不同无机氮源对东海原甲藻生长的影响

不同无机氮源对东海原甲藻生长的影响

欧美珊，吕颂辉*（暨南大学水生生物研究中心，广州 510632）

【摘要】在实验室条件下，研究了不同浓度、不同形态的氮（NaNO3、NH4Cl 和NaNO2）对东海原甲藻（Prorocentrum donghaiense）生长的影响。结果表明：在NH4Cl浓度为5.20 μmol·L-1（N/P为8）时藻的比生长率最高，而N/P为32和100时，藻的生长明显受到抑制。在NaNO3为氮源时，最适N/P为12（氮浓度为7.80 μmol·L-1）。而NaNO2作氮源，N/P为16（10.40 μmol·L-1）时藻的比生长率最高，N/P为32和100时藻的生长也明显受到抑制。研究显示，东海原甲藻对无机氮NH4Cl和NaNO3和NaNO2都可以利用，最适生长的N/P比范围在8～20之间，相对高的N/P（32、100）不利于东海原甲藻的生长。

关键词：东海原甲藻；氯化铵；硝酸钠；亚硝酸钠；比生长率

中图分类号：Q949.2 文献标识码：A 文章编号：1008-8873(2006)01-028-04 Effects of different inorganic nitrogen sources on the growth of Prorocentrum donghaiense

OU Mei-shan, LU Song-hui*(Institute of Hydrobiology, Jinan University Guangzhou 510632, China)

Abstract The effects of three nitrogen sources (NaNO3、NH4Cl and NaNO2) and different N/P ratios on the growth of Prorocentrum donghaiense were investigated. Results showed that all three nitrogen sources can be utilized by P. donghaiense.

The optimum N/P ratio of P. donghaiense was 8 when NH4Cl was the nitrogen source, and the growth was limited when N/P ratio was over 20. The optimum N/P ratio for NaNO3 was 12, and the figure for NaNO2 was 16. The results revealed that the optimum N/P ratio for all three N sources was between 8～20, and relatively higher N/P ratio (32 and 100) would limit the growth of the algae.

Key words: Prorocentrum donghaiense; NaNO3; NH4Cl; NaNO2; Growth rate

近年来，我国沿海赤潮发生次数逐年增加，2000年记录的赤潮达28次，2001年为77次，2002年达79次。东海是中国近海富营养化最严重的海区之一，成为中国赤潮发生最多的海区，2002年赤潮发生次数达55次，占全国的70%。除了赤潮发生次数增加外，近年来形成赤潮的生物种类也有所变化，东海原甲藻成为该海区的主要肇事种[1]。

东海原甲藻主要分布在东海长江口与浙江沿岸水域，在我国广东和香港海域有出现的记录[2]。近年来在长江口与浙江北部沿岸水域春季常常形成数百至数千平方公里的特大规模赤潮[3]。2000年5月中下旬，发生在浙江舟山渔场海域岱山岛至中街山列岛之间的原甲藻赤潮面积达5 800 km2。2002年5月，发生在浙江舟山附近海域的原甲藻赤潮面积亦达到1 500 km2，持续达1个月[4]，赤潮时最大细胞密度记录达3.6×108·L-1。这些大规模的赤潮对海洋生态系统带来较严重的危害，引起了赤潮研究者的广泛关注。

一般认为海域的富营养化是赤潮发生的物质基础，但也有数据显示[5]，赤潮不一定发生在营养高值区，它还与其他理化因子如温度、水体透光度等有密切联系。为进一步了解东海原甲藻的营养生理特点与繁殖规律，提高对原甲藻赤潮发生机制的了解和爆发规律的认识，本文对东海原甲藻的无机氮营养生理进行了研究。

1 材料和方法

1.1材料

1.1.1藻种实验用东海原甲藻（Prorocentrum donghaiense）分离自东海赤潮高发区，保存于暨南大学藻种室，实验前将处于对数生长期的实验藻种离心，饥饿培养两天再接种。

1.1.2培养基 f/2培养基（N、P浓度按实验要求另加）。

N源分别为：NH4+-N（氯化铵）、NO3- -N（硝酸钠）、NO2- -N（亚硝酸钠）。

P源为：NaH2PO4·2H2O。

1.2方法

配制人工海水，在人工海水（AW）中加入除N、P之外的所有f/2培养基的其他成分，然后根据东海赤潮高发区磷浓度的平均值，设置P(NaH2PO4·2H2O) 浓度为0.65 μmol·L-1；各N源浓度按设定浓度添加。每个实验设计的N/P均为：0（对照组）、1、8、12、

生态科学 2006年2月第25卷第1期 ECOLOGIC SCIENCE Feb., 2006, 25(1):28～31

图1

不同N/P （NH 4+

-N ）下东海原甲藻的生长曲线 Fig 1 Growth of P . donghaiense at different NH 4+-N levels

图2 不同N/P （NH 4-N ）下东海原甲藻的最大比生长率 Fig 2 Specific growth rate (μ) of P . donghaiense at different NH 4+-N levels

