改良的成年大鼠骨髓源性破骨细胞诱导培养体系_夏文芳
改良的成年大鼠骨髓源性破骨细胞诱导培养体系
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夏文芳 陈璐璐 曾天舒
华中科技大学同济医学院附属协和医院内分泌科,武汉 430022
摘要 为在短时间内获得更多的破骨细胞,在近几年国内成年大鼠骨髓源性破骨样细胞培养的基础上加以改良,以建立一个简便、有效的诱导培养体系。收集3月龄SD 大鼠股骨骨髓细胞悬液,置入含有20%胎牛血清、1,25(O H)2V itD 3的培养液中。将培养体系分为4组:A 组为对照组,未加入粒细胞/巨噬细胞集落刺激因子(GM -CSF)和地塞米松(Dex amethaso ne );B 组加入GM -CSF;C 组加入Dex amethasone;D 组加入GM -CSF 和Dex amethasone,观察各组破骨样细胞(o steocla st-like cell,O LC)及骨陷窝形成情况,并计数比较。培养第6d,便可见所培养细胞衍变为形态不规则、有伪足形成的多核巨细胞,抗酒石酸酸性磷酸酶(T R AP )染色(+),且具有骨吸收作用,符合破骨细胞的鉴定标准。D 组所形成O L C 及骨陷窝数目较其它3组明显增多(P <0.01),且O L C 出现较早。结果表明:成功地建立了一个以1,25(O H)2V itD 3、GM -CSF 、Dexa methasone 为诱导分化条件的培养体系。所获得破骨细胞数量多,特征明显,且培养所需时间短。
关键词 骨髓; 破骨细胞; 细胞培养; 粒细胞/巨噬细胞集落刺激因子; 地塞米松中图法分类号 R 329-33
Modified Culture System for Induction of Osteoclasts
from Bone Marrow Stem Cells in Rat
Xia W enfa ng ,Chen Lulu,Zeng Tianshu
Department of Endocrinology ,X iehe Hospital ,Tongji Medical College ,Huazhong University of Science and Technology ,W uhan 430022
Abstract A more effectiv e culture system for inductio n of osteoclasts from bone ma rrow stem cells in ra t w as ex plo red to obtain mo re osteoclasts in a short tim e .Femurs from 3-mouth -SD rats w ere dissected and bone ma rrow cells collected and cultured in DM EM containing 20%FCS ,1,25(O H )2VitD 3.The culture system wa s divided into 4g ro ups :g ro up A ,co ntro l g roup ;gro up B receiv ing g ranulocy te -macro phage colo ny-stim ula ting facto r (GM-CSF);g ro up C receiving dexam ethaso ne;g roup D receiving GM-CSF and dex amethasone.Osteo clast-like cells (O LC)and bo ne reso rption pits w ere o bserv ed in all g roups and count-ed.Six days a fter culture,the bone m arrow cells dev eloped into irreg ular multinucleated cells w ith pseudopo-dial projectio ns.It has been confirmed tha t multinucleated cells w ere typical osteoclasts which w ere positive fo r T RAP staining and fo rm ed reso rption pits on iv ory dentine https://www.wendangku.net/doc/8510829218.html,paring with other 3g roups,the number o f OLCs and bone reso rption pits in the g roup D w ere o bviously increased (P <0.01)and cells ap-pea red relativ ely earlier .The rat osteoclast marrow culture sy stem in the presence of 1,25(O H )2VitD 3,dex -amethasone and GM -CSF w as successfully established .
Key words bone mar ro w ; o steoclast ; cell culture ; g ranulocyte -m acro phag e colo ny -stim ula ting facto r ; dex amethasone
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国家自然科学基金资助项目(N o.39770930)
夏文芳,女,1973年生,医学硕士
建立破骨细胞体外培养方法有利于从细胞与分子水平进行骨吸收机理的基础研究。由于直接分离所获得的破骨细胞数量少,存活时间短,不利于观察各种因素对破骨细胞分化过程及活性的影响,自1981年Testa [1]
等首次在体外骨髓造血细胞培养时发现
有破骨细胞形成以来,骨髓源性细胞培养诱导分化破骨细胞的技术逐渐开展并得到应用。国内目前所用的成年大鼠骨髓源性破骨细胞培养,主要以1,25(O H)2VitD 3作为诱导物,获得的破骨细胞数量尚不够令人满意。本实验在培养体系中加入粒细胞/巨噬细胞集落刺激因子(GM -CSF )与地塞米松(Dex am-ethaso ne )作为诱导分化条件,以期在短时间内获得更多的破骨细胞,为研究破骨细胞形成及分化提供一
第31卷第5期第534页2002年10月华中科技大学学报(医学版)
J Huaz h ong Univ Sci Tech [Health Sci]Vol.31No.5P .534
Oct.2002
个更为简便、实用、有效的方法。
1 材料与方法
1.1 动物
清洁级3月龄SD雌性大鼠5只,华中科技大学同济医学院实验动物学部提供,体重(230±10)g。
1.2 主要试剂
达尔伯克氏必需基本培养基(DM EM)和胎牛血清(FCS):美国Gibco公司产品;GM-CSF:Sig ma 公司;1,25(OH)2VitD3:美国雅培公司产品;Dex am-ethasone:Sig ma公司;抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色试剂盒:中国医科院血液病学研究所产品;W rig ht-Giemsa混合染色剂:由我院血液病研究所提供;象牙骨片:丹麦临床及基础研究中心馈赠。
