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突变体构建

突变体构建
突变体构建

突变体构建

1.定点突变:快速,高效,简便

设计原理:引物与模板链退火,pfu DNA聚合酶合成突变链。DpnⅠ酶体外降解非突变型质粒模板(甲基化质粒模板)

设计引物:

引物包含5’端重叠区和3’端延伸区。

引物长度:除突变点之外,两条引物的长度大约为30个核苷酸,5’端重叠区包含15-20个碱基,3’端延伸区包含至少10个碱基。

突变引物:突变点位于两条引物上,分别位于正向突变引物重叠区下游、紧邻重叠区;反向突变引物5’端。

退火温度的计算不包括突变碱基。如图:

5’’3’-TACTGGTACTAATGCGGTTCGCGC G

延伸区重叠区

2.嵌合型突变体的构建:

将一个基因与另一个基因,互换构建嵌合型突变变体,可以通过overlapping PCR的方法获得。

●原理:

比如两个基因,一个命名为A,一个命名为B。

A的序列为5-atgcatgctagctagaacgct acgctgactaccccctgatc-3,

B的序列为5-atgctagtagctagcccccc cc aggggataattttttaaaacg-3。

●首先我们要设计引物,假设引物的序列为:

A1:5-atgcatgctagctagaacgct-3

A2:5-ggggggctagctactagcat gatcagggggtagtcagcgt-3

B1:5-acgctgactaccccctgatc atgctagtagctagcccccc-3

B2:5-cgttttaaaaaattatcccct-3

(设计引物的时候在A2的3端加入了20个B基因5端的序列,在B1的5端加入了20个A基因3端的序列。)

●步骤:

(1)以A1,A2扩增A基因,B1,B2扩增B基因

(2)回收A,B基因

(3)以A,B为共同的模板,A1和B2为引物,扩增A+B,这样我们就利用重组PCR的方法将A+B拼接起来了。

《烟草突变体库创建与功能基因组学研究》项目内容与

附件: 《烟草突变体库创建与功能基因组学研究》项目内容与目标 一、总体要求 突变体通常指某个性状发生可遗传变异的材料,或某个基因发生突变的材料。长期以来,育种家尽力地发现和分离有价值的自然突变和变异材料。自20世纪70年代以来,γ射线和 EMS 理化诱变创制的人工突变体在遗传育种中开始应用,此后,T-DNA 插入和转座子标签等插入突变筛选突变体法的发展,大大地加快了突变体的创制步伐。水稻、番茄、油菜等作物中已建立了一系列突变体库,但烟草突变体库的创制基本没有开展。 建立烟草突变体库是烟草功能基因组学研究不可缺少的重要组成部分,是克隆和阐明烟草重要功能基因的基础和前提。随着烟草饱和突变体库的建立,可望直接获得突变基因的序列信息并确证基因序列与功能的关系,从而促进烟草重要功能基因的克隆鉴定。 利用理化诱变技术创制烟草突变体库本身也是一种传统的育种技术,通过筛选突变体,可望获得一系列性状特异、能稳定遗传、有利用价值的烟草育种材料,直接应用于新品种选育。 二、招标项目内容与目标

(一)攻关内容。 1.利用EMS、快中子诱变创建二倍体烟草(绒毛状烟草)、四倍体普通烟草的饱和突变体库。 2.利用逆转座子Tto1和Tto2创建四倍体烟草插入标签突变体库。 3.建立基于Tilling技术的烟草重要功能基因克隆与验证体系。 4.建立基于PCR技术的烟草重要功能基因克隆与验证体系。 5.建立基于逆转座子的烟草重要功能基因克隆与验证体系。 6.在建立功能基因克隆验证体系的基础上,对突变体进行初步的遗传分析并对重要农艺性状相关基因进行表达特性和功能分析。 (二)攻关目标。 1.创建烟草饱和的突变体库4个(二倍体、四倍体突变体,EMS突变体和快中子突变体),突变体数达8万个;逆转座子标签突变体2万以上。 2.建立基于Tilling技术、基于PCR技术、基于逆转座子的烟草重要功能基因克隆与验证体系并进行重要基因的克隆与功能鉴定。 3.阐明控制亚硝胺、钾含量、抗病等重要农艺性状的基因3个以上,获得低亚硝胺、高钾含量、高抗病的育种材料10个以上。

