形态考试
1.细胞培养：
一．细胞培养的定义：从体内取出细胞，在模拟体内生理环境下（无菌、适当温度和一定的营养条件），使细胞生存、生长并维持其结构和功能的方法。
细胞培养的优点与不足
（一）优点：
1长时间直接观察活细胞的形态结构和生命活动：细胞学、遗传学、免疫学、肿瘤学……
2摄影、摄电影和闭路电视等方法记录细胞变化
3细胞种类广泛：从低等生物到高等生物（人）；从胚胎到成体；从正常细胞到肿瘤细胞
4便于使用各种技术：相差显微镜、荧光显微镜、电子显微镜、组织化学、同位素标记等
5易于使用物理、化学和生物因素等进行研究
6提供大量生物性状相似的实验对象，更经济
（二）不足：
1即使模拟体内环境的技术发展很快，但是与体内环境相比，仍有较大差异
2对无菌要求高
3失去神经体液的调节和细胞间的相互作用：去分化、永生或恶变
二．培养细胞的生存环境
（一）无污染环境
细胞培养环境无毒、无菌是首要条件
人体：皮肤、黏膜；免疫系统；解毒器官（肝脏）
体外：保持细胞培养环境无任何污染，及时清除代谢物
（二）温度
人和哺乳动物培养细胞标准温度：36.5°C ±0.5°C
培养细胞对低温的耐受力比其对高温强
≤39 °C
三、细胞培养的基本技术
（一）细胞分离与原代培养
原代培养也称初代培养，指从供体分离得到所需细胞后，接种于培养器皿，进行首次培养
培养材料为血液、胸水、腹水和羊水等细胞悬液时，可采用低速离心分离
培养材料为组织块时，将组织块剪切得尽可能细小，然后用胶原酶或胰蛋白酶进一步消化，以获得细胞悬液
（二）细胞的传代
细胞由原培养器皿内分离稀释后传到新的培养器皿的过程为传代
贴附细胞的传代：多采用含有胰蛋白酶和EDTA的消化液消化传代，然后以合适比例接种在新的培养器皿内
悬浮细胞的传代：可直接添加新鲜培养液，或离心收集后换新鲜培养液，再以一定比例稀释传代
（三）气体环境与pH值
多数细胞生长需要O2，闭合式单层细胞培养氧分压1995 - 9975Pa
开放培养时（碟皿或培养瓶松盖培养），一般将细胞置于95%空气加5%CO2混合气体环境中CO2的主要作用在于维持培养基的pH 值，多数细胞的适宜pH值为7.2 – 7.4
原代培养细胞一般对pH的变动耐受差；永生细胞和恶性肿瘤细胞耐受力强
总的说来，培养细胞耐酸性比耐碱性大一些
（四）体外培养细胞生存所需基本物质
六碳糖是主要的能源（葡萄糖、半乳糖）氨基酸，所有的细胞都需要谷氨酰胺，其它还有精氨酸、胱氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、赖氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、苏氨酸、色氨酸、组氨酸、酪氨酸等培养细胞也需要维生素，如生物素、叶酸、泛酸、核黄素、硫胺素、胭酰胺等促生长
因子（EGF, FGF, NGF, PDGF, EDGF等）激素：胰岛素——促进细胞利用葡萄糖和氨基酸氢考（促进上皮细胞生长）其它物质基本元素：钾、钠、钙、镁、氮和磷微量元素：铁、锌、硒等
（五）渗透压
人血浆渗透压约290mOsm/kg，可视为培养细胞的理想渗透压鼠细胞渗透压约320mOsm/kg 大多数培养细胞的渗透压在260 mOsm/kg - 320 mOsm/kg
（六）培养基
按物质状态：半固体培养基，液体培养基
按其来源：
（1）合成培养基：根据已知细胞所需物质的种类和数量严格配制而成
（2）天然培养基：成分尚未搞清楚，如血清、血浆等
（3）无血清培养基：基本培养基＋促生长物质
（七）附着底物
除少数悬浮型细胞外，绝大多数培养细胞需要合适的底物以附着其上
类型：（1）玻璃：透明、易观察、易洗涤、能反复使用；
缺点：易破碎
（2）一次性塑料：常用聚苯乙烯，聚四氟乙烯；
缺点：易产生划痕，不宜反复使用
（八）抑制细胞生长因素
制备培养基消毒不彻底：有毒物质或微生物混入细胞生存环境中
血清灭活：能除去培养基中的补体和降低免疫球蛋白的毒性，并不损伤多肽生长因子，但可能灭活另一些有用的成分
（九）细胞冻存与复苏
培养细胞在传代过程中性质容易发生变化，且有支原体污染的危险
解决方法：细胞冻存，需要时复苏
在培养液中加入冷冻保护剂（小分子：甘油、二甲亚砜），以减少细胞内液形成冰晶对细胞的损伤。大分子：蔗糖、卵黄，稳定细胞膜