1.3 破骨细胞的分离与培养
拉颈处死动物,无菌条件下,分离股骨,剪断两侧骨骺端,用含10%FCS的DM EM(含100U/ml 青霉素,100μg/m l链霉素)5ml反复冲洗骨髓腔3次,收集骨髓细胞悬液,调整细胞数为1×107/ml;将此细胞悬液加入含有20%FCS、10-8mo l/L1,25 (O H)2VitD3的DM EM培养液中。根据培养液中是否加入GM-CSF(1.25ng/m l)、10-7mo l/L Dex am-ethasone分为4组:A组为对照组,未加入GM-CSF 和Dex amethasone;B组加入GM-CSF;C组加入Dex amethasone;D组加入GM-CSF和Dex ametha-sone。混匀后加入预置盖玻片的6孔板(1.3ml/孔)及预置骨片的24孔板(1ml/孔)内,每组各6孔。置CO2培养箱,在5%CO2,37℃条件下培养,每2～3d换液1次,于培养第6d,取出玻片,进行固定及染色。
1.4 破骨细胞的鉴定
1. 4.1 活体细胞观察:应用相差倒置显微镜动态观察培养细胞的形态与生长情况及骨吸收陷窝的形成。
1. 4.2 W right-Giemsa染色:于培养第6d,取出盖玻片,用含甲醛的W right-Giemsa混合染色剂染色8min,流水冲洗5min,二甲苯透明后用中性树胶封片。
1. 4.3 抗酒石酸酸性磷酸酶(T RAP)染色:于培养第6d,取出盖玻片,进行T RAP染色,二甲苯透明后用中性树胶封片。
1.5 OLC计数
以T RAP染色(+),细胞核≥3个的细胞为O LC,对培养第6d的盖玻片上的O LC进行计数,每张玻片计数上10个随机视野(200倍),取其均值为每张玻片的OLC数。每组计数6张玻片,取均值,结果以细胞数/玻片表示。
1.6 骨陷窝计数
参照王洪复等的方法进行[2]。培养7d后取出骨片,用 2.5%戊二醛固定液固定7min,0.25m ol/L 氢氧化氨中超声清洗5min×3次,系列酒精脱水,自然晾干,1%甲苯胺蓝染液室温染色3～4min,蒸馏水清洗后光镜下观察。光镜100倍下对整张骨片作陷窝计数,结果以陷窝数/骨片表示,每组计数6张骨片,取均值。
1.7 统计学处理
所有数据均用x-±s表示,进行多组间的单因素方差分析及配对两组的t检验。
2 结果
2.1 相差倒置显微镜下动态观察活体细胞
细胞培养2h后开始贴壁,为体积较小单个核细胞,大小基本一致,分布均匀(图1a,见封3)。培养第2d细胞形态开始发生变化,出现散在的大圆形细胞,细胞分布开始不均匀(图1b,见封3)。其后大圆形细胞数量逐渐增多,体积不断增大,形态演变为椭圆形、梭形、不规则形,并出现伪足,胞内可见多个核,成为破骨样细胞(OLC)(图1c,见封3)。至培养的第6d这些O LC形成达高峰,随后数量开始减少,培养液中出现细胞裂解碎片。同时在与骨片共同培养中可见骨片上部分O LC附着处产生圆形、椭圆形、不规则形的陷窝,边界清晰,底面粗糙。
2.2 细胞及骨陷窝染色鉴定
2.2.1 W right-Giemsa染色:镜下可见形态不规则的巨大细胞,胞核呈深兰紫色,多核(3～20余个),呈圆形、椭圆形,胞浆着色较浅,其中可见数个大小不等未着色空泡(图2,见封3)。
2. 2.2 TRAP染色:镜下可见细胞浆内酸性磷酸酶活性部位形成红色沉淀,胞核染色呈阴性,多核(3～20余个),部分胞浆可见大小不一的空泡(图3,见封3)。
2. 2.3 骨片甲苯胺蓝染色:可见吸收陷窝呈紫蓝色圆形、椭圆形、腊肠型等多种形态,部分连接呈串珠样(图4,见封3)。
2.3 各组OLC及骨陷窝计数比较
各组O LC及骨陷窝计数比较结果见表1。与A 组相比,B、C、D3组O LC及骨陷窝数量均明显增多(P<0.01);在D组即1,25(O H)2VitD3、GM-CSF、Dex amethaso ne的共培养体系中,OLC及骨陷窝数量较其他3组均明显增加(P<0.01)。
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夏文芳等.改良的成年大鼠骨髓源性破骨细胞诱导培养体系
表1 各培养体系O LC 及骨陷窝计数
比较(x -±s ,n =6)
组别O L C (个/玻片)骨陷窝(个/骨片)A 组 5.
24±0.45 8.
32±2.26
B 组10.56±0.53▲△15.57±3.58▲△
C 组12.81±0.61▲△18.65±3.62▲△
D 组
14.
73±0.
53
▲25.
88±4.
20▲
与A 组比较 ▲P <0.01;与D 组比较 △P <0.01
3 讨论
破骨细胞(OC )是骨吸收的直接参与者,破骨前体细胞的不断分化成熟和成熟破骨细胞的活化是骨吸收作用的前提。骨髓细胞培养方法的建立为观察各
种细胞因子对破骨细胞形成过程的影响及药物干预的细胞水平研究提供重要的实验基础。成年大鼠作为研究骨质疏松的良好模型,其破骨细胞的体外培养尤为重要。为在短时间内获得更多的破骨细胞,众多学者对其诱导分化条件进行了不断的改良。本实验在国内目前所采用方法的基础上进行改良,成功建立了以1,25(O H)2VitD 3、Dex amethasone 、GM-CSF 为诱导分化条件的大鼠体外骨髓源性破骨细胞培养方法,所培养细胞具有多核、T RAP 染色(+)的特点及骨
吸收作用,符合破骨细胞的鉴定标准[2]
。
1,25(O H)2VitD 3作为钙、磷代谢的重要调节激素,已被证实是OC 分化成熟的主要激活因子,可诱导破骨前体细胞的形成及融合为成熟的OC 。Taka-hashi [3]等对大鼠的破骨细胞培养研究表明,1,25(O H)2VitD 3的效应呈剂量依赖性,10-8
m ol /L 的1,25(O H )2VitD 3具有最强的生物效应。以往所用的破骨细胞培养体系亦证明培养中加入VitD 3可明显促进破骨细胞的形成与分化。
Dex amethasone 在骨髓源性破骨细胞形成中的作用目前尽管仍不十分明确,但已有较多研究表明,Dex amethasone 能够促进破骨细胞的形成[4,5]。我们在培养体系中加入10
-7
m ol /L 的Dex amethaso ne,
结果发现在培养第3d 就出现大量T RAP 染色(+)单核细胞,明显多于未加Dex amethasone 者,且OLC 形成数量与骨吸收陷窝数较未加Dexam ethaso ne 者明显增多。因此认为Dex amethaso ne 对破骨前体细胞的形成具有促进作用。新近发现的破骨细胞分化因子(ODF)被认为是介导各种刺激因子诱导OC 生成及功能信号传导的最终因子,O DF 因子与其受体的相互作用介导了成骨/基质细胞与前破骨细胞的直接接触。已有研究显示1,25(O H )2VitD 3和Dex am-
ethaso ne 可能通过诱导成骨/基质细胞合成ODF 因子[6],从而发挥其促进前破骨细胞分化成为破骨细胞的作用。
GM-CSF 在骨髓源性破骨细胞形成中的作用目前存在较多争论,Lig g ett [7]
在小鼠的骨髓源性破骨细胞培养中发现GM -CS F 能够促进T RAP 染色(+)的单核细胞进一步分化为成熟的多核细胞,但Shuto [5]等认为GM-CSF 对破骨细胞的形成具有抑制作用,同时M achonald [8]则发现在人的骨髓干细胞培养中GM-CSF 能够刺激前体细胞的分裂、增殖。我们在实验中观察到,在培养液中加入GM -CSF ,所形成TRAP (+)细胞增多,骨片吸收陷窝数亦增加,表明GM-CSF 对破骨细胞的形成及活性具有促进作用。
