后小鼠血清里面的抗体检测呈阳性，对照组小鼠血清抗体检测呈阴性。实验方法：

单克隆抗体制备中筛选杂交瘤细胞的原理

单克隆抗体制备中筛选杂交瘤细胞的原理 标准化管理部编码-[99968T-6889628-J68568-1689N]

单克隆抗体制备过程中筛选杂交瘤细胞的原理和方法 单克隆抗体制备过程中，有两次筛选过程，第一次是选出杂交瘤细胞（用选择培养基），第二次是进一步选出能产生我们需要的抗体的杂交瘤细胞。 第一次筛选的原理和方法： 细胞融合后，杂交瘤细胞的选择性培养是第一次筛选的关键。普遍采用的HAT选择性培养液是在普通的动物细胞培养液中家次黄嘌呤、氨基蝶呤和胸腺嘧啶核苷酸。其一居室细胞中的DNA合成油两条途径： 一条途径是生物合成途径（“D途径”），即由氨基酸及其其他小分子化合物合成氨基酸，为DNA分子的合成提供原料。再此合成过程中，叶酸作为重要的辅酶参与这一过程，而HAT培养液中氨基蝶呤是一种叶酸的拮抗物，可以阻断DNA合成的D途径。 另一条途径是应急途径（“S途径”），她是利用次黄嘌呤——鸟嘌呤磷酸核苷转移酶和胸腺嘧啶核苷激酶催化次黄嘌呤和胸腺嘧啶生成相应的核苷酸，两种酶缺一不可。 因此，在HAT培养液中，未融合的效应B细胞核两个效应B细胞融合的D途径被氨基蝶呤阻断，随S途径正常，但因缺乏在体外培养液中增殖的能力，一般10天左右会死亡。对于骨髓瘤细胞以及自身融合细胞而言，由于通常采用的骨髓瘤细胞是次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核苷转移酶缺陷型细胞，因此自身没有S途径，且D途径又被氨基蝶呤阻断，所有在HAT培养液中也不能增殖而很快死亡。只有骨髓瘤细胞与效应B细胞相互融合形成的杂交瘤细胞，既具有效应B细胞的S途径，又具有骨髓瘤细胞在体外培养液中长期增殖的特性，因此能在HAT培养液中选择性存活下来，并不断增殖。 第二次筛选的原理和方法： 在单克隆抗体的生产过程中，由于效应B细胞的特异性是不同的，经HAT培养液第一次筛选出的杂交瘤细胞产生的抗体存在差异，必须对杂交瘤细胞进行第二次筛选，选出能产生特定抗体的杂交瘤细胞。二次筛选通常采用有限稀释克隆细胞的方法，将杂交瘤细胞多倍稀释，接种在多孔的细胞培养板上，是每孔细胞不超过一个，通过培养让其增殖，然后检测各孔上清液中的细胞分泌的抗体，上清液可与特定抗原结合的培养孔为阳性孔。阳性孔中的细胞还不能保证是来自单个细胞，继续进行有限