t-DNA插入突变体检测

t-DNA插入突变体的鉴定 实验时间:2012年5月18日 摘要T i质粒是上有一段特殊的DNA区段,当农杆菌侵染植物细胞时,该DNA区段能自发转移进植物细胞,并插入植物染色体DNA中。所以Ti质粒上的这一段能转移的DNA被叫做T-DNA。将感兴趣的基因改造插入到T-DNA区段中,通过农杆菌侵染植物细胞,实现外源基因对植物的遗传转化,得到含有突变的植株。本实验即检测所得植株是否为T-DNA的插入突变体。 1.引言 Ti质粒是土壤农杆菌的天然质粒,该质粒上有一段特殊的DNA区段,当农杆菌侵染植物细胞时,该DNA区段能自发转移进植物细胞,并插入植物染色体DNA中。Ti质粒上的这一段能转移的DNA被叫做T-DNA。若将Ti质粒进行改造,把感兴趣的基因放进T-DNA序列中,通过农杆菌侵染植物细胞,实现外源基因对植物的遗传转化。T-DNA插入到植物染色体上的什么位置,是随机的。如果T-DNA插入进某个功能基因的内部,特别是插入到外显子区,将造成基因功能的丧失。所以利用农杆菌Ti质粒转化植物细胞,是获得植物突变体的一种重要方法。农杆菌Ti质粒转化植物细胞后,在获得的后代分离群体中,有T-DNA插入的纯合突变体,杂合突变体,和野生型。在突变体研究中,需要的材料是纯合突变体,所以必须从分离群体中将纯合突变体鉴定出来。 本次实验中,采用液CTAB(或者TSP法)提取拟南芥植株的DNA,然后PCR将所获DNA 扩增,在之后采用琼脂糖凝胶电泳技术,分离处长度不一的DNA带,以确东样品是否为T-DNA 插入突变纯和体。 PCR(Polymerase Chain Reaction), 即聚合酶链式反应是体外核算扩增技术, 具有特异、敏感、产率高、快速、简便、 重复性好、易自动化等突出优点;能在一 个试管内将所要研究的目的基因或某一 DNA片段于数小时内扩增至十万乃至百万 倍,使肉眼能直接观察和判断。(PCR基本 原理如右图) DNA含有PO43-基团,在pH8.0 Buffer (本实验中为TAE)中带负电, 在电场中

线虫的EMS诱变和突变体筛选2015

线虫的EMS诱变和突变体筛选 摘要:秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans,C. elegans)是一种被广泛研究的模式生物,其性状容易辨别,突变型多且容易获得。本实验用EMS诱变剂对同步化后的N2型怀卵成虫线虫进行不定向诱变,筛选出一系列的突变体,再通过对亲代突变体的子代进行进一步的筛选,筛选出F1、F2、F3突变体,最后获得性状稳定的、能够稳定遗传的突变体,可以将突变体至于-80℃保存。本次试验涉及到的生物技术有:无菌操作技术,同步化技术,EMS诱变技术,显微操作技术等。将获得的突变体与野生型作对比,可以在显微镜下观察到性状明显的突变体,将突变体转移、传代、保留,最后获得稳定的突变体。 关键词:秀丽隐杆线虫同步化EMS诱变无菌操作技术突变体 1.引言 秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans,C. elegans)是一种以细菌为食,居住在土壤中,无毒无害、可以独立生存的线虫。它有如下几个特点:①其个体小,成体仅1mm长,雌雄同体全身共有959个细胞,雄性线虫全身共有1031个体细胞;②为雌雄同体:雄性个体仅占群体的0.2%,可自体受精或双性生殖;③染色体组简单:只有5对常染色体和1对性染色体;④基因组便于研究:基因组大小仅为100Mb,并且内含子少,基因密度高;⑤生活周期短且随温度变化:线虫整个的生命周期仅3天(25℃)。野生型线虫胚胎发育中细胞分裂和细胞系的形成具有高度的程序性,这样就便于对其发育进行遗传学分析。温度越高,生活周期越短;⑥有大量突变株;⑦繁殖能力强:成虫一生可产300个受精卵;⑧易于保存:可以用-80℃冰箱长期保存 线虫作为模式生物,与酵母、果蝇、斑马鱼、小鼠和拟南芥等一起,为生命科学的发展做出了极大的贡献。它与其他模式生物相比,有自身优势,如:①它只有消化系统和呼吸系统,并且肉眼可见,容易研究;②它是目前最适合大规模药物筛选的多细胞动物,③它的研究成本低:既提供了一个完整动物实验系统,又避免了小鼠模型的高价费时等。但也有其缺点,如:①线虫的神经元细胞对RNAi不敏感;②线虫没有心脏、获得性免疫系统、呼吸系统等,所以一些人类疾病无法在线虫中模拟;③鉴于线虫与人类种间距离太远,线虫的作用仍是在药物研发初期,快速粗筛,提供线索,需要再经过哺乳动物模型的“细筛”。 基于线虫的自身体积小并且结构简单的优势,国内外众多的科研机构都在以线虫作为研究材料,在RNAi、衰老、药物筛选、功能基因组学等领域进行研究。研究发现,线虫中大约有35%的基因是在人体中具有等同作用,并且有大量人类遗传疾病同源基因,只有大约58%是线虫特有的,所以,从理论上讲, 只要人类疾病的靶蛋白或调控途径是物种间保守的, 就可能利用模式生物来进行研究。 目前,已经有许多成功的线虫病理模型,如:溶酶体病,阿尔茨海默症(Alzheimer’s, AD),多囊肾病(polycystic kidney disease),Duchenne 肌营养不良症,过氧化物体生物合成缺陷等。 甲基磺酸乙酯,简称EMS,是一种重要的致癌物之一,生物学上可以用来创建突变体库。本实验就是将EMS作为诱变剂来获得线虫的突变体。线虫有单基因突变形成的表型,例如:运动不协调(uncoordianated,Unc)、短胖(dumpy,Dpy)、打卷(roller,Rol)等,造成这些表型的基因有很多个,分别分布于各条染色体上。这些易于观察的表型作为遗传标记,给线虫的经典遗传学实验带来了极大的便利。此外,线虫还有许多组织特异性标记的品系,如在线虫中负责协调前后运动的D型运动神经元。我们通过对排卵时期的线虫进行诱变,观察诱变后线虫突变体表形,对突变体后代进行筛选,探究影响突变型基因的显隐性,

