农杆菌的转化流程

农杆菌的转化流程

方案一

1. 农杆菌的培养及感受态的制备

①农杆菌菌株划YM平板，26-28℃培养48 h；

②挑取单菌落接种到40 ml 无抗生素的YM液体培养基中，250 r/min，26-28℃悬浮培养12-16 h；

③将菌液转入灭过菌的50 ml离心管中，4℃，8000 r/min,离心8 min；

④弃上清，加入用100 mM NaCl (4℃预冷)重悬收集的农杆菌；

⑤ 4℃，8000 r/min, 离心8 min；

⑥弃上清，加入原始菌液1/50体积（800μ l/管（此时的感受态农杆菌可以直接用于转化）并分装成100μ l）的20 mM CaCl2重悬菌体；

⑦置液氮中10 s，放入-20℃冰箱中保存备用。

2.农杆菌的转化（冻融法）

将感受态农杆菌置于冰上，加入1μg质粒DNA（体积不宜超过10 μ l），充分混匀，冰上放置30 min；

②置液氮中快速冷却约1min后迅速转入37℃水浴中，待其融化；

③加1 ml 无抗生素的YM 液体培养基于28℃，230 r/min 培养2-4 h；（或直接用1 mlμl，留500 μ l于管中④ 3000 r/min 离心2 min收集菌体，将上清吸去500 培养菌直接涂布含抗生素的YM平板）；

⑤重悬菌体并涂布到含有适当抗生素的YM平板上吹干, 28℃培养48 h；

⑥挑取单菌落接种到筛选液体YM培养基中，28℃，250 r/min 培养48 h，将菌液用于保存或转化；

注：EHA105抗利福平霉素，LBA4404抗硫酸链霉素。在转化前后的所有培养基中均可加入相应的这两种抗生素，以防止杂菌污染。以上挑菌及抗生素加入工作均在超净台上进行。

3．转基因烟草体系的建立

⑴烟草无菌苗的培养：

① 70%乙醇消毒烟草种子30 s后，用无菌水清洗两次，更换NaClO处理25-30 min，无菌水清洗四次；

②将灭菌后的种子移至1/2 MS固体培养基（大量元素、微量元素、CaCl2、FeSO4）、1.0 mg/L维生素、2.0 mg/L 苷氨酸、3% 蔗糖、0.6-0.7% 琼脂（KOH 调至pH 5.7-5.8），于25-26℃，14 h光照/10 h黑暗条件下萌发；

③ 14天后，将萌发出的烟草幼苗转移至含有相同1/2 MS培养基的组织培养盒中，同样条件下继续培养4-6周，小苗长出后可用于叶盘转化。

⑵农杆菌介导的烟草叶盘转化和愈伤组织的筛选

于无菌条件下将无菌苗的成熟叶片除去叶边缘和主要叶脉，切成0.5 cm的小方块，浸泡在MS液体培养基悬浮的用于转化的农杆菌菌液中；

② 10 min后取出叶片于灭菌的滤纸上吸去菌液，以叶片上表面接触培养基，8-9片/培养皿，排列于倒有共培养基（MS（大量元素、微量元素、CaCl2、FeSO4）、1.0 1℃光照培养箱中，14±mg/L维生素、2.0 mg/L甘氨酸、3% 蔗糖、0.6-0.7%琼脂、pH 5.7-5.8）的平皿中，置于24 h光照/10 h黑暗条件下共培养48 h；

③ 1℃恒温摇床上振荡漂洗45-60±当看到叶片与培养基接触边缘长出白色农杆菌时，将叶片转移至不加激素的MS液体培养基中，约28 min，夹出叶片放于灭菌的滤纸上除去多余的液体培养基；

④将叶片上表面朝向培养基，8片/皿排列于生芽筛选培养基（MS（大量元素、微量元素、CaCl2、FeSO4）、500 mg/L Carbincine、300 mg/L Kanamicine、0.1 mg/L NAA、1.0 mg/L BAP、0.59 g/L MES、1.0 mg/L 1℃光照培养箱中，14 h光照/10±维生素、2.0 mg/L甘氨酸、3%蔗糖、0.6-0.7%琼脂、pH 5.7-5.8）上，置于24 h 黑暗条件下培养1个月；

⑤待愈伤组织长出绿芽时，切下绿芽并转入生根培养基（MS（大量元素、微量元素、CaCl2、FeSO4）、200 mg/L Carbincine、100 mg/L Kanamicine、1.0 mg/L

维生素、2.0 1℃光照培养箱中，14 h光照/10±mg/L甘氨酸、1.5%蔗糖、0.6-0.7%琼脂、pH 5.7-5.8）中进行筛选（9棵/组培盒），置于24 h黑暗条件下培养筛选；

⑥将能在生根培养基中长出根的幼苗的芽切下，再次插入到生根培养基中，在相同培养条件下继续筛选，挑选能长出根的烟草幼苗植入土壤生长。

根癌农杆菌转化烟草方案二

1）农杆菌感受态细胞的制备

（1）挑取根癌农杆菌LBA4404单菌落于3ml的YEB液体培养基（含链霉素Sm 100ug/ml）中，28°C振荡培养过夜；

（2）取过夜培养菌液500ml接种于50ml YEB(Sm 100ug/ml)液体培养基中，28°C 振荡培养至OD600为0.5；

（3）5,000rpm, 离心5min；

（4）加10ml 0.15M NaCl悬浮农杆菌细胞，5,000rpm, 离心5min；

（5）1ml 预冷的20mM CaCl2悬浮细胞，冰浴，分装成100 l，液氮中速冻1分钟，置-70°C保存备用。

2）植物表达载体向农杆菌感受态细胞的转化

取200ml感受态细胞，加入1mg构建好的质粒DNA，液氮中速冻1分钟，37°C 水浴5分钟，然后加入1ml YEB培养基，28°C慢速振荡培养4小时；1,000 rpm 离心30sec，弃上清，加入0.1ml YEB培养基重新悬浮细胞，涂布于含有100ug/ml Kan 和125ug/ml Sm的YEB平板上，28°C培养约48小时。

3）阳性克隆的鉴定

挑取平板上长出的单菌落，接种于YEB液体培养液(含有100ug/ml Kan 和125ug/ml Sm)中，28°C振荡培养过夜；小量提取质粒DNA，以质粒DNA为模板进行PCR扩增鉴定。

4）用于转化烟草的农杆菌菌液的准备

将含有植物表达载体的农杆菌接种于YEB液体培养液(含有100ug/ml Kan和125ug/ml Sm)中，28°C振荡培养至OD600为0.6~0.8；4000rpm，室温离心10分钟，用MS盐溶液（PH7.0）重新悬浮菌体，使用时采用MS盐溶液稀释至原体积的20~50倍。