本实验对原有的培养体系进行改良,建立以1,25(O H)2VitD 3、Dex amethasone 、GM -CSF 为诱导分化条件的培养体系。其实验方法简便,所用时间较短,获得破骨细胞数量多,可重复性强。为研究破骨细胞骨吸收机理提供一个更为实用、有效的实验方法。
参 考 文 献
1 T esta N G,Allen T D,Lajtha L G.Gener atio n o f o steo-clasts in v itro .J Cell Sci ,1981,47:127
2 于明香,金慰芳,王洪复等.破骨细胞体外培养与形态观
察.上海医科大学学报,1996,23(1):52
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4 Ka jj H ,Sug imoto T ,Kana tani M et al .Dex am etha so ne
stimula tes o steocla st-like cell fo rma tio n by directly act-ing o n h emo poie tic blast cells and enhances osteo clast-like cell fo rmation stimula ted by pa rathy roid ho rmo ne and pro stag landin e 2.J Bone M ine r Res ,1995,12:7345 Shuto T ,Kukita T ,Hirata M et al .Dex am etha so ne
stimula tes o steocla st-like cell fo r matio n by inhibiting
g ranulocy te -mac rophag e colony -stimula ting facto r pr o-ductio n in mouse bo ne ma rr ow cultures.Endocrino log y,1994,134:1121
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(2001-07-20 收稿)
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536·华中科技大学学报(医学版) 2002年10月第31卷第5期
改良的成年大鼠骨髓源性破骨细胞诱导培养体系
〔正文见第534页〕
骨髓间质干细胞分离培养的经验总结
骨髓间充质干细胞经验总结 2003年8月，为给大家提供一个网上交流干细胞研究经验的平台，我们干细胞版设立了骨髓间充质干细胞培养讨论区，经过近三个月的讨论学习，我们既学习丰富了自己的知识体系，也对间充质干细胞尤其是分离培养方面有了更为翔实的认识，为了大家阅读的方便，我们决定把本版中的相关内容，同时参考部分书目和文献，做一总结。 一、骨髓间充质干细胞的分离 目前常用的分离MSC的方法有全骨髓法和密度梯度离心法，全骨髓法即根据干细胞贴壁特性，定期换液除去不贴壁细胞，从而达到纯化MSC的目的。密度梯度离心法即根据骨髓中细胞成分比重的不同，提取单核细胞进行贴壁培养。随着对MSC表面抗原认识的深入，有人利用免疫方法如流式细胞仪法、免疫磁珠法等对其进行分离纯化，但经过流式或磁珠分选后的细胞出现了增殖缓慢等一些问题，加之耗费较大和技术的难度，在某种程度上限制了这些方法的广泛应用。 1．直接培养法（全骨髓培养法） 1987年，Friedenstein等发现在塑料培养皿中培养的贴壁的骨髓单个核细胞在一定条件下可分化为成骨细胞、成软骨细胞、脂肪细胞和成肌细胞，而且这些细胞扩增20－30代后仍能保持其多向分化潜能，这类细胞即为骨髓间充质干细胞（BMSC），其工作对今后MSC 的研究具有重要意义，不仅证实了骨髓MSC的存在，而且创建了一种体外分离和培养MSC 的简便可行的方法，得到了广泛的应用。 culture-spirit采用直接贴壁法，24-36小时首次换液，换液时用PBS洗两次，7-10天传第一代，以后2-3天传代。培养基采用Hyclone的DMEM/F-12（1：1），血清是天津TBD的FBS（顶级），得到了较好的培养结果。 布兰卡根据自己培养大鼠MSC的经验，详细介绍了实验步骤： （1）接种后60-80分钟,换液去除悬浮细胞 （2）原代培养24h,48h各换液一次 （3）观察细胞情况，在原代培养7天左右时，如观察到成片的典型形态的细胞，在瓶底用Marker笔标记，0.25%胰酶消化，镜下观察控制，约5-10分钟（室温太低时应放置到孵箱中），加入全培养基终止消化，瓶体朝上，吸管轻轻吹打4-8分钟，尤其是标记部位。不要用力吹打，以免把贴壁较牢的成纤维细胞，上皮样细胞吹打下来 （4）传代到新瓶中，加入少量培养基，孵箱静置20-30分钟后，MSC大多牢固贴壁。瓶底朝上，轻轻吹打，丢弃悬浮以及贴壁不牢的细胞（大多是上皮样细胞），加入全培养基开始传代培养，如观察仍有较多杂细胞，可重复上述步骤。 （5）经上述处理后，原代的那瓶细胞仍有一些MSC生长，可继续按原代培养，如观察到MSC的克隆，仍可按上述步骤纯化处理。 （6）原代或传代的细胞如观察的少量成片的杂细胞，可直接镜下瓶底标记后，超净台里用长吸管尖端机械刮除，吸出去掉。 菊花与刀用的是全骨髓培养法，直接用含10%的FBS培养基冲洗大鼠的股骨和胫骨，为了避免冲起许多气泡应缓慢冲，冲的次数不应太多。冲洗后不用离心直接接种在培养瓶里，48h~72h后首次换液，一般7~10天可传代。 天之饺子介绍的小鼠MSC的分离方法：取6w小鼠的股骨和胫骨，直接用含培养基冲出骨髓，一定要尽量把干垢端的骨髓冲干净。冲洗后不离心直接接种在培养瓶里，24－48h后去悬浮，再接下来的每3－4天换液一次，直到需要传代。 2. 密度梯度离心法 裴雪涛等用比重为1.073g/ml的percoll分离（400g×20min）人骨髓MSCs，取界面处细
脂肪源性干细胞与整形美容医学
脂肪源性干细胞与整形美容医学 一、脂肪干细胞介绍 二、ADSCs研究应用的三优势（脂肪干C应用及三大优势） 三、ADSCs在整形美容领域的应用研究 四、展望 一、脂肪干细胞介绍 1976年Fridenstein等首先报道从骨髓中分离出克隆源性的具有多向分化潜能的基质细胞-骨髓间充质干细胞（marrow-derived mesenchymal stem cells，MSCs）。Zuk等于2001年发现脂肪组织中除了含有已经定型的前脂肪细胞外，也包含一种具有多向分化潜力的细胞群，其性质与MSCs十分相似，但又不完全相同。 这些细胞已被证实不仅具有分化成为骨骼、软骨、脂肪、心肌、神经等组织的能力，而且同样具有促进伤口愈合、损伤组织细胞再生和减少疤痕的能力及抗衰老能力。 这种细胞被称为脂肪来源干细胞（adipose-derived stem cells，ADSCs）、脂肪来源成体干细胞（adipose-derived adult stem cells，ADAS cells）、脂肪来源成体间质细胞（adipose-derived adult stromal cells）、脂肪来源间质细胞（adipose-derived stromal
