母鼠妊娠期铅镉联合暴露对新生鼠大脑bcl-2,Bax和C-fos mRNA表达的影响及NAC保护效应

中国农业科学 2010,43(2):417-423

Scientia Agricultura Sinica doi: 10.3864/j.issn.0578-1752.2010.02.024 母鼠妊娠期铅镉联合暴露对新生鼠大脑bcl-2，Bax 和c-fos mRNA表达的影响及NAC保护效应

路 浩2，达剑森1，梅 莉2，张 英1，刘宗平1

（1扬州大学兽医学院，江苏扬州 225009；2西北农林科技大学动物医学院，陕西杨凌 712100）

摘要：【目的】研究母鼠妊娠期铅镉联合暴露对新生鼠大脑bcl-2、Bax、c-fos mRNA表达的影响及N-乙酰半胱氨酸（N-Acetylcysteine, NAC）的保护作用。【方法】35只怀孕SD母鼠被随机分为7组，即A组为对照组（饮用蒸馏水）、B组为铅组（300 mg·L-1）、C组为铅+NAC组（300 mg·L-1 +20 mmol·L-1）、D组为镉组（10 mg·L-1）、E组为镉+NAC组（10 mg·L-1+20 mmol·L-1）、F组为铅+镉组（300 mg·L-1+10 mg·L-1）、G组为铅+镉+NAC组（300 mg+10 mg·L-1+20 mmol·L-1）。采用饮水染毒，染毒时间为21d，分娩后应用实时荧光定量PCR检测新生鼠大脑bcl-2、Bax、c-fos mRNA 的相对表达。【结果】与对照组比较，各染毒组bcl-2mRNA表达降低，除B组外，D组、F组均差异显著（P＜0.05），Bax、c-fos mRNA表达显著升高（P＜0.05），其中以F组作用最为明显；NAC拮抗组与相应染毒组比较，除C组bcl-2mRNA表达与B组无显著性差异外（P﹥0.05），其余各组差异显著（P＜0.05）；Bax、c-fos mRNA表达均显著降低（P＜0.05）。【结论】铅镉联合表现协同毒性效应，NAC对铅、镉致新生鼠大脑凋亡基因表达异常引起的脑细胞凋亡具有明显的保护作用。

关键词：妊娠期；铅镉联合；实时荧光定量PCR；N-乙酰半胱氨酸；协同效应

Influence of Combined Exposure to Lead and Cadmium on Bcl-2, Bax and c-fos mRNA Expression in Neonatal Brain and the

Protective Effects of N-Acetylcysteine on Pregnant Rats

LU Hao2, DA Jian-sen1, MEI Li2, ZHANG Ying1, LIU Zong-ping1

(1College of Veterinary Medicine, Yangzhou University, Yangzhou 225009, Jiangsu; 2College of Veterinary Medicine, Northwest A&F

University, Yangling 712100, Shaanxi)

Abstract: 【Objective】 In order to observe the impact of low-level lead or/and cadmium and protective effect of N-Acetylcysteine in cortical neurons of neonatal SD rats, the cultured cortical neurons of neonatal rats were used to perform the toxicity test. 【Method】Thirty-five adult female SD rats were divided into control group, lead acetate group (300 mg·L-1), lead acetate + NAC group (300 mg·L-1 + 20 mmol·L-1), cadmium chloride group (10 mg·L-1), cadmium chloride + NAC group (10 mg·L-1+20 mmol·L-1), group of lead and cadmium (300 mg·L-1 +10 mg·L-1), group of lead and cadmium + NAC (300 mg·L-1 +10 mg·L-1+ 20 mmol·L-1), and the additives were given in the drinking water. After gestational periods the expressions of bcl-2, Bax and c-fos mRNA in brain of neonatal rats were detected by real time fluorescent quantitative PCR. 【Result】In comparison with the control group, there was a significant decrease in the expression of bcl-2 mRNA except for B group (P＜0.05), and the expression of Bax and c-fos mRNA appeared a significant increase (P＜0.05), especially F group. Compared NAC protective groups with the poisoning groups, the expression of bcl-2 mRNA increased to a certain extent (P＜0.05 or P＞0.05), but the expression of Bax and c-fos mRNA significantly decreased (P＜0.05). 【Conclusion】The results showed that lead and cadmium appeared a synergetic effect, and it indicated that NAC could protect apoptosis of brain cells caused by exceptional gene expression from lead and/or cadmium in neonatal SD rats.