5）烟草转化

（1）烟草叶片的无菌处理取温室生长的烟草叶片，流水下冲洗掉表面杂物，再用蒸馏水洗涤；70%的乙醇灭菌30秒后，无菌水冲洗一次；2.5%次氯酸钠处理

8~10分钟；无菌水冲洗三次，备用；

（2）无菌的烟草叶片切去边缘和主要叶脉，切成0.4′0.6cm2大小；

（3）切好的外植体在农杆菌菌液中浸泡10分钟；

（4）用无菌滤纸吸干植物材料表面的菌液，转入上铺一层滤纸的MS基本培养基，28°C暗培养；

（5）三天后，将材料转到含有抗生素的分化培养基（MS+3mg/L 6-BA+0.2mg/L NAA+ Kan 75~100ug/ml + Cb 500ug/ml）中进行培养；

（6）待抗性芽生长至2~3cm高时，切下小芽转入生根培养基中诱导生根，生根培养基配方：MS基本培养基+ Kan 100ug/ml + Cb 500ug/ml。

农杆菌侵染拟南芥花序的转化方法

农杆菌侵染拟南芥花序的转化方法 制备转化用的农杆菌菌液 准备： 1．灭菌试管 400毫升细长烧杯2瓶，离心瓶4-6个（250ml）。 2．试剂：YEP 1200ml（每瓶300ml 共4瓶）+Kan 1;1000，Rif1:500。 1/2MS+2%蔗糖（灭菌115度20分钟），Silwet在-20℃贮存。 3．步骤： 共转化农杆菌：于中午12点接菌于有YEP培养液的试管中10ul：10ml接种。28℃，3000rpm摇过夜，约30小时，次日下午6点将已摇活的菌按（1：400）及750ul菌液转至汉300毫升YEP+K50+Rif中培养28℃，300rpm约14小时，次日上午8点测OD值，用YEP+Rif作为空白对照，当菌液达到OD600为1.5~3.0之内时，可收集菌体于250ml离心瓶（灭菌）,4℃，4000g 离心10min 。用10%蔗糖（含0.02%silwet）稀释至OD600 约为0.8-- 1.0左右即，用10%蔗糖作对照。转化时将花在溶液中浸泡50s左右，于弱光下生长。 4．浇水：转化前一天将需要做转化的野生型拟南芥苗子浇水浇透。 （注意：选取上述配好的溶液2ml，充分打碎管底部的菌体，在将混匀的菌体溶入600ml溶液中，混匀后再加入Silwet(100%)120ul终浓度为0.02%）。 2．先将浇透水用于转化的苗子的夹全部剪掉，再用宽胶带把花盆的土封好。3．转化的准备工作：2个400细长烧杯，宽胶带，记号笔，表等。 4．转化过程略，视苗的长势弱 0.8 Pa 3`，长势好的0.8 Pa 5`。 5．标记好，将转化好的苗平放于盒子内，上盖封口膜封好，避光培养24hrs 2天后，将植株立起正常培养，浇水，3天1次。 花序浸泡(flower-dipping)法转化拟南芥

农杆菌感受态细胞的制备原理和实验步骤及验证

农杆菌电击感受态的制备及电击转化 表达载体pB-2mb-FRO-1.7A和pB-2mb-1.7A空载体的农杆菌（EHA105）电击转化 （1）抽提纯化pB-2mb-FRO-1.7A和pB-2mb-1.7A空载体的重组质粒 pB-2mb-FRO-1.7A重组载体和pB-2mβ-1.7A空载体的（DH5α）菌种接种于5ml LB（含卡那霉素50mg/L）液体培养基中，37℃，200rpm震荡培养过夜。按V-GENE公司的质粒提取试剂盒提取pB-2mb-FRO-1.7A重组质粒。 （2）取200ml型号的电击杯用无水乙醇浸泡，晾干。 （3）农杆菌EHA105电击预备处理。 I. 接种于5ml YEP（含链霉素Sm50mg/L）液体培养基中，28℃，200rpm震荡培养过夜至OD600值为0.4。EHA105 II. 离心管中收集1ml菌液，4℃，8000rpm，离心30s。1.5ml III. 去残液，沉淀用200μl ddH2O充分悬浮，4℃，8000rpm，离心30s。 IV. 重复步骤ⅲ三次。 V. 去残液，沉淀用200ml ddH2O充分悬浮，即为电击用农杆菌EHA105感受态。加入200μl灭菌甘油混匀后置于-80℃备用。 （4）电击 I. 分别取10ml pB-2mb-FRO1-1.7A和pB-2mb-1.7A重组质粒至200μl EHA105感受态中，轻打混匀，然后转移至电击杯中，置冰上。 II. 准备好电击装置（BioRad），电压为2.5V，用手按住电击按钮，直到啪的一声电击完毕。 III. 室温静置2min后加入800ml YEP培养液，28℃静置1h，然后28℃，200rpm培养2h。IV. 离心30s，收集菌液，沉淀用200ml ddH2O悬浮，用玻璃棒涂布含含卡那霉素50mg/L 和含链霉素Sm50mg/L的YEP固体培养基平板，28℃培养48h。8000rpm 1.制备农杆菌电转感受态 (1)挑取根癌农杆菌EHA 105单菌落，接种于5mlLB〔含利福平(Rif) 50mg/L,；链霉素 100mg/L)液体培养基中，28'C, 220rpm震荡培养过夜。 (2)将2m1过夜培养的菌液加到50ml含同样抗生素的LB培养基中，28'C, 220rpm震荡 3-4小时，至OD560=0.5左右。 (3) 5000rpm离心5分钟，去上清。 (4) 加入40m1 10%甘油悬浮菌体，冰浴30min. (5) 4'C, 5000rpm离心5分钟，去上清。 (6 加入30mL10%甘油重悬浮菌体，4'C, 5000rpm离心5分钟， (7)重复步骤6一次，去上清，加入2ml10%甘油悬浮，分装于1.5ml的离心管中(200 p 1/ 管)备用。 2 农杆菌感受态的电转化 〔I)取2 ul质粒加到200 u I EHA 105感受态细胞中，轻轻混匀，冰浴 30分钟。 (2)把质粒和感受态混合液吸入电极杯，电击转化。 (3)马上加入lml新鲜的LB液体培养基，28'C, 150rpm轻摇4-6小时。 (4)收集菌体涂布于含有链霉素100mg/L),利福平(50mg/L)及质粒所含的抗性的LB固体培

