过氧化氢酶米氏常数的测定
过氧化氢酶米氏常数的测定
一、实验目的
1. 了解米氏常数的测定方法
2. 学习提取生物组织中的酶
二、实验原理
1.米氏反应动力学
米氏方程 (Michaelis-Menten Equation):
2.米氏常数的意义：
①反映酶的种类：Km是一种酶的特征常数，只与酶的种类有关，与酶浓度、底物浓度无
关。
②米氏常数是酶促反应达到最大反应速度Vmax一半时的底物浓度。其数值大小反映了
酶与底物之间的亲和力：Km值越大，亲和力越弱，反之Km值越小，亲和能力越强。
③Km可用来判断酶（多功能酶）的最适底物：Km值最小的酶促反应对应底物就是该酶
的最适底物。
3.米氏常数的求法：
该方法的缺点是难以确
定最大反应速度Vmax。
该作图法应用最广。但在低浓度是v值误差较大，在[S]等差值实验时作图点较集中于纵轴。因此在设计底物浓度时，最好将1/[S]配成等差数列，这样可使点距较为平均，再配以最小二乘回归法，就可以得到较为准确的结果。
此法优点是横轴上点分布均匀，缺点是1/v会放大误差，同时对底物浓度的选择有要求。[S]<
4.氧化酶：生物体内重要的三种氧化酶类，其作用均是消除体内自由基：
①POD：过氧化物酶
②SOD:超氧化物歧化酶
③CAT：；过氧化氢酶
5.过氧化氢酶的作用：
植物体内活性氧代谢加强而使过氧化氢发生积累。过氧化氢可进行一步生成氢氧自由基。氢氧自由基是化学性质最活泼的活性氧，可以直接或间接地氧化细胞内核酸、蛋白质等生物大分子，并且有非常高的速度常数，破坏性极强，可使细胞膜遭受损害，加速细胞的衰老和解体。过氧化氢酶（catalase，CAT）可以清除过氧化氢、分解氢氧自由基，保护机体细胞稳定的内环境及细胞的正常生活，因此CAT是植物体内重要的酶促防御系统之一，其活性高低与植物的抗逆性密切相关。
6.过氧化氢酶活力的测定方法：
①紫外吸收法：
过氧化氢在240nm波长下有强烈吸收，过氧化氢酶能分解过氧化氢，使反应溶液吸光度（A240nm）随反应时间而降低。根据测量吸光度的变化速度即可测出过氧化氢酶的活性。（以一分钟内A240nm下降为一个单位）
②滴定法（高锰酸钾法、碘量法）
在反应系统中加入一定量（反应过量）的过氧化氢溶液，经酶促反应后，用标准高锰酸钾溶液（在酸性条件下）滴定多余的过氧化氢。根据单位时间内消耗的过氧化氢的量即可测出过氧化氢酶活力大小。
7.实验中的反应：
H2O2被过氧化氢酶分解出 H2O 和 O2 , 未分解的 H2O2 用 KMnO4 在酸性环境中滴定, 根据反应前后的浓度差可以算出反应速度:
酶
2H2O2 ?→ 2H2O + O2
2KMnO4+5H2O2+3H2SO4 ?→ 2MnO4+K2SO4+8H2O+5O2
（本实验以马铃薯提供过氧化氢酶）
三、实验试剂
1. 0.02mol/L 磷酸缓冲溶液 (pH=: 实验室提供.
2. 酶液: 称取马铃薯 5g, 加缓冲液 10mL, 匀浆过滤.
3. 0.01mol/L 高锰酸钾.
4. L H2O2.
5. 25%H2SO4.
四、实验操作
取 6 只锥形瓶, 按下表的顺序加入试剂.
先加好过氧化氢和蒸馏水, 加酶液后立即混合, 依次记录各瓶的起始反应时间. 反映到达 5min 立即加入2ml 25%硫酸终止反应, 充分混匀.。用 L 的 KMnO4溶液滴定瓶中剩余的过氧化氢至微红色, 记录消耗的高锰酸钾体积.。
五、注意事项：
1.反应时间必须准确。
2.酶浓度须均一，若酶活力过大，应适当稀释。
3.滴定终点的判定。
六、实验结果：
过氧化氢浓度：L
称取马铃薯的质量：
七、实验结果分析：
1.曲线上少一个点的原因：
用移液管移取序号为2的过氧化氢溶液（应为）错误的移取了，故在制图时将其舍去。
2.曲线线性较好（R2=）的原因：
本实验采取了两人分工的方法完成实验，控制反应结束及滴定分别由一人完成，所以标准都相同，从而在一定程度上提高了实验的准确性。
3.Km计算结果呈负值的原因：
Km呈负值（即整条直线都向下移动），亦即所有测定的v值都偏大。
由v=(c1**c2*V2)/5，故推断最可能的原因是V2整体测量偏小，可能的操作失误是编号为0的空白对照组中高锰酸钾的滴加量偏高，从而使除去该点的整体的高锰酸钾量都偏小。
血清米氏常数的测定
实验四 碱性磷酸酶米氏常数的测定 一．实验目的 1.通过碱性磷酸酶米氏常数的测定，了解其测定方法及意义。 2.学会运用标准曲线测定酶的活性，加深对酶促反应动力学的理解。 二．实验原理 当温度、pH 及酶浓度恒定的条件下，酶促反应的初速度随作用物浓度[S]增大而增大，但增大到一定限度时，作用物浓度再增加，则反应速度不再增加。此时反应速度为最大速度（V max ）。如图5-1所示。 Michaelis Menten 对酶促反应速度与作用物浓度之间的这种关系进行了大量实验研究，并于1913年提出了数学方程式，即著名的米一曼（Michaelis-Menten ）方程式： 式中Km 即为米氏常数，Vmax 为最大反应速度，当v =Vmax/2时，则Km=[S]。Km 是酶的特征常数，测定Km 是研究酶的一种方法。由于用Michaeis-Menten 方程中的V 与[S]作图求Km ，不方便，Lineweaver-Burk 将上式变形，以1/v 对1/[S]作图，如图5-2： Vm 1/2Vm Km [S] 图5-1