cells，ADSCs）、脂肪间充质干细胞（adipose mesenchymal stem cells，AdMSCs），成脂肪细胞（lipoblast）等等。现在被统称为脂肪源性干细胞（adipose-derived stem cells，ADSCs）。 二、ADSCs研究应用的三优势（脂肪干C应用及三大优势） 作为以修复重建为主旨的整形外科及以年轻化为核心的美容医学，再生医学一直是备受关注与研究探索的领域。由于MSCs获取途径与疾病治疗性价比的差异，整形外科领域再生医学研究与临床应用受到限制。脂肪源性间充质干细胞一经报道，首先在整形外科领域引起轰动效应，这种关注大大推动了ADSCs的研究，它的临床应用也正在追赶着MSCs的步伐。 首先，来源取材方便不仅是ADSCs一个最大的优势，也是整形外科的优势。一方面，脂肪组织在体内分布广泛，储量丰富；另一方面，吸脂术是整形外科成熟的常规手术，手术风险小，其作为常规“废弃的副产品”获取容易。 对患者来说，吸脂雕塑体形的同时享受干细胞的年轻化神奇功效是一次双赢的生命重塑，痛苦与恐惧感少于骨髓提取，亦无血源污染与免疫排斥风险，由此形成临床应用的优势。据国外报道，1994~2000年开展吸脂术的初期阶段，进行的66570例吸脂手术中，死亡率为0，发生
骨骼肌卫星细胞的研究现状
骨骼肌卫星细胞的研究现状 阎振鑫S111666（四川大学生命科学学院细胞生物学专业成都） 摘要：肌卫星细胞是目前公认的骨骼肌干细胞，负责骨骼肌生长和损伤修复。干细胞研究 成为医学研究领域的热点，肌卫星细胞移植成为治疗骨骼肌损伤萎缩和心肌坏死的新的治疗方案，具有广阔的前景。肌卫星细胞的体外培养中大多采用胰酶胶原酶两步消化法得到细胞悬液。在原代培养中最关键的是细胞的纯化。防止成纤维细胞的污染，主要是采用查速铁壁的方法将细胞分离。胰岛素多肽家簇、MyoD转录因子家族和MEF2家族等对肌肉的形成起重要的调控作用。 关键词：骨骼肌卫星细胞体外培养干细胞移植 肌卫星细胞是小的单核梭形细胞，是源于胚胎中胚层的干细胞，在正常骨骼肌中，它位于基底膜与肌纤维浆膜之间，处于静止状态。当受到外界刺激，在应激状态下可以分裂、增生，形成新的肌纤维，是骨骼肌再生的储备力量，负责骨骼肌的生长和损伤修复。因此,肌卫星细胞特有的成肌能力倍受重视[1-4]。目前，干细胞研究成为医学领域研究的热点，肌肉干细胞因直接参与分化骨骼肌而受世人关注。胚胎和成体内都存在肌肉干细胞，成人体内存在两类具有干细胞样特性的细胞，一类称为卫星细胞(Satellite Cells，SC)也叫成肌祖细胞(Myogenic Progenitor Cell，MPC)，另一类称为肌源干细胞(Muscle Derived Stem Cell，MDSC)，也叫群旁细胞(Side Population S，SP)，后者在数量上远少于前者。目前公认的肌肉干细胞主要是指肌肉卫星细胞[5]。 近年来，国外有报道将肌卫星细胞移植到冻伤的骨骼肌中，可改善肌肉功能[6]。组织缺损或器官功能障碍是人类保健中发生频繁、危害性大、花费高的问题之一。近年来随着组织工程技术的发展，应用肌组织工程技术，进行骨骼肌再生代替以往的手术方法修复动力性瘫痪，以其特有的优点避免了以往手术的缺陷，为瘫痪肌肉的动力修复开创了一个崭新的研究前景。另外，骨骼肌可能会通过分泌低分子量细胞因子即骨骼肌源性抑瘤物显著抑制肿瘤细胞生长[7-10]。现就肌卫星细胞的研究现状作一综述。 1肌卫星细胞的体外培养 1961年Mauro首先发现了肌卫星细胞，并推测肌卫星细胞实质上是一种处于休眠状态下的成肌细胞[11]，是肌细胞核的一种来源。肌卫星细胞作为肌组织工程技术的种子细胞，它的体外培养、鉴定及生物学特性已有大量实验研究，取得了显著的成果[ 12 ]。培养肌卫星细胞的材料来源，目前多数取自兔、鼠、犬、鸡等的肌肉组织，人体肌卫星细胞的培养已有报道，培养方法多采用胰酶、胶原酶分步消化，分离出单个成肌细胞，通过差速贴壁法去除混杂的成纤维细胞，再进行单层细胞培养。在这些步骤中纯化卫星细胞防止纤维细胞的污染是关键，在这个步骤中较好的做法是：采用PrePlate差速贴壁法进行细胞纯化，去除杂质细胞的污染。将细胞接种于明胶包被的培养瓶中培养2h，贴壁细胞为P1P；未贴壁细胞悬液转皿培养12h，贴壁的细胞为P1P2；未贴壁细胞悬液再转皿培养24h，贴壁的细胞为P1P3，未贴壁细胞悬液转皿培养24h，贴壁的细胞为P1P4；再次将未贴壁的细胞悬液转皿培养24小时，贴壁的细胞为P1P5。P1P5培养3d后换液，以后隔天换液1次，倒置显微镜下观察，
骨组织工程中骨髓基质细胞的研究进展.
作者单位:第四军医大学口腔医学院颌面外科,西安(710032 作者简介:刘彦普(1956-,河北人,副主任医师. 骨组织工程中骨髓基质细胞的研究进展 RESEARCH PR OGRESS ON BONE MARR OW MATRIC CE LL IN BONE TISSUE PR OJECT 刘彦普,钱奇春,杨维东 中图分类号:R322.7文献标识码:A 文章编 号:100524979(20020320229204 种子细胞研究是骨组织工程学的重要内容。理想的骨种子细胞应具备以下特点:①取材容易,损伤小;②易定向分化为成骨细胞,传代繁殖力强;③适应性强,植入机体后能保持成骨活性。目前,作为骨组织工程的种子细胞有4种来源:骨、骨外膜、骨髓、骨外组织。这些来源各有优缺点,其中骨髓来源的骨髓基质细胞(b one m arrow strom al cell ,BMSC 具有来源广泛、取材方便、生长稳定、增殖快、定向分化力强、易于接种成活等优点,在骨组织工程中显示出良好的应用前景。1BMSC 的成骨潜能 骨髓基质是骨髓腔中为造血干细胞提供结构和功能支持的结缔组织,由基质细胞和细胞间基质构成。骨髓成骨能力主要来源于BMSC 中的成纤维细胞集落形成单位(colony forming unit fibroblast ,CFU 2F ,它具有多向分化潜能,在特定培养条件下可转化成多种间充质细胞,如成纤维系细胞、成骨系细胞、软骨细胞、脂肪细胞、肌肉细胞和内皮细胞等[1]。Mani 2atopoulos [2]等首次观察到鼠BMSC 在体外培养条件下 具有形成钙化的骨样组织的能力,X 线衍射分析表明 钙化物具有与骨组织类似的羟基磷灰石结构,免疫组织化学显示BMSC 产生I 型胶原,骨钙素(osteocalcin ,OC 与骨涎蛋白表达阴性。Benayahu [3]等将BMSC 体外
大鼠解剖方面的资料
1. 外观大鼠外观与小鼠相似,但个体较大。一般成年大鼠体长不小于18-20cm。尾上覆有短毛和环状角质鳞片，数量多于200片。上下颌各有两个切齿和六个臼齿，共16颗牙齿。齿式为（1003/1003）×2。 2. 大鼠骨骼约105-108块，大鼠的生长发育期长,长骨长期有骨骺存在，不骨化。切齿终生不断生长，大鼠需不断啃咬磨牙以维持其长度恒定，故垫料中应有部分小木块供其啃咬。 3. 大鼠唾液腺包括腮腺、颌下腺和舌下腺。分别位于下颌骨后缘至锁骨的腹外侧、下颌骨后缘和胸腔入口的腹侧、颌下腺口侧。颈区肩胛部间沉积的脂肪组织呈腺体状，称为冬眠腺，在产热中起着重要作用。 4. 胃由前后两部分组成，前胃为无腺区，后胃为有腺区，前后两部分由一个界限嵴分开，食管通过界限嵴的一个褶进入胃小弯，此褶是大鼠不能呕吐的原因。 5. 肠道分为十二指肠、空肠、回肠、盲肠、结肠、直肠。其中小肠最长，约114cm（102-126），盲肠较长，约6-8cm。 6. 肝脏呈紫红色，占体重的比例大，约为体重的1/25，由四叶组成（右侧叶、中叶、左叶和尾叶）。肝脏的再生能力强,经部分肝切除术后仍可再生。成年大鼠切除肝2/3，在一周内肝脏生长最快，三周内肝脏重量可恢复到接近正常。大鼠无胆囊，各肝叶的胆管会合成胆总管，开口于十二指肠。胰脏位于胃和十二指肠的弯曲处，呈淡粉色，形状不规则，似脂肪。 7. 心脏重量约占体重的1/30-1/20，由左心房、左心室、右心房、