收稿日期：2008-06-05；接受日期：2009-11-16

基金项目：国家自然科学资金资助项目（30440050，305713647）、江苏省高校“青蓝工程”中青年学术带头人培养对象资助项目（2006）

作者简介：路浩，讲师，博士。E-mail：jjlhml@https://www.wendangku.net/doc/8d15249435.html,。通信作者刘宗平，教授，博士。Tel：0514-********；Fax：0514-********；

E-mail：liuzongping@https://www.wendangku.net/doc/8d15249435.html,

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Key words: gestational period; combined lead and cadmium; real time fluorescent quantitation PCR; N-Acetylcysteine;

synergetic effect

0 引言

【研究意义】近年来，对环境化学物毒性危害的研究已由原来单一因素为主向因素间联合作用方向发展。铅、镉均是生产和生活中接触频率大、暴露范围广的蓄积性神经毒物，极易通过胎盘到达胎儿[1]，能对发育中的中枢神经系统产生重要影响。【前人研究进展】即使是低剂量也能对发育的中枢神经系统产生不良作用[2]，可引起血脑屏障破坏[3]、使脑组织内bax/bcl-2升高，进而诱发脑细胞凋亡，影响智力及学习和记忆[4]；研究表明，很多基因参与细胞凋亡，如凋亡相关基因bcl-2家族、ICE家族、p53以及即早基因如c-fos、c-jun等。已发现的bcl-2家族成员中有的抑制凋亡，如bcl-2、bcl-xl、MCL-1等；有的促进凋亡，如bax、bcl-xs、bad、bak等。它们相互作用以调节细胞的存活和凋亡，被视为调节细胞凋亡的中心角色[5]。c-fos属于即刻早期基因（immediate early gene，IEG）的一种，正常情况下，IEG参与神经细胞的生长、分化、信息传递、学习和记忆等生理过程。近年来即刻早期基因（IEG）在神经系统的生理及病理过程中所起的重要调节作用日渐受到关注。有研究表明，N-乙酰半胱氨酸（N-Acetylcysteine，NAC）具有干扰自由基生成，清除已生成的自由基，调节细胞的代谢活性，预防DNA损伤，调整基因表达和信号转导系统，抗细胞凋亡等作用[6]。【本研究切入点】本试验通过对母鼠妊娠期采用铅、镉单独及联合染毒，旨在探讨母鼠妊娠期铅、镉暴露条件下对胎儿脑凋亡相关基因bcl-2、Bax和c-fos表达的影响，同时观察NAC 的保护效应。【拟解决的关键问题】为铅镉联合神经毒性效应及作用机理及预防和治疗铅镉毒性损伤提供科学依据，为铅镉神经毒性的早期预报指标提供参考。

1 材料与方法

1.1 实验动物与试验设计

35只怀孕SD大鼠由扬州大学比较医学中心提供，动物室自然节律采光，室温18—22℃，湿度45%—65%，清洁，安静，试验用醋酸铅和醋酸镉用蒸馏水配制，母鼠被随机分为7组后自由饮水染毒，试验分组见表1，妊娠期结束后每组每窝随机取3只新生鼠断颈处死，置于冰盘内迅速除去新生鼠脑颅骨，剥离硬脑膜及软脑膜，取出完整的脑组织，取部分脑组织迅速投入液氮中保存备用。

