污泥中产PHB菌群筛选与分离

污泥中产PHB菌群的筛选与分离

[摘要] 聚β-羟基丁酸酯（phb）作为环境友好型塑料，具有完全生物可降解性。活性污泥可用于积累phb，但由于其系统内菌群结构较复杂，且累积phb的含量较低，因此从污泥中分离出高产phb单菌落，有利于提高phb的产量。本文利用耐尔蓝染色剂对污泥中高产phb的菌群进行筛选和分离，并通过培养基优化分析了筛得菌株累积phb的情况。结果表明：经过培养基优化，phb最高含量可占菌体干重的51.67%。

[关键词] phb 活性污泥筛选分离

1、前言

phb不但是一种热塑性高分子材料，更是一种生物可降解材料，有望部分替代化学合成塑料消除“白色污染”，它所具有的良好性能使得它在医药领域、组织工程、压电制品等方面有广阔的应用前景[1]。

目前，对于生物合成phb的研究主要集中在活性污泥驯化及phb 提取工艺，对于生物合成phb过程中微生物种群变化的研究则较少，而在实际生产过程中，微生物种群的变化对于合成过程的工艺优化可以起到很重要的帮助作用[2-4]。

因此，本文旨在通过对利用活性污泥生产phb系统中的微生物群落结构进行分析，进而发现在生产过程中微生物群落变化的规律和特性，以期辅助改进和优化活性污泥生产phb 的工艺，从而提高phb的产率。

厌氧培养方法

厌氧性细菌的分离培养法 厌氧菌需有较低的氧化—还原势能才能生长 (例如破伤风梭状芽孢杆菌需氧化—还原电势降低 至 0.11V 时才开始生长 )，在有氧的环境下，培养基的氧化—还原电势较高，不适于厌 氧菌的生长。为使培养基降低势，降低培养环境的氧压是十分必要的。现有的厌氧培养法甚多，主要有生物学，化学和物理学 3 种方法，可根据各实验室的具体情况而选用。 1．生物学方法 培养基中含有植物组织 (如马铃薯、燕麦、发芽谷物等 )或动物组织 (新鲜无菌的小片组织或 加热杀菌的肌肉、心、脑等 ) ，由于组织的呼吸作用或组织中的可氧化物质氧化而消耗氧 气(如肌肉或脑组织中不饱和脂肪酸的氧化能消耗氧气，碎肉培养基的应用，就是根据这 个原理 )，组织中所含的还原性化合物如谷胱甘肽也可以使氧化—还原电势下降。 另外，将厌氧菌与需氧菌共同培养在一个平皿内，利用需氧菌的生长将氧消耗后，使 厌氧菌能生长。其方法是将培养皿的一半接种吸收氧气能力强的需氧菌(如枯草杆菌 )，另一半接种厌氧菌，接种后将平皿倒扣在一块玻璃板上，并用石蜡密封，置37恒温箱中培养2~3d 后，即可观察到需氧菌和厌氧菌均先后生长。 2．化学方法 利用还原作用强的化学物质，将环境或培养基内的氧气吸收，或用还原氧化型物质，降低氧化—还原电势。 此法系用连二亚硫酸纳 (Sodium hydrosulphite) 和碳酸钠以吸收空气中的氧气，其反应式如 下： Na2S204 十Na2C03十O2 一→ Na2SO4十Na2SO3 十C02 取一有盖的玻璃罐，罐底垫一薄层棉花，将接种好的平皿重叠正放于罐内 (如系液体培养基，则 直立于罐内 )，最上端保留可容纳 1~2 个平皿的空间 (视玻罐的体积而定 )，按玻罐的体积每 1000cm3 空间用连二亚硫酸纳及碳酸钠各 30g，在纸上混匀后，盛于上面的空平皿中，加水少许使 混合物潮湿，但不可过湿，以免罐内水分过多。若用无盖玻罐，则可将平皿重叠正放在浅底容器上，以无盖玻罐罩于皿上，罐口周围用胶泥或水银封闭 (如图１－５ )。 （２）焦性没食子酸法 焦性没食子酸在碱性溶液中能吸收大重氧气，同时由淡棕变为深棕色的焦性没食橙(Purpurgallin) 。每 l00cm3 空间用焦性没食子酸1g 及 10％氢氧化纳或氢氧化钾l0ml ，其具体方法主要有下列几种： 1）单个培养皿法： 将厌氧菌接种于血琼脂平板。取方形玻璃板一块，中央置纱布或棉花或重叠滤纸一片，在 其上放焦性没食子酸 0.2g 及 10％ NaOH 溶液 0.5mL 。迅速拿去皿盖，将培养皿倒置于其上，周围 以融化石蜡或胶泥密封。将此玻璃板连同培养皿放人 37C 温箱培养 24~48h 后，取出观察。 2） Buchner 氏试管法： 取一大试管，在管底放焦性没食子酸0.5g 及玻璃珠数个或放一螺旋状铅丝。将已接种的培养管 放人大试管中，迅速加入 20％ NaOH 溶液 0.5ml，立即将管口用橡皮塞塞紧，必要时周围封以石 蜡， 37 培养 24~48h 后观察 (图１－６ )。 ３）玻罐或干燥器法： 置适量焦性没食子酸于一干燥器或玻罐的隔板下面，将培养皿或试管置于隔板上，并在玻 罐内置美蓝指示剂一管，从罐侧加入氢氧化钠溶液放于罐底，将焦性没食子酸用纸或纱布包好， 用线系住，暂勿与氢氧化钠接触，待一切准备好后．将线放下，使焦性没食子酸落人氢