图5-2 作图后，将各点连线延长，直线与横轴的交点为，根据在横轴上的截距，可以计算出该酶的Km。 本实验以碱性磷酸酶为例，用磷酸苯二钠为其作用物，碱性磷酸酶能分解磷酸苯二钠产生酚和磷酸，酚在碱性溶液中与4氨基安替比林作用，经铁氰化钾氧化生成红色的醌衍生物，根据红色深浅可测出酶活力高低。其反应式如下： 利用在不同作用物浓度的条件下，测定的酶活性（A），按Lieweaver-Burk二氏法作图，从 x 轴上的截距求得其Km值。 三．预习题 试说明米氏常数Km的物理意义和生物学意义。 四．实验器材与试剂
过氧化氢酶米氏常数的测定
过氧化氢酶米氏常数的测定 傅璐121140012 一、实验目的 1. 了解米氏常数的测定方法 2. 学习提取生物组织中的酶 二、实验原理 1.米氏反应动力学 (Michaelis-Menten Equation): 米氏方程 2.米氏常数的意义： ①反映酶的种类：Km是一种酶的特征常数，只与酶的种类有关，与酶浓度、 底物浓度无关。 ②米氏常数是酶促反应达到最大反应速度Vmax一半时的底物浓度。其数值大 小反映了酶与底物之间的亲和力：Km值越大，亲和力越弱，反之Km值越小，亲和能力越强。 ③Km可用来判断酶（多功能酶）的最适底物：Km值最小的酶促反应对应底物 就是该酶的最适底物。 3.米氏常数的求法： 该方法的缺点是难以确定最大 反应速度Vmax。
该作图法应用最广。但在低浓度是v值误差较大，在[S]等差值实验时作图点较集中于纵轴。因此在设计底物浓度时，最好将1/[S]配成等差数列，这样可使点距较为平均，再配以最小二乘回归法，就可以得到较为准确的结果。 此法优点是横轴上点分布均匀，缺点是1/v会放大误差，同时对底物浓度的选择有要求。[S]<
碱性磷酸酶米氏常数测定
碱性磷酸酶米氏常数测定 P60 【实验原理】 在环境的温度、pH和酶的浓度一定时，酶促反应速度与底物浓度之间的关系表现在反应开始时，酶促反应的速度(V)随底物浓度(S)的增加而迅速增加。若继续增加底物浓度，反应速度的增加率将减少。当底物浓度增加到某种程度时，反应速度会达到一个极限值，即最大反应速度(V max)，如图所示。 底物浓度与酶促反应速度的这种关系可用Michaelis-Menten方程式表示。 V = V max[S]/(K m+[S]) 上式中V max为最大反应速度，[S]为底物浓度，K m为米氏常数(Michaelis constant)，而其中V则表示反应的起始速度。当V= V max/2时，K m=[S]。所以米氏常数是反应速度等于最大反应速度一半时底物的浓度。因此K m的单位以摩尔浓度(mol／L)表示。 K m是酶的最重要的特征性常数，测定K m值是研究酶动力学的一种重要方法，大多数酶的K m值在0.01-100(mmol/L)间。 酶促反应的最大速度V max实际上不易准确测定，K m值也就不易准确测出。林-贝(1ineweaver - Burk)根据Michaelis-Menten方程，推导出如下方程式，即：1/V = （K m +[S]）/ V max[S]或1/V = K m/ V max·（1/[S]）+1/ V max 此式为直线方程，以不同的底物浓度1/[S]为横坐标，以1/V为纵坐标，并将各点连成一直线，向纵轴方向延长，此线与横轴相交的负截距为-1/ K m，由此可以正确求得该酶的K m值，如图所示。
本实验以碱性磷酸酶为例，测定不同底物浓度的酶活性，再根据Lineweaver-Burk法作图，计算其K m值。 可以作为碱性磷酸酶底物的物质很多，底物反应的酶对于不同的底物有不同的K m值。本实验以磷酸苯二钠为底物，由碱性磷酸酶催化水解，生成游离酚和磷酸盐。酚在碱性条件下与4-氨基安替比林作用，经铁氰化钾氧化，生成红色的醌衍生物，颜色深浅和酚的含量成正比。故可以从标准曲线上查知酚的含量，从而计算化学反应速度。反应式如下： 【实验方法】 一．底物浓度对酶促反应速度的影响 (1) 取6支试管，作好标记，按下表操作。 管号123456 0.04mol/L 基质液/mL0.10 0.20 0.30 0.40 0.80 0.0 0.1mol/L碳酸盐缓冲液/mL0.70 0.70 0.70 0.70 0.70 0.70 蒸馏水/mL 1.10 1.00 0.90 0.80 0.40 1.20 37℃水浴5min 血清/mL0.10 0.10 0.10 0.10 0.10 0.10 最终基质浓度/mmol?L-1 2.00 4.00 6.00 8.00 16.00 0.00 (2) 加入血清后，各管混匀并且立即记录时间，将上述各管置37℃水浴中准确保温15 分钟。 (3) 保温结束，立即加碱性溶液1.1mL终止反应。 (4) 各管分别加入0.3％4-氨基安替比林1.0mL，0.5％铁氰化钾2.0mL，充分混匀，放置10分钟，以6号空白管作对照，于510nm波长处比色测定，根据酚标准曲线计算酚含量。 (5) 以各管基质浓度的倒数1/[S]为横坐标，以各管反应速度的倒数1/V（μmol.L-1.min-1为单位）作纵坐标，作图求出K m值。 二．酚标准曲线的绘制 (1) 取洁净干燥试管6支，按下表依次加入试剂。