表1 试验设计

Table 1 Design of the test

不同组别的染毒剂量Poisoned doses in different groups

处理

Treatment A B C D E F G 醋酸铅Lead acetate (mg·L-1) － 300 300 －－ 300 300 醋酸镉Cadmium acetate (mg·L-1) －－－ 10 10 10 10 NAC (mg·L-1) － 20 20 20

1.2 主要试剂

TRIzol RNA抽提试剂购自Invitrogen公司；逆转录试剂盒购自Promega公司；DNA Marker 2000，Tag 酶购自大连宝生物工程有限公司；荧光定量PCR试剂及SYBR GreenⅠ均购自shinegene公司；DEPC水购自Sigma公司；其余均为国产分析纯，购自上海化学试剂公司。

1.3 总RNA的提取

将新生鼠大脑从液氮中取出，研磨成粉末，转入DEPC水处理过的1.5 mL EP管中，按比例加入Trizol 总RNA提取液，按Trizol Regent Kit操作说明书提取大脑组织总RNA，-70℃保存备用。取适量稀释后测定A 260和A 280时的吸光度比值，计算RNA的浓度。另取5 μL RNA溶液用1.0%琼脂糖凝胶电泳，观察RNA的完整性。

1.4 逆转录反应

取总RNA 1 μg，使用A3500逆转录试剂盒，按照试剂盒操作说明进行逆转录反应，反应体系为：2×RT buffer 15 μL、Random primer（100 pmol·μL-1）1.5 μL、RTase 1.5 μL、模板（RNA）5 μL，加DEPC

2期 路 浩等：母鼠妊娠期铅镉联合暴露对新生鼠大脑bcl-2，Bax 和c-fos mRNA 表达的影响及NAC 保护效应 419

处理H 2O 至30 μL 。25℃ 10 min ，40℃ 60 min ，70℃ 10 min ，-20℃保存备用。 1.5 引物设计

根据GenBank 中大鼠β-actin 、bcl-2、Bax 和c-fos mRNA 全序列，取其保守区，应用Clone Manager 设计引物，引物序列见表2，由上海生工生物技术有限公司合成。

1.6 荧光定量PCR 反应

以RT 后的cDNA 为模板，按照荧光定量PCR Kit 进行荧光定量PCR 反应。反应体系为：2×PCR buffer 25 μL 、F-Primers （25 pmol·μL -1）0.6 μL 、R-Primers （25 pmol·μL -1）

0.6 μL 、模板（cDNA ）1 μL ，加DEPC 水至50 μL ，反应条件为94℃ 4 min ，94℃ 15 s ，60℃ 25 s ，72℃ 25 s ，40个循环。

表2 引物序列

Table 2 The sequences of primers

基因 Gene 序列号码 Sequence number

序列位置 Sequence position 产物长度 Product length

序列 Sequences

β-actin NM_031144 290—309bp 419—439bp 150bp F: 5′-CCCATCTATGAGGGTTACGC-3′ R: 5′-TTTAATGTCACGCACGATTTC-3′ bcl-2 NM_016993 317—338bp 533—553bp 237bp F: 5′-ACGAGTGGGATACTGGAGATGA-3′ R: 5′-GACGGTAGCGACGAGAGAAGT-3′ Bax NM_017059 263—281bp 408—426bp 164bp F: 5′-CCCGAGAGGTCTTCTTCCG-3′ R: 5′-GTCCAGTGTCCAGCCCATG-3′ c-fos

NM_005252 558—579bp 709—730bp

173bp F:5′-ATCCGAAGGGAAAGGAATAAGA-3′

R: 5′-GCTGCCAAAATAAACTCCAGTT-3′

1.7 PCR 产物的分析

β-actin 在动物体内表达相当恒定，因此选其作为内参照进行实时荧光定量PCR 分析。将目的基因的CT 值（threshold cycle ）与标准曲线相比较计算目的基因的浓度。为消除RNA 降解系统及定量误差的影响，以目的基因与内参照（β-actin ）的比值表示目的基因的相对含量。每个样本重复3次，以均值来表示结果。