右心室组成。左心室发出主动脉弓，由此分出无名动脉、左颈总动脉、左锁骨下动脉。无名动脉又分出右颈总动脉和右锁骨下动脉。主动脉弓到心脏背侧沿脊柱下行，形成背主动脉，背主动脉再分支到髂部和四肢。 8. 肺脏为海绵状，淡粉色,位于胸腔中部,分为左、右两部分。左肺为一个大叶，右肺分为4叶（前叶、中叶、副叶、后叶）。 9. 肾脏呈暗红色、蚕豆状，位于腹腔背侧脊柱两侧。每侧肾都和一条白色细长的输尿管相连，输尿管下接膀胱。 10. 大鼠的神经系统与人类相似，亦包括中枢神经系统和周围神经系统两部分。中枢神经包括脑和脊髓，周围神经包括脑神经、脊神经、植物神经。脑分为大脑、间脑、中脑、小脑和延脑，大鼠的大脑很发达，中脑较小。由脑发出的神经叫脑神经，共12对。脊神经和植物神经和其它动物相似。 实验用大鼠解剖生理学 一、概述 每年约使用3千5百万只鼠应用于研究和测试。使用实验大鼠进行的研究包括老化，肿瘤neoplasia，药效与毒性，含特定菌之动物gnotobiology，龋齿的研究，脂质新陈代谢，维他命之作用，行为，酒精中毒和肝脏硬化，关节炎，苯酮尿症(phenylketonuria)，黄疸，果糖不耐症，高血压、胚胎学，畸胎畸形学，肾性尿崩症及传染性疾病等皆可使用大鼠进行研究。 二、解剖构造
脂肪源性干细胞在整形美容中的应用
脂肪源性干细胞在整形美容中的应用 施雨辰一、技术原理 干细胞是一类具有自我复制能力的多潜能细胞，在一定条件下，它可以分化成多种功能细胞，并具有较高的端粒酶活性，是人体的青春活力因子。随着年龄的增长，人体内的干细胞数量会不断降低，增殖分化潜能也不断的衰弱，直接导致衰老和疾病的发生发展。 而选择脂肪源性干细胞是因为，脂肪移植后成活率难以预测，且随着时间而发生变化。但绝大多数研究表明，脂肪源性干细胞可以通过种种方式显著提高脂肪移植后的成活率，而其他方法提高脂肪成活率的程度相对不明显，甚至其价值有待考证。 脂肪源性干细胞就是从脂肪组织中分离提取出来的具有多样分化功能和可塑黏附性的细胞群,所以可以代替病变细胞和老化细胞,起到治疗的作用。同时，脂肪源性干细胞较其他成体干细胞的分化能力强，抗衰老效果显著，疗效更持久。 在整形美容医学中，首先对患者实施常规肿胀麻醉，通过在患者脂肪比较集中部位进行脂肪的抽取，抽取脂肪50mL，然后在其中置入适量的胶原酶液进行震动，以220r/min的条件进行离心处理，混合物充分消化后进行过滤处理；当混合液离心后，会出现脂肪层、生理盐水层以及沉淀层；借助移液管将脂肪予以抽出，并将抽出的脂肪注射进患者的皮肤真皮层中，来重整功能细胞的供应系统，增加正常细胞的数量、活性，从而达到恢复肌肤状况，起到“表面”对抗衰老的目的。 二、技术应用 目前，干细胞医学美容技术在欧美、日本等国发展较为迅速。在中国，在美容整形外科中脂肪源性干细胞主要是应用于凹陷的填充或者各部位的年轻化治疗，且多用于临床试验，在广泛的临床应用中仍存在障碍。同时，一些打着“干细胞”技术的产品使得市场质量参差不齐，市场上销售的大部分“干细胞”技术或产品不是很规
骨髓基质干细胞及其应用的研究进展(一)
骨髓基质干细胞及其应用的研究进展(一) 【摘要】骨髓间充质干细胞(mesenchymalstemcells，MSCs)，又称骨髓基质干细胞，是骨髓中非造血实质细胞的干细胞，具有高度的自我复制能力和多向分化潜能，可分化成多种细胞。【关键词】骨髓干细胞 骨髓间充质干细胞(mesenchymalstemcells，MSCs)，又称骨髓基质干细胞，是骨髓中非造血实质细胞的干细胞，具有高度的自我复制能力和多向分化潜能，可分化成多种细胞。近来研究表明它可以向三个胚层的多种组织分化，如来源于外胚层的神经元、神经胶质细胞等，MSCs移植为脑缺血患者开辟了一种新的治疗方法。本文对MSCs移植治疗脑缺血的研究综述。 1骨髓基质细胞的生物学特性 1.1目前发现至少存在3种形态的MSCs。Colter等从培养的人骨髓细胞中分离出MSCs后，发现来自单细胞的克隆中除了含有小的梭形和大的扁平MSCs外，还有一种非常小的圆形细胞，这种小圆形细胞有更强的折光性，它们比大的MSCs能更快分裂、增殖，并且有更强的多向分化潜能，当将MSCs放在不同的微环境内时，它们可相应地分化为成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞或成肌细胞等1-3]。MSCs具有多向分化的潜能，MSCs经静脉途径或局部注射移植到不同的组织时，MSCs即可在相应的组织内分化形成该类组织细胞3，4]。 1.2MSCs的易粘附、易贴壁生长，易增殖特性使得它们经过数次换液和传代后得到分离、纯化3]。 2骨髓基质细胞在体外诱导分化为神经元和胶质细胞 最近研究发现，在特定的实验条件下可将人、大鼠及小鼠等的MSCs在体外诱导分化为神经元样和胶质细胞样细胞，SanchozRamos等发现，表皮生长因子(epidermalgrowthfactor，EGF)或脑源性营养因子(brain-derivedneuotroficfactor，BDNF)可诱导人及小鼠的少数MSCs分化为神经元样及胶质细胞样细胞，它们表达神经前体细胞的标志物巢素蛋白(nestin)及其RNA、神经元标记物神经元特异性核蛋白(neuronspecificnuclearprotein，NeuN)、星形胶质细胞标记物胶质原纤维酸性蛋白(glialfibrillaryacidicprotein，GFAP)。将人或小鼠的MSCs与胚胎大鼠中脑或纹状体神经元共培养时，部分MSCs分化为NeuN阳性的神经元样细胞及GFAP阳性的星形胶质细胞样细胞，因此，除了可能通过营养因子和细胞因子传递信号外，细胞与细胞的直接接触还可能在MSCs的分化中发挥重要作用5]。 3MSCS移植治疗局灶性脑缺血的可行性及原理 3.1供体与受体 MSCs移植治疗脑缺血多为同种异体移植，如Brazelton等6]采用的供体鼠为成熟转基因大鼠，鼠龄8～10w，受体鼠为致死量放疗后的相同鼠龄的大鼠，移植的为新鲜未经培养的MSCs。有些学者将供体鼠化疗(5-氟尿嘧啶，150mg/kg，腹部注射)2d后取其骨髓进行体外培养3代，移植前72h加BrdU进行标记，受体鼠亦为相同鼠龄相同体重的同种鼠7]。Zhao等8]的研究中，hMSCs来自于10～35岁的健康志愿者，hMSCs转染了增强的绿色荧光蛋白基因，经26代培养后移植入成熟雄鼠体重(230～250g)，结果未出现免疫排斥反应，说明MSCs具有相当大的免疫反应调节能力。上述研究中，或是供体经化疗或是受体经放疗或是MSCs经多次传代培养以降低免疫活性，从而减少移植物抗宿主反应的发生。 3.2MSCs在脑内有迁移能力 Kopen等将小鼠MSCs注入新生小鼠侧脑室后12d，发现MSCs已迁移至前脑、小脑，而且不破坏脑组织结构，其迁移方式与出生后早期的神经发育过程相同，提示MSCs的行为类似神经前体细胞9]。 3.3目前MSCs移植治疗局灶性脑缺血的途径有3种：脑立体定向移植，经颈内动脉注射移植及经静脉注射移植
小鼠骨髓基质细胞使用说明
小鼠骨髓基质细胞 小鼠骨髓基质细胞产品说明： 为使客户能尽快开展实验，派瑞金发货的原代细胞均处于对数生长期，且每次发货为汇合率达到70%的细胞，收到细胞后即可开展实验。 派瑞金提供的小鼠骨髓基质细胞取自新鲜的组织，按照标准操作流程分离培养。研发的小鼠骨髓基质细胞完全培养基能提供细胞最佳的生长条件，降低杂细胞污染，保证不同批次间细胞质量的稳定。 同时，派瑞金还建立了严格的细胞鉴定流程，所提供的原代细胞均需经过细胞类型特异性标记物、细胞形态学等检测，保证细胞纯度在90%以上；同时也需经过微生物检测，保证不含有HIV、HBV、HCV、支原体、真菌及其他类型的细菌。 小鼠骨髓基质细胞注意事项： 1. 收到细胞后首先观察细胞瓶是否完好，培养液是否有漏液、浑浊等现象，若有上述现象发生请及时和我们联系。 2. 仔细阅读细胞说明书，了解细胞相关信息，如细胞形态、所用培养基、血清比例、所需细胞因子等。 3. 请客户用相同条件的培养基用于细胞培养。培养瓶内多余的培养基可收集备用，细胞传代时可以一定比例和客户自备的培养基混合，使细胞逐渐适应培养条件;建议使用派瑞金的完全培养基。 4. 建议客户收到细胞后前3天各拍几张细胞照片，记录细胞状态。 5. 该细胞只能用于科研，不得用于临床应用。 小鼠骨髓基质细胞其他相关小鼠原代细胞： 小鼠小肠粘膜上皮细胞小鼠大隐静脉平滑肌细胞 小鼠肺微血管内皮细胞小鼠冠状动脉平滑肌细胞 小鼠肺血管平滑肌细胞小鼠大隐静脉内皮细胞 小鼠Ⅱ型肺泡上皮细胞小鼠冠状动脉内皮细胞 小鼠气管上皮细胞小鼠骨细胞 小鼠气管平滑肌细胞小鼠滑膜细胞 小鼠肺成纤维细胞小鼠骨骼肌细胞 小鼠支气管上皮细胞小鼠表皮细胞 小鼠支气管成纤维细胞小鼠真皮成纤维细胞 小鼠肺大静脉平滑肌细胞小鼠破骨细胞 小鼠肺大动脉平滑肌细胞小鼠皮肤肥大细胞