几种拟南芥突变体鉴定方法

HY5‐215 The Arabidopsis HY5 gene encodes a bZIP protein that regulates stimulus‐induced development of root and?hypocotyl, Genes Dev. 1997 Nov 15; 11(22): 2983–2995. In the genome of hy5‐215, the splicing acceptor site of the first intron (=G) was replaced by A, suggesting that this mutation causes aberrant RNA processing In hy5‐215, the nucleotide g‐1117 (white letter), which is the last nucleotide in the first intron, is replaced by an a HY5‐215的突变位点与野生型相比,并没有酶切位点的变化。引物在有一个错配位点的情况下,可以产生一个新的酶切位点PsiI,从而将野生型、杂合、纯合进行区分。 Design proper primers and choose proper a enzyme by dCAPS Finder 2.0 (https://www.wendangku.net/doc/8710297145.html,/dcaps/dcaps.html)

HY5proF GAGAGAATATGCGAGTGAATGAC Len 22 TM 54 HY5proR TCTAAAGTCTCTTTTATGTTTTA T A Len 25 TM 50.8 PsiI: 但是,实验室并没有PsiI ,所以只能再去寻找新的内切酶。在设计的引物有2 个错配位点时,可以产生新的酶切位点,AluI 将野生型切断。 HY5-215 F CGTATCTCCTCATCGCTTTCAATAG Len 25 TM 60.0 HY5-215 R GTCCCGCTCTTTTCCTCTTTATC Len 23 TM 60.8 AluI:

突变体构建

突变体构建 1.定点突变:快速,高效,简便 设计原理:引物与模板链退火,pfu DNA聚合酶合成突变链。DpnⅠ酶体外降解非突变型质粒模板(甲基化质粒模板) 设计引物: 引物包含5’端重叠区和3’端延伸区。 引物长度:除突变点之外,两条引物的长度大约为30个核苷酸,5’端重叠区包含15-20个碱基,3’端延伸区包含至少10个碱基。 突变引物:突变点位于两条引物上,分别位于正向突变引物重叠区下游、紧邻重叠区;反向突变引物5’端。 退火温度的计算不包括突变碱基。如图: 5’’3’-TACTGGTACTAATGCGGTTCGCGC G 延伸区重叠区 2.嵌合型突变体的构建: 将一个基因与另一个基因,互换构建嵌合型突变变体,可以通过overlapping PCR的方法获得。 ●原理: 比如两个基因,一个命名为A,一个命名为B。 A的序列为5-atgcatgctagctagaacgct acgctgactaccccctgatc-3, B的序列为5-atgctagtagctagcccccc cc aggggataattttttaaaacg-3。 ●首先我们要设计引物,假设引物的序列为: A1:5-atgcatgctagctagaacgct-3 A2:5-ggggggctagctactagcat gatcagggggtagtcagcgt-3 B1:5-acgctgactaccccctgatc atgctagtagctagcccccc-3 B2:5-cgttttaaaaaattatcccct-3 (设计引物的时候在A2的3端加入了20个B基因5端的序列,在B1的5端加入了20个A基因3端的序列。) ●步骤: (1)以A1,A2扩增A基因,B1,B2扩增B基因 (2)回收A,B基因 (3)以A,B为共同的模板,A1和B2为引物,扩增A+B,这样我们就利用重组PCR的方法将A+B拼接起来了。

拟南芥突变体购买流程-完全图解

最近要购买一批拟南芥突变体,想请教有经验的虫友购买拟南芥突变体的具体流程,例如我需要一个APETALA1的突变体,应到哪个网站进行搜索,怎样进行选择订购,越具体越好,有截图就更好了,谢谢大家了! Step 1. 打开NCBI主页:https://www.wendangku.net/doc/8710297145.html,/ 打开的页面如下: 如下 得到如下页面:

进一步获得该基因在NCBI里面的基因信息,到此我为什么要做这一步呢,主要是想获得该gene在拟南芥中的系统名,见下图: 记住这个名称:AT1G69120这个就是APETALA1(AP1)基因 接下来开始查找APETALA1(AT1G69120)的突变体,拟南芥突变体库世界上有很多,公开的没有公开私用的都有,突变的方法也不尽相同,有DS的,T-DNA插入的,Tos17,EMS方法突变的等等。。。。。。 但是,我们通常用美国SALK研究所的突变体库,这个突变体库比较权威,从这里可以找到几乎现有的所有拟南芥突变体,包括T-DNA插入,RIKEN FST等等各种不同的突变类型,而且有详细的突变位点介绍和购买方法 它的搜索界面一目了然,使用也很方便。 下面介绍SALK突变体库的使用方法: Step 2:打开SALK主页:https://www.wendangku.net/doc/8710297145.html,/ 点击T-DNA Express 进入(红圈处点击),如下显示:

显示如下,所有信息全在如下窗口中 从上述窗口中可以获得很多不同group制得的突变体,有SALK T-DNA,CSHL FST(冷泉港实验室的)等等,我个人建议使用SALK 的突变体,订购比较方便,听同学说好像一百美元一个,上图中,蓝色下划线的那两个,以SALK_冠名的那个,两个显示的是不同的插入位置,和T-DNA插入方向(看在图中的位置和箭头方向) 点击其中一个进入信息页,比如点击SALK_056708,得到如下页面:

科创-突变体鉴定

项目编号 东北农业大学大学生科技创新基金 申请书 项目名称:拟南芥AtbZIP1转录因子基因At5g49540 的突变体鉴定 项目主持人:李松 所在学院:生命科学学院 研究起止时间:2008年11月1日至2009年11月1日 东北农业大学教务处制

