ELISA技术要点和常见问题

agacatatggtgagaagcaaaaaattgtggatcagcttgttgtttgcgttaacgttaatctttacgatg gcgttcagcaacatgtctgtgcaggctaattcagattcagaatgcccgttgtcacatgatggctattgc ctgcatgatggcgtttgcatgtatattgaagcactggataaatatgcatgcaattgcgttgttggctat attggcgaaagatgccaatatcgcgatctgaaatggtgggaactgagataagtcgacgaattcaat

ELISA技术要点和常见问题

By 51AB Biotech? Mar 28th, 2008 ? Category: troubleshooting

在ELISA实验前的注意事项

仔细阅读说明书

确定试剂盒在有效期内

按说明书确定所有试剂齐全（数量、体积）

标本制备要规范，每份标本体积要按2-3个复孔以上的量制备（贮存），尽量分装做备份。短期内无法实验者，注意低温保存

准备好所有实验额外所需物品，如试管、吸头、移液器、离心机等

根据检测标本数量确定所需试剂的量

按说明书将所用试剂平衡至室温，配制所需试剂

DIY夹心法ELISA常见技术指南

选择抗体时最好选择一个单抗和一个多抗进行配对；若选择两个单抗，必须识别不同表位的抗体；最好从同一家公司选择抗体对。

ELISA实验中为了确定最佳信号和最低背景应将捕获抗体（0.5-4μg/ml）和检测抗体（0.25-2μg/ml）在预实验中进行彼此相抗的滴定。同时，应包括在适当范围内的标准品的系列稀释。按试剂说明书常规提供的范围进行操作。

标准品的配制：对于每种细胞因子应仔细阅读说明书，注意每批的细节。在使用细胞因子前，瞬时离心试剂瓶，尽可能多地收回其中的细胞因子。根据每批说明书中的细节，将冻干的细胞因子复溶。

一般待测抗原标准曲线的线性范围的可通过将标准品做8次2倍系列稀释从2000pg/ml 到15pg/ml。可利用标准的ELISA操作流程、放大试剂盒、第三类试剂、或改变酶底物系统可在一定范围内提高灵敏度。

为了优化灵敏度，建议过夜孵育标准品和标本。

若使用过氧化物酶作为显色系统，应严禁在洗液和稀释液中加叠氮钠，叠氮钠可抑制过氧化物酶的活性。

当测定混合液体中的抗原时，如血清，建议在标本稀释液中加不相干的Ig.

ELISA常见问题及处理对策

问题

可能原因

解决方法

无颜色

试剂孵育的时间没有按说明书操作。

确定生物素化抗体，连接的HRP试剂或链霉亲和素-HRP使用的时间是否适当。

不同试剂盒或不同批号的试剂混用。

重新检查试剂的标签，确准所有组分都属于正使用的试剂盒中的。不能混用不同试剂盒或不同批号的试剂。

漏加酶

检查操作流程，注意不要漏加

HRP酶污染了叠氮钠

使用新配制的试剂，禁含叠氮钠

标准品有问题（若在标本孔中有信号）

按说明书检查标准品的制备使用1瓶新标准品

某一容器未洗净,残留灭活酶物质

尽可能用试剂盒内容器,另觅一定要洁净、可靠

使用含血清的缓冲液配制/复溶抗体

重新确认所选用的试剂

.漏加显色剂A或B

加显色剂后观察一下液面高度

试剂配制/使用有误

将实验重做；严格按说明书操作，每次配制和使用前看清标签。

缓冲液污染

配制新新鲜的缓冲液

显色弱

超过有效期的产品可能会产生很弱的信号。

检查产品的有效期

加入试剂的体积和时间有误

确定所使用的每一个试剂的体积正确的和加入的时间是适当的。

试剂、样品用前未能平衡

用前试剂、样品置室温平衡10分钟左右

缩短孵育时间能使实验的信号变弱。

检查孵育的时间。

在温度变化的环境内孵育酶标板。

确定孵育的温度，应避免温度的变化。

使用了被污染的试剂

检查试剂是否被污染。

标准品/标本制备方法不规范

检查标准品/标本的制备，标准品应按说明书进行复溶和稀释。低温贮存的标本避免反复冻融，严禁使用溶血标本。样品用NaN3防腐,抑制了酶的反应

显色底物制备不规范

检查底物的制备，如体积是否正确，混合是否恰当充分。

检测时间不当

是否在规定的时间内检测。

仪器设定不正确，滤光片不匹配。

仪器是否设定正确，滤光片的使用等。

高背景（本底）

洗涤操作不规范

洗板不充分，使用手工洗板常出现。最好使用洗板机，或使用洗瓶洗涤。每孔应完全充满洗涤缓冲液，倾出时应迅速。若使用洗板机，应校准并设定足够充满每孔的体积量。板的内侧不应接触设备。检查每孔是否有残留的洗液或每孔加样量的体积是否准确。在两次洗板之间加30秒的浸泡。

实验中孵育温度和时间不适当

确定每一实验步骤的孵育温度和时间是否适当

酶加量过多

加酶前验看移液器调节量是否准确。检查稀释度，若必要进行效价测定。

封闭不完全

检查封闭液的计算量；提高封闭时间。

标本或标准品中的干扰物质

做适当的对照

显色剂受光照时间较长,或污染

显色剂A和B应于使用前10分钟从冰箱取出

整批样品放置时间过长,样品污染

样品应保持新鲜,或低温保存,防止污染

缓冲液污染

制备新鲜的缓冲液

吸头重复使用,未洗净或消毒不完全而用于加酶或显色剂

吸头尽可能一次性使用

太多的信号：全部的板子变成规则的蓝色

不充分的洗涤/洗涤步骤被遗漏-没结合的过氧化物酶仍有残留。

最好使用洗板机充分洗涤检查孔内是否有残留的洗液或加样量是否准确。

底物溶液混合太早并转成蓝色

应控制底物混合的时机并立即使用

太多的酶结合物

检查稀释度，必要时进行效价测定

封板膜或试剂容器被重复使用，导致HRP残留，使TMB底物产生非特异蓝色。使用新鲜的封板膜，每步使用不同的试剂容器

缓冲液中污染金属或HRP

制备新鲜缓冲液

高CV值（CV：coefficient of variation），花板

操作不慎或洗涤不充分

按说明书洗板、加样、显色。洗板尤为重要，如上所述

出现干板，没有使用封板膜、封板膜重复使用

确定每两步骤间，酶标板应保持湿润。使用封板膜封口，注意每步使用新鲜的封板膜。

由于操作失误或板子质量差（结合不均匀）造成包板不均匀。

稀释用的PBS中不要加其它蛋白检查包被和封闭液体积、时间和试剂加入的方法。

检查所使用的酶标板，使用ELISA板子（不要使用组织培养板）

移液器不准确，吸头重复使用。

检查并校准移液器。每次取样必须换吸头。回顾标本的加入步骤，确保每次加样的准确性，保证吸取的液体按所设定的体积吸入和排出，连续加样时注意检查吸头，确保所加液体的体积。