食品中多种动物源性成分检测实时荧光PCR法(BJS 201904)
附件4 食品中多种动物源性成分检测实时荧光PCR法 BJS 201904 1 范围 本方法规定了肉及肉制品中猪、驴、山羊、绵羊、牦牛、鼠源性成分检测的实时荧光PCR方法。 本方法适用于肉及肉制品中猪（Sus scrofa）、驴（Equus asinus）、山羊（Capra hircus）、绵羊（Ovis aries）、牦牛（Bos grunniens）、鼠源性成分的一种或多种成分同时定性检测。 注：本方法中鼠源性成分包括海狸鼠（Myocastor coypus）、小鼠（Mus musculus）、大鼠（Rattus norvegicus）、豚鼠（Cavia porcellus）和竹鼠（Rhizomy spruinosus）源性成分。 2原理 提取样品DNA，通过特异性引物探针进行动物源性成分的实时荧光PCR扩增，根据PCR 扩增反应中产物荧光信号及扩增曲线判定，实现对样品动物源性成分的定性分析。 3试剂和材料 除另有规定外，本方法所用试剂为分析纯或生化试剂，实验用水应符合GB/T 6682的要求。所有试剂均用无DNA酶污染的容器分装。 3.1检测用引物和探针 (a) 猪cytb基因检测用引物探针序列为： 5’端引物：5’-GCACTTTATCCTGCCATTCATCATT-3’ 3’端引物：5’-GTACAAGGATTAGTAGGATTAGT-3’ 探针：5’-FAM-CGCCCTCGCAGCCGTACATCTCCTA-BHQ1-3’ (b) 驴nad5基因检测用引物探针序列为： 5’端引物：5’-GCTAGCCTCATTATCAGTAT-3’ 3’端引物：5’-GTGATGAGGATACGTGCT-3’ 探针：5’-FAM-TCATATCATCAATCCTCAACACCCACA-BHQ1-3’ (c) 山羊cytb基因检测用引物探针序列为： 5’端引物：5’-CTTTATCCTCCCATTCATCATCA-3’ 3’端引物：5’-GAATTCCTGTGGGGTTGTTC-3’ 探针：5’-FAM-GCTCTCGCCATAGTCCACCTGCTTTTC-BHQ1-3’ (d) 绵羊cytb基因检测用引物探针序列为： 5’端引物：5’-CTCATGCTACTAGTACTATTTACG-3’
脂肪组织来源的干细胞提取、制备及储存质量管理专家共识
脂肪组织来源的干细胞提取、制备及储存质量管理专家共识 脂肪组织来源的干细胞（adipose tissue-derived stromal/stem cells ，ASCs）是从脂肪 组织中分离提取得到的，具有取材容易、对机体损伤小、体内储备量大、体外可大规模培养、可多向分化等优点。ASCs 在人体修复重建、免疫调节及组织再生等方面的应用成为近年来干细胞研究的重要内容，也是组织工程及再生医学的研究热点。 大量研究表明，自体脂肪组织移植到软组织缺损部位后，其中40%~60% 会被吸收，自体脂肪组织结合ASCs 移植，能明显减少自体脂肪组织移植的吸收、液化、坏死及纤维化等情况发生，有利于构建具有生物学结构和功能的脂肪组织。同时，利用脂肪组织可以进行大规模的ASCs 提取、制备、储存，为再生医学提供种子细胞。 目前，国内外尚缺乏ASCs 提取、分离、制备及储存的标准和质量管理规范，导致各制 备机构或研究应用机构之间无法进行统一评估和交流，严重制约了ASCs 在皮肤软组织修复重建等相关领域的发展。为了建立安全、规范、稳定、可追溯的行业共识、指南及标准，从源头保证ASCs 的提取、制备、储存的高质性和安全性，中国医药生物技术协会皮肤软组织修复与重建技术分会联合从事细胞制备和存储、皮肤软组织修复重建、分子生物学及整形和美容外科等多学科的专家，参照中国医药生物技术协会《细胞库质量管理规范》及《干细胞制剂制备质量管理自律规范》，组织起草脂肪组织采集及ASCs 制备、检测、储存的标准和质量管理专家共识，旨在促进ASCs 在皮肤软组织修复重建技术等领域研究成果的转化，进一步促进多学科的交流和发展。 1脂肪组织采集 1.1脂肪组织采集机构要求 脂肪组织的采集工作应在取得《医疗机构执业许可证》的医疗机构中实施。采集人员应持医师或者护士执业证书，经过相应的专业技术培训。采集机构应具有完整的标准化操作规程（standard operation procedure ，SOP），并备有采集过程中的应急预案。采集过程应在层流手术室内进行无菌操作，最大限度地减少污染和交叉感染的发生。 1.2脂肪组织供者要求 对供者健康状况进行全面检查（如一般信息、既往病史和家族性遗传病等）及病原微生物的感染筛查和在危险疫区停留情况的调查。身体状态良好、有完整体检报告、无遗传性家族病史、无恶性肿瘤、无急慢性传染病及血液系统疾病；血常规及分类、肝肾功能正常；人源性特定病毒（包括但不仅限于HIV、HBV、HCV 、HTLV、EBV、CMV 等）阴性、梅毒螺旋体阴性（提供脂肪组织的同时，另需提供不少于8ml 外周血用于复检，ABO血型、HLA- Ⅰ类和Ⅱ类分型检查，以备追溯性查询）。若供者HBV、HCV 、HTLV、EBV、CMV 检查结果为阳性，实验室应具有处理感染性样本的独立物理空间、独立的空调系统，能做到使用后的器具和相关物品可经过灭活处理后再移出该区域。感染性样本与非感染性样本的处理及制备不使用同一设备，方可进行脂肪组织的采集，但必须使供者知情，同时通知接收、制备、质控及医护人员等做好防护措施。当实验室不具备上述相对应病原体阳性制备/ 培养区时，不得采集上述阳性供者的脂肪组织。若供者HIV 、梅毒螺旋体检查结果为阳性时，不得采集供者的脂肪组织。高度怀疑HIV感染或者考虑HIV 感染窗口期的供者不予采集。 1.3采集方式、采集部位和采集量 1.3.1采集方式 用肿胀液（生理盐水250ml ＋2%利多卡因10~15ml ＋肾上腺素0.25mg）局部浸润麻醉供脂肪组织区域，以20ml 注射器配备口径1.5~3.5mm 、侧孔3.0~5.0mm 的吸脂针，进
实验设计-骨髓基质细胞系的建立
小鼠骨髓细胞群细胞系的建立 一、实验目的： 1) 通过培养小鼠骨髓基质细胞，建立小鼠骨髓基质细胞系 2) 了解细胞培养的一般步骤和注意事项，培养无菌操作意识 二、实验原理： 细胞培养：多细胞生物，以细胞分裂的方式产生新的细胞，用来补充体内衰老和死亡的细胞。移植到体外后，只要条件适合，依然保持着分裂增殖的能力。利用这个原理,将小鼠骨髓基质细胞移植到体外培养。通过一定的纯化方法，从原代细胞得到传代细胞，经过若干代中，部分细胞发生遗传物质的变化成为无限传代的性质，分离得到细胞系。 培养细胞纯化：由于上皮细胞和成纤维细胞对胰蛋白酶的耐受性不同，成纤维细胞先脱壁，利用此道理，采用多次差别消化法将上皮细胞核成纤维细胞分离而达到纯化的目的 三、材料：实验小白鼠 四、药剂及配制：