1.8 统计分析

应用SPSS11.5软件对数据进行多重比较和方差统计分析。

2 结果

2.1 总RNA 的检测

用紫外分光光度计检测所提RNA 的质量，OD 260/OD 280为1.9，证明所提RNA 的质量较好，无降解和蛋白质污染；用1%的琼脂糖凝胶电泳检测所提RNA ，可以明显看见两条清晰的条带，分别是28S ，18S ，说明所提的RNA 的完整性较好，无DNA 污染，可以进行实时荧光定量PCR 反应。

2.2 铅镉联合对新生鼠大脑bcl-2 mRNA 表达的影响

及NAC 的保护效应

由图1可见，各染毒组新生鼠大脑bcl-2 mRNA 的表达量均显著低于对照组（P ＜0.05），B 组、D 组

和F 组分别下降5.29%、25%和50.9%；各NAC 拮抗组与相应染毒组比较，C 组bcl-2 mRNA 的表达量升高了1.92%、E 组升高了13.9%、G 组升高了18.2%，除B 组和C 组无显著性差异外（P ＞0.05），D 组和E 组、F 组和G 组差异显著（P ＜0.05）。结果显示，铅、镉单独及其联合染毒对新生鼠大脑bcl-2 mRNA 的表

n=15，图中字母相同则表示差异不显著（P ＞0.05），字母不同者表示

差异显著（P ＜0.05）。下同

n=15, the data in table are M±SD, means with same superscripts in the figure differ insignificantly (P ＞0.05), while with different superscripts differ significantly (P ＜0.05). The same as below

图1 各组新生鼠大脑bcl-2 mRNA 的相对表达量

Fig. 1 The relative expression of bcl-2 mRNA in cerebrum of

neonatal rats in each group

420 中国农业科学43卷

达均具有明显抑制作用，镉对bcl-2 mRNA表达的抑制作用明显强于铅，铅镉联合的抑制作用均较铅、镉单独染毒明显，铅镉联合呈现明显的协同毒性效应，其中镉在铅镉联合毒性损伤中发挥主导作用，在染毒的同时添加NAC能增加新生鼠大脑bcl-2 mRNA的表达，能有效缓解铅、镉引起的脑细胞凋亡。

2.3 铅镉联合对新生鼠大脑Bax mRNA表达的影响及

NAC的保护效应

由图2可见，与对照组相比，各染毒组新生鼠大脑Bax mRNA的表达量均显著升高（P＜0.05），B组、D组和F组分别升高37.5%、135.9%和177.9%，且组间差异显著（P＜0.05）；各NAC拮抗组与相应染毒组比较，C组Bax mRNA的表达量下降19.8%、E组下降94.5%、G组下降165.3%，各组间差异显著（P ＜0.05）。结果显示，铅、镉单独及其联合染毒对新生鼠大脑Bax mRNA的表达均具有明显诱导作用，镉对Bax mRNA的诱导表达强于铅，铅镉联合的诱导表达能力明显强于铅、镉单独染毒，呈现明显的协同毒性效应，在染毒的同时添加NAC能显著降低新生鼠大脑Bax mRNA的表达，能明显减轻铅、镉诱导产生的Bax引起的脑细胞凋亡。

图2 各组新生鼠大脑Bax mRNA的相对表达量

Fig. 2 The relative expression of Bax mRNA in cerebrum of neonatal rats in each group