植物表达载体转化农杆菌操作步骤

植物表达载体转化农杆菌操作步骤 来源：郭庆水的日志 植物表达载体转化农杆菌操作步骤 第一部分：农杆菌介导转化水稻 1、农杆菌选择：LBA4404、EHA105、GV3101 2、农杆菌活化：将保存的农杆菌在固体LB培养基上画线（或加或不加抗生素，LBA4404:Rif 或Str；EHA105：Rif或Str；GV3103：庆大霉素。如果不加抗生素就有可能造成这些菌株的Ti质粒丢失，导致农杆菌缺乏侵染性），抗生素浓度为：50μg/ml。28℃培养。 3、农杆菌感受态细胞的制备： 1）挑取单菌落接种于3ml LB液体培养基中，220rpm 28℃振荡培养至OD600 =0.5。 2）吸取1.5ml菌液于离心管中，冰浴10min； 3）5000（13000）rpm离心30s，弃去上清液； 4）沉淀用1.5 ml 0.5M NaCl悬浮,冰浴20min； 5）5000（13000）rpm离心30s，弃去上清液； 6）每管用100μl 20mMCaCl2悬浮，用于转化； 制备好的感受态细胞可马上使用，也可按每管200ul分装于无菌离心管中，于4℃保存48小时内使用，长期贮存时必须在液氮中速冻后转一70℃保存。使用时从一70℃取出，置冰上融化后使用。 4、DNA直接转化农杆菌： 1）50μl农杆菌感受态细胞中加入质粒DNA 0.1～1μg（5－10ul），之后冰浴30 min； 2）放入液氮中5min（或1min），然后立即放入37℃水浴锅中水浴5min； 3）取出离心管，加入0.5mlLB，28℃、220rpm振荡培养3～5hr； 4）取出菌液于含相应抗生素的LB平板上涂板，在培养箱中28℃条件下倒置培养。2天左右菌落可见。 （pEmu载体：AMP+Rif/Str；pK载体：Kan＋Rif/Str；pTCK载体：Kan＋Rif/Str） 5、重组农杆菌鉴定： 1）挑取单菌落，接种于含相应抗生素的LB液体培养基中，28℃振荡培养过夜。（pEmu载体：AMP+Rif/Str；pK载体：Kan＋Rif/Str；pTCK载体：Kan＋Rif/Str） 2）小量提取质粒DNA，加GTE同时加5μL溶菌酶（50μg "ml -1，贮藏浓度为50mg/ml或10mg/ml）。 3）质粒酶切或PCR鉴定。 6、三亲交配法： 参考一： 1）接种含重组质粒的大肠杆菌于含的LB平板，于37℃培养； （pEmu载体：50μg"ml -1AMP；pK载体：50μg"ml -1Kan；pTCK载体：50μg"ml -1Kan）2）接种含动员质粒pRK2013的大肠杆菌于不含抗生素的LB平板上，于37℃培养； 3）接种受体农杆菌EHA105/LBA4404于50μg"mL-1 Rif/Str的LB平板上28 ℃培养； 4）分别挑取上述平板单菌落，分别于LB液体培养基中震荡培养； 5）待三种菌生长到对数期时，各取50μL，混匀，涂布于无抗生素的LB 平板上，28℃培养过夜； 6）挑取长出的小块菌，接种于含相应抗生素的LB液体培养基中，28℃振荡培养24h；（pEmu载体：50μg"ml -1AMP＋50μg"mL-1 Rif/Str；pK载体：50μg"ml -1Kan＋50μg"mL-1

水稻农杆菌转化方法

方法1 NB基本培养基(右边的为N6,大量相同,加glycine甘氨酸2 mg/L) KNO3 2830 mg/L (NH4)2SO4 463 mg/L KH2PO4 400 mg/L MgSO4.7H2O 185 mg/L CaCl2.2H2O166 mg/L FeSO4.7H2O 27.8mg/L 5.6 Na2EDTA 37. 5 mg/L 7.5 MnSO4.4H2O 10 mg/L 27.8 H3BO3 3 mg/L 1.6 ZnSO4.7H2O 2 mg/L 1.5 Na2MoO4.2H2O 0.25 mg/L 0.25 CuSO4.5H2O 0.025 mg/L 0.025 CoCl2.6H2O 0.025 mg/L 0.025 KI 0.75 mg/L 0.8 盐酸硫胺素thiamine CHL VB1 10 mg/L 0.1 盐酸吡哆醇pyridoxine-CHL VB6 1 mg/L 0.5 烟酸nicotinic acid 1 mg/L 0.5 肌醇myo-inositol 100 mg/L 100 水解酪蛋白300 mg/L 谷氨酰胺500 mg/L 脯氨酸500 mg/L 蔗糖30,000 mg/L PHytagel 2.6 mg/L pH 5.8 Basic培养基 B N6（大量）50ml （20倍） A Ms-Fe盐10-20ml（100倍）CH 0.3g/L S B5 macro 10ml （100倍）phytogel 4g/L或agar 8g/L I B5 vita 10ml （100倍）sucrose 30g/L C proline 0.5g/L glutamine 0.5g/L N6 (大量梗稻种子) 终浓度母液(20倍) 终浓度母液(20倍)培KNO32830mg/L56.6g/L Mg SO4.7H2O185 mg/L 3.7 g/L 养(NH4)2SO4463 mg/L9.26 g/L CaCl2.2H2O 166 mg/L 3.32 g/L 基KH2PO4400 mg/L8.00 g/L 制备1 KNO3, (NH4)2SO4, KH2PO4同时倒入烧杯,加水搅拌, 使之完全溶解.

农杆菌转化法原理

农杆菌转化法原理 This manuscript was revised on November 28, 2020

农杆菌转化法原理： 农杆菌是普遍存在于土壤中的一种革兰氏阴性细菌，它能在自然条件下趋化性地感染大多数双子叶植物的受伤部位(受伤处的细胞会分泌大量酚类化合物,从而使农杆菌移向这些细胞)，并诱导产生冠瘿瘤或发状根。 根癌农杆菌和发根农杆菌中细胞中分别含有Ti质粒和Ri质粒，其上有一段T-DNA，农杆菌通过侵染植物伤口进入细胞后，可将T-DNA插入到植物基因组中,并且可以通过减速分裂稳定的遗传给后代，这一特性成为农杆菌介导法植物转基因的理论基础。 人们将目的基因插入到经过改造的T-DNA区，借助农杆菌的感染实现外源基因向植物细胞的转移与整合，然后通过细胞和组织培养技术，再生出转基因植株。农杆菌介导法起初只被用于双子叶植物中，近年来，农杆菌介导转化在一些单子叶植物（尤其是水稻）中也得到了广泛应用。 农杆菌转化植物细胞涉及一系列复杂的反应，主要包括：①受伤的植物细胞为修复创伤部位，释放一些糖类、酚类等信号分子。②在信号分子的诱导下，农杆菌向受伤组织集中，并吸附在细胞表面。③转移DNA上的毒粒基因被激活并表达，同时形成转移DNA的中间体。④转移DNA进入植物细胞，并整合到植物细胞基因组中。 方法：（根据不同受体环境基因要求而不同） 1．农杆菌准备 2．外植体的准备（愈伤组织、悬浮细胞系、幼嫩茎段或叶片）; 3．用 MS-AS液体培养基稀释原菌液15倍（1.5ml / 20ml）或离心后稀释3倍; 4．外植体与菌液共培养20 分钟; 5．放置在带滤纸的培养皿上（注意充分吸干多余的菌液）; 6．将外植体接种到MS-AS固体诱导培养基，培养2－3天 ; 7．移至含卡那霉素（Kan）300mg/L和羧苄青霉素（Cb 300mg/L）的固体筛选培养基上进行Kan抗性愈伤组织的筛选; 8．隔20天，进行第二次筛选； 9．抗性愈伤组织在固体筛选培养基上分化成苗； 10 在生根培养基上生根，获得完整的再分化植株。