细胞毒性T细胞作用的分子机制

第四章 细胞毒性T 细胞作用的分子机制 免疫系统针对病原所产生的免疫应答分为两大类：以抗体为主体介导的中和细胞外病原体的体液免疫反应和以细胞毒性T 细胞（CTL ）为主体介导的特异杀伤被感染靶细胞的细胞免疫反应。其中细胞免疫反应对于彻底地杀灭病原体、清除被感染的“改变”了的自身细胞显得尤为重要。细胞免疫反应包括NK 细胞等介导的非特异性靶细胞杀伤和CTL 为主、Th 细胞为辅所介导的特异性靶细胞杀伤。CTL 对于被感染细胞的MHC I 类分子限制特异性的杀伤是细胞免疫应答的重要内容，其研究对于了解免疫识别、免疫杀伤以及新型疫苗的分子设计都有重要意义。 第一节 CTL 作用概述 CTL 即杀伤性T 细胞，是一类具有CD8+表面标志、受MHC I 类分子限制性杀伤功能的T 细胞。CTL 的重要功能是可以特异性地杀伤靶细胞。CTL 介导的靶细胞杀伤的特点是：杀伤受TCR 以及MHC I 类分子的严格限制。CTL 对靶细胞的杀伤还具有特异性、程序性和快速性的特点。另外，IL-2和其它一些细胞因子在CTL 前体的体外培养和效应CTL 的分化诱导中也起着重要作用。 一、CTL 的主要生物学功能 CTL 对感染了病原的靶细胞杀伤构成了细胞免疫的重要部分。CTL 在识别“改变”了的自身细胞，如病毒感染细胞、恶性细胞和移植反应中的移植细胞等起着非常重要的作用。由于人体所有的有核细胞都表达I 类MHC 分子，因此，CTL 原则上可以识别和清除几乎所有改变了的自身细胞。 二、CTL 作用的MHC 限制性 CTL 的杀伤作用受MHC 严格限制。CTL 在杀伤抗原特异性靶细胞过程中，不识别可溶性抗原或者与非自身MHC I 类分子结合的抗原，而只能识别与自身MHC I 类分子相联系的特异性抗原多肽。 三、CTL 的组成 CTL 的命名是根据体外与一定比例的特异性靶细胞孵育后杀伤一定百分率的靶细胞这一功能来确定的。因此，CTL 不是一种特定的细胞，而是一个具有特异性杀伤活性的T 细胞群体。在组成上，它包括CD8+T 细胞和CD4+T 细胞。 1、CD8+ T 细胞 主要有αβTCR 型CD8+T 细胞和γδTCR 型CD8+T 细胞。前者以αβTCR 识别靶细胞表面上的MHC I 类分子-肽复合物（图4- ）；后者则以γδTCR 识别靶细胞表面的 HLA-I HLA-II 图4-1 TCR-抗原肽-HLA 三分子复合物 αβ TCR αβ TCR

抗体

本专题以抗体为出发点，联系了高中教材中多个章节的知识点，如免疫、遗传的物质基础、生物膜系统及细胞工程、动物代谢知识等。以该知识点为专题进行复习，不仅可以进一步熟知教材中的相关知识点，加强对课本知识的横纵向联系，使知识更加系统化，而且对于培养分析、综合、应用等能力有一定的帮助。一、知识体系： 一知识解析 （一）抗体的定义： ●产生：抗体是机体受到抗原刺激后产生的 ●特性：能与该抗原发生特异性结合 ●功能：具有免疫功能 ●化学本质：球蛋白（可用双缩脲试剂进行鉴定，产生紫色反应） （二）抗体的结构： 组成抗体的基本元素是C、H、O、N等，由各种化学元素组成基本单位――氨基酸，各种氨基酸通过缩合方式形成肽链，抗体是由4条肽链构成的蛋白质，4条肽链通过一定的化学键连接，再折叠、盘曲形成的空间结构就是抗体。 （三）抗体的合成与分泌： 1．抗体是分泌蛋白，其合成及分泌是在体液免疫的反应阶段进行的，合成部位是在效应B 细胞内的粗面内质网上的核糖体上，与其合成及分泌相关的细胞器有核糖体、内质网、高尔基体、线粒体（注意掌握各细胞器所起的作用）；其合成及分泌的途径是：核糖体→内质网→高尔基体→细胞膜→胞外，分布到血清、组织液、外分泌液（如唾液、泪、尿、乳汁等）中；该物质出细胞的方式为外排作用。 2．抗体的合成要受到相应基因的控制，控制其合成的基因为真核细胞基因，其结构包括编码区和非编码区，非编码区对编码区的表达起调控作用，编码区包括内含子和外显子。3．基因控制抗体的合成包括转录和翻译过程。（场所、原料、条件、过程等） 4．人体内合成抗体所需要的原料－氨基酸的来源途径有：肠道吸收、自身蛋白质的分解、氨基转换作用（其它物质的转变）等。 （四）抗体的作用及与人体健康 抗体主要在体液免疫的效应阶段起作用，作用方式有三种：①抑制细菌繁殖和对宿主细胞的黏附；②使病毒失去，感染和破坏细胞的能力，③多数情况是与抗原作用形成沉淀或细胞集团，被吞噬细胞吞噬消化。抗体在细胞免疫的效应阶段还可以协助效应T细胞清除抗原。当免疫功能失调时，可引起各种免疫病，如： ●在过敏原的作用下产生的抗体会吸附在某些细胞的表面上，当过敏原再次侵入人体，抗体会作用于相应的细胞释放出化学物质（如组织胺），使机体产生过敏反应。体液免疫反应与过敏反应中抗体的比较如下： 比较项目体液免疫反应过敏反应 区别 分布血清（主要）、组织液和外分泌液中 吸附于皮肤、呼吸道、消化道黏膜及血液中某 些细胞的表面。 作用 机理 与抗原特异性结合，使抗原沉淀或形成细 胞集团等，消灭抗原。 过敏原与细胞表面的抗体结合，使细胞释放组 织胺等，从而引起过敏反应。 相同点都是由效应B细胞产生的，化学本质都是免疫球蛋白。 ●在某些特殊情况下，若人体的免疫系统对自身成分发生自身免疫反应，对自身的组织和器官造成损伤并出现症状，就称为自身免疫病。