2.4 铅镉联合对新生鼠大脑Bax/bcl-2比值的影响

及NAC的保护效应

Bax/bcl-2的比值，对细胞存活与凋亡起着十分重要的作用。比值越大，表明细胞凋亡越多，两者呈正相关。从图3可以看出，各染毒组Bax/bcl-2比值均高于对照组，B组、D组和F组分别是对照组的1.48倍、3.16倍和5.88倍，与对照组比较，除B组外无显著性差异外（P＞0.05），D组和F组差异显著（P＜0.05）；各拮抗组与对照组相比，B、D和F组Bax/bcl-2比值分别升高1.22、1.59和1.68倍，均明显低于相应染毒组，其中D组和E组、F组和G组之间差异显著（P ＜0.05），由此可见，本试验剂量下镉引起的脑细胞凋亡明显强于铅，铅镉联合引起的凋亡最为严重，铅镉联合作用表现明显的协同毒性效应，NAC对铅、镉引起的细胞凋亡具有明显的保护作用。

2.5 铅镉联合对新生鼠大脑c-fos mRNA表达的影响

及NAC的保护效应

由图4可见，各染毒组新生鼠大脑c-fos mRNA 的表达量均显著高于对照组（P＜0.05），B组、D组和F组分别升高120.7%、213.8%和272.4%，且组间

图3 各组新生鼠大脑皮质Bax/bcl-2比值的变化

Fig. 3 The ratio changes of Bax/bcl-2 in cerebrum of neonatal rats in each group

图4 各组新生鼠大脑c-fos mRNA的相对表达量

Fig. 4 The relative expression of c-fos mRNA in cerebrum of neonatal rats in each group

2期路浩等：母鼠妊娠期铅镉联合暴露对新生鼠大脑bcl-2，Bax和c-fos mRNA表达的影响及NAC保护效应 421

有显著性差异（P＜0.05）；各NAC拮抗组与相应染毒组比较，C组c-fos mRNA的表达量下降113.8%、E 组下降110.4%、G组下降158.6%，各组间差异显著（P＜0.05）。结果显示，铅、镉单独及其联合染毒对新生鼠大脑c-fos mRNA的表达具有明显诱导作用，镉的诱导能力明显强于铅，铅镉联合的诱导表达不是二者的简单相加，而是呈现明显的协同毒性效应，在染毒的同时添加NAC能能显著降低新生鼠大脑c-fos mRNA的表达，对铅、镉诱导产生的c-fos引起的脑细胞凋亡具有明显缓解作用。

3 讨论

重金属污染物对生态系统或个体的影响无论多复杂，或最终的影响如何严重，其对生物机体最早的作用必然是从生物大分子（如 DNA、RNA、各种酶）开始的，然后逐步在细胞、器官、个体、种群和生态系统各个水平上反映出来[7]。所以分子基因水平上的这种最早期作用在环境保护方面有很大的预测价值。

Bcl-2基因家族包括bcl-2、Bax、Bcl-x及其编码的蛋白质，是细胞凋亡信号的主要调节者，在细胞凋亡调控过程中起着重要作用。它们在中枢神经系统中有Bcl-2、Bax的表达。Bcl-2的表达及其蛋白增加可以抑制细胞凋亡，提高细胞的存活能力。Bcl-2蛋白是一种与细胞器，尤其是线粒体膜相关联的稳定蛋白，主要位于线粒体外膜、内质网膜和核膜，它可以保护膜的稳定性，减少细胞内、核内Ca2+浓度的改变，从而阻止凋亡信号的传导。而Bax及其蛋白却以同聚体（Bax/Bax）或异二聚体（Bax/Bcl-2）形式存在，具有促进凋亡的作用。Bax/Bcl-2家族是与细胞凋亡关系密切的一组相关基因，它通过表达的蛋白发挥抑制或促进细胞凋亡的作用。Bax/Bcl-2家族蛋白在凋亡刺激因素存在的情况下决定细胞凋亡的发生。Bax/Bcl-2的比值在中枢神经系统神经细胞凋亡中起关键作用[8]。本试验结果表明，铅、镉单独及联合引起的脑细胞凋亡及在中枢神经系统损伤作用过程中，凋亡相关bcl-2、Bax的表达具有十分重要的作用。铅、镉对bcl-2 mRNA 的表达具有明显的抑制作用，而对Bax mRNA的表达则表现出很强的诱导作用，其中镉的毒性作用明显强于铅。各试验组新生鼠大脑Bax/Bcl-2的比值均显著升高（P＜0.05），特别是铅镉联合组升高尤为明显。这表明铅、镉在进入人或动物机体后，表现相互协同而非拮抗的毒性效应[9-10]。