16、20、32、100；三种氮源的浓度都是0、0.65、5.20、7.80、10.40、13.00、20.80、65.00 μmol ·L -1。每个实验都分为8个浓度梯度。

接种少量对数生长期的藻细胞（细胞初始浓度在500 cell ·mL -1左右）培养于三种N 源的不同N 浓度的培养基中，每种浓度平行培养两瓶（每个100 mL 的三角瓶中都盛50 mL 相应培养基）。

将接种了的藻液置于温度为20±1℃、光强为4000 LX 、光暗周期Ｌ/Ｄ为12∶12的光照培养箱中培养。 1.3生长曲线的测定

从接种第二天起，每隔1天同一时间取样，用浮游植物计数框(0.1 mL)于显微镜下计算藻细胞数，每个样品取样两到三次，取其平均值。

通过对数生长期藻细胞数的变化用公式：μ= (lnX t -lnX 0)/t 计算比生长速率，X 0表示初始细胞密度，X t 表示ｔ天后细胞密度。

2 结 果

2.1 NH 4+-N 对东海原甲藻生长的影响

不同 NH 4Cl 浓度下东海原甲藻的生长曲线如 图1，其最大比生长率见图2。不同NH 4Cl 浓度下，

东海原甲藻的生长随时间的变化曲线基本呈现出“S ”形，在接种后数天藻细胞生长缓慢，第六天进入对数生长期。高浓度条件下，藻细胞生长受到抑制，而稳定期N/P 为12时生物量最高，而且稳定期生物量较平稳，只出现轻微的下降。由图2可知，NH 4Cl 浓度为5.20 μmol ·L -1（N/P 为8）时藻的最大比生长率最高，达0.499 d -1 ，表明该N/P 下的NH 4Cl 浓度最适合藻细胞的生长，而N/P 在12和16时，藻的最大比生长率分别为0.464和0.447 d -1，也适合该藻的生长，在超过最适合NH 4Cl 浓度水平时，随着N/P 的升高，比生长率降低。由此可见：NH 4Cl 为氮源时，N/P 为8～16都适合东海原甲藻的生长。 2.2 NO 2- -N 对东海原甲藻生长的影响

不同NaNO 2浓度下东海原甲藻的生长曲线如 图3，其最大比生长率见图4。图3显示，以NaNO 2为氮源，各浓度组在接种后第四天进入对数生长期，到达生物量最高时，维持4～6 d 后生物量微降。如 图4所示，NaNO 2浓度为10.40 μmol ·L -1（N/P 为16）时东海原甲藻有最大比生长率（0.455·d -1），而N/P 为8和12时的最大比生长率与N/P 为16时很接近，为0.447·d -1，这三个浓度组的最大比生长率比其它浓度组的高，表明该N/P 下的NaNO 2浓度适合藻细胞的生长。由此可见：NaNO 2为氮源下，N/P 为8～16最适合东海原甲藻的生长。

2.3 NO 3- -N 对东海原甲藻生长的影响

不同NaNO 3浓度下东海原甲藻的生长曲线如图5，其最大比生长率见图6。由图5可见，不同NaNO 3浓度下，东海原甲藻的生长随时间的变化曲线也基本呈现出“S ”形，在接种后第5 d 进入对数生长期，稳定期N/P 为16时生物量最高，而且稳定期生物量较稳定。图6显示，NaNO 3浓度为7.80 μmol ·L -1（N/P 为12）时东海原甲藻的最大比生长率最高，达0.482 d -1，表明该N/P 下的NaNO 3浓度最适合藻细胞的生长。实验的两个浓度组（N/P=1、8），随着N/P 的增高，藻的最大比生长率相差不大，而N/P 分别为16、20的浓度组的最大生长率与N/P 为12时相差不远，均在0.45 d -1之上，但随着N/P 的增大，出现抑制现象生长率变低。由此可见：在以NaNO 3为氮源的条件下，N/P 在12～20之间都适合东海原甲藻的生长，最适的N/P 是12。