项目名称 拟南芥AtbZIP1转录因子基因At5g49540 的突变体鉴定 研究起止时间2008.11~2009.11 申请金额1000元 项目主持人 姓名李松学号A09060068所在学院生命科学学院所学专业生物技术学生类别二年级年级班级生物技术 指导教师 (1) 姓名才华职称讲师 所在学院生命科学学院研究领域植物基因工程 指导教师 (2) 姓名纪巍职称助教 所在学院生命科学学院研究领域植物基因工程 项目组成员姓名刘维学号A0960072 专业班级生技062 姓名肖松学号A09060086 专业班级生技062 姓名王鹏姬学号A09060080 专业班级生技062 姓名卢清瑶学号A09060073 专业班级生技062

一、项研究的目的意义、国内外研究概况、主要创新之处 1.研究的目的意义 基因功能的主要研究方法包括:(1)克隆相关基因,进行异体超表达研究(Meyer 等2000,2004;Schulze等2003); (2)利用T-DNA插入突变技术,获得目的基因敲出突变体(Bouche 和Bouchez 2001;Parinov和Sundaresan 2000),再通过筛选出的纯合突变体,研究目的基因的功能(Meyer等2004)。与前者相比,后者具有许多优势(Meyer 等2004),已成为反向遗传学研究的主要手段(Bouche和Bouchez 2001;Parinov和Sundaresan 2000)。 bZIP类转录因子普遍存在于动植物及微生物中,是植物中一类很大的转录因子家族,在拟南芥中就有75个家族成员,在植物生长发育以及抗逆境胁迫的过程中起到重要的作用。本研究利用已购买的拟南芥AtbZIP1基因的突变体作为实验材料,利用“三引物法”在DNA水平上对突变体进行插入纯合鉴定;在此基础上,对插入纯合的突变体,提取其RNA并进行RT-PCR,在RNA水平上鉴定T-DNA插入是否抑制了AtbZIP1基因的表达,最终获得不表达AtbZIP1基因的拟南芥突变体。本研究可为利用突变体进行功能互补研究AtbZIP1基因的功能提供突变体材料,进而为研究AtbZIP1转录因子在植物生长发育以及抗逆境胁迫的过程中所起的作用奠定基础。 2.国内外研究概况 1)突变体鉴定的方法的研究现状 反向遗传学研究的首要条件是获得大量基因敲除突变体,建立一套快速、可靠的T-DNA插入突变体鉴定方法对其进行鉴定很重要。目前,鉴定方法主要有2种(https://www.wendangku.net/doc/8710297145.html,/tdnaprimers.html): “三引物法”和“双引物法”。 “三引物法”的原理如图1 所示,即采用三引物(LP、RP、LB)进行PCR 扩增。野生型植株(wild type, WT)目的基因的两条染色体上均未发生T-DNA 插入,所以其PCR 产物仅有1 种,分子量即从LP到RP的大小; 纯合突变体植株(homozygous lines, HM)目的基因的两条染色体上均发生T-DNA 插入,而T-DNA 本身的长度约为17 kb,过长的模板会阻抑目的基因特异扩增产物的形成,所以也只能得到1种以LB与LP (或RP)为引物进行扩增的产物,分子量即从LP 或RP 到T-DNA 插入位点的片段的长度再加上从LB 到T-DNA载体左边界的片段的长度;杂合突变体植株(heterozygous lines, HZ)只在目的基因的一条染色体上发生了T-DNA 插入,所以PCR 扩增后可同时得到

突变体质粒构建—PCR法-2011

实验题目:突变体质粒构建——PCR 法 背景与原理: 蛋白与蛋白间,蛋白与核酸间相互作用是后基因组学研究重要内容之一,而体外突变技术则是研究这种复杂关系的一个有效手段。通过PCR 方法可向目的DNA 片段中引入任何所需的变化,包括碱基的添加、删除、点突变等。PCR 定点突变迅速、高效并且重复性好,是基因研究工作中一种非常有用的手段。其基本原理可简述如下图: 本实验拟在某基因编码区(CDS )内,通过PCR 定点突变引入一个EcoRI 酶切位点。该基因片段长724bp ,上下游分别以XhoI 和BamHI 两个酶切位点插入真核表达载体pcDNA3.1,即pcDNA3.1-CDS 。此基因内部含有一个EcoRI 酶切位点,我们通过PCR 法诱 产物I 产物II 第一轮PCR 第二轮PCR 退火 延伸 8个循环后加入 引物1/引物4

变又形成一个EcoRI酶切位点,可以通过EcoRI单酶切验证突变是否成功。具体设计如下: 仪器、试剂及药品配方: 1.仪器:PCR仪,电泳槽,水浴锅,凝胶成像仪,离心机,振荡培养箱,温箱,超净工作 台,冰箱 2.试剂及配方: 2.1试剂:DNA回收试剂盒,限制性内切酶(BamHI,EcoRI,XhoI),T4连接酶,DNA电 泳marker 2.2PCR反应体系: primex 12.5μl 模板1μl 上游引物(5μM)2μl 下游引物(5μM)2μl 水7.5μl 2.3primex配制: primex Taq酶0.125μl 10×Taq酶buffer 2.5μl dNTP(2.5μM)2μl 水7.875μl 2.4DNA电泳buffer(TAE): 工作液(1×)储存液(50×) 40mM Tris-乙酸242g Tris/57.1ml冰乙酸