五、仪器器材： （1）培养皿×3、500ml烧杯×1、棉花、医用解剖器材（剪刀、镊子、解剖刀）、10ml注射器、4号针头、离心管若干、三角瓶若干、25ml卡式瓶若干、滴管、精密pH试纸、0.22μm微孔滤膜、血球细胞计数板、标签纸、油性笔、冻存管（2）超净工作台、CO2培养箱、高速离心机、高压灭菌锅、显微镜、水浴锅、-86℃冰箱
2、无菌工作室及其内物品的消毒灭菌（1）超净工作台 检查超净工作台是否正常；用之前用沾了75%酒精的脱脂棉擦拭，再开30min的紫外照射（2）小件物品 用牛皮纸（报纸）将小件物品(如镊子、解剖刀等)包裹好放进饭盒里，放进灭菌锅，其他物品也一并放入蒸汽灭菌锅内，95KPa、121℃下灭菌30min （3）其他仪器灭菌 3、试剂配制（如上表） 4、器材准备 5、注意： 1) 使用高压灭菌锅时注意正确使用方法，以免引起危险 2) 超净工作室和工作台必须清理干净，以免引起细胞污染 浸泡 ?用5%的盐酸溶液浸泡过夜 刷洗 ?用足量的洗衣粉反复刷洗,将瓶壁上的残渍洗干净 浸酸 ?将干燥后的器皿用重络酸钾溶液(重络酸钾120g:浓硫酸200ml:蒸馏水 1L)浸泡过夜 冲洗 ?将浸酸后的玻璃器皿用自来水冲洗,然后用蒸馏水,最后干燥、待用 第二部分原代培养 器材：解剖刀、剪刀、镊子、平皿、注射器、离心机、血球计数板、15ml离心管×4、培养瓶×2，冰块 试剂：乙醚、D-Hank’s溶液、生理盐水仪器：超净工作台、离心机、显微镜步骤： 1.取样 1) 超净工作台上的物品：灭菌后的解剖刀、剪刀、镊子、注射器、平皿、冰块 2) 将小鼠用乙醚麻醉后引颈处死（用培养皿盛），在盛有75%酒精的烧杯中浸 泡5min。在超净工作台上分离双侧股骨（培养皿下置冰块），在含生理盐水的50mm2玻璃平皿中去除股骨周围肌肉组织（皿下置冰块）。 3) 剪去骺端。用10mL注射器抽取食量D-Hank’s液冲洗骨髓腔，将骨髓冲入 培养瓶。
骨髓基质干细胞及其应用的研究进展
---------------------------------------------------------------最新资料推荐------------------------------------------------------ 骨髓基质干细胞及其应用的研究进展骨髓基质干细胞及其应用的研究进展( 作者： 张秀云发表时间： 2019 年 11 月 ) 【摘要】骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)，又称骨髓基质干细胞，是骨髓中非造血实质细胞的干细胞，具有高度的自我复制能力和多向分化潜能，可分化成多种细胞。 【关键词】骨髓干细胞骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells， MSCs)，又称骨髓基质干细胞，是骨髓中非造血实质细胞的干细胞，具有高度的自我复制能力和多向分化潜能，可分化成多种细胞。 近来研究表明它可以向三个胚层的多种组织分化，如来源于外胚层的神经元、神经胶质细胞等， MSCs 移植为脑缺血患者开辟了一种新的治疗方法。 本文对MSCs 移植治疗脑缺血的研究综述。 1 骨髓基质细胞的生物学特性 1.1 目前发现至少存在 3 种形态的 MSCs。 Colter 等从培养的人骨髓细胞中分离出 MSCs 后，发现来自单细胞的克隆中除了含有小的梭形和大的扁平 MSCs 外，还有一种非常小的圆形细胞，这种小圆形细胞有更强的折光性，它们比大的 1 / 9
MSCs 能更快分裂、增殖，并且有更强的多向分化潜能，当将 MSCs 放在不同的微环境内时，它们可相应地分化为成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞或成肌细胞等。 MSCs 具有多向分化的潜能，MSCs 经静脉途径或局部注射移植到不同的组织时， MSCs 即可在相应的组织内分化形成该类组织细胞。 1.2 MSCs 的易粘附、易贴壁生长，易增殖特性使得它们经过数次换液和传代后得到分离、纯化。 2 骨髓基质细胞在体外诱导分化为神经元和胶质细胞最近研究发现，在特定的实验条件下可将人、大鼠及小鼠等的MSCs 在体外诱导分化为神经元样和胶质细胞样细胞，Sanchoz Ramos 等发现，表皮生长因子(epidermal growth factor，EGF)或脑源性营养因子(brain-derived neuotrofic factor， BDNF)可诱导人及小鼠的少数 MSCs 分化为神经元样及胶质细胞样细胞，它们表达神经前体细胞的标志物巢素蛋白(nestin)及其 RNA、神经元标记物神经元特异性核蛋白(neuron specific nuclear protein，NeuN)、星形胶质细胞标记物胶质原纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein， GFAP)。 将人或小鼠的 MSCs 与胚胎大鼠中脑或纹状体神经元共培养时，部分 MSCs 分化为 NeuN 阳性的神经元样细胞及 GFAP 阳性的星形胶质细胞样细胞，因此，除了可能通过营养因子和细胞因子传递信号外，细胞与细胞的直接接触还可能在 MSCs 的分化中发挥重要作用。 3 MSCS 移植治疗局灶性脑缺血的可行性及原理
人骨髓基质细胞向成骨细胞分化过程中差异表达基因的筛选
生理学报 Acta Physiologica Sinica , August 25, 2006, 58 (4): 370-376 https://www.wendangku.net/doc/8510829218.html, 370 研究论文 Received 2006-03-30 Accepted 2006-06-02 This work was supported by the National Natural Science Foundation of China (No. 30400251). * Corresponding author. Tel: +86-10-62179164; Fax: +86-10-62173457; E-mail: jmchun@https://www.wendangku.net/doc/8510829218.html, 人骨髓基质细胞向成骨细胞分化过程中差异表达基因的筛选 刘美玲，石心泉，周万灏，刘洪文，李 东，贾孟春* 国家人口计划生育委员会科学技术研究所，北京 100081 摘 要：为了探讨人骨髓基质细胞(bone marrow stromal cells, BMSCs)向成骨细胞分化过程中差异表达的基因，本实验采用体外培养人BMSCs ，诱导向成骨细胞分化。分别选取培养12和21 d 的细胞作为驱动方(driver)和实验方(tester)，进行抑制消减杂交，构建cDNA 消减文库，将挑选出的阳性克隆与GenBank 人基因库中已公布的核酸序列进行同源性比较分析。结果表明，从培养21 d 的BMSCs 中，筛查出5个差异基因，与人基因库中已知基因的同源性分别达到90%以上。有兴趣的是，核心蛋白聚糖和Bax inhibitor 1在培养21 d 的BMSCs 中差异表达。RT-PCR 检测显示，核心蛋白聚糖基因在培养21d 的细胞中高表达，而在12 d 的细胞中未检测到表达；Bax inhibitor 1基因在培养21 d 细胞中的表达明显高于12 d 的细胞。