烟草农杆菌转化实验步骤1

烟草农杆菌转化实验 实验配方：1L RMOP: 20×大量元素50ml 200×微量元素5ml 200×有机5ml 200×铁盐5ml 3%蔗糖30g 0.8%琼脂（国产）4g/500ml 灭菌后，每500ml培养基加入: 0.1mg/L NAA 1mg/ml NAA 50μL 1mg/L 6-BA 1mg/ml6-BA 500μL YEB: 液体培养基：1L 酵母提取物1g 牛肉膏5g 蛋白胨5g 蔗糖5g MgSO4?7H2O 0.5g pH7.0 高压灭菌。 固体培养基： 每升YEB 液体培养基加15g 琼脂粉，高压灭菌。 卡那霉素（Kan）储液：100mg/ml 利福平（Rif）储液：50mg/ml YEB 固体培养基平板: 灭菌后的YEB 固体培养基待其温度降至50℃时加入卡那霉素（Kan）和利福平（Rif），至终浓度为50mg/l，混匀后立即倒入培养皿，凝固后4℃倒置保存。 一．农杆菌感受态细胞的制备 （1）划线活化农杆菌，挑取农杆菌单菌落于3ml的YEB液体培养基（含Rif 50mg/l）中，28℃振荡培养过夜； （2）取过夜培养菌液1ml接种于50ml YEB（Rif 50mg/l）液体培养基中，28℃振荡培养至OD600为0.5； （3）取2ml菌液，13000rpm，离心30sec, 弃上清； （4）加入10ml 0.1M CaCl2，使农杆菌细胞充分悬浮，冰浴30min；

（5）13000rpm，离心30sec，弃上清，置于冰上，加入2.5ml预冷的0.1M CaCl2，充分悬浮细胞，分装在1.5ml EP管中，液氮中速冻1min，置-80℃冰箱保存备用。二．质粒DNA导入农杆菌 ①电转法： 1.取农杆菌感受态在冰上冻融； 2.加2μL质粒DNA于100μL感受态细胞中，用枪头轻轻搅拌混匀； 3.然后再将其转入电转杯中（不要产生气泡），在2500V高压下电击； 4.取出电转杯，加入500μL预冷的YEB培养基（不含抗生素），轻轻吹打混匀，吸出菌液转入1.5ml离心管中，28℃，200rpm振荡培养5h； 5.取30-40μL菌液涂在含相应抗生素（50mg/l Kan和50mg/l Rif）的YEB平板上，28℃倒置培养1.5-2天； 6.挑选单菌落PCR检测，将阳性菌落保存。 ②冻融法： 1、在200μl感受态细胞中加入2－6μl质粒DNA，冰浴5min，液氮中速冻5min； 2、迅速转入37℃水浴中，热激5min； 3、加入1ml YEB（不含抗生素）液体培养基，28℃慢速振荡培养2－4小时； 4、3000rpm离心4min，去一部分上清，留取200μl菌液涂布于含有50mg/l Kan 和50mg/l Rif的YEB平板； 5、放置约0.5h，待水份干后，28℃培养约24小时至长出菌落。 6、挑选单菌落PCR检测，将阳性菌落保存。 三．烟草遗传转化实验 ①准备农杆菌 （1）将农杆菌在平板上划线，从平板上挑取单菌落，接种到20mL附加相应抗生素（kan 50mg/L, Rif 50mg/L）的YEB液体培养基中，在恒温摇床上，于28℃下以180r/min培养至OD600为0.6~0.8（约需17h）。 （2）将OD600为0.6~0.8的菌液，按1%~2%的比例，转入新配制的无抗生素（含Rif）的YEB液体培养基中，可同时加入100~500μmol/L的乙酰丁香酮。在上述相同的条件下再培养6h左右，待OD600为0.2~0.5时即可用于转化。

农杆菌介导转基因的原理

农杆菌介导转基因的原理？ 转基因技术的飞速发展为生物定向改良和分子育种提供了一种较佳的方法，并使其成为基因工程和育种的最有效途径，目前应用较广泛的转基因技术有农杆菌介导法、花粉通道法、显微注射法、基因枪法、离子束介导法等等，其中农杆菌介导法以其费用低、拷贝数低、重复性好、基因沉默现象少、转育周期短及能转化较大片段等独特优点而备受科学工作者的青睐。农杆菌介导法主要以植物的分生组织和生殖器官作为外源基因导入的受体，通过真空渗透法、浸蘸法及注射法等方法使农杆菌与受体材料接触，以完成可遗传细胞的转化，然后利用组织培养的方法培育出转基因植株，并通过抗生素筛选和分子检测鉴定转基因植株后代。 农杆菌是普遍存在于土壤中的一种革兰氏阴性细菌，它能在自然条件下趋化性地感染大多数双子叶植物的受伤部位，并诱导产生冠瘿瘤或发状根。根癌农杆菌和发根农杆菌中细胞中分别含有Ti质粒和Ri质粒，其上有一段T-DNA，农杆菌通过侵染植物伤口进入细胞后，可将T-DNA插入到植物基因组中。因此，农杆菌是一种天然的植物遗传转化体系。人们将目的基因插入到经过改造的T-DNA区，借助农杆菌的感染实现外源基因向植物细胞的转移与整合，然后通过细胞和组织培养技术，再生出转基因植株。 农杆菌转化的详细机理已有大量综述, 并介绍新进展. 野生型根癌农杆菌能够将自身的一段DNA转入植物细胞. 因为转入的这一段DNA含有一些激素合成基因, 因而导致转化细胞自身激素的不平衡从而产生冠瘿瘤. 这些致瘤菌株都含有一个约200 kb的环状质粒, 被称为Ti(tumor inducing)质粒, 包括毒性区(Vir 区)、接合转移区(Con区)、复制起始区(Ori区)和T-DNA区4部分. 其中与冠瘿瘤生成有关的是Vir区和T-DNA区. 前者大小为30 kb, 分virA～J等至少10个操纵子, 决定了T-DNA的加工和转移过程. T-DNA可以将携带的任何基因整合到植物基因组中, 但这些基因本身与T-DNA的转移与整合无关, 仅左右两端各25 bp的同向重复序列为其加工所必需, 其中14 bp是完全保守的, 分10和4 bp不连续的两组. 两边界中以右边界更为重要. VirA作为受体蛋白接受损伤植物细胞分泌物的诱导, 自身磷酸化后进一步磷酸化激活VirG蛋白; 后者是一种DNA 转录活化因子, 被激活后可以特异性结合到其他vir基因启动子区上游的一个叫vir框(vir box)的序列, 启动这些基因的转录. 其中, virD基因产物对T-DNA进行剪切, 产生T-DNA单链. 然后以类似于细菌接合转移过程的方式将T-DNA与VirD2组成的复合物转入植物细胞], 在那里与许多VirE2蛋白分子(为DNA单链结合蛋白)相结合, 形成T链复合物(T-complex). 在此过程中VirE1作为VirE2的一个特殊的分子伴侣具有协助VirE2转运和阻止它与T-DNA链结合的功能. 实验表明, 转基因植物产生的VirE2蛋白分子也能在植物细胞内与VirD2-T-DNA形成T链复合物. 之后, 这一复合物在VirD2和VirE2核定位信号(NLS)引导下以VirD2为先导被转运进入细胞核. 转入细胞核的T-DNA以单或多拷贝的形式随机整合到植物染色体上. 研究表明T-DNA优先整合到转录活跃区, 而且在T-DNA的同源区与DNA的高度重复区T-DNA的整合频率也比较高. 整合进植物基因组的T-DNA也有一定程度的缺失、重复、填充和超界等现象发生, 例如在用真空渗透法转化的拟南芥中有66%出现超界现象, 甚至有整个Ti质粒整合进植物基因组的报道, T-DNA超界转移现象的机理尚不完全清楚, 可能与其左边界周边序列有关. 现在, 对农杆菌感染过程中其本身因子的转录与调控已研究得相当深入, 但