样品离心处理不全,反应孔内发生凝血或残留细胞成分

标本充分离心, 3000rpm 6分以上，严禁使用凝血（溶血）的标本

缓冲液污染

制备新鲜的缓冲液

标准曲线可得到，但两点之间区别很差（低或平的曲线）

酶结合物不足

检查稀释度，必要时进行效价测定

捕获抗体没有很好结合到板上

检查所使用的酶标板，使用ELISA板子（不要使用组织培养板）稀释用的PBS 中不要加其它蛋白

检测抗体不足

检查稀释度，必要时进行效价测定

板子显色不足

延长底物孵育实验使用推荐品牌的底物溶液

操作不慎

回顾ELISA操作流程，消除任何擅自修改的程序。

标准曲线稀释度计算有误

核查计算的情况，制备新的标准曲线

标准曲线很好，但是没有任何期望的阳性信号产生

在标本中无相应的细胞因子

使用内参对照重复实验，重新考虑实验的相应参数

标本基质遮盖检测

将标本至少做1∶2相应的稀释，或进行系列稀释观测它的恢复性

标准曲线很好，但是标本的判读值很高

标本中含的细胞因子水平超过实验范围

将标本做稀释并再次实验

当使用HRP酶结合物时，TMB底物加终止液后显绿色

孔中的试剂显色不充分

轻轻振荡板子

边缘效应

工作环境温度不均衡

避免将板子在变化温度环境中孵育

漂移

实验过程中出现间断

整个实验应连续操作：在实验开始前将所有标准品和标本做适当的准备

试剂没有按说明书平衡至室温

在所有试剂加入孔前，确保它们已平衡至室温，除非说明书中有另外的要求。

是否可更改试剂盒所提供的实验操作步骤？

一般厂商为确保最高的灵敏度和特异性，对试剂盒都进行了优化，为确保每一试剂盒实验的规范性应按说明书操作。

是否可混用不同试剂盒中的试剂？

不行。绝大多数试剂在每批试剂盒中是特异的，若有问题可与厂家或代理商联系。

是否可增加或减少标本的体积。

商品化的试剂盒所需加入的标本体积是优化的，应按说明书操作，不建议更改所加标本的体积。

是否可重确定自己的标准曲线的点？

可以。说明书上有建议的制备标准曲线时标准品的稀释度，可改变稀释倍数和增加曲线的点，但是必须在实验范围内，高于试剂盒中最高标准品的点和低于灵敏度以下的点是无效的。

ELISA检测方法有哪些

ELISA检测方法有哪些？ 酶联免疫吸附测定（Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay，ELISA）是研究蛋白抗体的重要方法。它是采用抗原与抗体的特异结合将被测物质与酶标抗体进行直接或间接结合，然后通过标记酶与底物产生颜色反应进行定性和定量分析。那么，它与其它检测方法的灵敏度及您了解吗？跟着小编往下看 ELISA通常分为四种类型：直接法、间接法、竞争法、夹心法等，直接上图： 直接法（Direct ELISA）仅需要抗原和酶标一抗，操作简便，可避免交叉反应，然而该方法要求酶标一抗有较高的特异性要求，同时也并非所有的一抗适合标记处理。直接法在实际运用中并不多见，它并不能对样本中抗体进行定量分析，因为样本中抗体是非酶标抗体，无法进行后续显色，但是该法经过改进就是竞争性ELISA方法，见后文。 间接法（Indirect ELISA）使用了二抗增加信号强度，也使抗体的选择多样化，然而间接法容易产生交叉反应。间接法只能用于测定抗体，主要用于疾病的诊断，其优点是只需要改变包被抗原，酶标抗体是通用的。 夹心法（Sandwich ELISA）分为双抗体夹心法和双抗原夹心法： 双抗体夹心法中抗原被两个抗体——捕捉抗体和检测抗体，结合于不同位点。捕捉抗体固定于载体上，检测抗体通过结合抗原进行显色分析。应用于双抗体夹心法检测的抗体需是单抗，而且对同一抗原结合位点不同，如此才能避免交叉反应或两种抗体竞争性结合同一位点。夹心法具有高灵敏度、高专一性的优势，但该法只适用于有多个结合位点的抗原检测，主要用于检测各种大分子抗原——例如在医学检测中测定HBsAg、HBeAg、AFP等。由于双抗体夹心法特异性高，在检测过程中有时会将样本和酶标抗体同时加入进行反应（一步法），此时如果样本中抗原含量过高会导致其与固相抗体和酶标抗体均有结合而不形成“夹心复合物”，

HIV实验室ELISA检测方法

人类免疫缺陷病毒抗体诊断试剂盒（酶联免疫法） 1 试剂信息 试剂厂家：北京万泰生物药业股份有限公司 2 样本要求 2.1 本试剂使用样品为人血清或血浆，含有EDTA、柠檬酸钠或肝素等抗凝剂的样品可用于本实验。 2.2 不能检测含悬浮纤维蛋白或聚集物，重度溶血的样品。 2.3 样品中应无微生物，可在2-8℃储存1周，长期储存应低温冻存，避免反复冻融。 2.4 使用前请将样品室温平衡30分钟以上，冷冻样品实验前需混匀。 3 检测步骤 3.1 配液：将浓缩洗涤液用蒸馏水或去离子水20倍稀释。 3.2 编号：将样品对应微孔板按序编号，每板应设阴性对照3孔，阳性对照1型、2型各1孔、空白对照1孔。 3.3 加样：分别在相应孔中加入待测样品或阴、阳性对照100μL。 3.4 温育：用封板膜封板后，置37±1℃温育60±2分钟。 3.5 洗板：小心揭掉封板膜，用洗板机洗涤5遍，最后一次尽量扣干。 3.6 加酶：每孔加入酶标试剂100μL，空白孔除外。 3.7 温育：用封板膜封板后，置37±1℃温育60±2分钟。 3.8 洗板：操作同步骤5。 3.9 显色：每孔加入显色剂A、B液各50μL，轻轻震荡混匀，37±1℃避光显色30±1分钟。 3.10 测定：每孔加入终止液50μL，轻轻振荡混匀，10分钟内测定结果。 4 参考值 临界值（CUTOFF）计算：临界值=阴性对照A均值+0.12. 5 检验结果的解释 5.1 阴性对照孔A值≦0.10，阳性对照A值≧0.80，否则试验无效。 5.2 若有1孔阴性对照A值大于0.1应舍弃，若两孔或两孔以上阴性对照A值大于0.1，应重复试验。

5.3 阴性判定：样品A值<临界值（CUTOFF）者为HIV抗体阴性。 5.4 阳性判定：样品A值≧临界值（CUTOFF）者为HIV抗体阳性。（注意：初试阳性应重新取样双孔复试。复试阳性者应按《全国艾滋病检测技术规范》送HIV确证实验室进行确证实验。）