碱性磷酸酶米氏常数的测定
碱性磷酸酶米氏常数的测定 [目的与要求] 通过碱性磷酸酶米氏常数的测定，了解其测定方法及意义。学会运用标准曲线测定酶的活性，加深对酶促反应动力学的理解。 [原理] 在环境的温度、pH和酶的浓度一定时。酶促反应速度与底物浓度之间的关系表现在反应开始时。酶促反应的速度(V)随底物浓度(S)的增加而迅速增加。若继续增加底物浓度，反应速度的增加率将减少。当底物浓度增加到某种程度时，反应速度会达到一个极限值，即最大反应速度(V max)，如图37所示。 底物浓度与酶促反应速度的这种关系可用Michaelis-Menten方程式表示。 V = V max[S]/(K m+[S]) 上式中V max为最大反应速度，[S]为底物浓度，K m为米氏常数(Michaelis constant)，而其中V则表示反应的起始速度。当V= V max/2时，K m =[S]。所以米氏常数是反应速度等于最大反应速度一半时底物的浓度。因此K m的单位以摩尔浓度(mol／L)表示。 K m是酶的最重要的特征性常数，测定K m值是研究酶动力学的一种重要方法，大多数酶的K m值在0.01-100(mmol/L)间。 酶促反应的最大速度V max实际上不易准确测定，K m值也就不易准确测出。林-贝(1ineweaver - Burk)根据Michaelis-Menten方程，推导出如下方程式，即： 1/V = （K m +[S]）/ V max[S]或1/V = K m/ V max·（1/[S]）+1/ V max 此式为直线方程，以不同的底物浓度1/[S]为横坐标，以1/V为纵坐标，并将各点连成 一直线，向纵轴方向延长，此线与横轴相交的负截距为-1/ K m，由此可以正确求得该酶的K m 值，如图38所示。 图37 底物浓度对反应速度的影响图38 Lineweaver-Burk作图法 本实验以碱性磷酸酶为例，测定不同底物浓度的酶活性，再根据Lineweaver-Burk法作图，计算其K m值。 可以作为碱性磷酸酶底物的物质很多，底物反应的酶对于不同的底物有不同的K m值。本实验以磷酸苯二钠为底物，由碱性磷酸酶催化水解，生成游离酚和磷酸盐。酚在碱性条件下与4-氨基安替比林作用，经铁氰化钾氧化，生成红色的醌衍生物，颜色深浅和酚的含量成正比。根据吸光度的大小可以计算出酶的活性，也可以从标准曲线上查知酚的含量，进而算出酶活性的大小。反应式如下：
米氏常数的测定
底物浓度对酶促反应速度的影响 ——米氏常数的测定 一．目的要求 1.1了解底物浓度对酶促反应的影响。 1.2掌握测定米氏常数K m 的原理和方法。 二．实验原理 酶促反应速度与底物浓度的关系可用米氏方程来表示： 式中： v ——反应初速度（微摩尔浓度变化/min ）； V ——最大反应速度（微摩尔浓度变化/min ）； [s]——底物浓度（mol/L ）； K m ——米氏常数（mol/L ）。 这个方程表明当已知K m 及V 时，酶促反应速度与底物浓度之间的定量关系。K m 值等于酶促反应速度达到最大反应速度一半时所对应的底物浓度，是酶的特征常数之一。不同的酶，K m 值不同，同一种酶与不同底物反应K m 值也不同，K m 值可以近似地反应酶与底物的亲和力大小：K m 值越大，表明亲和力小；K m 值小，表明亲和力大。则测K m 值是酶学研究的一个重要方法。大多数纯酶的K m 值在0.01～100mmol/L 。 Linewaeaver-Burk 作图法（双倒数作图法）是用实验方法测K m 值的最常用的简便方法： 实验时可选择不同的[s]，测定对应的v ，以 对 作图，得到一个斜率为V K m 的直线，其截距 ][1s 则为m K 1，由此可求出K m 的值（截距的负倒数）。 本实验以胰蛋白酶消化酪蛋白为例，采用Linewaeaver-Burk 双倒数作图法测定双倒数作图法。胰蛋白酶催化蛋白质中碱性氨基酸（L-精氨酸和L-赖氨酸）的羧基所形成的肽键水解。水解时有自由氨基生成，可用甲醛滴定法判断自由氨基增加的数量而跟踪反应，求得初速度。 ] [][s K s V v m += V s V K v m 1 ][1.1+ =v 1][1s
过氧化氢酶米氏常数的测定
过氧化氢酶米氏常数的测定一、实验目的 了解并掌握米氏常数的意义和测定方法 二、实验原理 H 2O 2 被过氧化氢酶分解出H 2 O和O 2 ，未分解的H 2 O 2 用KMnO 4 在酸性环境中滴 定，根据反应前后H 2O 2 的浓度差可求出反应速度。 2H 2O 2 = 2H 2 O + O 2 2KMnO 4 + 5H 2 O 2 + 3H 2 SO 4 = 2MnSO 4 + K 2 SO 4 + 5O 2 ↑ + 8H 2 O 本实验由马铃薯提供过氧化氢酶。在保持恒定的条件下，用相同浓度的过 氧化氢酶催化不同浓度的H 2O 2 分解。在一定限度内，酶促反应速度与H 2 O 2 浓度 成正比。用双倒数作图法(即以1/v对1/[S]作图)可求得过氧化氢酶的Km值。三、实验器材 锥形瓶(6个) 吸管、酸式滴定管 四、实验试剂 1、0.02mol/L 磷酸缓冲液(pH=7) 2、0.004 mol/L KMnO 4 (需标定) 3、0.05 mol/L H 2O 2 (需标定) 4、25% H 2 SO 4 五、实验操作 1、酶液的提取：称取马铃薯（去皮）5克，加0.02mol/L 磷酸缓冲液10mL，再加少量海砂，研磨成匀浆，离心(3000r/ min，10min)，上清液即为酶液。 2、滴定：取干燥锥形瓶6只，按下表顺序加入试剂：