复苏：手工降温、程序降温仪——―慢冻速溶‖
2.共聚焦显微镜原理和应用
原理：激光扫描共聚焦显微镜对普通荧光显微镜的改进：
1．用激光做光源：单色性好（无色差）、相干性好、方向性强、能量高
2．采用共聚焦技术：物镜焦平面上的针孔挡住杂散光，消除球差、色差，提高分辨率
3．采用点扫描技术：避免相邻点衍射光和散射光的干扰，提高清晰度和精密度
4．利用光电倍增管采集和放大光信号（灵敏度高），并用计算机处理信号（再次提高清晰度）★激光扫描共聚焦显微镜是在普通荧光显微镜的基础上采用共轭光路，使用激光作为光源，配置扫描和检测装置，由计算机控制的新型显微镜。
应用：显微摄影激光扫描共聚焦显微镜是在普通荧光显微镜的基础上采用共轭光路，使用激光作为光源，配置扫描和检测装置，由计算机控制的新型显微镜。其广泛用于荧光定性、定量测量，具备断层扫描、三维图像重建、活细胞动态荧光监测、荧光光漂白恢复、荧光共振能量转移等功能。还可用于多重荧光染色的检测，如同时观察细胞膜、细胞器、细胞核结构，也可同时检测细胞内游离钙和pH或膜电位等的动态变化。
总而言之，激光扫描共聚焦显微镜可进行多参数、多功能的研究，且快速准确、自动化程度高，是检测组织细胞荧光信号的先进技术手段。
举例：1. 细胞生物学：如细胞结构。
2. 生物化学：如酶、核酸、荧光原位杂交和受体。
3. 生理和药理学：如离子通道、细胞内各种离子浓度在药物作用下的变化
4. 遗传学和胚胎学：如细胞生长、分化、成熟变化，基因表达和基因诊断。
5. 神经生物学：如神经细胞结构、神经递质的成分
6. 微生物和寄生虫学：细菌、寄生虫结构
7. 病理学及临床应用：自身免疫学疾病的诊断和肿瘤诊断
8. 免疫学：细胞和组织免疫荧光观察。
3，显微摄影步骤
1．滤色镜的安放
1）打开主开关，调节电压到9V左右
2）将色温平衡滤色镜LBD—2N放在视场光阑上(选用的彩色底片为日光型)
3）放一块中性密度（Neutral density缩写ND）滤色镜于灯壳前的槽口中，目的是以观察者观察标本时，即可使眼睛不疲劳，又能方便镜检工作。（ND滤色镜不影响色温）。
2．将标本放在载物台上，用10×物镜观察调焦，显微摄影的调焦通过摄影附件的聚焦望远镜进行，转动聚焦望远镜筒上的圆环，使取景框中的双十字线达到最清晰的程度，再旋动微调旋钮，使标本与双十字线象同时清晰。
3．用10x物镜观察标本对好焦点，将视场光阑收缩到最小，再慢慢地旋动聚光镜上下移动旋钮，在视场光阑象出现直到最清晰时为止。
4．旋动二个聚光镜定心螺钉，将视场光阑象调到视场正中。
5．旋开视场光阑象边缘，使它接触到视场的圆外切，并将视场光阑调到中心位置。
6．调节曝光的技术PM—10ADS型平均测光面积为30％，点测光为1％。
7．自动曝光锁（AE lock）的使用
1）使用自动曝光锁拍全景照片
在同一张组织标本上的任何不同部位或者是某几个部位相互拼接起来，不论需要多少张，只要按下AElock键后，所要拍的感光片都能得到合适的曝光，而且各张底片的密度一致，再将此分拍的各张底片放大成各自的照片，将这些照片拼接起来，就成为一张完美的，密度一致的全景照片。
2）AElock与点测光并用
如果标本上的组织需要点测光，而被拍的目的物又不在画面的中心，这就需要先将拍摄的目的物移动到画面的点测光的中心位置，再按下AElock键后，才能移动标本组织到原来位置，正式进行全景画面的拍摄工作。
3）在接近最长曝光时间的时候进行摄影
如果所显示的曝光时间接近在最长曝光时间的时候，如在荧光显微摄影时，进行正常的自动曝光，就必然显示曝光不足的报警灯光与声音，这时，如按下AElock钮，就可阻止报警而成功地进行长时间的曝光。
彩色补偿滤色镜(CC)的使用
减去所偏的颜色需加补偿滤色镜颜色和缩写
蓝黄CCY
青红CCR
绿品红CCM
黄蓝CCB
红青CCC
品红绿CCG
孔径光阑的功能及其使用
安装在聚光镜中的光阑叫孔径光阑。它的作用是使图像的分辨率、焦深处在最佳状态。这些最佳条件的取得，是以所用物镜的数值孔径来调节照明系统的数值孔径（聚光镜的数值孔径）。如想得到高质量的照片，孔径光阑要调节在物镜数值孔径的60％到80％之间。
怎样调节孔径光阑
第一种方法：标本对好焦点，取出左边目镜，用肉眼观察镜筒，边观察物镜的后焦点平面，边用手调节孔径光阑，以60％-80％为宜。