ELISA检测

ELISA检测 ----- 固相捕获法测IgM抗体 在病原体急性感染的诊断中，通常需检测IgM抗体，如急性甲型肝炎诊断的血清抗HAVIgM检测、急性乙型肝炎病毒感染的血清抗HBc lgM检测和TORCH项目的系列IgM检测等。IgM抗体也有使用间接法测定的，如目前在市场上可见到的有些TORCH系列的IgM检测试剂盒。在使用间接法测IgM抗体时，由于临床血清样本中含有高浓度的IgG抗体，其中部分特异IgG抗体将与IgM抗体竞争与固相抗原结合，从而干扰IgM抗体的检测。 因此，在使用间接法测定IgM抗体时，通常须将血清样本用抗人IgG抗体或SPA预处理，以去除IgG的干扰。这样不但测定较为繁琐，而且影响测定的特异性和灵敏度。目前，常用的IgM抗体检测方法为捕获法，即以抗人IgM抗体(抗人u链)作为固相抗体，当加入血清标本时，其中的IgM类抗体(特异的和非特异的)即可被固相抗体捕获，再加入特异抗原，其与固相上捕获的IgM抗体结合后，加入酶标抗特异抗原的抗体，最后加入底物显色。具体操作步骤如下： 1．首先将抗人IgMbt链抗体于碳酸盐缓冲液中40c下过夜包被聚苯乙烯等固相，形成固相抗体，洗涤去除未与固相结合或结合不紧的抗体后，用小牛血清或牛血清白蛋白等封闭，洗涤去除未结合的部分及杂质。 2．加入含待测IgM抗体的临床样本如血清等，温育一定时间后洗板；此时，待测样本中的IgM抗体就会与固相上的抗P链抗体反应而吸附于固相上。 3．加入特异的抗原如HAV抗原、HBcAg等，温育一定时间后洗板；此时，特异抗原就会与固相上的特异IgM抗体发生反应。 4．加入酶标记的抗特异抗原的抗体，温育一定时间后洗板；此时，在固相上即形成相应的抗原抗体复合物。 5．加入酶底物，温育显色测定 本方法要着重注意的是RF(1gM类)及其他非特异IgM的干扰。RF(1gM类)由于其能与固相抗人u 链抗体结合，并可与随后加入的酶标抗体(动物IgG)反应，从而导致假阳性反应。而非特异IgM由于其

ELISA检测方法

ELISA（酶联免疫吸附测定，enzyme linked immunosorbent assay）指将可溶性的抗原或抗体结合到聚苯乙烯等固相载体上，利用抗原抗体结合专一性进行免疫反应的定性和定量检测方法。 基本原理： ①使抗原或抗体结合到某种固相载体表面，并保持其免疫活性。 ②使抗原或抗体与某种酶连接成酶标抗原或抗体，这种酶标抗原或抗体既保留其免疫活性，又保留酶的活性。 ③在测定时，把受检标本（测定其中的抗体或抗原）和酶标抗原或抗体按不同的步骤与固相载体表面的抗原或抗体起反应。用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与其他物质分开，最后结合在固相载体上的酶量与标本中受检物质的量成一定的比例。 ④加入酶反应的底物后，底物被酶催化变为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据颜色反应的深浅有无定性或定量分析。由于酶的催化效率很高，故可极大地放大反应效果，从而使测定方法达到很高的敏感度。 双抗夹心法 夹心法常用于检测大分子抗原，一般的操作步骤为: ①将具有专一性的抗体固著于塑胶孔盘上，完成后洗去多余抗体； ②加入待测检体，检体中若含有待测的抗原，则其会与塑胶孔盘上的抗体进行专一性键结； ③洗去多余待测检体，加入另一种对抗原专一的一次抗体，与待测抗原进行键结； ④洗去多余未键结一次抗体，加入带有酶的二次抗体，与一次抗体键结； ⑤洗去多余未键结二次抗体，加入酶底物使酵素呈色，以肉眼或仪器读取呈色结果。 间接法 间接法常用于检测抗体，一般的操作步骤为： ①将已知的抗原固著于塑胶孔盘上，完成后洗去多余的抗原。

②加入待测检体，检体中若含有待测的一次抗体，则其会与塑胶孔盘上的抗原进行专一性键结。 ③洗去多余待测检体，加入带有酶的二次抗体，与待测的一次抗体键结。 ④洗去多余未键结二次抗体，加入酶底物使酶呈色，藉仪器（ELISA reader）测定塑胶盘中的吸光值（OD值），以评估有色终产物的含量即可测量待测抗体的含量。 竞争法 竞争法是一种较少用到的ELISA检测机制，一般用于检测小分子抗原，其操作步骤为： ①将具有专一性的抗体固著于塑胶孔盘上，完成后洗去多余抗体； ②加入待测检体，使检体中的待测抗原与塑胶孔盘上的抗体进行专一性键结； ③加入带有酶的抗原，此抗原也可与塑胶孔盘上的抗体进行专一性键结，由于塑胶孔盘上固著的抗体数量有限，因此当检体中抗原的量越多，则带有酶的抗原可键结的固著抗体就越少，亦即，两种抗原皆竞相与塑胶孔盘上抗体键结，即所谓竞争法之由来。 ④洗去检体与带有酶的抗原，加入酶底物使酶呈色，当检体中抗原量越多，代表塑胶孔盘内留下之带有酶的抗原越少，显色也就越浅。 注：当需要侦测无法获得两种以上单一性抗体的抗原，或是不易得到足够的纯化抗体以固著于孔盘上时，一般会考虑使用竞争法ELISA。

ELISA 直接法与间接法的区别

ELISA可用于测定抗原,也可用于测定抗体.在这种测定方法中有三个必要的试剂1)固相的抗菌素原或抗体,即"免疫吸附剂"(immunosorbent);(2)酶标记的抗原或抗体,称为"结合物"(conjugate);(3)酶反应的底物.根据试剂的来源和标本的情况以及检测的具体条件,可设计出各种不类型的检测方法. ELISA可分类是根据抗原抗体的结合情况来分类的。 主要有以下几种类型:（直接法也称一步法） 1 双抗体夹心法测抗原 双抗体夹心法是检测抗原最常用的方法,操作步骤如下: 1) 将特异性抗体与固相载体联结,形成固相抗体.洗涤除去未结合的抗体及杂质. 2) 加受检标本,保温反应.标本中的抗原与固相抗体结合,形成固相抗原抗体复合物.洗涤除去其他未结合物质. 3) 加酶标抗体,保温反应.固相免疫复合物上的抗原与酶标抗体结合.彻底洗涤未结合的酶标抗体.此时固相载体上带有的酶量与标本中受检抗原的量相关. 4) 加底物显色.固相上的酶催化底物成为有色产物.通过比色,测知标本中抗原的量.在临床检验中,此法适用于检验各种蛋白质等大分子抗原,例如HBsAg,HBeAg,AFP,hCG等.只要获得针对受检抗原的异性抗体,就可用于包被固相载体和制备酶结合物而建立此法.如抗体的来源为抗血清,包被和酶标用的抗体最好分别取自不同种属的动物.如应用单克隆抗体,一般选择两个针对抗原上不同决定簇的单抗,分别用于包被固相载体和制备酶结合物.这种双位点夹心法具有很高的特异性,而且可以将受检标本和酶标抗体一起保温反应,作一步检测. 在一步法测定中,当标本中受检抗原的含量很高时,过量抗原分别和固相抗体及酶标抗体结合,而不再形成"夹心复合物".类同于沉淀反应中抗原过剩的后带现象,此时反应后显色的吸光值(位于抗原过剩带上)与标准曲线(位于抗体过剩带上)某一抗原浓度的吸光值相同(参见 1.3.2,图1-4),如按常法测读,所得结果将低于实际的含量,这种现象被称为钩状效应(hook effect),因为标准曲线到达高峰后呈钩状弯落.钩状效应严重时,反应甚至可不显色而出现假阴性结果.因此在使用一步法试剂测定标本中含量可异常增高的物质(例如血清中HBsAg,AFP和尿液hCG等)时,应注意可测范围的最高值.用高亲和力的单克隆抗体制备此类试剂可削弱钩状效应. 假使在被测分子的不同位点上含有多个相同的决定簇,例如HBsAg的a决定簇,也可用针对此决定的同一单抗分别包被固相和制备酶结合物.但在HBsAg的检测中应注意亚型问题,HBsAg有adr,adw,ayr,ayw4个亚型,虽然每种亚型均有相同的a决定簇的反应性,这也是用单抗作夹心法应注意的问题. 双抗体夹心法测抗原的另一注意点是类风湿因子(RF)的干扰.RF是一种自身抗体,多为IgM型,能和多种动物IgG的Fc段结合.用作双抗体夹心法检测的血清标本中如含有RF,它可充当抗原成份,同时与固相抗体和酶标抗体结合,表现出假阳性反应.采用F(ab')或Fab片段作酶结合物的试剂,由于去除了Fc段,从而消除RF的干扰.双抗体夹心法ELISA试剂是否受RF的影响,已被列为这类试剂的一项考核指标。 双抗体夹心法适用于测定二价或二价以上的大分子抗原,但不适用于测定半抗原及小分子单价抗原,因其不能形成两位点夹心. 2 双抗原夹心法测抗体 反应模式与双抗体夹心法类似.用特异性抗原进行包被和制备酶结合物,以检测相应的抗体.与间接法测抗体的不同之处为以酶标抗原代替酶标抗抗体.此法中受检标本不需稀释,可直接用于测定,因此其敏感度相对高于间接法.乙肝标志物中抗HBs的检测常采用本法.本法关键在于酶标抗原的制备,应根据抗原结构的不同,寻找合适的标记方法. 3 间接法测抗体 间接法是检测抗体常用的方法.其原理为利用酶标记的抗抗体(抗人免疫球蛋白抗体)以检测与固