醋酸菌的分离鉴定和发酵条件研究

第2章醋酸菌的分离鉴定和发酵条件研究 2.1引言 醋酸菌包括醋酸杆菌属和醋酸单胞菌属[30]，又名醋酸细菌。醋酸菌的细胞一般为杆状、直或者稍弯，也有少部分像椭圆形，由单个、成对或者成链状排列的，大小一般在0.6～0.8×1.0～3.0 μm。醋酸菌没有芽胞是革兰氏阴性菌，它有的细胞是周生鞭毛种类，一般在液面上生长会形成较厚的菌膜。黑色醋酸杆菌等为另一些种类的醋酸菌细胞是端生鞭毛。醋酸菌的分布广泛，在未灭菌的醋、啤酒、黄酒中果酒，以及在果园的土壤中、葡萄或酸败食物表面中都有生长[31]。醋酸菌是酿醋过程中不可缺少的。醋酸菌在发酵过程中，会产生大量的醋酸和其他有机酸，而且还有醇类[32]。 本章节研究醋酸菌的分离鉴定和发酵条件，通过平板分离、革兰氏染色、产醋酸实验，并经生理生化鉴定和查阅伯杰氏手册，做出进一步鉴定。 2.2实验材料与方法 2.2.1材料与仪器 分离样品：取自湖北某果醋厂发酵的醋醅。 试验主要仪器设备型号及产地如表2.2.1.a。 表2.2.1.a主要仪器设备 Tab 2.2.1.a Main instrument equipment 主要仪器型号厂家 生化培养箱 双目生物显微镜 分析天平 手提式不锈钢蒸汽灭菌锅 超净工作台 精密数字式酸度计 PYX-250S-A BME（BA/E3） BS224S DSX-280B SW-CJ-1FD pHS-3C 长沙科技 科力仪器 德国莱卡 北京化丰 上海南鹏 上海科技