单克隆抗体制备过程中经过两次筛选

单克隆抗体制备过程中经过两次筛选 单克隆抗体制备过程中，总共有两次筛选，第一次筛选出杂交瘤细胞，第二次筛选出能产生特异性抗体的杂交瘤细胞，两次筛选的原理和方法是不相同的。 第一次筛选的原理与方法：细胞融合后，杂交瘤细胞的选择性培养是第一次筛选的关键。普遍采用的HAT选择性培养液是在普通的动物细胞培养液中加入次黄嘌呤（H）、氨基喋呤（A）和胸腺嘧啶核苷酸（T）。其依据是细胞中的DNA合成有两条途径：一条途径是生物合成途径（“D途径”），即由氨基酸及其他小分子化合物合成核苷酸，为DNA分子的合成提供原料。在此合成过程中，叶酸作为重要的辅酶参与这一过程，而HAT培养液中氨基喋呤是一种叶酸的拮抗物，可以阻断DNA合成的“D途径”。另一条途径是应急途径或补救途径（“S途径”），它是利用次黄嘌呤—鸟嘌呤磷酸核苷转移酶（HGPRT）和胸腺嘧啶核苷激酶（TK）催化次黄嘌呤和胸腺嘧啶核苷生成相应的核苷酸，两种酶缺一不可。因此，在HAT培养液中，未融合的效应B细胞和两个效应B细胞融合的“D途径”被氨基喋呤阻断，虽“S途径”正常，但因缺乏在体外培养液中增殖的能力，一般10d左右会死亡。对于骨髓瘤细胞以及自身融合细胞而言，由于通常采用的骨髓瘤细胞是次黄嘌呤—鸟嘌呤磷酸核苷转移酶缺陷型（HGPRT）细胞，因此自身没有“S途径”，且“D途径”又被氨基喋呤阻断，所以在HA T培养液中也不能增殖而很快死亡。惟有骨髓瘤细胞与效应B细胞相互融合形成的杂交瘤细胞，既具有效应B细胞的“S途径”，又具有骨髓瘤细胞在体外培养液中长期增殖的特性，因此能在HA T培养液中选择性存活下来，并不断增殖。 第二次筛选的原理和方法：在实际免疫过程中，由于采用连续注射抗原的方法，且一种抗原决定簇刺激机体形成相对应的一种效应B淋巴细胞，因此，从小鼠脾脏中取出的效应B淋巴细胞的特异性是不同的，经HA T培养液筛选的杂交瘤细胞特异性也存在差异，所以必须从杂交瘤细胞群中筛选出能产生针对某一预定抗原快定簇的特异性杂交瘤细胞。通常采用有限稀释克隆细胞的方法，将杂交瘤细胞多倍稀释，接种在多孔的细胞培养板上，使每一孔含一个或几个杂交瘤细胞（理论上30%的孔中细胞数为0时，才能保证有些孔中是单个细胞），再由这些单细胞克隆生长，最终选出分泌预定特异抗体的杂交细胞株进行扩大培养。因此，单克隆抗体制备过程中，两次筛选的原理和方法是不相同的。 单克隆抗体制备的基本原理与过程 原理： B淋巴细胞在抗原的刺激下，能够分化、增殖形成具有针对这种抗原分泌特异性抗体的能力。B细胞的这种能力和量是有限的，不可能持续分化增殖下去，因此产生免疫球蛋白的能力也是极其微小的。将这种B细胞与非分泌型的骨髓瘤细胞融合形成杂交瘤细胞，再进一步克隆化，这种克隆化的杂交瘤细胞是既具有瘤的无限生长的能力，又具有产生特异性抗体的B淋巴细胞的能力，将这种克隆化的杂交瘤细胞进行培养或注入小鼠体内即可获得大量的高效价、单一的特异性抗体。这种技术即称为单克隆抗体技术。 过程： 1）免疫脾细胞的制备制备单克隆抗体的动物多采用纯系Balb/c小鼠。免疫的方法取决于所用抗原的性质。免疫方法同一般血清的制备，也可采用脾内直接免疫法。 2）骨髓瘤细胞的培养与筛选在融合前，骨髓瘤细胞应经过含8-AG的培养基筛选，防止细胞发生突变恢复HGPRT 的活性（恢复HGPRT的活性的细胞不能在含8-AG的培养基中存活）。骨髓瘤细胞用10%小牛血清的培养液在细胞培养瓶中培养，融合前24h换液一次，使骨髓瘤细胞处于对数生长期。 3）细胞融合的关键: 1技术上的误差常常导致融合的失败。例如，供者淋巴细胞没有查到免疫应答。这必然要失败的。 2融合试验最大的失败原因是污染，融合成功的关键是提供一个干净的环境，以及适宜的无菌操作技术。 4）阳性克隆的筛选应尽早进行。通常在融合后10天作第一次检测，过早容易出现假阳性。检测方法应灵敏、准确、而且简便快速。具体应用的方法应根据抗原的性质，以及所需单克隆抗体的功能进行选择。常用的方法有RIA法、ELISA法和免疫荧光法等。其中ELISA法最简便，RIA法最准确。阳性克隆的筛选应进行多次，均阳性时才确定为阳性克隆进行扩增。 5）克隆化克隆化的目的是为了获得单一细胞系的群体。克隆化应尽早进行并反复筛选。这是因为初期的杂交瘤细胞是不稳定的，有丢失染色体的倾向。反复克隆化后可获得稳定的杂交瘤细胞株。克隆化的方法很多，而最常用的是有限稀释法。 （1）显微操作法：在显微镜下取单细胞，然后进行单细胞培养。这种方法操作复杂，效率低，故不常用。 （2）有限稀释法：将对数生长期的杂交瘤细胞用培养液作一定的稀释后，按每孔1个细胞接种在培养皿中，细胞增值后成为单克隆细胞系。第一次克隆化时加一定量的饲养细胞。由于第一次克隆化生长的细胞不能保证单克隆化，所以为获得稳定的单克隆细胞株需经2～3次的再克隆才成。应该注意的是，每次克隆化过程中所有有意义的细胞都