Elisa常见类型及实验标准操作方法与常见问题

Elisa常见类型及实验标准操作方法与常见问题 酶联免疫吸附试验（ELISA）是一种实验室常用的检测方法，广泛应用于测量溶液中的分析物（抗体或抗原）的浓度。与其他基于抗体的检测方法不同的是，酶联免疫吸附试验或酶免疫测定（EIA）通过与固相支持物的结合和系列洗涤步骤，实现特异性和非特异性相互作用的分离，并可通过最终有色产物的形成，定量分析原始样品中分析物的含量。 ELISA 实验通常以细胞培养上清液、血清、血浆以及组织裂解物等为样品。该实验必备三种试剂：固相的抗原或抗体；酶标记的抗原或抗体；酶作用的底物。根据样品的性质、检测的实验条件、试剂的来源，可设计出不同类型的ELISA 检测方法。 该实验可迅速分析大量平行样品，在基础研究和临床诊断实践中广泛使用。 一、直接ELISA 原理：将抗原与固相载体连接，洗涤除去未结合的抗原及杂质。加酶标抗体进行孵育。固相免疫复合物上的抗原与酶标抗体结合。彻底洗涤未结合的酶标抗体。此时固相上带有的酶量与标本中受检抗原的量相关。加底物反应。直接法主要用于测定抗原。 优点：操作流程简短，实验步骤少；无需使用二抗，避免了交叉反应；实验步骤少，操作不易出错。 缺点：实验中的一抗需要直接用酶标记，成本相对较高。 二、间接法ELISA

原理：将抗原与固相载体相连结，形成固相抗原。洗涤除去未结合的抗原及杂质。加入特异性一抗与固相抗原相结合，形成固相抗原抗体复合物。经洗涤后，加酶标二抗。固相免疫复合物中的抗体与酶标二抗结合，从而间接地标记上酶。洗涤后，加底物显色。 优点：酶标二抗可加强信号，提高灵敏度；灵活性更大，同一酶标二抗可应用于多种不同的一抗；不直标一抗，可保留更多的免疫反应性；成本更低，使用标记抗体更少。 缺点：交叉反应几率升高。 三、双抗夹心法ELISA 原理：双抗体夹心法适用于测定二价或二价以上的大分子，但不适用于小分子抗原。将特异性抗体（捕获抗体）与固相载体连接，形成固相抗体。洗涤除去未结合的抗体及杂质。加入待检样品，保温孵育。样品中的特异性抗原与固相抗体结合，形成固相抗原抗体复合物。洗涤除去其他未结合物质。加酶标抗体（检测抗体）保温孵育。固相免疫复合物上的抗原与酶标抗体结合。彻底洗涤未结合的酶标抗体。加底物反应。 双抗原夹心法测抗体的反应模式与测抗原相似，用特异性抗原进行包被和制备酶结合物，以检测相应的抗体。

ELISA方法的基本原理和操作步骤

ELISA方法的基本原理和操作步骤 基本原理 1971年Engvall和Perlmann发表了酶联免疫吸附剂测定（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）用于IgG定量测定的文章，使得1966年开始用于抗原定位的酶标抗体技术发展成液体标本中微量物质的测定方法。这一方法的基本原理是：①使抗原或抗体结合到某种固相载体表面，并保持其免疫活性。②使抗原或抗体与某种酶连接成酶标抗原或抗体，这种酶标抗原或抗体既保留其免疫活性，又保留酶的活性。在测定时，把受检标本（测定其中的抗体或抗原）和酶标抗原或抗体按不同的步骤与固相载体表面的抗原或抗体起反应。用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与其他物质分开，最后结合在固相载体上的酶量与标本中受检物质的量成一定的比例。加入酶反应的底物后，底物被酶催化变为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据颜色反应的深浅刊物定性或定量分析。由于酶的催化频率很高，故可极大地地放大反应效果，从而使测定方法达到很高的敏感度。 方法类型和操作步骤 ELISA可用于测定抗原，也可用于测定抗体。在这种测定方法中有3种必要的试剂：①固相的抗原或抗体，②酶标记的抗原或抗体，③酶作用的底物。根据试剂的来源和标本的性状以及检测的具备条件，可设计出各种不同类型的检测方法。 （一）双抗体夹心法 双抗体夹心法是检测抗原最常用的方法，操作步骤如下：

（1）将特异性抗体与固相载体连接，形成固相抗体：洗涤除去未结合的抗体及杂质。 （2）加受检标本：使之与固相抗体接触反应一段时间，让标本中的抗原与固相载体上的抗体结合，形成固相抗原复合物。洗涤除去其他未结合的物质。 （3）加酶标抗体：使固相免疫复合物上的抗原与酶标抗体结合。彻底洗涤未结合的酶标抗体。此时固相载体上带有的酶量与标本中受检物质的量正相关。 （4）加底物：夹心式复合物中的酶催化底物成为有色产物。根据颜色反应的程度进行该抗原的定性或定量。 根据同样原理，将大分子抗原分别制备固相抗原和酶标抗原结合物，即可用双抗原夹心法测定标本中的抗体。 （二）双位点一步法 在双抗体夹心法测定抗原时，如应用针对抗原分子上两个不同抗原决定簇的单克隆抗体分别作为固相抗体和酶标抗体，则在测定时可使标本的加入和酶标抗体的加入两步并作一步（图15-5）。这种双位点一步不但简化了操作，缩短了反应时间，如应用高亲和力的单克隆抗体，测定的敏感性和特异性也显著提高。单克隆抗体的应用使测定抗原的ELIS 在一步法测定中，应注意钩状效应（hookeffect），类同于沉淀反应中抗原过剩的后带现象。当标本中待测抗原浓度相当高时，过量抗原分别和固相抗体及酶标抗体结合，而不再形成夹心复合物，所得结果将低于实际含量。钩状效应严重时甚至可出现假阴性结果。 （三）间接法测抗体