农杆菌介导转化和再生的杨树

农杆菌介导法转基因杨树 摘要： 杨树品种已发展为一种植物转化和再生系统。叶植，从稳定发芽培养的一个杨树杂交NC - 5339（银白杨标本），被共培养用于农杆菌遗传转化关于一个烟草的看护培养。致瘤的和无防备的农杆菌株隐藏包含一个双元载体，其中包含两个新霉素磷酸转移酶II(NPT II')和细菌5莽草酸3-磷酸合酶（EPSP）（AROA）嵌合基因融合。没有开发芽，叶外植体时，双元缴械拉力的根癌农杆菌菌株共培养。然而，转化的植物，没有野生型的T-DNA获得使用农杆菌株原癌基因的二进制。NPT II '酶的活性检测，Southern印迹法分析和免疫学检测证实了遗传转化成功细菌EPSP合酶Western印迹。这是首次报道成功收回转化植株森林树，也是第一个记录的插入和重要农艺性状的外源基因的表达成木本植物物种。 关键词：白杨；转化；农杆菌 前言 基因工程树种的能力将是特别有用的遗传改良，如大型成熟的植物并长期有性世代倍(Nelson and Haissig 1984; Sederoff and Ledig 1985)。森林树种的应用重组DNA技术的一个先决条件是发展的基因转移系统。方法，例如显微注射(Crossway et al.1986)和直接DNA摄入(Paszkowski et al. 1985; Fromm et al. 1986) 已被用于外源基因引入到草本作物物种，但是，最有效的基因转移的方法，利用自然感染冠瘿病的机制造成的有机体，农杆菌(Bevan et al. 1983 ; Fraley et al. 1983 ; Herrera-Estralla, 1983). 。根癌农杆菌的自然感染周期期间，细菌的T-DNA 整合到宿主植物的染色体，从而导致肿瘤对植物的生产（奇尔顿等人，1980）。可以删除和替换而不影响根癌农杆菌的T-DNA转移到植物（DeGreve等，1982）的能力，由异源基因的肿瘤诱导基因。这些修改后的根癌农杆菌菌株的原生质体，悬浮细胞，外植体组织的共培养，可导致转化植物缺乏致癌基因性状的隔离。因此，我们着手开发一个混合型杨树无性系，银白杨x grandidentata的（NC - 5339 ）作为载体的农杆菌转化体系。 有许多特征能使杨树NC-5339得到理想的转化研究首先，杨树是一个重要的全球森林树种。这是一个快速增长的落叶阔叶树，栽培主要用于纸浆生产。对

农杆菌感受态细胞的制备原理和实验步骤(精)

一、目的及要求 了解和掌握农杆菌感受态细胞制备的原理和方法。 二、实验原理 在利用根癌农杆菌介导的基因转化中，首先要获得含有目的基因的农杆菌工程菌株。 在基因工程操作中，感受态细胞的制备和质粒的转化是一项基本技术。感受态是细菌细胞具有的能够接受外源DNA 的一种特殊生理状态。农杆菌的感受态可用CaCl2 处理而诱导产生。将正在生长的农杆菌细胞在加入到低渗的氯化钙溶液中，0℃下处理便会使细菌细胞膜的透性发生改变，此时的细胞呈现出感受态。 制备好的农杆菌感受态细胞迅速冷冻于70℃可保存相当一段时间而不会对其转化效率有太大影响。 三、实验仪器、材料和试剂 仪器：超净工作台，恒温摇床，冷冻高速离心机，高压灭菌锅，冰箱，70℃超低温冰柜，分光光度计，接种针，10ml 试管，50ml 离心管，1.5ml 离心管，冰浴，微量进样器及吸头。以上玻璃仪器和离心管需在用前灭菌，灭菌条件：120℃，15分钟。 材料：土壤农杆菌LBA4404菌株或其它农杆菌菌株 试剂： YEB 液体培养基（1升）：酵母提取物1g ，牛肉膏5g ，蛋白胨5g ，蔗糖 5g ， MgSO4.7H2O 0.5g, pH7.0，高压灭菌； 链霉素（Sm ）储液：125mg/ml

0.15 N NaCl，高压灭菌。 20mM CaCl2，高压灭菌。 四、实验步骤 1. 挑取根癌农杆菌LBA4404 单菌落于3ml 的YEB 液体培养基（含Sm 125mg/l）中，28°C 振荡培养过夜； 2. 取过夜培养菌液0.5ml 接种于50mlYEB(Sm 125mg/l液体培养基中，28°C 振荡培养至OD600为0.5； 3. 5000rpm, 离心5min ； 4. 加入10ml 0.15N NaCl，使农杆菌细胞充分悬浮，5000rpm, 离心5min ； 5. 弃上清，置于冰上，加入1ml 预冷的20mM CaCl2，充分悬浮细胞，冰浴中保存，24小时内使用，或分装成每管200ml ，液氮中速冻1 分钟，置70°C 保存备用。

植物基因转化常用方法(植物遗传,农杆菌、病毒介导和基因枪转化法)

一. 植物遗传转化的方法 植物遗传转化技术可分为两大类：一类是直接基因转移技术，包括基因枪法、原生质体法、脂质体法、花粉管通道法、电激转化法、PEG介导转化方法等，其中基因枪转化法是代表。另一类是生物介导的转化方法，主要有农杆菌介导和病毒介导两种转化方法，其中农杆菌介导的转化方法操作简便、成本低、转化率高，广泛应用于双子叶植物的遗传转化。 二.农杆菌介导的基因转化方法 （一）农杆菌的Ti质粒与T-DNA的整合机制 几乎所有双子叶植物都容易受到土壤农杆菌感染，而产生根瘤。它是一种革兰氏阴性土壤杆菌（A. tumefaciens）。其致瘤特性是由Ti（tumor－inducing）质粒介导的。农杆根瘤菌之所以会感染植物根部是因为植物根部损伤部位分泌出酚类物质乙酰丁香 酮和羟基乙酰丁香酮，这些酚类物质可以诱导Vir（Virulence region)基因的启动表达，Vir基因的产物将Ti质粒上的一段T－DNA单链切下，而位于根瘤染色体上的操纵子基因产物则与单链T－DNA结合，形成复合物，转化植物根部细胞。T－DNA上有三套基因，其中两套基因分别控制合成植物生长素与分裂素，促使植物创伤组织无限制地生长与分裂，形成冠瘿瘤。第三套基因合成冠瘿碱，冠瘿碱有四种类型：章鱼碱（octopine）、胭脂碱（nopaline）、农杆碱（agropine）、琥珀碱（succinamopine），使农杆菌生长必需的物质。 1. Ti质粒的结构 在发现根瘤农杆菌诱发冠瘿瘤的本质是Ti质粒后，Ti质粒便成为冠瘿瘤形成基因鉴定与分析的主要研究对象。 Ti质粒大约在160～240kB之间。其中T-DNA大约在15kb-30kb。Vir基因区在36kb 左右。除此之外，Ti质粒上还存在Con区（region encoding conjugation)和Ori区（origin of replication)。

