酒曲中根霉的分离

酒曲中根霉菌的分离纯化

一、实验目的:

1、了解酒曲的多种形态、其中的主要微生物及其在米酒发酵中的作用

2、根据根霉菌生长特性设计特有的分离及形态观察方法

3、掌握倒平板的方法和分离纯化微生物的基本操作

二、实验原理:

酒曲中通常含有根霉、毛霉及酵母菌,还有一些特有的酶类,在米酒酿造中根霉菌通常起双边发酵的作用,因此根霉种类、发酵特性对于产品的特性品质具有非常重要的意义。

根霉在人工培养基或自然基物上生长时,菌丝体向空间延伸,遇光滑平面后营养菌丝体形成葡蔔枝,节间产生假根,假根处葡蔔枝上着生成群的孢子囊梗,柄顶端膨大形成孢子囊,囊内产生孢子囊孢子。进行根霉菌分离时常利用此生长和形态特性判断是否根霉菌,再挑取单个孢子囊孢子进行纯化。

马铃薯葡萄糖培养基(PDA)被广泛用于培养霉菌和酵母菌,它是半合成培养基。

三、试剂和器材:

培养基制备材料:马铃薯、葡萄糖、琼脂溶液和试剂:无菌水、乳酸石炭酸棉染液、

仪器和其他用品;酒曲,盛90ml无菌水并带有玻璃珠的三角烧瓶、无菌培养皿,载玻片,吸管、接种环、无菌玻璃涂棒、显微镜等

四、方法与步骤:

1.培养基的制备

培养基的配方如下:马铃薯200g、葡萄糖20g、琼脂15-20g、水1000ml、PH自然

(1)培养基制备:将马铃薯去皮,切成块煮沸半小时,然后用纱布过滤备用。称取加入20g 葡萄糖和4g琼脂与适量水放于三角烧瓶中加热溶解,待融化后不足水至1000ml并加入马铃薯充分搅匀。

(2)分装:按实验要求取适量配制的培养基分装在试管内用于纯化培养。由于是固体培养基,装量宜不超过管高的1/5,灭菌后制成斜面。

(3)加塞:培养基分装后,在试管口塞上棉塞,以阻止外界微生物进入培养基内而造成污染。

(4)灭菌:将分装的培养基以0.1MPa,121℃,高压蒸汽灭菌20min。

(5)搁置斜面:将灭菌的试管培养基冷至50℃左右(以防斜面上冷凝水太多),将试管口端搁在玻璃棒或者合适高度的器具上,搁置的斜面长度以不超过试管总长度的一半为宜。(6)无菌检查;将灭菌培养基放入37℃的温室中培养24—48小时,以检查灭菌是否彻底。

2.稀释涂布平板法

(1)倒平板:将马铃薯培养基冷至55-60℃均匀地倒入平板,倒3皿

(2)制备酒曲稀释液:称取酒曲样10g,放入盛90ml无菌水并带有玻璃珠的三角烧瓶中,振荡约20min,使细胞分散。用一支1ml无菌吸管吸取1ml酒曲悬液加入盛有9ml无菌水的大试管中充分混匀,此为10-2稀释液,一次类推制成10-3、10-4、10-5、和10-6几种稀释度的酒曲溶液。

(3)涂布:将上述培养基的平板底部用记号笔分别写上10-4、10-5和10-6三种稀释度字样,然后用无菌吸管分别由10-4、10-5和10-6管酒曲稀释液中吸取0.2ml放入平板中央,用无菌玻璃涂棒在培养基表面轻轻地涂布均匀,起方法是将菌液先沿一条直线轻轻地来回推动,使之分布均匀,然后改变方向90°沿另一垂直线来回推动,平板内边缘处课改变方向用涂棒在涂布几次,温室下静置5-10min。

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