先加好0.05mol/L H 2O 2 及蒸馏水，加酶液后立即混合，依次记录各瓶的起 始反应时间。各瓶时间达5min时立即加2.0mL 25% H 2SO 4 终止反应，充分混 匀。用0.004 mol/L KMnO 4滴定各瓶中剩余的H 2 O 2 至微红色，记录消耗的KMnO 4 体积。 六、实验计算 分别求出1─5瓶的底物浓度[S]和相应的反应速度v。 C 1V 1 10 [S] = 5 ∕2C2V2 C 1V 1 – v = 式中 [S]：为底物物质的量浓度(mol/L) C 1：为H 2 O 2 物质的的量浓度(mol/L)
【米氏常数】 米氏常数测定实验报告.docx
【米氏常数】米氏常数测定实验报告 此人姓米，单名兰，却没有米兰那种碧绿盎然，幽香沁人的素雅。她的身高同十几年前参军时，相差无几—1.55米。3号军装穿在身上，仍旧如长袍加身，宽大得令人忍俊不禁。第一个对米兰发表看法的，是化验科的金云。金云姑娘，确如行于天穹的云霞，轻盈高挑的身材，朗若明月的脸庞，使她这只“鹤”，高立于我们这所医院的所有兵姑娘之中。姑娘对自己的美都是敏感的，“大兵”也不例外。更何况金云的仰慕者不计其数。不知何故，却一概吃了闭门羹，落得个没趣。这个金云啊，美丽使她的嘴变得尖酸起来。于是乎，米兰也逃不出她那双带着讥讽的笑盈盈的大眼睛。从医校毕业分到化验科的第2周，金云在医学论文宣读会上，见到了比讲台高不了多少的米兰。“米兰？嘻嘻！”她一眨黑白分明的眸子，咬着身边另一位护士的耳朵，“米氏常数。嗯？”“米氏常数？”“酶的底物浓度取决于米氏常数。它在同等条件下是恒定的。你瞧，她多恒定，永远只比讲台高半尺。咯咯！”周围的姑娘们八成听见了。否则，各种无法揣测的眼神，为什么都聚向站在讲台后面，涨红了脸的米兰？金云矜持地向周围扫了一眼，她为自己的想象力而暗暗自得。这位以全优成绩毕业的姑娘，连头发梢都是高傲的。“……是个沉痛的教训。”米兰颤动着嘴角，向幻灯投影机插进一张照片。金云低呼了一声，礼堂里那些抄录笔记的大夫们，也交头接耳起来—幕布上一张奇丑无比的脸。严重烧伤使患者分不清男女，辨不全五官。变形的脸上爬满了蚯蚓似的斑痕。又是一张照片，仍旧是一张奇丑的脸。“手术没有获得预期效果。主要教训是……”金云无心去关心那位没有恢复容貌的患者，也不再留神米兰那些专科术语了。她痴呆呆地盯住米兰—“真是太一般啦！”五官似乎是符合解剖位置，但安在米兰宽大的脸庞上，总那么别扭。又黑又硬的头发从无沿帽下“炸”开来，象一道狭窄的帽檐。金云下意识地拂拂自己额前那蓬微微弯曲、浓密地偏向一侧的刘海。她的天生的卷发，足以使她在那些煞费苦心，用塑料发筒修饰发型的姑娘面前，不以为然地眯上眼睛。“是个整型外科大夫，她怎么不替自己整整？起码割个双眼皮吧？”金云注意地瞧了一眼米兰有点搭下的眼皮，“谢天谢地，我可是永远不会去找她的。”她庆幸地一笑，悄悄从口袋里掏出一本装潢精美的外语单词本，不再注意米兰说什么了。“小金，到我宿舍坐会儿？”金云带着几分惊诧，小心翼翼地跨进米兰的屋子。那是个光怪陆离的迷宫。我的妈呀！肖像陈列室么？当今中国影坛上红极一时的影星们，几乎都被米兰请到这儿了。还有那些金发碧眼的欧美人，顶着一头螺蛳似的卷发的黑人，眉间挂着钻石披着头巾的阿拉伯人。神态各异，维妙维肖。金云黑亮的眉毛堆了起来，小嘴撅得高高：“她不知道美对她是多么大的揶揄？”她开始可怜米兰，甚至有些懊悔“米氏常数”的绰号，起得太损了。米兰知道么？这几天，她似乎很注意金云，那双小眼睛，一遇到金云便熠熠发光。似乎要吞食金云脸上那片动人的红晕。“喜欢么？”“嗯。”“我能为你画一幅肖像么？”“啊？！”那些水粉，油画，炭条的人物肖像，真的出自米兰的手么？金云注意到屋角的油画箱和写生板，还有一大瓶松节油。难怪一进屋便嗅到了一股姑娘屋里少有的怪味，原来是它！“你不相信我的艺术造诣？”米兰不等金云回话，拖过一张靠椅笑嘻嘻地说，“坐啊！”自己朝后退几步，眯起细小的眼睛，“我不是外光派。”她迅速地铺开“家伙”，往小马扎上一坐，“你脸上的色彩很丰富，线条很好。”太诱惑人了！一幅油画肖像！金云有3册厚厚的粘胶影集。有些姑娘翻起她的像册，总是喷嘴，露出羡慕又妒嫉的神色。尽管都是清一色的国防绿军装，清一色的“2块5”，可穿在金云身上，却使她越发象雨后新竹般秀丽挺拔。但金云却腻了。横竖就那样，没什么艺术价值。她端坐在椅子上，乜斜着米兰：“这个怪人。试试吧。”她想：只要米兰的笔稍有不忠实的描写，她立刻逃离这个肖像陈列馆。“你不要紧张。拿出平时最轻松的姿态，比方说，去见你的妈妈、爱人、朋友。你可以随意走动，和我交谈。”米兰滔滔不绝地说着。金云发觉，她射向自己的眼神那么怪。似乎金云不是一位漂亮的姑娘，
分光光度法测定蔗糖酶的米氏常数