突变体鉴定

作物突变体的细胞学研究 一、突变体的初步观察和遗传分析 在某品系材料A中发现一株突变体,将其命名为M,优先将M自交,得到具有突变性状的纯系,如果为不育等特殊性状则可以采取不断回交的方式得到相应 纯系;再将M与A和另外一品系Y分别正交和反交,得到F 1世代;将得到的F 1 自交得到各个的F 2世代;将F 1 与M进行回交,分别得到对应的BC 1 世代;如果需 要,还可以继续回交得BC 2 等世代。 观察M的突变性状在自交过程中是否始终存在,则能初步判别此突变性状是否为可遗传性状; 分别统计M与A,M与Y的正反交的表型数据,分析所有正交与反交的差异,可以判别此性状是由核基因控制或者细胞质基因控制,甚至为核质互作控制; 结合M自交过程中的突变性状的遗传特性和所有F 1 突变性状,可判别突变性状为隐性或显性; 统计分析F 2和BC 1 世代的突变表型数据,可判别控制突变性状为质量性状或 者数量性状,以及质量性状中的的基因的对数。 在数据的分析过程中要充分应用生物统计的方法,如方差分析,Χ2检验等。 二、突变体的细胞学观察 核型分析原理与步骤 核型分析是指在一个物种内,对其染色体数目。结构及其它特征进行描述性分析,从而对单一染色体进行初步分析的过程。在突变基因确定为核基因后,则可以进行核型分析。 不同物种的染色体都有各自特定的形态结构(包括染色体的长度、着丝点位置、臂比、随体大小等)特征,而且这种形态特征是相对稳定的。因此,染色体核型分析是植物遗传性研究的重要内容。 染色体核型分析主要包括染色体长度、染色体臂比、着丝点位置、次缢痕等。染色体的长度差异有两种,一种是不同种、属间染色体组间相对应的染色体的绝对长度差异,一种是同一套染色体组内不同染色体的相对长度差异。

【WO2019205919A1】一种生物突变体库的构建方法【专利】

20 (51)国际专利分类号:(72)发明人:姜临建(JIANG,Linjian);中国山东 C12N15/82(2006.01)C12N15/85(2006.01)省青岛市黄岛区青龙河路53号,Shandong A01H5/00(2018.01)C12N15/00(2006.01)266000(CN)。 (21)国际申请号:PCT/CN2019/081654(81)指定国(除另有指明,要求每一种可提供的国家 (22)国际申请日:2019年4月8日(08.04.2019)保护):AE,AG,AL,AM,AO,AT,AU,AZ,BA,BB,BG, BH,BN,BR,BW,BY,BZ,CA,CH,CL,CN,CO,CR,CU, (25)申请语言:中文CZ,DE,DJ,DK,DM,DO,DZ,EC,EE,EG,ES,FI,GB, (26)公布语言:中文GD,GE,GH,GM,GT,HN,HR,HU,ID,IL,IN,IR,IS, JO,JP,KE,KG,KH,KN,KP,KR,KW,KZ,LA,LC,LK,(30)优先权: LR,LS,LU,LY,MA,MD,ME,MG,MK,MN,MW,MX, 201810400607.72018年4月28日(28.04.2018)CN MY,MZ,NA,NG,NI,NO,NZ,OM,PA,PE,PG,PH,PL,(71)申请人:青岛清原化合物有限公司(QING PT,QA,RO,RS,RU,RW,SA,SC,SD,SE,SG,SK,SL, DAO KINGAGROOT CHEMICAL COMPOUND CO.,SM,ST,SV,SY,TH,TJ,TM,TN,TR,TT,TZ,UA,UG,LTD.)[CN/CN]:中国山东省青岛市黄岛区青US,UZ,VC,VN,ZA,ZM,ZW。 龙河路53号,Shandong266000(CN)。(84)指定国(除另有指明,要求每一种可提供的地区 保护):ARIPO(BW,GH,GM,KE,LR,LS,MW,MZ, NA,RW,SD,SL,ST,SZ,TZ,UG,ZM,ZW),欧业(AM, (54)Title:CONSTRUCTION METHOD FOR BIOLOGICAL MUTANT LIBRARY (54)发明名称:一种生物突变体库的构建方法 (57)Abstract:Disclosed in the present invention is a construction method for a biological mutant library.The construction method for a biological mutant library disclosed in the present invention comprises:1)introducing a DNA segment to a target organism to obtain a genetically modified organism,the DNA segment being capable of expressing elements required by implementation of site-directed mutation of target DNA in the genetically modified organism;and2)culturing the genetically modified organism to obtain a biological mutant library,the organism being a sexual reproductive organism,and the genetically modified organismbeing capable of site-directed mutation of target DNA in a germ cell.According to the mutant library obtained by using the present method,organisms having the characteristics of anti-biotic stress,anti-abiotic stress,high yield,good quality characteristics,high secondary metabolite yield,etc.can be obtained by screening.Therefore,the present method has a great application prospect. [见续页]

拟南芥突变体购买流程-完全图解

Step 1. 打开NCBI主页: 打开的页面如下: 如下 得到如下页面: 进一步获得该基因在NCBI里面的基因信息,到此我为什么要做这一步呢,主要是想获得该gene在拟南芥中的系统名,见下图:

记住这个名称:AT1G69120这个就是APETALA1(AP1)基因 接下来开始查找 APETALA1(AT1G69120)的突变体,拟南芥突变体库世界上有很多,公开的没有公开私用的都有,突变的方法也不尽相同,有DS的,T-DNA插入的,Tos17,EMS方法突变的等等。。。。。。 但是,我们通常用美国SALK研究所的突变体库,这个突变体库比较权威,从这里可以找到几乎现有的所有拟南芥突变体,包括T-DNA插入,RIKEN FST等等各种不同的突变类型,而且有详细的突变位点介绍和购买方法 它的搜索界面一目了然,使用也很方便。 下面介绍SALK突变体库的使用方法: Step 2:打开SALK主页:点击 T-DNA Express 进入(红圈处点击),如下显示:

显示如下,所有信息全在如下窗口中 从上述窗口中可以获得很多不同group制得的突变体,有SALK T-DNA,CSHL FST(冷泉港实验室的)等等,我个人建议使用SALK 的突变体,订购比较方便,听同学说好像一百美元一个,上图中,蓝色下划线的那两个,以SALK_冠名的那个,两个显示的是不同的插入位置,和T-DNA插入方向(看在图中的位置和箭头方向) 点击其中一个进入信息页,比如点击SALK_056708,得到如下页面:

我们主要是从 ABRC 订购,点击进入页面,填写要求的相关信息,万事大吉。祝实验顺利!

水稻TOS17突变体库的创建与应用

1文献综述 1.1水稻基因组学研究现状 1.1.2 水稻全基因组测序 水稻(Oryza sativa L.)是世界上最主要的粮食作物之一,全世界有一半的人口食用它,水稻年总产量占世界粮食作物产量第三位,维持较多人口的生活。亚洲是世界水稻主产区,近年稻米产量占世界的90%以上,中国稻米年产量占亚洲的38%。大米作为我国主要粮食种类,在养活我国13亿人口和改善我国居民营养结构中具有举足轻重的影响。同时,水稻又以其基因组相对较小(~430Mbp),高效的遗传转化体系,与玉米、大麦和小麦等其它禾本科作物在基因组上存在明显的共线性,而成为研究单子叶植物的模式植物。 国际水稻基因组计划(IRGSP)启动于1998年,以粳稻品种(japonica)日本晴(Nipponbare)为模式材料,由中国、日本、美国等是十个国家参与,所采用的方法为逐步克隆策略(clone by clone sequencing),随后在2002年由日本和中国科学家率先公布了第1、4染色体的精确序列(Feng et al., 2002; Sasaki et al., 2002; Consortium 2003);2003年9月第10条染色体的全长序列由美国Clemson大学公布(Rice Chromosome 10 Sequencing Consortium, 2003)。2005年8月水稻全基因组精确序列在Nature发表(International Rice Genome Sequencing Project, 2005)。IRGSP公布的水稻“日本晴”精确序列经过分析表明:(1) 水稻“日本晴”基因组大小为389Mb,IRGSP公布的序列能够覆盖其全基因组的95%,并包含了所有的常染色质和两个完整的着丝粒;(2) 整个基因组中包含大约37544个非转座相关基因,其中71%的基因可能在拟南芥中有同源基因;(3)通过与拟南芥基因组序列对比分析发现,拟南芥90%的基因在水稻中可能存在同源物;(4) 水稻中预测的37544个基因中,29%是属于成簇的基因家族;(5) 水稻基因组中转座元件的数目和种类与玉米和高粱基因组共线性区段的扩张是一致的;(6) 有证据证明基因能从细胞器中转移到细胞核(International Rice Genome Sequencing Project, 2005)。 另外的一些科学研究部门和公司也分别启动了各自的水稻测序计划。如华大基因在2005年宣布完成籼稻品种“93-11”的全基因组序列测序,其所采用的方法为鸟枪法。Syngenta公司也于2002年宣布完成了粳稻品种“日本晴”的全基

拟南芥突变体的筛选与鉴定综述

本科生文献综述题目拟南芥突变体的筛选综述 系别林学与园艺学院 班级园艺102班 姓名唐辉 学号103231228 答辩时间年月

新疆农业大学林园学院 拟南芥突变体的筛选综述 唐辉指导老师:王燕凌 摘要:本文归纳了拟南芥抗旱、抗氧化、耐低钾、耐硒、耐盐、晚花突变体筛选的研究内容。在拟南芥抗旱突变体筛选中将用到甘露醇模拟干旱胁迫来进行试 验。在抗氧化、耐低钾、耐硒中将用到Na 2SeO 3 、钾、硒、NaCl等化合物或者化学 元素对拟南芥突变体的生长发育影响来进行拟南芥突变体的筛选。概括了拟南芥突变体在甘露醇模拟干旱中的生长影响以及拟南芥突变体在抗氧化、耐低钾、耐硒、耐盐等逆境环境中生长研究方面的观点。总结了拟南芥突变体在先如今人们研究中常用的几种筛选方法,指出了拟南芥突变体筛选的研究需求,并提出筛选拟南芥抗逆突变体的重要意义。 关键词:拟南芥;突变体;筛选;研究 Screening Summary of Arabidopsis Mutants Tang Hui Instructor:Wang Yanling Abstract: This paper summarizes the Arabidopsis drought, oxidation resistance, low potassium, selenium-resistant, salt, late-flowering mutants creening research.And detailed exposition of the various materials and processes Arabidopsis mutants creening methods needed in the screening process.In the anti-oxidation, anti-potassium, selenium resistance will be used Na2SeO3, potassium, selenium, NaCl chemical elements or compounds such mutations affect thegrowth and development of the body to be screened Arabidopsis thaliana mutants.Thus summarizes the growth of Arabidopsis mutants mannitol and simulated drought in Arabidopsis mutants in anti-oxidation, anti-potassium,selenium resistance point of view, salt and other adverse environments grow research.Arabidopsis mutants summarized earlier research that people now commonly used inseveral screening methods, pointed out the Arabidopsis mutant screening research needs and the importance of screening