间接ELISA法检测抗体

间接ELISA法检测血清抗体 1. 仪器耗材 （1）仪器：洗板机，酶标仪，恒温箱 （2）耗材：96孔酶标板（NUNC或海门），加样槽 2. 试剂及配制 （1）包被缓冲液： A. PBS (500ml，pH=7.2±0.1)：NaCl 4.25g， NaH2PO4·2H2O 0.178g，Na2HPO4·12H2O 1.386g，溶解定容至500ml，测量pH在7.1-7.3（若超出此范围则不能使用）。常温可保存一周。 B. 1×碳酸盐缓冲液（100ml，pH=9.6）：Na2CO3 0.2756g，NaHCO3 0.6216g，溶解定容 至100ml水，测量pH在9.5-9.7之间（若超出此范围则不能使用）。4℃可保存一个月。 （2）洗液：0.5%PBS’T（1L）：每1L PBS（pH=7.2±0.1）加入Tween-20 5ml，充分混匀。 （3）封闭液： A. 2.5%drymilk/PBS’T（100ml）：将2.5g drymilk 溶解于100ml PBS’T中，短期保存于4℃，长期保存于-20℃。 B. 10%FBS/PBS’T（100ml）：10ml FBS于90ml PBS’T混合，短期保存与4℃。（4）稀释缓冲液： A. 2.5%drymilk/PBS’T：配方同上。 B. 10%FBS/PBS’T：配方同上。 C. 2.5% dry milk EDTA/EGTA PBS’T： C-1：EDTA/EGTA PBS’T：1.117g EDTA加入至100ml PBS’T中，搅拌至溶解（大约15min）；1.141g EGTA加入至100ml PBS’T中，搅拌（大约15min），待部分溶解后，用10N 的NaOH调节pH至7.0；上述两种溶液以1：1的比例混合，测量其pH值在6.3±0.5

ELISA原理和分类(附图解)

一、ELISA的原理 ELISA的基础是抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记。结合在固相载体表面的抗原或抗体仍保持其免疫学活性，酶标记的抗原或抗体既保留其免疫学活性，又保留酶的活性。在测定时，受检标本（测定其中的抗体或抗原）与固相载体表面的抗原或抗体起反应。用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与液体中的其他物质分开。再加入酶标记的抗原或抗体，也通过反应而结合在固相载体上。此时固相上的酶量与标本中受检物质的量呈一定的比例。加入酶反应的底物后，底物被酶催化成为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据呈色的深浅进行定性或定量分析。由于酶的催化效率很高，间接地放大了免疫反应的结果，使测定方法达到很高的敏感度。 二、ELISA的类型 ELISA可用于测定抗原，也可用于测定抗体。在这种测定方法中有三个必要的试剂：（1）固相的抗原或抗体，即"免疫吸附剂"（immunosorbent）； （2）酶标记的抗原或抗体，称为“酶联物”、“结合物”（conjugate）； （3）酶反应的底物。根据试剂的来源和标本的情况以及检测的具体条件，可设计出各种不同类型的检测方法。用于临床检验的ELISA主要有以下几种类型： （一）双抗体夹心法测抗原

双抗体夹心法是检测抗原最常用的方法，操作步骤如下： （1）将特异性抗体与固相载体联结，形成固相抗体。洗涤除去未结合的抗体及杂质。（2）加受检标本，保温反应。标本中的抗原与固相抗体结合，形成固相抗原抗体复合物。洗涤除去其他未结合物质。 （3）加酶标抗体，保温反应。固相免疫复合物上的抗原与酶标抗体结合。彻底洗涤未结合的酶标抗体。此时固相载体上带有的酶量与标本中受检抗原的量相关。 （4）加底物显色。固相上的酶催化底物成为有色产物。通过比色，测知标本中抗原的量。在临床检验中，此法适用于检验各种蛋白质等大分子抗原，例如HBsAg、HBeAg、AFP、hCG 等。只要获得针对受检抗原的异性抗体，就可用于包被固相载体和制备酶结合物而建立此法。如抗体的来源为抗血清，包被和酶标用的抗体最好分别取自不同种属的动物。如应用单克隆抗体，一般选择两个针对抗原上不同决定簇的单抗，分别用于包被固相载体和制备酶结合物。这种双位点夹心法具有很高的特异性，而且可以将受检标本和酶标抗体一起保温反应，作一步法检测。 在一步法测定中，当标本中受检抗原的含量很高时，过量抗原分别和固相抗体及酶标抗体结合，而不再形成"夹心复合物"。类同于沉淀反应中抗原过剩的后带现象，此时反应后显

ELISA检测方法

ELISA(酶联免疫吸附测定,enzyme linked immunosorbent assay)指将可溶性的抗原或抗体结合到聚苯乙烯等固相载体上,利用抗原抗体结合专一性进行免疫反应的定性与定量检测方法。 基本原理: ①使抗原或抗体结合到某种固相载体表面,并保持其免疫活性。 ②使抗原或抗体与某种酶连接成酶标抗原或抗体,这种酶标抗原或抗体既保留其免疫活性,又保留酶的活性。 ③在测定时,把受检标本(测定其中的抗体或抗原)与酶标抗原或抗体按不同的步骤与固相载体表面的抗原或抗体起反应。用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与其她物质分开,最后结合在固相载体上的酶量与标本中受检物质的量成一定的比例。 ④加入酶反应的底物后,底物被酶催化变为有色产物,产物的量与标本中受检物质的量直接相关,故可根据颜色反应的深浅有无定性或定量分析。由于酶的催化效率很高,故可极大地放大反应效果,从而使测定方法达到很高的敏感度。 双抗夹心法 夹心法常用于检测大分子抗原,一般的操作步骤为: ①将具有专一性的抗体固著于塑胶孔盘上,完成后洗去多余抗体; ②加入待测检体,检体中若含有待测的抗原,则其会与塑胶孔盘上的抗体进行专一性键结; ③洗去多余待测检体,加入另一种对抗原专一的一次抗体,与待测抗原进行键结; ④洗去多余未键结一次抗体,加入带有酶的二次抗体,与一次抗体键结; ⑤洗去多余未键结二次抗体,加入酶底物使酵素呈色,以肉眼或仪器读取呈色结果。 间接法 间接法常用于检测抗体,一般的操作步骤为: ①将已知的抗原固著于塑胶孔盘上,完成后洗去多余的抗原。