卵白蛋白口服液对小鼠免疫功能影响论文

卵白蛋白口服液对小鼠免疫功能的影响 【摘要】目的：观察卵白蛋白口服液对小鼠免疫功能的影响。方法：balb/c小鼠连续灌胃30天后检测碳廓清能力、迟发型变态反应、抗体生成细胞数、血清溶血素水平、巨噬细胞吞噬鸡红细胞能力、nk细胞活性及cona诱导的脾淋巴细胞转化能力等免疫指标。结果：卵白蛋白口服液对小鼠的脏/体比值、碳廓清能力及nk细胞活性无明显影响；对迟发型变态反应、抗体生成细胞数、hc 50、巨噬细胞吞噬鸡红细胞能力及cona诱导的小鼠淋巴细胞转化有显著作用。结论：卵白蛋白口服液能增强小鼠免疫功能。 【关键词】卵白蛋白；免疫功能；小鼠 【中图分类号】r 285 【文献标识码】a 【文章编号】1004- 7484（2012）04- 0123- 02 【abstract】objective：to observe the impact of the ovalbumin oral liquid on immune function in mice. methods：given balb/c mice the ovalbumin oral liquid intragastrically 30 days, we detected immune indicators, including carbon clearance ability, delayed type hypersensitivity, antibody-producing cell count, serum hemolysin level, macrophage phagocytosis of chicken erythrocytes capacity, nk cell activity and cona-induced lymphocyte transformationability, etc. results：the ovalbumin oral liquid had no obvious influence on organ weight / body weight ,