(完整word版)农杆菌介导植物转化的机制及影响转化效率的因素

二、农杆菌介导植物转化的机制及影响转化效率的因素 转化机制： 与植物基因转化有关的农杆菌有两种类型：根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）和发根农杆菌（Agrobacterium rhizogenes）。根癌农杆菌含有Ti 质粒。发根农杆菌含有Ri 质粒。根癌农杆菌的Ti 质粒和发根农杆菌Ri 质粒都具有一段转移DNA (transfer DNA，又称T-DNA)，在农杆菌侵染植物时，T-DNA 可以插入到植物基因组中，使其携带的基因在植物中得以表达。由于T-DNA 能够进行高频率的转移，而且Ti 质粒和Ri 质粒上可插入大到甚至150kb 的外源基因，因此，Ti 质粒和Ri 质粒成为植物基因转化中的理想载体系统。 1 与农杆菌转化相关的基因 与转化相关的基因主要包括农杆菌染色体上的基因和Ti 质粒上T-DNA 以外Vir 区的基因。染色体基因包括chvA、chvB、att、pscA、chvD 以及chvB。它们大多编码一些膜相关蛋白，负责细菌向植物受伤细胞趋化移动和帮助细菌附着于植物受伤细胞上。ChvD 蛋白可能在低pH 和磷酸饥饿情况下提高VirG 蛋白的合成水平。ChvE 与VirA 蛋白共同对virG 起激活作用。 原始的Ti质粒根据其功能的不同，可分为4个区： （1）T-DNA区：是在农杆菌侵染细胞时，从Ti质粒上切割下来转移到植物基因组中的一段DNA，其携带的基因与肿瘤的形成有关，但与T-DNA本身的转移与整合无关。T-DNA 上最重要的是两端的2个边界(LB和RB)，它们是T-DNA转移所必需的。只要其存在，T-DNA可以将携带的任何基因转移并整合到植物基因组中， T-DNA的右边界在T-DNA的整合中对于靶DNA位点的识别具有重要作用，因此，尤以右边界更为重要． （2）毒性区：位于T-DNA以外的1个30~40 kb的区域内，该区段编码的基因但对T-DNA 的转移和整合非常重要．这些基因也称为Ti质粒编码毒性基因(vir)。 （3）接合转移区：该区段存在有与细菌间接合转移有关的基因(tra)，调控Ti质粒在农杆菌间转移。 （4）复制起始区：该区段调控Ti质粒的自我复制。在遗传转化过程中除了Ti质粒上的基因参与外，还有农杆菌染色体基因。染色体基因包chvA、chvB、att、pscA、chvD 以及chvB。它们大多编码一些膜相关蛋白，负责细菌向植物受伤细胞趋化移动和帮助细菌附着于植物受伤细胞上。延伸因子P对于农杆菌的生长非常重要，但非必需．高水平的糖结合蛋白一ChvE可以扩大VirA蛋白对酚类物质的识别范围。结合ATP盒式转运体类似物蛋白ChvD，参与Vir区基因的表达调控，chvD基因座中插入无启动子的lacZ，农杆菌侵染力以及Vir区基因表达量大大下降，ChvD突变体中virG组成型表达侵染力则得以恢复，这一现象说明ChvD通过影响virG表达控制毒性。 2 Vir 基因的诱导表达机制 在植物受到创伤后，创伤组织的细胞释放出创伤信号——酚类化合物，如乙酰丁香酮。

农杆菌感受态细胞的制备原理和实验步骤及验证

农杆菌感受态细胞的制备原理和实验步骤发布日期：2010-04-28 发布 人:technew最后更新时间:2010-04-28 浏览次数:889 一、目的及要求 了解和掌握农杆菌感受态细胞制备的原理和方法。 二、实验原理 在利用根癌农杆菌介导的基因转化中，首先要获得含有目的基因的农杆菌工程菌株。 在基因工程操作中，感受态细胞的制备和质粒的转化是一项基本技术。感受态是细菌细胞具有的能够接受外源DNA 的一种特殊生理状态。农杆菌的感受态可用CaCl2 处理而诱导产生。将正在生长的农杆菌细胞在加入到低渗的氯化钙溶液中，0℃下处理便会使细菌细胞膜的透性发生改变，此时的细胞呈现出感受态。 制备好的农杆菌感受态细胞迅速冷冻于70℃可保存相当一段时间而不会对其转化效率有太大影响。 三、实验仪器、材料和试剂 仪器：超净工作台，恒温摇床，冷冻高速离心机，高压灭菌锅，冰箱，70℃超低温冰柜，分光光度计，接种针，10ml 试管，50ml 离心管，1.5ml 离心管，冰浴，微量进样器及吸头。以上玻璃仪器和离心管需在用前灭菌，灭菌条件：120℃，15分钟。 材料：土壤农杆菌LBA4404菌株或其它农杆菌菌株 试剂： YEB液体培养基（1升）：酵母提取物1g，牛肉膏5g，蛋白胨5g，蔗糖5g， MgSO4.7H2O 0.5g, pH7.0，高压灭菌； 链霉素（Sm）储液：125mg/ml 0.15 N NaCl，高压灭菌。 20mM CaCl2，高压灭菌。