实验报告解析 （目的要求、基本原理、仪器试剂和实验步骤四个部分可参阅实验预习或者实验内容部分，数据处理部分参见数据处理） 一、实验重点 1、掌握本实验的基本原理。 2、掌握实验中用到仪器的操作方法，并能熟练使用。 3、了解实验中的注意事项并能解释为什么。 二、实验难点 1、葡萄糖标准曲线的绘制 2、反应实验条件的控制 三、注意事项 1、分光光度计使用注意事项： (1)使用前，使用者应该首先了解本仪器的结构和原理，以及各个旋钮之功能。 (2)仪器接地要良好，否则显示数字不稳定。
(3)如果大幅度改变测试波长时，在调整“00.0”和“100”后稍等片刻（因光能量变化急剧，光电管受光后响应缓慢，需一段光响应平衡时间），当稳定后，重新调整“00.0”和“100”即可工作。 (4)仪器左侧下角有一只干燥剂筒，应保持其干燥，发现干燥剂变色应立即更新或烘干后再用。 (5)当仪器停止工作时，关掉电源，电源开关需同时切断，并罩好仪器 2、葡萄糖标准曲线的绘制要精确 3、反应条件要严格安要求控制 四、思考题回答 1、为什么说米氏常数是一个特征性常数，而且最大反应速度不是？ 米氏常数是酶的特征性常数，可用来表示酶和底物亲和力的大小。米氏常数与底物浓度和酶浓度无关，而受温度和pH值的影响，竞争性抑制剂米氏常数增大，最大反应速度不变；非竞争性抑制剂米氏常数不变，最大反应速度减小；反竞争性抑制剂米氏常数减小，最大反应速度减小。 Km：米氏常数，是研究酶促反应动力学最重要的常数。它的意义如下：它的数值等于酶促反应达到其最大速度Vm一半时的底物浓度〔S〕，图示以及公式推导。
它可以表示E与S之间的亲和能力，Km值越大，亲和能力越强，反之亦然。它可以确定一条代谢途径中的限速步骤：代谢途径是指由一系列彼此密切相关的生化反应组成的代谢过程，前面一步反应的产物正好是后面一步反应的底物，例如，EMP途径。限速步骤就是一条代谢途径中反应最慢的那一步，Km值最大的那一步反应就是，该酶也叫这条途径的关键酶。它可以用来判断酶的最适底物，某些酶可以催化几种不同的生化反应，叫多功能酶，其中Km值最小的那个反应的底物就是酶的最适底物。 Km是一种酶的特征常数，只与酶的种类有关而与酶的浓度无关，与底物的浓度也无关，这一点与Vm是不同的，因此，我们可以通过Km值来鉴别酶的种类。但是它会随着反应条件（T、PH）的改变而改变。 2、为什么测定酶的米氏常数要采用初始速度法？ 米氏方程式是根据中间产物理论推导出来的。即在酶催化反应中，酶（E）和底物（S）首先生成中间产物（ES），然后分解成产物（P）和游离酶（E）： （1） 、、代表反应各步的速率常数。当反应以恒态进行时，ES的生成速率等于分解速率，即 （2） 式中、和分别代表酶、底物和中间产物的浓度。令
过氧化氢酶米氏常数的测定
过氧化氢酶米氏常数的测定 一、实验目的 1. 了解米氏常数的测定方法 2. 学习提取生物组织中的酶 二、实验原理 1.米氏反应动力学 米氏方程 (Michaelis-Menten Equation): 2.米氏常数的意义： ①反映酶的种类：Km是一种酶的特征常数，只与酶的种类有关，与酶浓度、底物浓度无 关。 ②米氏常数是酶促反应达到最大反应速度Vmax一半时的底物浓度。其数值大小反映了 酶与底物之间的亲和力：Km值越大，亲和力越弱，反之Km值越小，亲和能力越强。 ③Km可用来判断酶（多功能酶）的最适底物：Km值最小的酶促反应对应底物就是该酶 的最适底物。 3.米氏常数的求法： 该方法的缺点是难以确 定最大反应速度Vmax。 该作图法应用最广。但在低浓度是v值误差较大，在[S]等差值实验时作图点较集中于纵轴。因此在设计底物浓度时，最好将1/[S]配成等差数列，这样可使点距较为平均，再配以最小二乘回归法，就可以得到较为准确的结果。 此法优点是横轴上点分布均匀，缺点是1/v会放大误差，同时对底物浓度的选择有要求。[S]<
分光光度法测定蔗糖酶的米氏常数
分光光度法测定蔗糖酶的米是常数 一．实验目的： 1. 用分光光度法测定蔗糖酶的米是常数M K 和最大反应速率max v 。 2. 了解底物浓度与酶反应速率之间的关系 3. 掌握分光光度计的使用方法 二．实验原理： 酶是由生物体内产生的具有催化活性的蛋白质。它表现出特异的催化功能，因此叫生物催化剂。酶具有高效性和高度选择性，酶催化反应一般在常温、常压下进行。 在酶催化反应中，底物浓度远远超过酶的浓度，在指定实验条件时，酶的浓度一定时，总的反应速率随底物浓度的增加而增大，直至底物过剩此时底物的浓度不再影响反应速率，反应速率最大。 Michaelis 应用酶反应过程中形成中间络合物的学说，导出了米氏方程，给出了酶反应速率和底物浓度的关系： s M s c K c v v +?= m a x 米氏常数M K 是反应速率达到最大值一半时的底物浓度。测定不同底物浓度时的酶反应速率，为了准确求得M K ，用双倒数作图法，可由直线方程： max max 111v c v K v s M + ? = 以v 1为纵坐标， s c 1为横坐标，作图，所得直线的截距是 max 1v ，斜率是 max v K M ，直线与 横坐标的交点为M K 1- 。 本实验用的蔗糖酶是一种水解酶，它能使蔗糖水解成葡萄糖和果糖。该反应的速率可以用单位时间内葡萄糖浓度的增加来表示，葡萄糖与3,5-二硝基水杨酸共热后被还原成棕红色的氨基化合物，在一定浓度范围内，葡萄糖的量和棕红色物质颜色深浅程度成一定比例关系，因此可以用分光光度计来测定反应在单位时间内生成葡萄糖的量，从而计算出反应速率。所以测量不同底物（蔗糖）浓度s c 的相应反应速率v ，就可用作图法计算出米氏常数M K 值。 三．仪器与试剂： 高速离心机一台；分光光度计一台；恒温水浴一套；比色管（25ml ）9支；称液管（1ml ） 10支；称液管（2ml ）4支；试管（10ml ）10支；3,5-二硝基水杨酸试剂（即DNS ）；0.1mol.dm -3 醋酸缓冲溶液；蔗糖酶溶液；蔗糖（分析纯）；葡萄糖（分析纯）。 四．实验步骤：