c-fos属于即刻早期应答基因（immediate early gene，IEG），属核内蛋白类细胞癌基因，是人或动物细胞中固有的正常基因，适度的c-fos表达参与DNA 损伤与修复，包括细胞周期调控，对受损细胞有保护功能，而不适当的表达将干预细胞核的修复功能而使细胞走向凋亡[11]。c-fos表达产物在调控细胞生长、分裂、增殖、分化乃至程序性死亡等方面具有重要意义[12-13]。当有外界刺激时，IEG（主要包括c-fos、c-jun）可作为刺激活神经元的第二信使与目的基因表达信息传递中介物，而被认为是神经元的一种“第三信使”[14-16]。Stephenson等[17]研究发现，IEG的诱导表达既可探索污染物毒性作用的靶细胞，又有助于定量探讨剂量－效应关系。在重金属毒性的研究和评价中，IEG具有较重要的理论意义和潜在应用价值。González-Martín等[18]研究发现，c-fos的持续表达在细胞形态学死亡前数小时或数天即开始，因此其可能是细胞终末分化的标志及发生死亡的先兆。1992年，Chen等[19]研究c-fos在神经细胞凋亡中的作用时发现，c-fos的诱导表达与成熟神经元的可塑性有关，它对细胞死亡过程的基因调控与细胞分化的调控机制相似。Ansurudeen等[20]研究认为，参与激活神经元死亡基因之一的c-fos对支持营养匮乏的外部信号起反应，即表达增加将引起连锁的分子事件，包括蛋白的合成及诱导，对细胞存活至关重要的胞内管家蛋白（house- keeping genes）的丢失，这两种蛋白均导致神经元变性及死亡。同时，c-fos能抑制使细胞维持生存的一些基因的表达，维持着随后的细胞死亡过程并持续很长时间。这种死亡的一个生物学特征是基因组的活性降解，形成寡聚核苷酸片断，并呈现出典型的阶梯状DNA区带图谱，同时伴有凋亡的形态学特征及生化改变。本研究认为，铅、镉及其联合均能诱导c-fos的高表达，与对照组相比均有显著差异（P＜0.05），由此可见，c-fos对外源性化学物质铅、镉的刺激非常敏感，c-fos表达变化在铅、镉神经毒性分子机制研究中具有重要作用，再结合近年来国外的研究表明[21-24]，c-fos、c-jun均被认为是化学致癌物分子毒作用早期反应的原癌基因，因此c-fos表达变化对铅、镉神经毒性具有早期预报的作用。

NAC是一种天然的含硫氨基酸的衍生物，作为巯基供给体能与许多毒性物质，特别是重金属（如铅、镉、汞等）直接发生反应，在机体肠内与有毒物质结合，是机体抵御众多有毒物质的第一道防线。NAC拮抗Pb、Cd的毒性作用机制目前研究比较多的是它的

422 中国农业科学43卷

抗氧化作用。NAC是半胱氨酸的衍生物，它能再合成具有生物活性的谷胱甘肽，从而起到抗氧化作用及自由基清除作用。从本研究结果也可以看出，添加NAC 能明显提高抑凋亡基因bcl-2 mRNA的表达，而使促凋亡基因Bax和c-fos mRNA的表达显著下降，表明NAC对铅、镉致bcl-2、Bax和c-fos的异常表达所引起的脑细胞凋亡具有重要的保护作用。

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（责任编辑林鉴非）