杂交瘤细胞生成抗体技术

杂交瘤细胞生成抗体技术 （一）杂交瘤技术的诞生 淋巴细胞杂交瘤技术的诞生是几十年来免疫学在理论和技术两方面发展的必然结果，抗体生成的克隆选择学说、抗体基因的研究、抗体结构与生物合成以及其多样性产生机制的揭示等，为杂交瘤技术提供了必要理论基础，同时，骨髓瘤细胞的体外培养、细胞融合与杂交细胞的筛选等提供了技术贮备。 1975年8月7日，Kohler和Milstein在英国《自然》杂志上发表了题为“分泌具有预定特异性抗体的融合细胞的持续培养”（Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity）的著名论文。他们大胆地把以前不同骨髓瘤细胞之间的融合延伸为将丧失合成次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶（hypoxanthine guanosine phosphoribosyl transferase，HGPRT）的骨髓瘤细胞与经绵羊红细胞免疫的小鼠脾细胞进行融合。融合由仙台病毒介导，杂交细胞通过在含有次黄嘌呤（hypoxanthine，H）、氨基喋呤（aminopterin，A）和胸腺嘧啶核苷（thymidine，T）的培养基（HAT）中生长进行选择。在融合后的细胞群体里，尽管未融合的正常脾细胞和相互融合的脾细胞是HGPRT+，但不能连续培养，只能在培养基中存活几天，而未融合的HGPRT-骨髓瘤细胞和相互融合的HGPRT-骨髓瘤细胞不能在HAT培养基中存活，只有骨髓瘤细胞与脾细胞形成的杂交瘤细胞因得到分别来自亲本脾细胞的HGPRT和亲本骨髓瘤细胞的连续继代特性，而在HAT培养基中存活下来。实验的结果完全像起始设计的那样，最终得到了很多分泌抗绵羊红细胞抗体的克隆化杂交瘤细胞系。用这些细胞系注射小鼠后能形成肿瘤，即所谓杂交瘤。生长杂交瘤的小鼠血清和腹水中含有大量同质的抗体，即单克隆抗体。 这一技术建立后不久，在融合剂和所用的骨髓瘤细胞系等方面即得到改进。最早仙台病毒被用做融合剂，后来发现聚乙二醇（PEG）的融合效果更好，且避免了病毒的污染问题，从而得到广泛的应用。随后建立的骨髓瘤细胞系如SP2/0-Ag14，X63-Ag8.653和NSO/1都是既不合成轻链又不合成重链的变种，所以由它们产生的杂交瘤细胞系，只分泌一种针对预定的抗