实验一：米氏常数的测定
双倒数法测定过氧化物酶的米氏常数 学院/专业/班级____________________________________________ 姓名_______________ 合作者___________________________________________________ 教师评定___________ 【实验目的】以过氧化物酶为例，掌握测定酶促反应初速率和米氏常数的原理及方法 【实验原理】1913年，Michaelis 和Menten 运用酶反应过程中形成中间络合物的原理，首先提出了底物浓度和酶促反应速率的关系式，即著名的米氏方程： [][] S K S V v m max +?= 式中：v 为反应初速率（微摩尔浓度变化/min ）；V max 为最大反应速率（微摩尔浓度变化/min ）；[S ]为底物浓度（mol/L ）；K m 为米氏常数（mol/L ）。这个方程式表明当已知K m 及V max 时，酶反应速率与底物浓度之间的定量关系。K m 值等于酶促反应速率达到最大反应速率一半时所对应的底物浓度，是酶的特征常数之一。不同酶的K m 值不同，同一种酶与不同底物反应K m 值也不同，K m 值可以近似的反应酶与底物的亲和力大小：K m 越大表明亲和力越小；K m 越小表明亲和力越大。大多数纯酶的K m 值在0.01~100 mmol/L 。通过米氏方程的不同变形，可有多种求算米氏常数的方法，一般较常用的双倒数法，即取米氏方程的倒数式：[]max max m V 1S 1V K v 1+?=以v 1对[] S 1作图得一直线，该直线与横轴截距[]m K 1S 1=-。 过氧化物酶是一种对氢受体（H 2O 2） 底物有特异性，对氢供体底物缺乏特异性的酶，它可催化过氧化氢氧化许多多元酚或多元胺类底物发生显色、荧光或化学发光反应，可用于微量过氧化氢含量测定，也可以和其它酶反应系统偶联可用于测定许多与生命相关的物质：如葡萄糖、半乳糖、氨基酸、尿酸及胆甾醇等，亦是免疫分子和核酸分析中常用的标记物。通常使用的过氧化物酶是从植物辣根中提取的，因此也称为辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase, HRP ）。HRP 属于含血红素蛋白的一种，是由辅基——氯化血红素（铁卟啉）和脱辅基蛋白（糖蛋白）组成，分子量为44000。 HRP 是双底物酶（过氧化氢+多元酚或胺类底物），为求其对某一底物的K m ，通常的做法是令另一底物的浓度相对于待测底物大大过量，即可把该酶促反应当作单底物反应来处理。本实验我们选用3,3’,5,5’-四甲基联苯胺（TMB ）作为氢受体，它可被Hb 催化过氧化氢氧化生成有色产物，该产物在反应条件下（pH5-7左右）为蓝色物质（λmax =650 nm ）。实验中我们使TMB 的浓度大过量，测定HRP 对H 2O 2的K m 值（反之亦可测定HRP 对TMB 的K m 值）。 【实验仪器及试剂】 仪器：日立 UV-3010紫外可见分光光度计；石英比色皿（1 cm ）：2只；100 μL 微量取样器1支（枪头若干）；1 mL 取液器一支；电磁搅拌器1台（1 cm 聚四氟乙烯搅拌子1个 ） 试剂：过氧化物酶（HRP 溶液： mol/L ；3,3’,5,5’-四甲基联苯胺溶液（TMB ）： mol/L （DMSO 溶液）；H 2O 2溶液： mol/L ；磷酸缓冲液（PBS ）：pH= ； mol/L
酶促反应动力学实验
实验 酶促反应动力学 ————蔗糖酶米氏常数的测 【目的要求】 1．了解酶促动力学研究的范围。 2．以蔗糖酶为例，掌握测定米氏常数(Km) 【实验原理】 在酶促反应中，当反应体系的温度、pH 和酶浓度恒定时，反应初速度(v)则随底物 浓度[S]的增加而加速，最后达到极限，称为最大反应速度(v)。Michaelis 和Menten 根据反应速度与底物浓度的这种关系，推导出如下方程： ] [] [S k S V v m += 此式称为米氏方程，式中Km 称为米氏常数，按此方程，可用作图法求出Km 。方法有： 1．以v[S]作图 由米氏方程可知，v=V ／2时，Km ＝[S]即米氏常数值等于反应速度达到最大反应速度一半时所需底物浓度。因此，可测定一系列不同底物浓度的反应速度v,以v 对[S]作图。当v ＝V ／2时，其相应底物浓度即为Km 。 2．以1／v 对1／[S]作图 取米氏方程的倒数式： V S V k v m 1][11+?= 以1／v 对1／[S]作图可得一直线，其斜率为Km ／V ，截距为1/V 。若将直线延长与横轴相交，则该交点在数值上等于—l ／Km 。 本实验以蔗糖为底物．利用一定量蔗糖酶水解不同浓度蔗糖所形成的产物(葡萄糖和果糖)的量来计算蔗糖酶的Km 值。葡萄糖和果糖能与3，5—二硝基水杨酸试剂反应，生成桔红色化合物，可于520nm 处比色测定之。 【试验材料】 1．试剂 (1)标准葡萄糖溶液：准确称取100mg 葡萄糖溶于少量饱和的苯甲酸溶液(0.3%)，再转移到