②加入待测检体,检体中若含有待测的一次抗体,则其会与塑胶孔盘上的抗原进行专一性键结。 ③洗去多余待测检体,加入带有酶的二次抗体,与待测的一次抗体键结。 ④洗去多余未键结二次抗体,加入酶底物使酶呈色,藉仪器(ELISA reader)测定塑胶盘中的吸光值(OD值),以评估有色终产物的含量即可测量待测抗体的含量。 竞争法 竞争法就是一种较少用到的ELISA检测机制,一般用于检测小分子抗原,其操作步骤为: ①将具有专一性的抗体固著于塑胶孔盘上,完成后洗去多余抗体; ②加入待测检体,使检体中的待测抗原与塑胶孔盘上的抗体进行专一性键结; ③加入带有酶的抗原,此抗原也可与塑胶孔盘上的抗体进行专一性键结,由于塑胶孔盘上固著的抗体数量有限,因此当检体中抗原的量越多,则带有酶的抗原可键结的固著抗体就越少,亦即,两种抗原皆竞相与塑胶孔盘上抗体键结,即所谓竞争法之由来。 ④洗去检体与带有酶的抗原,加入酶底物使酶呈色,当检体中抗原量越多,代表塑胶孔盘内留下之带有酶的抗原越少,显色也就越浅。 注:当需要侦测无法获得两种以上单一性抗体的抗原,或就是不易得到足够的纯化抗体以固著于孔盘上时,一般会考虑使用竞争法ELISA。

ELISA检测样品的处理方法

ELISA检测样品的处理方法 Author:Elabscience views:502 通常我们可用于ELISA检测的样本是有多种类型的，如血清、血浆、尿液、细胞培养上清或组织匀浆液等，不同类型的检测样本前期的处理方法是不一样的。正确的处理样本是保证ELISA检测的正确性和准确性的第一步，下面简单介绍一下不同类型的样本的处理方法。 1、血清血清是最常用于ELISA检测的一类样本，处理也比较简单。用无热原、无内毒素的试管或离心管采集血液标本，将试管或离心管室温放置2小时或4℃过夜，使血清析出。（最好将试管或离心管倾斜放置，使液面横截面增大，能使血清更大程度的析出。）4℃1000×g离心20分钟，仔细收集上清。建议将血清分装多份，-20℃或-80℃保存，避免反复冻融。采血过程中应避免溶血，因为红细胞裂解时会释放具有过氧化酶活性的物质，在以HRP为标记的ELISA检测中会有非特异性的显色，而导致检测的不准确性。同时也应避免细菌污染，因为菌体内可能含有内源性的HRP从而导致检测的假阳性。 2、血浆用含抗凝剂的采血管或离心管采集血液标本，标本采集后30min内4℃1000×g离心15min，取上清即血浆。将上清分装多份，-20℃或-80℃保存，避免反复冻融。避免使用溶血或高血脂的标本。常用的抗凝剂为EDTA、肝素钠和枸橼酸钠等，检测时还应仔细阅读试剂盒说明书，检查试剂盒是否对抗凝剂有特殊要求。 3、细胞培养上清取细胞培养上清到离心管，1000×g离心20min，除去细胞碎片及杂质，取上清，-20℃或-80℃保存，避免反复冻融。 4、细胞裂解液1）吸去培养板内的培养基，用胰酶消化细胞，加适量培养基将细胞从培养板上吹下来。悬浮细胞可省略。2）收集细胞悬液，1000×g离心10min，弃去培养基，用预冷的PBS润洗3次。3）加入适量的预冷PBS或细胞裂解液（临用前加入蛋白酶抑制剂）重悬细胞。通常6孔板一个孔的细胞量需要150~250μL PBS重悬。4）将样品放入-20℃或-80℃，使样品冷冻，再放室温解冻样品，反复冻融几次，使细胞充分裂解。也可将样品进行超声破碎，以达到裂解的目的。 5、5） 4℃10000×g 离心10min，除去细胞碎片，取上清，-20℃或-80℃保存，避免反复冻融。5、组织匀浆液1）将组织样本用PBS (0.01M, PH 7.4) 冲洗，洗去组织表面残留的血液或杂质。2）将组织块称重，记录后剪碎，碎块应尽量小，便于匀浆得更充分3）将组织按一定的比例加入预冷的PBS（临用前加入蛋白酶抑制剂）匀浆，匀浆时置于冰上或冰浴中。（通常按组织重量：PBS体积=1:9的比例匀浆，例如1g的组织样本对应9mL的PBS，具体体积可根据实验需要适当调整，检测后计算样品浓度时应乘以相应的稀释倍数）4）吸取匀浆液到离心管，4℃5000×g 离心5~10min，取上清，-20℃或-80℃保存，避免反复冻融。 6、6、尿液、唾液等其他液体生物样本1000×g离心20min，取上清即可检测。总的来说，因为ELISA只能检测可溶性蛋白的含量，所以应保证所有样本均为澄清的液体，沉淀或悬浮物都应离心去除。为了保证检测的准确性，保存于-20℃或-80℃的样本最好在1~6个月内检测；4℃保存的样本应在1周内进行检测。另外，还应保证样本不含NaN3，因为NaN3会抑制HRP的活性，从而导致假阴性的结果。

实验方法整理-ELISA

1971年Engvall和Perlmann发表了酶联免疫吸附测定（enzymelinkedimmunosorbentassay, ELISA）用于IgG定量测定的文章，使得1966年用于抗原定位的酶标抗体技术发展成液体标本中微量物质的测定方法。 一、ELISA的原理 ELISA的基础是抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记。结合在固相载体表面的抗原或抗体仍保持其免疫学活性，酶标记的抗原或抗体既保留其免疫学活性，又保留酶的活性。 进行检测时，样品中的受检物质（抗原或抗体）与固定的抗体或抗原结合。通过洗板除去非结合物，再加入酶标记的抗原或抗体，此时，能固定下来的酶量与样品中被检物质的量相关。通过加入与酶反应的底物后显色，根据颜色的深浅可以判断样品中物质的含量，进行定性或定量的分析。 由于酶的催化效率很高，间接地放大了免疫反应的结果，使测定方法达到很高的灵敏度。 二、ELISA的基本类型 ELISA可用于测定抗原，也可用于测定抗体。这种测定方法中有3种必要的试剂： 1. 固相的抗原或抗体； 2. 酶标记的抗原或抗体； 3. 酶作用的底物。 根据试剂的来源和标本的性状及检测的具备条件，可设计出各种不同类型的检测方法。 1. 双抗体夹心法测抗原 针对抗原分子上两个不同抗原决定簇的单克隆抗体分别作为固相抗体和酶标抗体。适用于测定二价或二价以上的大分子抗原，不适用于测定半抗原及小分子单价抗原，因其不能形成两位点夹心。

2. 竞争法测抗原 首先将特异性抗体包被于固相载体表面，经洗涤后分成两组：一组加酶标记抗原和被测抗原的混合液，另一组只加酶标记抗原，经孵育洗涤后加底物显色，这两组底物降解量之差，即为所要测定的未知抗原的量。此方法测定的抗原只要有一个结合部位即可，对小分子抗原如激素和药物类的测定常用此法。优点是快，缺点是需要较多量的酶标记抗原。 3. 免疫抑制法测抗原