四、实验步骤 1. 挑取根癌农杆菌LBA4404 单菌落于3ml 的YEB液体培养基（含Sm 125mg/l）中，28°C振荡培养过夜； 2. 取过夜培养菌液0.5ml接种于50mlYEB(Sm 125mg/l)液体培养基中，28°C振荡培养至OD600为0.5； 3. 5000rpm, 离心5min； 4. 加入10ml 0.15N NaCl，使农杆菌细胞充分悬浮，5000rpm, 离心5min； 5. 弃上清，置于冰上，加入1ml预冷的20mM CaCl2，充分悬浮细胞，冰浴中保存，24小时内使用，或分装成每管200ml，液氮中速冻1 分钟，置70°C保存备用。 一．农杆菌感受态细胞的制备 二．双元载体转化农杆菌EHA105 三．杆菌转化子的鉴定 A．农杆菌转化子的PCR鉴定 B．农杆菌转化子的酶切鉴定 关键词：农杆菌感受态细胞转化子 一．农杆菌感受态细胞的制备（同大肠杆菌质粒DNA的提取），然后将其转化大肠杆菌，再提取大肠杆菌的质粒DNA进行酶切鉴定。 取-70℃保存的EHA105于含有50μg/ml链霉素平板划线，28℃培养2天。挑单 菌落接种于5ml YM（0.5g/L KH 2 PO 4 ,10 g/L Mannitol,2 g/L L-Glutamine,0.2 g/L NaCL,0.2 g/L MgSO 4,0.3 g/L Yeast extract,PH 7 .0）液体培养基中，220rpm， 28℃振荡培养18 hr 左右。将5ml菌液转接于100ml YM液体培养基中， 28℃,220rpm,振荡培养至OD 600 =0.5。转入无菌1.5ml的EP管，5000g离心5min, 去上清液。加入1ml预冷的0.1M的CaCl 2 溶液，轻轻悬浮细胞，冰上放置20min， 4℃下，5000g离心5min，去上清。加入200μl预冷的含15%甘油的0.1M的CaCl 2溶液，轻轻悬浮。混匀后立即冻存于-80℃。 二．双元载体转化农杆菌EHA105 取1μg左右的质粒DNA加入到200μl EHA105感受态细胞中，混匀后，冰浴30min；-70℃放置10min ；取出后37℃水浴5min或42℃水浴1min；冰浴2min；加入800μl YM液体培养基,28℃，175rpm摇培3hr；取出后涂在含50μg/ml Kanamycin 的YM平板上，28℃培养到形成单菌落。

农杆菌感受态细胞的制备方法

实验一农杆菌感受态细胞的制备 ［目的及要求］ 了解和掌握农杆菌感受态细胞制备的原理和方法。 ［实验原理］ 在利用根癌农杆菌介导的基因转化中，首先要获得含有目的基因的农杆菌工程菌株。 在基因工程操作中，感受态细胞的制备和质粒的转化是一项基本技术。感受态是细菌细胞具有的能够接受外源DNA的一种特殊生理状态。农杆菌的感受态可 用CaCl 2处理而诱导产生。将正在生长的农杆菌细胞加入到低渗的CaCl 2 溶液中， 0℃下处理便会使细菌细胞膜的透性发生改变，此时的细胞呈现出感受态。制备好的农杆菌感受态细胞迅速冷冻于-70℃可保存相当一段时间而不会对其转化效率有太大的影响。 ［实验仪器、材料和试剂］ 一、仪器：超净工作台，恒温摇床，冷冻高速离心机，高压灭菌锅，冰箱， -70℃超低温冰柜，分光光度计，接种针，10ml试管，50ml离心管，1.5ml 离心管，冰浴，微量进样器及吸头。 以上玻璃仪器和离心管需在用前灭菌，灭菌条件：120℃，15分钟。 二、材料：土壤农杆菌LBA4404菌株或其它农杆菌菌株 三、试剂：YEB液体培养基（1L）：酵母提取物1g，牛肉膏5g，蛋白胨5g， 蔗糖5g，MgSO 4·7H 2 O 0.5g，pH7.0，高压灭菌。 利福平（Rif）储液：50mg/ml 20mM CaCl 2 ，高压灭菌。 ［实验步骤］ 1、挑取根癌农杆菌LBA4404单菌落于3ml的YEB液体培养基（含Rif 50mg/l）中，28℃振荡培养过夜； 2、取过夜培养菌液1ml接种于50mlYEB（Rif 50mg/l）液体培养基中， 28℃振荡培养至OD 600 为0.5；

3、取2ml菌液，13000rpm，离心30sec, 弃上清； ，使农杆菌细胞充分悬浮，冰浴30min； 4、加入1000μl 20mM CaCl 2 5、13000rpm，离心30sec，弃上清，置于冰上，加入500μl预冷的20mM CaCl ，充分悬浮细胞，冰浴中保存，24hr内使用，或液氮中速冻1min，置-70℃ 2 保存备用。 实验二质粒DNA直接导入农杆菌 ［目的及要求］ 了解和掌握质粒DNA转化农杆菌细胞的原理和方法，获得能用于植物转化的工程菌。 ［实验原理］ 在低温下，外源DNA（质粒）可吸附到感受态细胞表面，诱导细胞吸收DNA。（加入热激原理）转化了质粒DNA的农杆菌随后28℃恢复培养，可使质粒上携带的编码抗生素的抗性基因得到表达，因此，转化了质粒的农杆菌细胞可在含有相应抗生素的培养基上生长，而没有转化的细胞则无法生长。

农杆菌转化法原理

农杆菌转化法原理： 农杆菌是普遍存在于土壤中的一种革兰氏阴性细菌，它能在自然条件下趋化性地感染大多数双子叶植物的受伤部位(受伤处的细胞会分泌大量酚类化合物,从而使农杆菌移向这些细胞)，并诱导产生冠瘿瘤或发状根。 根癌农杆菌和发根农杆菌中细胞中分别含有Ti质粒和Ri质粒，其上有一段T-DNA，农杆菌通过侵染植物伤口进入细胞后，可将T-DNA插入到植物基因组中,并且可以通过减速分裂稳定的遗传给后代，这一特性成为农杆菌介导法植物转基因的理论基础。 人们将目的基因插入到经过改造的T-DNA区，借助农杆菌的感染实现外源基因向植物细胞的转移与整合，然后通过细胞和组织培养技术，再生出转基因植株。农杆菌介导法起初只被用于双子叶植物中，近年来，农杆菌介导转化在一些单子叶植物（尤其是水稻）中也得到了广泛应用。 农杆菌转化植物细胞涉及一系列复杂的反应，主要包括：①受伤的植物细胞为修复创伤部位，释放一些糖类、酚类等信号分子。②在信号分子的诱导下，农杆菌向受伤组织集中，并吸附在细胞表面。③转移DNA上的毒粒基因被激活并表达，同时形成转移DNA的中间体。④转移DNA进入植物细胞，并整合到植物细胞基因组中。 方法：（根据不同受体环境基因要求而不同） 1．农杆菌准备 2．外植体的准备（愈伤组织、悬浮细胞系、幼嫩茎段或叶片）; 3．用MS-AS液体培养基稀释原菌液15倍（1.5ml / 20ml）或离心后稀释3倍; 4．外植体与菌液共培养20 分钟; 5．放置在带滤纸的培养皿上（注意充分吸干多余的菌液）; 6．将外植体接种到MS-AS固体诱导培养基，培养2－3天; 7．移至含卡那霉素（Kan）300mg/L和羧苄青霉素（Cb 300mg/L）的固体筛选培养基上进行Kan抗性愈伤组织的筛选; 8．隔20天，进行第二次筛选； 9．抗性愈伤组织在固体筛选培养基上分化成苗； 10 在生根培养基上生根，获得完整的再分化植株。