100ml容量瓶中，用饱和苯甲酸溶液稀释到刻度，混匀，即得浓度为1mg／m1的标准葡萄糖溶液。冰箱贮藏可长期保存； (2)pH4.5的0.1mol/L醋酸缓冲液：取lmol/L醋酸钠溶液43m1及lmol／L醋酸溶液57m1，稀释至1000m1即得； (3)pH4.5的10％蔗糖溶液：准确取l0g蔗糖溶于少量pH4.5的0.1mol／L醋酸缓冲液，转移到100ml容量瓶中，用同样缓冲液稀释到刻度备用； (4)3，5—二硝基水杨酸试剂：溶液I：4.5％NaOH溶液300m1，1％3，5一二硝基水杨酸溶液880m1及酒石酸钾钠(KNaC4O6·4H20)255g三者一起混合均匀。 溶液Ⅱ：取结晶酚10g及lo％NaOH溶液22m1，加蒸馏水稀释成100ml，混匀。 溶液Ⅲ：取6.9gNaHSO3溶于64ml溶液n中。 将溶液皿和溶液I混合，激烈振摇混匀，即得3，5—二硝基水杨酸溶液，放置一周后备用。 (5)酵母蔗糖酶溶液：称取鲜酵母l0g于研钵中，加少量细砂及10一15ml蒸馏水研磨。磨细后置冰箱中，过滤，滤液加2—3倍体积冷丙酮，搅拌均匀后离心，沉淀用丙酮洗两次，真空干燥得固体粉末状酶，再溶于100ml蒸馏水，即得酶溶液。若有不溶物可用离心法除去。该酶液活力以6—12单位为佳。蔗糖酶活力单位的定义为：在一定条件下反应5min，每产生lmg葡萄糖所需要的酶量。备用。 2．器材 (1)100m1三角烧瓶2只； (2)研钵1只； (3)50m1及100m1容量瓶各1只； (4)离心机1台(4000rpm)； (5)糖管8支； (6)恒温水浴1台； (7)吸量管：1.0ml×2支； (8)秒表1只； (9)72l型分光光度计1台。 【实验方法】 1．标准曲线的绘制 取干净糖管6支，如下表所示添加试剂。 调零点，于520nm处测定吸光度。以葡萄糖含量为横坐标，以吸光度为纵坐标作图。2．根据活力选择酶浓度 将10％蔗糖溶液稀释成pH4.5的6.5％的溶液，取此溶液5m1于试管中，共加两管。将两管同时置于25℃水浴中保温5min，然后向管中加入蔗糖酶溶液1.0ml，立即混匀， 同时用秒表计时，准确反应5min后，立即加入5ml0.1mol/LNaOH溶液终止酶反应。另 一管先加入5.0ml0.11mol/LNaOH溶液，再加入蔗糖酶溶液1.0ml(此为对照管)。 取干净糖管3支，第l、2管分别加入上述反应液各1.0ml及水各1.0m1，第3管加蒸馏
碱性磷酸酶米氏常数的测定
For personal use only in study and research; not for commercial use 碱性磷酸酶米氏常数的测定 【实验目的】通过碱性磷酸酶（alkaline phosphatase ，AKP ）米氏常数的测定，了解其测定方法和意义。学会运用标准曲线测定酶的活性及观察抑制剂对酶促反应动力学的影响，加深对酶促反应动力学的理解。 【实验原理】本实验以磷酸苯二钠为底物，由碱性磷酸酶催化水解，生成游离酚和磷酸盐。 酚在碱性条件下与4-氨基安替比林作用，经铁氰化钾氧化，生成红色的醌衍生物，颜色深浅和酚的含量成正比。根据吸光值的大小可以计算出酶的活性，也可以从标准曲线上查知酚的含量，进而算出酶活性的大小。 【实验步骤】1. 底物浓度对酶促反应速度的影响 (1) 取6支试管，作好标记。按下表操作：（未加抑制剂组） 另取6 支试管， 做好标记。按下 表操作： （高精 氨酸组） (2) 加入酶液(0.05μg/ml)后,各管混匀并立即记录时间,将上述各管置37℃水浴中准确保 温15分钟。 (3) 保温结束，立即加碱性溶液1.1 ml 终止反应。 (4) 各管分别加入0.3% 4-氨基安替比林1.0 ml ，0.5%铁氰化钾2.0 ml ，充分混匀，放置 10分钟，以6号空白管作对照，于510 nm 波长处比色，根据酚标准曲线计算酶活性。 (5) 以各管基质浓度的倒数1/[S]为横坐标，以各管吸光度值的倒数或者以酶活性单位的倒 数为1/V 做横坐标，作图求出Km 值。 2.酚标准曲线的绘制 (1) 取洁净干燥试管6支，按下表依次加入试剂： (2) 混匀后室温放置15分钟，于510 nm 波长处比色。 (3) 以酚含量（μg ）为横坐标，吸光度值为纵坐标，绘制酚标准曲线。
淀粉酶米氏常数的测定