细胞毒理学

细胞毒理学及其研究方法 公共卫生学院劳动卫生教研室金亚平 定义: 毒理学(Toxicology)是研究外源性物质对生命有机体损伤作用规律及其机制的一门学科。 细胞毒理学(Cytotoxicology): 是研究外源性物质对生命细胞损伤作用规律及其机制的一门毒理学分支学科。 研究内容 细胞毒理学是以培养细胞为研究对象进行毒理学研究的一门科学，它主要是应用体外模型对外界环境中有害因子(物理、化学和生物)进行监测，评价其对人体可能产生的危害。 研究有害因子的一般毒性作用 判断外源性有害因子对细胞的一般毒性及评价可能引起的潜在毒性作用。 可通过光学显微镜/电镜及其他方法，直接观察体外培养细胞受损的性质与程度，如细胞的形态学改变、贴壁性差、生长速度减弱、细胞退化、死亡及完整性受损等。 已知对人类有毒性作用的大多数药物或毒物，在体内与体外的毒性效应是一致的。 研究有害因子的特异毒性作用 从哺乳动物或人体的不同组织器官分离出不同类型的细胞。用以筛检不同毒物对不同细胞的毒性。有害因子诱变作用及致癌作用: 体外培养细胞，特别是哺乳动物的离体细胞已广泛应用于体外测试诱变和致癌的试验中，其包括基因点突变、染色体畸变、姊妹染色单体互换、染色体显带、DNA 损伤、程序外DNA合成和细胞恶性转化等。如砷的致癌作用。 研究有害因子在细胞内的代谢 体外培养细胞可能是研究毒物代谢最合适的体外试验模型。体外细胞培养避免了体内复杂因素(如神经-内分泌、营养物质等)的干扰，可以按研究者预先设计的需要，来严格控制有害因子的剂量及与细胞接触的时间。可以直接检测、分析细胞内代谢的改变，容易了解毒物代谢与毒性之间的量-效关系。如砷体内代谢等。 研究有害因子的毒作用机制 也是研究有害因子毒性作用机制的最合适的材料。如用已建立的体外细胞转化系统研究辐射及化学致癌物诱发细胞癌变的机制，用血管上皮细胞和星形胶质细胞的体外培养系统研究毒物对血脑屏障的损伤，用巨噬细胞和成纤维细胞组成的体外培养系统，研究二氧化硅致矽肺纤维发生、发展过程及其作用机制。 用于药物的筛选、进行药效学评价 可用于研究药物的作用、毒副反应及其作用机制，为选择疗效好、毒副反应小的药物提供资料，在此研究基础上，对疗效好、毒性小的初筛药物，再用动物实验模型加以验证。 细胞毒理学发展简史 细胞毒理学作为毒理学的一个分支学科出现是近10多年的事。因此，它是一门较新的学科。 其优点: (1) 可以按实验要求控制实验条件，把整个实验安排在体外进行，在体外直接观察到细胞形态发生的改变，便于了解毒物与毒性作用之间的关系。 (2) 实验条件易于控制，可严格控制作用物的剂量和作用时间，排除体内复杂的神经-内分泌因素的干扰，实验结果稳定，重复性好。 (3) 操作简便，不需要复杂的大型仪器设备，实验经济。 (4) 可同时提供大量的生物学性状相同的细胞系(株)作为研究对象，避免了动物间的个体差异，实验易重复。 局限性： 因为细胞是在离开机体整体环境下，独立生长在体外环境中，其生物学性状多少会发生某些改变，

筛选杂交瘤细胞的方法

如何筛选杂交瘤细胞？ 教学中经常有学生问：如何筛选杂交瘤细胞？ 浙科版选修3教材中有筛选杂交瘤细胞的内容，但没有如何筛选的方法，以下的上海高考试题可以在教学中作为一个情境感知。 单克隆抗体制备示意图

NO.1 用选择培养基筛选 情境导入： 已知细胞合成D N A有D和S两条途径，其中D途径能被氨基嘌呤阻断。人淋巴细胞中有D N A合成的S途径，但一般不分裂增殖，鼠骨髓瘤细胞中尽管没有S途径，但能不断分裂增殖，将这两种细胞在试管中混合，加入聚乙二醇促进融合，获得杂种细胞（一般只考虑细胞两两融合）。 细胞存在情况分析： 骨髓瘤细胞和B淋巴细胞融合形成3种杂种细胞，则试管中有5种细胞，即B淋巴细胞自身融合的细胞、骨髓瘤细胞自身融合的细胞、杂交瘤细胞、B淋巴细胞和骨髓瘤细胞；鼠骨髓瘤细胞能不断分裂增殖，因此骨髓瘤细胞自身融合的细胞、杂交瘤细胞和骨髓瘤细胞能增殖。 设计方法： 在培养液中添加入氨基嘌呤再收集增殖的细胞。 原理分析： 加入氨基嘌呤后，使D合成途径阻断，仅有该合成途径的骨髓瘤细胞及其彼此融合的瘤细胞就不能增殖，但人淋巴细胞和骨髓瘤细胞融合后的杂种细胞可以利用淋巴细胞中的S途径合成D N A而增殖。