实用文档之elisa的检测原理及步骤

实用文档之"Elisa Kit使用方法" 检测原理: 本实验采用双抗体夹心ELISA法。抗人IL-4单抗包被于酶标板上，标本和标准品中的IL-4会与单抗结合，游离的成分被洗去。加入生物素化的抗人IL-4抗体和辣根过氧化物酶标记的亲和素。生物素与亲和素特异性结合；抗人IL-4抗体与结合在单抗上的人IL-4结合而形成免疫复合物，游离的成分被洗去。加入显色底物，若反应孔中有IL-4，辣根过氧化物酶会使无色的显色剂现蓝色，加终止液变黄。在450nm处测OD值，IL-4浓度与OD450值之间呈正比，可通过绘制标准曲线求出标本中IL-4的浓度。 试剂盒组成： 1．抗体预包被酶标板（8×12 或8×6） 2．冻干标准品（2 / 1 支；0.5ng/支） 3．标准品和标本稀释液（橙盖瓶）（1 瓶；20ml/12ml） 4．浓缩生物素化抗体（紫盖瓶）（1 支） 5．生物素化抗体稀释液（蓝盖瓶）（1 瓶；16ml/10ml） 6．浓缩酶结合物（棕盖瓶）（1 支） 7．酶结合物稀释液（紫盖瓶）（1 瓶；16ml/10ml） 8．浓缩洗涤液20×（白盖瓶）（1 瓶；50ml/25ml） 9．显色底物（TMB）（棕盖瓶）（1 瓶；12ml/6ml） 10．反应终止液（红盖瓶）（1 瓶；12ml/6ml） 11．封板胶纸（6/3 张） 12．产品说明书（1 份） 标本收集: 1. 收集血液的试管应为一次性的无热原，无内毒素试管。 2. 血浆抗凝剂推荐使用EDTA。避免使用溶血，高血脂标本。 3. 标本应清澈透明，悬浮物应离心去除。 4. 标本收集后若不及时检测，请按一次使用量分装，冻存于-20℃，-70℃电冰箱内，避免反复冻融，3-6月内检测。 5. 如果您的样本中检测物浓度高于标准品最高值，请根据实际情况，做适当倍数稀释(建议做预实验，以确定稀释倍数)。 注意事项: 1. 试剂盒使用前请保存在2-8℃。复溶后的标准品应分装后，将其放在-20～-70℃贮存。 2. 浓缩生物素化抗体，浓缩酶结合物体积小，运输中颠簸和可能的倒置，会使液体沾到管壁或瓶盖。因此使用前请用手甩几下或1000转/分离心1分钟，以使附着管壁或瓶盖的液体沉积到管底。取用前，请用移液器小心吹打4-5次使溶液混匀。

ELISA检测专题介绍

ELISA技术培训 技术简介： 酶联接免疫吸附测定法(Enzyme-Linked Immunosorbnent Assay）,简称ELISA，是实验室最常用的检测方法。酶是能够催化化学反应的特殊蛋白质，其催化效力超过所有人造催化剂，ELISA是将酶催化的放大作用与特异性抗原抗体反应结合起来的一种微量分析技术。酶标记抗原或抗体以后，既不影响抗原抗体反应的特异性，也不改变酶本身的活性。因此ELISA具有准确性高、检测时间短、价格低廉、判断结果有客观标准、结果便于记录和保存等优点，适合于大批标本的检测，广泛应用于食品安全检测、医疗检测以及免疫实验分析等领域。 核心原理： ELISA必须遵守以下3个核心原理：1.抗原或抗体能以物理性地吸附于固相载体表面，并保持器免疫学活性。例如：蛋白质分子结构上的疏水基团与聚苯乙烯表面的疏水基团能产生互作用而吸附。2.抗原或抗体可通过共价键与酶连接形成酶结合物，而此种酶结合物仍能保持其免疫学和酶学活性。3.酶结合物与相应抗原或抗体结合后，可根据加入底物的颜色反应来判定是否有免疫反应的存在，而且颜色反应的深浅是与标本中相应抗原或抗体的量成正比例的，由此进行定性或定量分析。在ELISA中酶起到很关键的作用，常用于ELISA法的酶有辣根过氧化物酶，碱性磷酸酯酶等，其中尤以辣根过氧化物酶为多。酶结合物是酶与抗体或抗原, 半抗原在交联剂作用下联结的产物,它不仅具有抗体抗原特异的免疫反应，还能催化酶促反应，显示出生物放大作用。 应用方向： ELISA应用的范围很广，而且正在不断地扩大，原则上ELISA可用于检测一切抗原、抗体及半抗原，可以直接定量测定体液中的可溶性抗原。在实际应用方面可用于疾病的临床诊断、疾病监察、疾病普查、法医检查、兽医及农业上的植物病害的诊断检定等。因此，它和生物化学、免疫学、微生物学、药理学、流行病学及传染病学等方面密切相关。按照待测物性质的不同，ELISA反应可以分为抗原检测反应及抗体检测反应。 在医学领域上，能够进行检测的抗原包括：内分泌方面的雌性激素、绒毛膜促性腺激素、黄体素、胰岛素、皮质醇、促甲状腺素和孕酮等，血液学方面的凝固因子（如第Ⅷ凝固因子）、红细胞抗原及结合球蛋白（Hapto Globin）等，肿瘤方面已试用检查甲胎蛋白（AFP）癌胚抗原（CEA），此外还有霍乱弧菌、大肠肝菌、绿脓杆菌和破伤风梭菌毒素；脑膜炎球菌及淋球菌抗原；检测免疫抑制病人中常见的白色念殊菌

elisa的检测原理及步骤

Elisa Kit使用方法 检测原理: 本实验采用双抗体夹心ELISA法。抗人IL-4单抗包被于酶标板上，标本和标准品中的IL-4会与单抗结合，游离的成分被洗去。加入生物素化的抗人IL-4抗体和辣根过氧化物酶标记的亲和素。生物素与亲和素特异性结合；抗人IL-4抗体与结合在单抗上的人IL-4结合而形成免疫复合物，游离的成分被洗去。加入显色底物，若反应孔中有IL-4，辣根过氧化物酶会使无色的显色剂现蓝色，加终 止液变黄。在450nm处测OD值，IL-4浓度与OD450值之间呈正比，可通过绘制标准曲线求出标本中IL-4的浓度。 试剂盒组成： 1．抗体预包被酶标板（8×12 或8×6） 2．冻干标准品（2 / 1 支；0.5ng/支） 3．标准品和标本稀释液（橙盖瓶）（1 瓶；20ml/12ml） 4．浓缩生物素化抗体（紫盖瓶）（1 支） 5．生物素化抗体稀释液（蓝盖瓶）（1 瓶；16ml/10ml） 6．浓缩酶结合物（棕盖瓶）（1 支） 7．酶结合物稀释液（紫盖瓶）（1 瓶；16ml/10ml） 8．浓缩洗涤液20×（白盖瓶）（1 瓶；50ml/25ml） 9．显色底物（TMB）（棕盖瓶）（1 瓶；12ml/6ml） 10．反应终止液（红盖瓶）（1 瓶；12ml/6ml） 11．封板胶纸（6/3 张） 12．产品说明书（1 份） 标本收集: 1. 收集血液的试管应为一次性的无热原，无内毒素试管。 2. 血浆抗凝剂推荐使用EDTA。避免使用溶血，高血脂标本。 3. 标本应清澈透明，悬浮物应离心去除。 4. 标本收集后若不及时检测，请按一次使用量分装，冻存于-20℃，-70℃电冰 箱内，避免反复冻融，3-6月内检测。 5. 如果您的样本中检测物浓度高于标准品最高值，请根据实际情况，做适当倍 数稀释(建议做预实验，以确定稀释倍数)。 注意事项: 1. 试剂盒使用前请保存在2-8℃。复溶后的标准品应分装后，将其放在-20～-70℃贮存。 2. 浓缩生物素化抗体，浓缩酶结合物体积小，运输中颠簸和可能的倒置，会使 液体沾到管壁或瓶盖。因此使用前请用手甩几下或1000转/分离心1分钟，以使附着管壁或瓶盖的液体沉积到管底。取用前，请用移液器小心吹打4-5次使溶液混匀。 3. 从冰箱中取出的浓缩洗涤液可能有结晶,属于正常现象，微加热至40℃使结晶完全溶解后再配制洗涤液。（加热温度不要超过50℃）使用时洗涤液应为室温。 4. 若需要分次使用标准品应按照每一次用量分装，将其放在-20～-70℃贮存。 避免反复冻融。 5. 不同批号的试剂盒组份不能混用（洗涤液和反应终止液除外）。

