大黄中蒽醌类成分的提取、分离和鉴定(实验报告).
大黄中蒽醌类成分的提取、分离和鉴定
一、实验目的
（1）熟悉蒽醌类成分的提取分离方法
（2）掌握pH梯度提取法的原理和操作技术
（3）学习蒽醌类化合物鉴定方法
二、实验器材
材料及试剂：大黄粗粉、浓硫酸、NaHCO3、Na2CO3、NaOH、浓盐酸、乙酸乙酯、石油醚、乙醚、普通滤纸、薄层层析硅胶板（2.5 cm×10 cm）、广泛PH试纸、剪刀、铅笔、尺子、点样毛细管、样品管等。
仪器：500mL圆底烧瓶、球形冷凝管（30cm）、橡皮管、烧杯、滴管、层析缸（广口瓶）、250mL分液漏斗、布氏漏斗、抽滤瓶、水浴锅、集热式磁力搅拌器、磁子、循环水式多用真空泵、铁架台等。
三、实验原理
大黄为蓼科植物,味苦,性寒,具有泻热通肠、凉血解毒、逐瘀通经等功效。其主要成分为为蒽醌化合物，含量约为3%~5%，大部分与葡萄糖结合苷，游离苷元有大黄酸、大黄素、芦荟大黄素、大黄酚、大黄素甲醚等。其中，大黄酸具有羧基，酸性最强；大黄素具有β-酚羟基，酸性第二；芦荟大黄素连有羟甲基，酸性第三；大黄素甲醚和和大黄酚的酸性最弱。根据以上化合物的酸度差异，可用碱性强弱不同的溶液进行梯度萃取分离。
大黄酸R1=H R2=COOH
大黄素R1=CH3R2=OH
芦荟大黄素R1=CH2OH R2=H
大黄素甲醚R1=CH3R2=OCH3
大黄酚R1=CH3R2=H
四、实验内容
大黄素的提取、分离流程图
大黄粗粉10g
20%H2SO4 150 ml
加热1h, 抽滤、干燥
滤饼
150ml乙醚回流提取1 h
乙醚层
水层（紫红色）乙醚层
HCl 3
大黄酸沉淀（粗品）
水层（红色）乙醚层
HCl 0.25% NaOH
大黄素沉淀（粗品）水层（红色）
芦荟大黄素、大黄酚、大黄素甲醚沉淀（混合物）
具体操作步骤
1. 游离蒽醌的提取
（1）酸水解：称取大黄粗粉10g，加20%H2SO4水溶液150mL，在水浴上加热1小时，放冷，抽滤，滤饼用NaOH溶液洗至近中性（pH约为6），于70℃干燥后，研碎，置250mL 圆底烧瓶中，加入乙醚150mL回流提取1小时（调45℃，回流即可），得到乙醚提取液。
（2）蒽醌类成分的提取：乙醚提取液经薄层层析检查有大黄酸、芦荟大黄素、大黄素、
大黄素甲醚和大黄酚。薄层板为硅胶—CMC粘合板，展开剂为石油醚（60～90℃）：乙酸乙酯（7：3）近水平或直立展开，在可见光下，可看到四个斑点。其中最上面黄色斑点为大黄酚和大黄素甲醚的混合物,在此条件下,不能分开,其余3个斑点依Rf值（由大到小）的顺序是大黄素（橙色斑点）、芦荟大黄素（黄色斑点）、大黄酸（黄色斑点），记录图谱并计算Rf值。
2. PH梯度萃取分离
（1）将乙醚提取液加入250mL分液漏斗中（使用前先检漏），以35 mL 5 % NaHCO3水溶液萃取三次，乙醚层经薄层层析检查（展开剂同上），指示已提尽大黄酸后，合并三次NaHCO3萃取液，用浓盐酸酸化至PH 2-3左右，析出大黄酸沉淀。（注意：加酸时应缓慢加入，以防酸液溢出，如出现分层现象，需将上层乙醚蒸去才能析出固体）。抽滤后，刮下颗粒并称重。
（2）经5% NaHCO3水溶液萃取后的乙醚层，继以35 mL 5 % Na2CO3水溶液萃取三次，乙醚层经薄层检查（展开剂同上），指示已提尽大黄素后，合并三次Na2CO3萃取液，用浓盐酸酸化至PH2-3左右，析出大黄素沉淀。（酸化时注意操作同前）。抽滤后，刮下颗粒并称重。
（3）经5% Na2CO3水溶液萃取过后乙醚层以35 mL 0.25% NaOH水溶液萃取四次，乙醚层经薄层检查（展开剂同上），指示已提尽后，合并三次 NaOH萃取液，用浓盐酸酸化至PH2-3左右，析出芦荟大黄素、大黄酚和大黄素甲醚沉淀混合物。（酸化时注意操作同前）。抽滤后，刮下颗粒并称重。
3. 样品鉴定
(1) 碱液试验分别取各蒽醌结晶数毫克置于样品管中，加2%氢氧化钠溶液1ml，观察颜色变化。凡有互为邻位或对位羟基的蒽醌呈蓝紫至蓝色，其它羟基蒽醌呈红色。
五、注意事项：
（1）游离蒽醌的提取要控制温度，回流不宜太剧烈。
（2）pH梯度萃取分离时，以保证提取充分，可以用薄层色谱作监测。
（3）注意碱液浓度及萃取时的静置时间对实验结果的影响。
六、数据记录、结果讨论与分析：
分别取各上述沉淀（蒽醌结晶）数毫克置于样品管中，加2%氢氧化钠溶液1ml 后，观察到各样品管中溶液均呈红色、但第1根管中颜色略淡。
七、 思考题
1、 简述大黄中5种游离羟基蒽醌化合物的酸性与结构的关系。
答：
A 大黄酸 R 1=H R 2=COOH
B 大黄素 R 1=CH 3 R 2=OH
C 芦荟大黄素 R 1=CH 2OH R 2=H
D 大黄素甲醚 R 1=CH 3 R 2
=OCH 3
E 大黄酚 R 1=CH 3
R 2=H
酸性：A>B>C>E ≈D