3 讨 论

海洋中的浮游植物是按一定比例自海水中吸收氮和磷的，这一恒定比例称为Redfield 系数（N/P=16）。海水中营养盐摩尔比值偏离Redfield 系数过高或过

1期 欧美珊，等：不同无机氮源对东海原甲藻生长的影响 29

图3 不同N/P

（NO 2-

-N ）下东海原甲藻的生长曲线

Fig 3 Growth of P . donghaiense at different NO 2- -N levels

图4 不同N/P （NO 2-

-N ）下东海原甲藻的最大比生长率

Fig.4 Specific growth rate (μ) of P . donghaiense at different NO 2- -N levels

低，均可导致浮游植物的生长受到某一相对低含量元素的限制[6, 7]。在海洋中氮往往成为初级生产力的限制因子[8]。N/P 比值表明赤潮发生过程中水体的营养状况，是藻类受 P 或 N 限制的重要指标。高 N/P 比意味着 P 限制，低 N/P 比意味着 N 限制，N 与 P 的比值不仅可影响环境中浮游植物的种群结构，也决定了特定海区赤潮发生的限制因子。Hodgkiss [9]等指出，营养盐比率如氮磷比值是赤潮事件更重要的调控因素，并认为大部分甲藻赤潮生物生长的最适 N/P 为 6～15，并且指出东海原甲藻生长最适N/P 为6～13/1。

一般认为[10~12]藻类最优先利用铵盐，然后是硝酸盐和亚硝酸盐。NH 4-N 是藻类优先利用的N 源，因为这种形态的N 可直接被利用，蒋汉明[12]认为随着NH 4+-N 被利用，培养液的pH 值逐渐下降，以至于抑制藻的生长，因而高浓度的铵盐会抑制藻的生长。其他无机形态的N （如NO 3-、NO 2-）都是间接被利用的。有研究[11, 12]指出NH 4-N 在被同化为氨基酸时并不需要被降解，而NO 3--N 却需要先被还原才能被利用。本试验的结果与此一致：在铵盐为氮源时，东海原甲藻的最大比生长率为0.499 d -1，硝酸盐为氮源时，最

大比生长率为0.482 d -1，而亚硝酸盐做氮源时，则为0.455 d -1 。

海洋原甲藻可以累积蛋白质和碳水化合物[13]，当外界氮源不能满足生长需要时，细胞内储存的蛋白质可用于维持指数生长。王金辉等[14]也从围隔实验中推测东海原甲藻也存在类似机制，当外界环境中营养盐浓度较高时能迅速吸收并转化成有机物储存，在环境中营养盐浓度较低时可以动用细胞内的有机储存维持细胞的生长。本试验的对照组也存在一定的生长速度，说明这一生长速度可能是靠消耗藻细胞内储存的蛋白质作为氮源而维持的，关于东海原甲藻对有机氮的吸收和利用研究，将有另文介绍。

本研究初步得出了三种不同无机氮源对东海原甲藻生长的影响，及其不同N/P 下藻的生长情况。从本实验的结果可以看出，实验的几种无机氮源（铵盐、硝酸盐和亚硝酸盐）东海原甲藻均能利用，各种氮源下最适合东海原甲藻生长的N/P 分别为：NH 4Cl ，8；NaNO 2，16；NaNO 3，12。而且东海原甲藻对各种氮源的利用范围不尽相同：铵盐N/P 为8～16，硝酸盐N/P 为12～20，而亚硝酸盐N/P 为8～16，表明东海原甲藻对无机盐利用的范围较广。高氮的条件N/P(32、100时）显然对东海原甲藻的生长是不利的，不但使细胞分裂缓慢，而且生物量低。实验的结果还显示出三个实验组的最大细胞密度有所差异，其中的氨氮实验组和亚硝态氮实验组是同步实验，氨氮实验组的最大细胞密度比亚硝态氮实验组要高，显示出氨氮比亚硝态氮更能促进东海原甲藻的生长。由于硝态氮没有能同步实验，鉴于可能存在两批藻种生长状态以及接种的初始密度有轻微的差别，从而影响到该组实验与氨氮和亚硝态氮实验组的可比性。

东海近海海域富营养化面积已居中国四大海区之首，并成为我国比较典型的赤潮高发区。例如，2001年全国四大海区共发现赤潮77次，其中东海就达 34次[15] 。但是赤潮不一定只发生在长江口附近的营养盐高值区，而通常发生在溶解无机和有机态营养盐浓度居于中等水平的咸淡水混合区域。如2002年5月份的大规模赤潮发生区内表层DIN/PO 43—P 比值约为35～65 [15]，远远小于长江口附近的90。本实验结果显示出三种无机氮最适合东海原甲藻生长的N/P 为8～20，也属于中等的营养水平，但比实际发生赤潮时的N/P 要低。但是，值得指出的是本实验研究的是单种形式的无机氮对东海原甲藻的作用，而现实过程中是多种形式的氮共同作用的结果，要清楚了解东海原甲藻赤潮与营养盐之间的关系，还需要进一步的研究。

30 生 态 科 学 25 卷

图5 不同N/P （NO 3-

-N ）下东海原甲藻的生长曲线

Fig.5 Growth of P . donghaiense at different NO 3- -N levels

图6 不同N/P （NO 3-N ）下东海原甲藻的最大比生长率

Fig.6 Specific growth rate (μ) of P . donghaiense at different NO 3- -N levels

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