关键词：骨髓基质细胞；成骨细胞；核心蛋白聚糖；基因中图分类号：R 329 Screening differentially expressed genes in human bone marrow stromal cells at defined stage of differentiation LIU Mei-Ling, SHI Xin-Quan, ZHOU Wan-Hao, LIU Hong-Wen, LI Dong, JIA Meng-Chun * National Population Research Institute for Family Planning, Beijing 100081, China. Abstract: To screen differentially expressed genes involved in osteogenic differentiation of human bone marrow stromal cells (BMSCs)at defined stages, subtractive cDNA library was established by means of suppression subtractive hybridization. The BMSCs cultured for 12 and 21 d were used as driver and tester, respectively. A subtract library was successfully constructed and five positive clones were selected from the library. Sequencing analysis and homology comparison showed that the five clones differentially expressed in BMSCs cultured for 21 d were at least 90% homologous with the known genes in human GenBank. It was interestingly found that the osteogenic BMSCs cultured for 21 d differentially expressed decorin and Bax inhibitor 1. RT-PCR was performed to confirm the differentially expressed genes. The results showed that the expression of Bax inhibitor 1 was significantly higher in the cells of 21-day than that of 12-day, while the expression of decorin was only detected in the cells of 21-day.Key words: bone marrow stromal cells; osteoblast; decorin; gene 正常骨量的维持需要骨祖细胞不断提供足够的成骨细胞，而正常骨转换中所需要的成骨细胞来源于骨髓基质细胞(bone marrow stromal cells, BMSCs)。BMSCs 是骨髓基质的一种间充质细胞，它能产生骨祖细胞系。BMSCs 具有多向分化潜能，在一定的诱导条件下可向脂肪细胞、肌细胞、软骨细胞，甚至神经细胞等分化[1,2]。定向分化的骨祖细胞首先增 殖并分化为前成骨细胞，同时表达I 型胶原和碱性磷酸酶(alkaline phosphatase, ALP)。I 型胶原的合成在细胞增殖期占主导地位，并与细胞的进一步分化有很大的关系。随后前成骨细胞分化为早期的成骨细胞并表达骨桥蛋白(osteopontin, OPN)，同时具有了骨基质形成的能力。最终，分化成熟的成骨细胞开始骨钙素(osteocalcin, OC)的表达，并进一步分化
老鼠
老鼠 老鼠 老鼠是一种啮齿动物，体形有大有小。种类多，全世界现有450多种。老鼠是现存最原始的哺乳动物之一，大约在恐龙时代就已出现，它们生命力旺盛、数量繁多并且繁殖速度极快，适应能力很强，几乎什么都吃，在什么地方都能住。会打洞、上树，会爬山、涉水，而且糟蹋粮食、传播疾病，对人类危害极大，所以一直受到人类打击，但它是一个打而不死，击而不破的动物家族，所以“鼠”字头顶着一个“臼”，意为“能耐受捣击”。鼠之所以被尊称为“老”，是因为它像退休养老的人一样，成天吃吃喝喝，不用劳动。排在十二生肖第一位。 中文学名：老鼠 别称：耗子、臭鼠 界：动物界 门：脊索动物门 纲：哺乳纲目：啮齿目亚目：鼠形亚目科：鼠科族：鼠族 分布区域： 除南极洲外全球。下水道、厕所、厨房等 处 数量类型：170种 爱吃食物：花生、瓜子等 寿命：1～3年 繁殖速度：40天可受孕 对人影响：生活宠物等 汉字词义 东汉经学家许慎《说文解字》[1]记载：“鼠，穴虫之緫名也（白话文：老鼠是打洞的动物的统称）。象形。凡鼠之属皆从鼠（白话文：凡是表示鼠类生物的汉字都以“鼠”为形旁）。”老鼠的鼠字的甲骨文、小篆的写法都是画一只老鼠，现在我们写的楷书里“臼”以前是画一只老鼠的头，下面的部分从左至右分别是前后四只脚和一条长尾巴。 动物简介 基本信息 老鼠 专业灭鼠公司：一丁害虫防治中心 本数据来源于百度地图，最终结果以百度地图数据为准。
（英文：Rat ，Mouse；拼音：láo shǔ）是一种啮齿动物，体形有大有小。种类多，共有约280个属，以及至少1300个种。数量繁多并且繁殖速度很快，生命力很强，几乎什么都吃，在什么地方都能住。会打洞、上树，会爬山、涉水，而且糟蹋粮食、传播疾病，对人类危害极大。是“四害”之一，但这也是为了自己的生存。除了天敌捕鼠外，人们还利用灭鼠专用器械(老鼠夹子、捕鼠鼠笼子、电子捕鼠器、粘鼠板、毒饵盒等）和灭鼠药物等方法灭鼠。 经历 古时，人们对鼠这种动物是相当畏惧的。鼠，什么东西都咬，还会传播鼠疫。“老鼠过街人人喊打”这句俗语就表明人们对老鼠的憎恶。古人对自己畏惧的东西普遍采取了“避而远之”的态度。于是，古人在这些事物之前冠以“老”字，以表示敬畏和不敢得罪的意思。有些地方因为迷信，在说到老鼠时，往往不敢直呼其名而呼之以“耗子”等。也有人认为老鼠的“老”是指年老的意思，认为老鼠是指鼠类中最为长寿的，但这种说法未必可信，因为老鼠并不长寿。但是老鼠对环境的适应能力也很强。1945年，美国在广岛和长崎投下两颗原子弹，因为核辐射过强，所以对当地的生态造成了严重破坏。但是之后人们发现，那里的老鼠几乎没有受到核辐射的影响，它们都没有畸形，也能正常的生育。人们常说“胆小如鼠”，老鼠的胆到底有多大呢？其实老鼠内脏中没有胆。 耗子说法由来 各种老鼠(7张) 五代时（公元907～960年）战争频繁，统治者变本加厉搜刮百姓，他们给苛捐杂税立了许多稀奇古怪的名目。据《旧五代史·食货志》记载，赋税除正项之外，还有许多附加税，如农家吃盐要上盐税，酿酒要交酗税，养蚕要上蚕税。不仅如此，附加税之外还有附加，名为“雀鼠耗”。官府规定：每缴粮食一石，加损耗两斗。连丝、棉、绸、线、麻、皮这些雀鼠根本不吃的东西，也要加“雀鼠耗”，每缴银十两加耗半两。到后汉隐帝时，“雀鼠耗”由纳粮一石加耗两斗，增到四斗，百姓更是苦不堪言，但又不敢公开抱怨皇帝，便将一肚子怨气发泄到老鼠身上，咒骂老鼠是“耗子”。这一说法，便流传至今。 编辑本段种类介绍 世界约有1700多种鼠类…在我国，有鼠类约170多种，我国南方主要鼠种有33种，老鼠有家栖和野栖两类。广东地区常见的家栖鼠主要有褐家鼠、黄胸鼠和小家鼠三种；野鼠主要是黄毛鼠，又称罗赛鼠、田鼠。 1、大家鼠(褐家鼠)：毛色灰，喜欢在墙根、墙角打洞，一般体重300g左右，大的有900g