NO.2 HAT选择培养基筛选杂交瘤细胞的机理 首先，在已免疫过的B淋巴细胞（即效应B细胞）和骨髓瘤细胞进行杂交时，可能出现的情况应该先弄清楚。 如果只考虑两两融合，可能的情况有：（1）（效应）B淋巴细胞和（效应）B淋巴细胞的融合；（2）（效应）B淋巴细胞和骨髓瘤细胞的融合（即杂交瘤细胞）；（3）骨髓瘤细胞和骨髓瘤细胞的融合（即瘤瘤细胞）。

第一类细胞在体外培养的条件下，因为无法无限增殖，最终死亡，因此，筛选的关键是限制第二类细胞的增殖。科学家在设计实验时，已经考虑到这方面问题，所以他们选择的瘤细胞是有遗传缺陷的，即胸腺嘧啶核苷激酶缺陷（T K－）或者次黄嘌呤磷酸核苷转移酶（H G P R T－）缺陷。 筛选的目的：获得杂交瘤细胞。 筛选的方法：用选择性培养基来完成，即H A T培养基。 加入次黄嘌呤（H）、氨基喋呤（A）及胸腺嘧啶核苷（T）的培养基称H A T培养基。其中，氨基喋呤可阻断D N A合成的主要途径。主要途径阻断后，依靠应急途径即在H G P R T（次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移 酶）和T K（胸苷激酶）作用下，利用胸腺嘧啶和次黄嘌呤合成D N A，缺少其中一种，D N A合成不能发生。 用于杂交的骨髓瘤细胞系均由经有毒药物诱导而成选择产生的代谢缺陷型细胞，细胞内均无T K或H G P R T，所以单个或融合骨髓瘤细胞在H A T 培养液中将死亡。B细胞虽然有H G P R T和T K，但在体外通常培养条件下，尤其是在单个细胞环境下难于长期存活和增殖传代。因此，只有杂交瘤细胞才能在H A T培养液中生长繁殖。 淋巴细胞：不能生长，5到7天死亡，原因是D N A的主要合成途径被A 阻断。 骨髓瘤细胞：不能生长，5到7天死亡，原因是H G P R T缺乏，D N A合成的旁路途经受阻。

细胞毒性试验总结

（一）实验前应明确的问题 1.选择适当的细胞接种浓度。一般情况下，96孔培养板的一内贴壁细胞长满时约有105个细胞。但由于不同细胞贴壁后面积差异很大，因此，在进行MTT试验前，要进行预实验检测其贴壁率、倍增时间以及不同接种细胞数条件下的生长曲线，确定试验中每孔的接种细胞数和培养时间，以保证培养终止致细胞过满。这样，才能保证MTT结晶形成酌量与细胞数呈的线性关系。否则细胞数太多敏感性降低，太少观察不到差异。 2.药物浓度的设定。一定要多看文献，参考别人的结果再定个比较大的范围先初筛。根据自己初筛的结果缩小浓度和时间范围再细筛。切记！否则，可能你用的时间和浓度根本不是药物的有效浓度和时间。 3. 时间点的设定。在不同时间点的测定OD值，输入excel表，最后得到不同时间点的抑制率变化情况，画出变化的曲线，曲线什么时候变得平坦了（到了平台期）那个时间点应该就是最好的时间点（因为这个时候的细胞增殖抑制表现的最明显）。 4.培养时间。200ul的培养液对于10的4～5次方的增殖期细胞来说，很难维持68h，如果营养不够的话，细胞会由增殖期渐渐趋向G0期而趋于静止，影响结果，我们是在48h换液的。 5.MTT法只能测定细胞相对数和相对活力，不能测定细胞绝对数。做MTT时，尽量无菌操作，因为细菌也可以导致MTT比色OD值的升高。 6.理论未必都是对的。要根据自己的实际情况调整。 7.实验时应设置调零孔，对照孔，加药孔。调零孔加培养基、MTT、二甲基亚砜。对照孔和加药孔都要加细胞、培养液、MTT、二甲基亚砜，不同的是对照孔加溶解药物的介质，而加药组加入不同浓度的药物。 8.避免血清干扰。用含15％胎牛血清培养液培养细胞时，高的血清物质会影响试验孔的光吸收值。由于试验本底增加，会试验敏感性。因此，一般选小于10％胎牛血清的培养液进行。在呈色后，尽量吸净培养孔内残余培养液。 （二）实验步骤 贴壁细胞： 1.收集对数期细胞，调整细胞悬液浓度，每孔加入100ul,铺板使待测细胞调密度至1000-10000孔，（边缘孔用无菌PBS填充）。 2.5%CO2，37℃孵育，至细胞单层铺满孔底（96孔平底板）,加入浓度梯度的药物,原则上，