农杆菌介导的烟草转化

农杆菌介导的烟草转基因技术 一、实验目的 了解转基因的基本原理及操作方法。 二、基本原理 根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）是一种能诱发植物产生肿瘤的细菌，根癌农杆菌中含有诱导植物产生肿瘤的质粒（Tumor inducing plasmid），简称为Ti质粒。野生型农杆菌的Ti质粒，含有两个与致瘤有关的区域：一个是T-DNA区（transferred DNA region），含致瘤基因；另一个是毒性区（Virulence region），在T-DNA的切割、转移与整合过程中起作用。农杆菌可将T-DNA插入到植物基因组中，并且可以通过减数分裂稳定地遗传给后代。我们将目的基因插入到经过改在的T-DNA区，借助农杆菌的感染实现外源基因向植物细胞的转移与整合，然后通过细胞和组织培养技术，再生出转基因植株。 三、材料 1、植物材料：烟草无菌苗 2、农杆菌与载体：EHA105；PBI121 四、方法步骤 1、试剂的配制 （1）LB固体培养基：胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化钠10g/L，琼脂8g/L。（2）液体MS/MT培养基PH：5.8-6.0 （3）烟草共培养培养基：固体MS培养基 （4）烟草筛选培养基： MS +（2.0mg/L）6-BA + （0.3mg/L）NAA + （30g/L）蔗糖+ （400mg/L）头孢霉素+ （50mg/L）卡那霉素+ （7.5g/L）琼脂PH：5.8-6.0 （5）烟草生根培养基：固体MS培养基 2、农杆菌侵染菌液的制备方法： （1）超净工作台紫外灯灭菌15min，接种环酒精灯灼烧灭菌备用 （2）铺皿：LB（50mg/L卡那霉素+25mg/L利福平） （3）划线：用接种环沾取预转化的农杆菌菌液于铺好的培养基划“之”字或者“#”字（4）封皿，做标记 （5）28℃恒温培养1d-2d

农杆菌介导法

实验九植物遗传转化——农杆菌介导法 一、目的 了解农杆菌转化的机理；掌握农杆菌介导转化水稻的技术 二、原理 根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)具有跨界转移DNA的能力。下列因子与转化过程有关： 1. Ti 质粒(tumor-inducing plasmid)上的T-DNA (transferred DNA) T-DNA是农杆菌Ti质粒上能够转移到植物基因组的一段DNA序列。T-DNA含有RB和LB两个边界，它们是25bp的正向重复序列，是T-DNA 转移的顺式作用元件。不同类型的农杆菌其边界序列有所不同，但划线部分为完全保守序列。置于该边界内的任何外源基因均可被转化。LB缺失突变后农杆菌仍能致瘤，但RB缺失会导致致瘤能力丧失，这时几乎完全没有T-DNA的转移。 LB（－链）5’GT TTACACCACAA TA TATCCTG CCA 3’ RB（＋链）5’TGA CAGGA TA TA TTGGCGGGTAA AC 3’ 2. Ti质粒上的Vir区（virulence region）操纵子 转化所必需的基因有vir A、B、C、D、E、G。其中蛋白VirD1/D2识别T-DNA边界RB和LB；VirC识别T-DNA右边界的超驱增强子；VirD2在T-DNA底链起内切酶作用造成切刻，并与T－链5’ 共价结合，带有1个核定位信号NLS；VirB形成转移复合通道；VirE2为单链DNA 结合蛋白，有2个NLS。该操纵子的表达顺序如下： vir A和vir G组成型表达形成VirA和VirG蛋白→VirA被植物创伤信号分子激活→激活的VirA使VirG激活→激活的VirG 诱导vir C、D、E、B、F、H表达。 3. 农杆菌染色体基因组相关基因：chv A、chv B（农杆菌运动、附着）、chv D、chv E（编码单糖结合蛋白、趋化性）、psc A、att、cel（合成纤维素丝，附着）。它们与农杆菌的趋化性和识别附着植物细胞有关。 4. 寄主细胞表面受体 5.诱导条件: 小分子酚类化合物：如乙酰丁香酮（AS，acetosyringone）、羟基乙酰丁香酮（OH-AS，hydroxyacetosyringone）；它们是植物细胞创伤反应的一部分，或创伤细胞合成木质素的一部分，是莽草酸合成途径的产物。植物细胞必须在创伤和活跃的代谢状态下才能产生AS及OH-AS。农杆菌对一系列植物酚类化合物具有趋化性，同时高浓度的AS又可使农杆菌的vir 基因活化表达。这些化合物是双子叶植物细胞壁合成的前体，通常不存在于单子叶植物中，这正说明了为什么根癌农杆菌不易感染单子叶植物。若要实现农杆菌对水稻的转化，必须添加这类诱导物。 糖类：如D-葡萄糖、D-木糖等。它们在Vir区基因诱导和农杆菌毒力上起一定作用。 高浓度的肌醇可促进vir基因的表达。 低pH：pH 5.1－5.8 时Vir区基因的诱导达到最高水平。

农杆菌介导法

农杆菌介导的高效水稻遗传转化体系的研究A Highly Efficient Agrobacterium - mediated Rice Transformation Method 水稻是基因组研究的模式植物 ,近年来水稻基因组研究取得了很大进展 ,构建了遗传图谱和物理图 谱 ,完成了籼稻和粳稻的全基因组草图测2 - 3序 ,以及第 1 号和第 4 号染色体的精细测4 - 5序 ,并对第 10 号染色体的结构进行了详细分析。在此基础上 ,各实验室大规模地 ,系统地进行水稻功能基因研究 ,普遍采用的研究手段是基因标签技术。基因标签技术包括 T - DNA 和转座子标签 ,创建大量的基因标签体是功能基因研究的材料平台。而根癌农杆菌介导的水稻遗传转化是水稻基因标签技术中的重要步骤之一。本研究完善了根癌农杆菌介导的水稻转化方法 ,以期为水稻功能基因研究提供丰富材料 , 为水稻重要农艺性状的改良开辟途径。 1材料 以水稻品种日本晴(Oryza sativa L. ssp.japonica)为试验材料。菌株类型为 EHA105 超毒力菌株 ,载体为增强子捕获载体 pFX- E24. 2 - 15R(见图 1) ,载体上带有 GUS报告基因、35 S的 CaMV 启动子序列和潮霉素选择标记基因(HYG) 。农杆菌菌株为EHA105。 2方法 2.1水稻愈伤组织的诱导诱导方法参照 HIEI7等。将日本晴水稻种子去壳 ,用 75 %乙醇灭菌 5min ,再用2. 5 %的次氯酸钠灭菌处理不同时间(40min ,37 min ,30 min 和 25 min) ,以确定最佳灭菌时间 ,灭菌后用无菌水冲洗 6～8 次 ,于 MS 固体培养基上28 ℃避光培养 ,30 d 后 ,将愈伤组织进行继代培 养 ,得到胚性愈伤组织。 2.2农杆菌转化愈伤组织用 AB 固体培养基+氯霉素 25 mg/L + 利福平 20 mg/L + AS 20 mg/L培养农杆菌 ,在20 ℃下培养5～6 d。用无菌勺子轻轻刮下培养的农杆菌 ,放入 AAM液体培养基中(加有2 mg/L 2 ,4