菌种筛选方法

菌种筛选方法 在实际工作中,为了提高筛选效率,往往将筛选工作分为初筛和复筛两步进行。初筛的目的是删去明确不符合要求的大部分菌株,把生产性状类似的菌株尽量保留下来,使优良菌种不致于漏网。因此,初筛工作以量为主,测定的精确性还在其次。初筛的手段应尽可能快速、简单。复筛的目的是确认符合生产要求的菌株,所以,复筛步骤以质为主,应精确测定每个菌株的生产指标,测得的数据要能够反映将来的生产水平。 1 从菌体形态变异分析有时,有些菌体的形态变异与产量的变异存在着一定的相关性,这就能很容易地将变异菌株筛选出来。尽管相当多的突变菌株并不存在这种相关性,但是在筛选工作中应尽可能捕捉、利用这些直接的形态特征性变化。当然,这种鉴别方法只能用于初筛。有人曾统计过3,484个产维生素B2的阿舒假囊酵母(Eremothecium ashbyii)的变异菌落,发现高产菌株的菌落形态有以下特点:菌落直径呈中等大小(8-10毫米),凡过大或过小者均为低产菌株;色泽深黄色,凡浅黄或白色者皆属低产菌株。又如,在灰黄霉素产生菌荨麻青霉(Penicillium urticae)的育种中,曾发现菌落的棕红色变深者往往产量有所提高,而在赤霉素生产菌藤仓赤霉(Gibberella fujikuroi)中,却发现菌落的紫色加深者产量反而下降。 2 平皿快速检测法平皿快速检测法是利用菌体在特定固体培养基平板上的生理生化 反应,将肉眼观察不到的产量性状转化成可见的"形态"变化。具体的有纸片培养显色法、变色圈法、透明圈法、生长圈法和抑制圈法等,见图5.6.1。这些方法较粗放,一般只能定性或半定量用,常只用于初筛,但它们可以大大提高筛选的效率。它的缺点是由于培养平皿上种种条件与摇瓶培养,尤其是发酵罐深层液体培养时的条件有很大的差别,有时会造成两者的结果不一致。图5.6.1 平皿快速检测法示意图平皿快速检测法操作时应将培养的菌体充分分散,形成单菌落,以避免多菌落混杂一起,引起"形态"大小测定的偏差。 1) 纸片培养显色法将饱浸含某种指示剂的固体培养基的滤纸片搁于培养皿中,用牛津杯架空,下放小团浸有3%甘油的脱脂棉以保湿,将待筛选的菌悬液稀释后接种到滤纸上,保温培养形成分散的单菌落,菌落周围将会产生对应的颜色变化。从指示剂变色圈与菌落直径之比可以了解菌株的相对产量性状。指示剂可以是酸碱指示剂也可以是能与特定产物反应产生颜色的化合物。 2) 变色圈法将指示剂直接掺入固体培养基中,进行待筛选菌悬液的单菌落培养,或喷洒在已培养成分散单菌落的固体培养基表面,在菌落周围形成变色圈。如在含淀粉的平皿中涂布一定浓度的产淀粉酶菌株的菌悬液,使其呈单菌落,然后喷上稀碘液,发生显色反应。变色圈越大,说明菌落产酶的能力越强。而从变色圈的颜色又可粗略判断水解产物的情况。 3) 透明圈法在固体培养基中渗入溶解性差、可被特定菌利用的营养成分,造成浑浊、不透明的培养基背景。将待筛选在菌落周围就会形成透明圈,透明圈的大小反映了菌落利用此物质的能力。在培养基中掺入可溶性淀粉、酪素或CaCO3可以分别用于检测菌株产淀粉酶、产蛋白酶或产酸能力的大小。 4) 生长圈法利用一些有特别营养要求的微生物作为工具菌,若待分离的菌在缺乏上述营养物的条件下,能合成该营养物,或能分泌酶将该营养物的前体转化成营养物,那么,在这些菌的周围就会有工具菌生长,形成环绕菌落生长的生长圈。该法常用来选育氨基酸、核苷酸和维生素的生产菌。工具菌往往都是对应的营养缺陷型菌株。