ELISA标准方法

ELISA标准方法 ELISA所用试剂 1. 包被液：Na2CO3: 1.6g NaHCO3: 2.9g。加双蒸水至1升，调节pH值至9.6（室温保存） 2. 5×PBS（1L）：Na2HPO4·12H2O：68.8g NaH2PO4·2 H2O：8.97g NaCl：45g 加双蒸水至1L，室温保存3—4周。 3. 洗涤溶液：含0.05％Tween20的PBS水溶液 PBST（1L）：5×PBS：200mL ；双蒸水：800mL；10%的Tween—20：5 mL 4. 底物液： A：无水醋酸钠：8.2g β—糊精：2.5g 过氧化氢脲：150 mg 加双蒸水至1000 mL，调pH至5.0，4℃保存。（使用时需达到室温）B：TMB 50mg 溶于二甲基亚砜（DMSO）5 mL ，室温避光保存。 使用前15分钟混合14.6 mL A液和0.45 mL B液。 5. 封闭液：1%BSA（溶解于PBS中） 6. 终止液：1.25M H2SO4 实验方法 1.半抗原与载体蛋白连接 采用活性酯法连接。以连接KLH为例，具体步骤： 精确称取半抗原活性酯10mg溶于1ml N,N-二甲基甲酰胺DMF中（溶液1）（－20℃保存），载体蛋白10mg溶于2ml pH值为9.3的KH2PO4溶液中（溶液2），根据半抗原与载体蛋白摩尔比例为1：13，取适量溶液1缓慢加入到溶液2中，在冰浴中混合。然后放于4℃冰箱内过夜（18h），室温放置1小时后将反应液装入透析袋，4℃下、pH=7.4的0.01 mol/mL 的PBS中透析，然后精确量取蛋白质偶联物溶液的体积，测定浓度和结合比，加入叠氮钠（1/1000）4℃保存。 2. 酶标抗原的制备 制备半抗原的活性酯，采用方法同半抗原与载体蛋白连接方法(1)相同，只是收集透析后的液体中加入硫柳汞（1/10000），4℃保存。 3.免疫程序 免疫动物选择雄性新西兰大白兔（活雄性大耳白），月龄3个月，体重1.5公斤，饲养于标准实验动物房中，连续观察3天，确定身体状况正常后进行免疫。 精确称取0.2ml人工抗原（5mg/ml）溶于0.3mL 0.9％的NaCl溶液；与0.5mL弗氏完全佐剂乳化后初次免疫，采用多点皮内和肌肉注射。加强免疫用0.1ml人工抗原溶于0.4mL 0.9％的NaCl溶液和0.5mL弗氏不完全佐剂乳化后免疫。分别于初次免疫后2周、4周、8周、12周、16周共加强免疫五次，分别于第 三、四、五、六次免疫完后10天，由兔子的耳缘静脉取血，进行效价检测。 4. 抗血清效价的测定：间接酶联免疫法 包被抗原（与载体蛋白OA连接物）1ug/well，室温过夜；PBST洗板三次后加入1％BSA/PBS 200uL/well 室温封闭1h；PBST洗板三次后加入50uL/well梯度稀释的抗血清，室温孵育1h；PBST洗板四次后加入50uL/well酶标二抗，室温孵育30min；PBST洗板五次后加入TMB底物体系150uL/well，室温显色反应20min；加入1.25M浓硫酸50uL/well终止反应。酶标仪读数，选择吸光度值在0.7－1.2范围内的抗血清稀释倍数，即为抗体效价。

液相阻断ELISA检测方法

一、亚洲I型口蹄疫抗体液相阻断 ELISA 试验操作方法 一、试验器材准备 1.移液器:5-50μl移液器、0.2—10μl移液器、50—200μl移液器、50 —300μl 12道移液器各一把。 2.移液枪尖 (若干)。 3.抗原抗体反应板:微量血凝板(U型、V型均可)5块,本试剂盒配备两块,用于被检血清的稀释和抗原抗体反应。注:抗原抗体反应板可重复使用,实验后,用水冲洗干净,然后用无离子水沸水浴30秒,晾干,待用。 4.超纯水 , 无离子水或蒸馏水。 二、试剂准备 1.包被缓冲液(PH9.6) 将所购试剂盒配备的碳酸盐缓冲液胶囊1粒小心打开,将胶囊内粉末倒入100ml无离子水中溶解即可。4℃存放,1月内有效。 2. 洗涤液(PBST) 将试剂盒配备的 25 倍浓缩 PBST 液(可能有结晶形成,用时微热溶化)用无离子水或蒸馏水做1:25稀释。(如果PH降低,务必用NaOH调至7.4) 3.底物溶液 取1片柠檬酸—磷酸盐片剂(试剂盒配备)溶于100mL无离子水中,溶化后,取50mL溶液, 再加1片邻苯二胺(OPD)片剂,充分溶解,分装（5mL/ 瓶或 10Ml ∕瓶 ), 避光之-2O℃保存。用前避光溶化 ,临时每1mL上述溶液加 10μL 本试剂盒配备的 3% 的双氧水(H 20 2 ) 。 三、操作步骤 1.用包被缓冲液稀释亚洲 1 型口蹄疫病毒兔抗血清至工作浓(1:1000), 在 ELISA 板上每孔加 50μl, 振荡 , 封板或置湿盒内，室温过夜。 图 1 96 孔酶标板检测 10 份样品布局图

图 1 为抗体滴度测定 (定量) 检测 10 份样品布局图;图 2 为抗体滴度测定( 定量 )检测 20 份样品布局图。 2. 抗原抗体(阴阳性对照血清及待检血清)反应 根据不同的需要,选择图1-2中的一种布局在抗原抗体反应板上操作。 图 2 96 孔酶标板检测 20 份样品布局图 以图 1 为例 , 在 U 型血凝板上按 50 μl/孔量用 PBST 将待检血清 从1:4 开始做2倍连续稀释至 1:512。同时,按图示稀释阴阳性对照血清 , 然后每 孔加入 50 μ l 用 PBST 稀释到使用浓度的亚Ⅰ洲型口蹄疫病毒抗原 (1:4, 即1份病毒抗原、加3份PBST), 病毒抗原对照孔加100μl。振荡混匀,封板,4 ℃过夜。加入病毒抗原后血清的稀释度变为从1:8开始的2倍稀释。 3.用洗涤液 (1×PBST) 洗 ELISA板5 次,在洗水纸上甩干,再将抗原抗 体混合物从抗原抗体反应板上按次序转移至ELISA板上的相对应孔,每孔 50μl封板,37℃温育1小时。 4.同上洗板5次, 甩干。用豚鼠抗血清稀释液稀释亚洲1型口蹄疫病毒豚 鼠抗