第二种方法：应用聚光镜上刻的数值孔径的标记乘以0.6到0.8。
4，组织化学术
定义应用化学反应与物理反应原理检测组织或细胞内某种化学成分并进行定位、定量及相关功能研究的技术。
1、多糖
显示多糖或蛋白多糖的常用方法是过碘酸—雪夫反应(periodic acid Schiff reaction,PAS反应)。组织或细胞中的多糖被结合形成紫红色沉淀物。此反应称PAS阳性反应，PAS阳性部位为多糖存在部位。
2、脂类
标本用甲醛固定，冷冻切片，用油红O、尼罗蓝或苏丹类染料染色，使组织和细胞中的脂类物质显示相应颜色。亦可用锇酸固定兼染色，脂类呈黑色。
3、酶
酶细胞化学反应的基本原理是利用酶对其相应底物的水解、氧化等作用，使底物的反应产物被某种捕获剂捕获并在原位沉淀，形成有色的终产物，借此测定该酶在细胞内的分布及活性强弱。
免疫组织化学术
利用免疫学抗原和抗体特异性结合的原理，检测组织或细胞中的多肽和蛋白质等大分子物质的分布。为显示抗原抗体复合物的存在，需进行抗体标记；用荧光素如异硫氰酸荧光素标记，可以在荧光显微镜下观察，用胶体金标记，可以在电镜下观察，用辣根过氧化酶标记，则可在光镜下或在电镜下观察。常用的方法有直接法、间接法和亲和素-生物素复合物法（ABC法）等。
显微摄影注意事项：
原 因
纠正措施
由于显微境照明的色温与所用彩色片需要
的色温不匹配
按要求加用色温平衡滤色镜
灯泡电压太低(或太高)
提高或降低灯泡电压
灯泡变黑，使用时间过久
换用新灯泡
原 因
纠正措施
彩色片型号不同
选择合适的型号
彩色片乳剂号不同
选同一批乳剂号 彩色画面背景偏绿
用CCO5M 滤色镜纠正 彩色画面背景偏红
用CCO5G 滤色境纠正
3.通过彩色负片扩印的彩色照片彩色还原不全
原 因 纠正措施
扩印照片的人员不了解实物的原来颜
色。
负片的同时，拍摄一张彩色正片，作为彩扩时校色的样本（或提供给扩印人员一张相同颜色的照片）。
（二）图像模糊
1．照片上整个图像模糊
原 因
纠正措施
由于取景目镜双十字线未调节在适当
位置
调节取景目镜顶部的屈光度校正
环，将双十字线调至最清晰。 由于外界震动引起焦点模糊或移动
防震桌
(一)彩色还原不全
1．彩色画面背景带有（红／蓝）颜色
2．彩色画面的背景带有（绿／品红）颜色
2．照片四周模糊
原因纠正措施
使用了消色差物镜改用平场（复）消色差物镜
物镜和照相目镜在组合选用上有误长筒物镜一定要选用NFK照相目镜短筒毓物
镜一定要选用FK照相目镜
(三)图像在焦点上，但是不清晰
1．分辨率不高
原因纠正措施
使用了低倍物镜与高倍照相目镜选用数值孔径大的物镜与低倍率的照相目镜
所用聚光镜的孔径光阑全部打开了缩小孔径光阑，其缩小的半径为物镜数值孔径
的60-80%
所用的视场光阑全部打开了将视场光阑缩小到比照相取景框略为大一些。
所用的盖玻片厚改用0．17mm厚度的盖玻片。
使用了低反差的底片改用高反差的底片
2．图像不清晰
原因纠正措施
物镜上的校正环，没有调节到适应载玻片的厚度一边观察标本，一边调节校正环，以达到最清晰时为止
常用物镜(盖玻片厚度0.17mm)用于无
盖玻片标本，或与此相反
改用无盖玻片物镜错将常用物镜用于无盖玻片标本改为专门用于无盖玻片的物镜
3．使用100×浸油系物镜，图像不清晰
原因纠正措施
没有用油使用专用油
使用浸油不合适专用油，(荧光油，白炽灯用油性能不同) 标本太厚标本2—3μm厚为好
（四）照片上出现标本以外的物体像
1．图像上有阴影
原因纠正措施
显微摄影装置中的光路选择移动杆或三
目镜筒被某些物体遮盖
将光路选择移动杆推入或拉出到合适位置
由于视场光阑收缩太多将视场光阑打开到比取景目镜中取景框的面
积略大一些
显微摄影装置中的棱镜，或大底片暗室适配器上的中继透镜，沾有碎胶片或污物将自动曝光控制器上的旋钮，放到T位置，按曝光键，这时快门打开，即可观看摄景装置中的棱镜是否有碎胶片，污物等。如有发现，加以清洁
（五）图像的明亮度不均匀
原因纠正措施
显微镜的照明光源没有调节在中心位置把照明光源调节到合适的位置
视场光阑离开了光轴位置缩小视场光阑，使它出现在目镜视场中，再
调节载物台聚光镜上的定心螺钉，使视场光
阑正好在中心位置。
光路系统中的光学元件被污染移动标本时，若污染物不随标本移动，说明
污染转在光路系统，清洁光路系统中各个光
学元件