实验二 淀粉酶米氏常数的测定 一、目的要求 了解底物浓度与酶反应速度之间的关系，学习和掌握米氏常数（Km ）及最大反 应速度（Vm ）的测定原理和方法，测出淀粉酶在以对淀粉为底物时的Km 和 Vm 值。 二、原理 酶促反应v-[S]曲线 其中[S]Vm 为最大反应速度；Km 为米氏常数。 米氏常数Km 是酶的一个基本特征常数，它包含着酶与底物结合和解离的性质。 特别是同一种酶能够作用于几种不同底物时，米氏常数Km 往往可以反映出酶与 各种底物的亲和力的强弱。 测定Km 和Vm ，可通过作图法求得。 最常用的Lineweaver-Burk 双倒数作 图法。这个方法是将米氏方程转化为倒数形式，即：
以1/v对1/[S]作图，可得一条直线，所得直线的截距是1/Vm，斜率为Km/ Vm。通过Lineweaver-Burk作图法作图后可方便的求出Km值。 三实验材料、仪器和试剂 1．实验材料 淀粉酶购自国药集团医药有限公司。精确称取酶制剂0.1g(以大约2000 U／g 计)，先用少量40℃蒸馏水溶解、浸提。将上层液小心倾入500ml容量瓶内，沉淀再加水捣研。如此重复，最后全部移入容量瓶中，定容后摇匀，用四层纱布过滤，滤液供测试定用。 2．仪器 比色管，试管25 mm×200 mm，平头移液管(可用磨去尖头的2mL移液管制)；刻度吸管5mI—(X1)，移液管20 mI；秒表，吸耳球(×1)，电热恒温水浴锅，721型分光光度计。 3．试剂 (1)原碘浓称取碘11 g，碘化钾(KI)22 g，先用少量蒸馏水使碘—碘化钾完全溶解，定容至500 mL，贮于棕色瓶内。 (2)稀碘液取原碘液2mL，加碘化钾20 g，用蒸馏水定容至500 mL．贮于棕色瓶内。 (3)4％可溶性淀粉精确称取可溶性淀粉4.000g（精确至0.001g），用少量蒸馏水调匀。边搅拌边加入煮水70mL，加热煮沸至透明，冷却后定容至100 mL, 此溶液现配现用。
实验七 淀粉酶动力学分析
实验七 淀粉酶动力学分析（Ⅱ） ——淀粉酶解米氏常数测定与阿卡波糖竞争性抑制动力学计算（4学时） 第四部分 α-淀粉酶K m 值的测定 一、实验目的 了解并掌握米氏常数的意义和测定方法。 二、实验原理 当底物浓度在较低浓度增加时，酶促反应速度随着底物浓度的增加而迅速增加。当底物增至一定浓度后，即使再增加其浓度，反应速度也不会增加很快。这是由于酶浓度限制了所形成的中间络合物浓度的缘故。 Michaelis 和Menten 推导得出底物浓度和酶促反应速度的关系式为： ] [] [max S K S V m += υ 此式称为米氏方程，式中：υ为反应速度，即每升反应体系中每分钟形成葡萄糖的摩尔数（mol/（L·min ））；m a x V 为最大反应速度（mol/（L·min ））；][S 为底物浓度，此实验以反应体中淀粉中葡萄糖残基的摩尔浓度表示（mol/L ），注意！应以反应体系总体积计算底物浓度，如淀粉溶液浓度为1%，反应体系中有3 mL 淀粉溶液和1 mL 淀粉酶液，则淀粉底物浓度应为： []=+?=1 33 16210S 0.0463 mol/L 10——1%的淀粉溶液浓度为10 g/L 180——淀粉中的葡萄糖残基的分子量 3——反应体系中1%淀粉溶液的体积（mL ） 1——反应体系中α-淀粉酶的体积（mL ） m K 为米氏常数，单位与底物浓度相同（mol/L ） 。 按此方程，可用作图法求出m K ，常用的方法为双倒数作图法。 取米氏方程的倒数，以 υ1对] [1S 作图：
max max 1 ][11 V S V K m + = υ 得一直线，其斜率为max V K m ，截距为max 1 V ，求出m K 。 三、实验器材与试剂 实验器材 1-16. 见实验七第一部分 17. 化学试剂：见实验七第二部分 实验试剂 1. pH5.0的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液 2. 1%淀粉溶液：称取1 g 可溶性淀粉的200 mL 烧杯中，用5 mL pH5.0的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液调成糊状。另取200 mL 烧杯，盛入95 mL pH5.0的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液，于电炉上烧开，倒入60 mL 于盛有淀粉糊的烧杯中，搅拌均匀，继续煮开并搅拌至透明状，冷却后移至100 mL 容量瓶中，用剩余缓冲液荡洗烧杯，倒入容量瓶中，最后用蒸馏水定容至刻度（老师准备）。 3. α-淀粉酶：将活性为2000 u/mL 的中温α－淀粉酶原酶液，用pH5.0的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液稀释4000倍（老师准备，现用现配）。 4. DNS 试剂：见实验七第一部分（老师准备) 四、实验方法 取13支干燥的18×180 mm 试管，按下表编号，实验组做两份平行实验，加入pH5.0的淀粉溶液和α-淀粉酶溶液，50℃反应10分钟，稀释一定倍数（约5倍，取1 mL 反应液，加4 mL 蒸馏水，混匀），取1 mL 稀释液加DNS 试剂，于沸水浴中加热2 min 进行显色，取出后在盛有冷水的500 mL 烧杯中冷却（注意换冷水），各加入蒸馏水9.0 mL ，摇匀，以空白管为调零点，在540 nm 波长测定吸光度值，从标准曲线查出葡萄糖的含量，算出酶反应速度υ（mol/（L·min ））。