植物突变体库的构建及突变体检测研究进展_郭建秋

收稿日期:2009-12-11 基金项目:国家重点基础研究发展计划(973计划)项目(2009CB118400) 作者简介:郭建秋(1972-),男,河南新安人,助理研究员,主要从事大豆品质改良利用研究。 E-ma il:guojianqiu.2008@https://www.wendangku.net/doc/8710297145.html, 植物突变体库的构建及突变体检测研究进展 郭建秋,雷全奎,杨小兰,马 雯,张向召 (洛阳市农业科学研究院,河南洛阳471022) 摘要:突变体是研究基因功能的重要材料,为此,介绍了创造突变体的方法,特别是理化诱变方法以及突变体的检测方法等方面的研究进展。关键词:植物突变体;构建;检测方法 中图分类号:Q319 文献标识码:A 文章编号:1004-3268(2010)06-0150-06 随着大量基因序列和EST 资料的积累,后基因组时代诞生了。功能基因组学是后基因组时代的重点研究内容,主要研究生物有机体内各种基因的生物学功能,进而了解所有基因如何协调发挥作用,完成一系列的生长发育过程。要精确了解每个基因的功能及基因间的相互作用,必须分析单个基因和多个基因的突变表型以及它们的时空表达剖面。随着新技术新方法的不断创新开发,分析鉴定基因功能的方法越来越多,并逐渐形成功能基因组学的分支学科。目前已经发展了多种分析鉴定基因功能的方法,其中最直接最有效的方法是构建饱和的基因突变体库,通过突变体分析鉴定基因功能。因此,突变体库的构建是功能基因组学的基础。为此,综述了创造突变体的方法以及突变体的检测筛选方法等方面的研究进展。1 创造突变体的方法 突变体库有不同的分类方法[1] 。按照产生突变体的方法大致可分为自发突变体库、体细胞无性系变异突变体库、理化诱变突变体库和插入突变体库4类。1.1 自发突变 自发突变是指自然条件下发生的突变,是生物变异的重要来源,是自然进化的基础。自发突变为人类提供了极有价值的研究材料。李玮等[2] 在芥菜型油菜品系L638-g 中发现了几株无致死效应的天然叶片黄化突变体,并研究揭示了该突变体的黄化机理及生物学特性。在水稻中,矮秆突变株的发 现揭开了矮化育种的序幕;细胞质雄性不育株的发现使水稻三系法杂种优势的利用成为现实;而光(温)敏核不育株的发现则为采用两系法利用水稻亚种间的杂种优势铺平了道路。但是自发突变的频率很低,在高等生物中,大约10万个到1亿个生殖细胞中才会有1个生殖细胞发生突变,且许多突变通过表型无法鉴定而丢失,很难进行系统收集。即使获得了感兴趣的突变株,要分离突变基因并进一步鉴定其功能也是相当困难的,因为自发突变体的遗传背景非常复杂。 1.2 体细胞无性系变异 体细胞无性系变异是组织培养中的普遍现象,泛指在细胞、组织和器官培养过程中,培养细胞和再生植株中产生的遗传变异,又可细分为自发无性系变异和诱发无性系变异。体细胞无性系变异的产生没有种属特异性,出现的频率一般比较高[3,4]。其变异频率随培养时间的延长而提高,且结合化学诱变和利用选择压力进行细胞突变体筛选可实现一定程度的定向诱变[5-7]。植物通过体细胞无性系变异,可产生一系列有益的新性状,对植物品种改良和选育新品种具有重要意义。但近年来的遗传转化实践表明,经历组织培养和再生阶段后,常表现出一些非目的性状的变异,其原因属体细胞无性系变异还是外源基因的插入诱变,往往很难确定[8]。体细胞无性系变异已在农作物的育种中广泛应用,并已获得了抗逆、可遗传的新品系[5]。赵成章等[9,10]从水稻幼胚愈伤组织中,筛选出一些早熟、矮秆、千粒重高 的新品系。孙立华等[11] 获得了抗水稻白叶枯病的 150

两种致病真菌(Botryosphaeria dothidea和Alternaria alternata)T-DNA突变体库的建立与分析

两种致病真菌(Botryosphaeria dothidea和Alternaria alternata)T-DNA突变体库的建立与分析由葡萄球座菌(B.dothidea)及链格孢(A.alternata)引发的病害在世界范围内流行,也是影响我国水果生产的两大主要病害,给我国水果生产造成巨大的经济损失。目前,对于该两种病原菌的研究仍处于初级阶段。虽对AM毒素(AM-toxin)合成基因的研究取得一些进展,但对其他相关基因及功能的研究仍较为缺乏。 农杆菌介导的T-DNA随机插入突变法是目前应用于植物和真菌基因功能研究中常用且有效的方法。为能够尽早的揭示B.dothidea及A.alternata与寄主之间的互作关系,开展致病相关基因的研究,本研究旨在建立农杆菌介导的 T-DNA转化体系,初步构建起两种致病菌的突变体库,并对部分突变体菌株进行 分析,以获得一些性状差异显著的菌株。主要结果如下:1.成功构建了农杆菌介导的B.dothidea原生质体遗传转化体系,转化效率为220株/106个原生质体;筛选获得901株突变体,初步建立了B.dothidea突变体库,PCR验证eGFP基因及抗潮霉素B基因均成功整合到B.dothidea基因组中。 2.对120株突变体菌株表型分析发现,4 3.3%的突变体菌株色素沉积加 深,14.2%的菌株色数沉淀减弱;对其生长速率测量发现,59.3%的突变体菌丝生长速率加快,仅有6.2%的菌丝生长速率有较为明显的减慢。3.对500个突变体菌株致病性检测,筛选获得16株致病性明显减弱的菌株,占供试突变体菌株的3.2%。 4.构建了链格孢苹果致病型农杆菌介导的孢子转化体系,优化了转化程序,以培养36-48 h所产孢子4℃处理6 h用于转化,转化效率为200株/106个分生孢子。 5.筛选获得880个突变体,初步构建起链格孢苹果致病型XP-1菌株突变体库,通过PCR检测及Southern blot杂交分析,抗潮霉素B基因成功整合到病原菌的

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