实验一 小鼠抗绵羊红细胞抗体的制备与检测

实验一小鼠抗绵羊红细胞抗体的制备与检测 实验原理：特异性免疫应答中，抗原可刺激机体产生特异性抗体。抗原免疫动物所产生的免疫血清实际上是针对该抗原表面不同表位的多种抗原的混合物，又称为多克隆抗体。 用纯化抗原免疫动物是制备多克隆抗体的常用方法。免疫血清的效价和特异性主要取决于抗原和实验动物两方面的因素。欲获得高效价的免疫血清，需同时加用佐剂以增强抗原的免疫原性；并适时地加强免疫以诱导机体的再次应答。欲获得高特异性的免疫血清，则必须保证抗原的纯度，在条件许可的范围内应对抗原进行最大限度的纯化。此外，抗原的剂量、免疫途径、免疫时间以及动物和佐剂的选择等，都是影响免疫血清效价和特异性的重要因素。实验步骤： 1、SRBC的制备：脱纤维防凝处理的绵羊血，加入适量生理盐水混匀，2000r/min离心5min，弃上清，再加入适量的生理盐水混匀，2000r/min离心5min，弃上清，利用生理盐水分别配制成上述浓度——20%SRBC、25%SRBC、30%SRBC、40%SRBC。 2、免疫小鼠：利用上述不同浓度的SRBC悬液给小鼠免疫，腹股沟皮下注射，每周1次，连续3周，每次0.1ml。注意做好标志。 3、溶血素的检测 （1）第4周，摘眼球取血，将血置于4℃冰箱内5~10min。 （2）5000r/min离心5~10min。 （3）按表进行试验。 （4）全部加完后混匀，置于37℃水浴中30min。 4、结果判定：首先判定第7管，出现不溶血现象，说明对照正确。然后判定1~6管如果出现溶血，说明试验成功，血清里含有溶血素。若未出现溶血则说明血清里不含有溶血素或含量太低未检测出来。 实验结果：左边为20%的实验组，右边为40%的实验组，1~4里分别加的是空白、阴性、阳性、待测血清。其中显色的3、4号为阳性，1、2号为阴性。 结果分析：根据4个管的颜色可知，待测小鼠血清为阳性，说明小鼠血清中含有抗绵阳红细胞抗原的抗体。但是左边3号颜色比右边深，可能是在实验过程中操作不当所致。 实验二豚鼠过敏实验——I型超敏反应 实验原理：超敏反应是指已致敏的机体再次接触相同变应原时，所引起的自身组织损伤和（或）生理功能紊乱。超敏反应是异常的或病理性的免疫应答。I型超敏反应又称为速发型超敏反应或变态反应。 在I型超敏反应中，变应原首次进入机体，刺激浆细胞产生IgE，IgE的Fc段与肥大细胞或嗜碱粒细胞表面的Fc?R结合，使得IgE吸附在这些细胞的表面，这是致敏阶段。当相同的变应原再次进入致敏机体时，即可与吸附在这些细胞表面的IgE结合，引起一系列反应，使这些细胞释放组胺等生物活性介质，引起I型超敏反应的发作，即发敏阶段。组胺是一个主要的生物活性介质，它的迅速释放，能扩张小血管和增加毛细血管通透性、刺激平滑肌收缩、促进黏膜腺体分泌增加；导致血压下降、呼吸困难、腹痛，甚至引起过敏性休克，导致死亡。 实验方法： 1、致敏注射：在实验开始前2周，给豚鼠注射皮下注射1ml稀释的蛋清。 2、发敏注射：固定好豚鼠，找到心尖搏动处，用碘酒、乙醇溶液依次消毒后，给豚鼠心内注射1ml稀释的蛋清。放开豚鼠，观察反应情况。