试验试剂：葡萄糖、酵母膏、甘油、无水乙醇(95%)、CaCO3、(NH4)2SO4、K2HPO4、KH2PO4、MgSO4·7H2O、FeCl3、乙酸钙、乳酸钙、浓硫酸均为分析纯；琼脂食用级。 2.2.2培养基[33-37] 表2.2.1.ｂ培养基成分表 Tab 2.2.1.ｂMedium composition 名称葡萄 糖 酵母 膏 无水乙醇 (v/v) 琼 脂 CaCO3备注 ⑴基础发酵培养基1%1%3%pH 4. 5 ⑵分离培养1%1%3%2%2%pH自然 ⑶斜面保藏培养基1%1%3%2%1%pH自然 ⑷液体保藏培养基1%1%1%pH自然 ⑸改进后的斜面液体 保藏培养基 1%1%3%2%1%pH自然 ⑹发酵培养基1%1%7%pH 4. 5 ⑺Horyer-Frateur培养 基 3%pH自然 ⑻GYC培养基10%5%2% 2. 5%pH自然 ⑼高糖培养基30%1%2%2%pH自然⑽生酮培养基3%2%甘油3% ⑾产5-酮基葡萄糖酸 盐培养基 3%1%2%2%pH自然 ⑿氧化乙酸培养基1% 1% 2% 乙酸钙1% pH 7.2 ⒀氧化乳酸培养基1% 1% 2% 乳酸钙2% pH7.0-7.2 ⒁乙醇培养基1% 3% 2% pH自然注：培养基⑸在斜面保藏培养基⑵上，30℃培养24 h，加入无菌碳酸钙，灌入并液体培养基到斜面上，至离管口2cm处，密封冷藏；培养基⑺其他成分有(NH4)2SO40.1%，K2HPO40.1%，KH2PO40. 01%，0.025%，FeCl30. 0005%；以上培养基均以121℃灭菌20 min。 2.2.3醋酸菌的分离纯化 2.2. 3.1分离纯化实验 称取醋醅样品5g，液态增殖培养48h后，按照浓度梯度10-6、10-7和10-8，

益生菌的筛选及安全性研究进展.

cacy of MS -222and benzocaine as anaesthetics under simulated transport conditions of a tropical ornamental fish Puntius filamento －sus (Valenciennes [J].Aquaculture research, 2010,41(2:309-314 [17]刘长琳, 何力, 陈四清, 等. 鱼类麻醉研究综述[J].渔业现代化, 2007,34(5:21-25 [18]Kiessling A,Johansson D,Zahl I H, et al. Pharmacokinetics,plasma cortisol and effectiveness of benzocaine,MS -222and isoeugenol measured in individual dorsal aorta -cannulated Atlantic salmon (Salmo salar following bath administration[J].Aquaculture,2009, 286(3/4:301-308 [19]Tang S,Thorarensen H,Brauner C J,et al. Modeling the accumulation of CO 2during high density,re-circulating transport of adult Atlantic salmon,Salmo salar,from observations aboard a sea -going commer －cial live-haul vessel[J].Aquaculture,2009,296(1/2:288-292[20]Velisek J,Svobodova Z,Piackova V. Effects of clove oil anaesthesia on Rainbow Trout (Oncorhynchus mykiss[J].Acta Veterinaria Brno, 2005(74:139-146 [21]Park M O,Im S Y,Seol D W,et al. Efficacy and physiological re － sponses of rock bream, Oplegnathus fasciatus to anesthetization with clove oil[J].Aquaculture, 2009,287(3/4:427-430 [22]Iversen M,Eliassen R A. The Effect of AQUI -S -(R Sedation on

土壤中芽孢杆菌的分离与筛选

实验十、土壤中芽孢杆菌的分离与筛选 ——培养基配制及样品采集 一、实验目的 学习和掌握菌种选育技术中从自然界中采样的技术，掌握芽孢杆菌筛选的特异性培养基配制方法。 二、实验原理 自然界含菌样品极其丰富，土壤、水、空气、枯枝烂叶、植物病株、烂水果等都含有众多微生物，种类数量十分可观。但总体来讲土壤样品的含菌量最多，土壤由于具备了微生物所需的营养、空气和水分，是微生物最集中的地方。从土壤中几乎可以分离到任何所需的菌株，空气、水中的微生物也都来源于土壤，所以土壤样品往往是首选的采集目标。但各种微生物由于生理特性不同，在土壤中的分布也随着地理条件、养分、水分、土质、季节而有很大的变化。因此，在分离菌株前要根据分离筛选的目的，到相应的环境和地区去采集样品。 三实验材料 1. 采样器具：灭菌的牛皮纸袋、小铲刀（或不锈钢勺）、温度计、pH试纸、 记号笔等。 2. 筛选培养基：肉汤琼脂培养基 四、操作步骤 1. 采样： 用取样铲，将表层5cm左右的浮土除去，取5～25cm处的土样10～25g，装入事先准备好的塑料袋内扎好，或事先灭菌处理的牛皮纸袋、玻璃器皿内。北方的干燥土壤，可在10～30cm处取样。给牛皮纸袋编号并记录地点、土壤质地、植被名称、时间及其他环境条件。一般样品取回后应马上分离，以免微生物死亡。 （注意：一般耕作土、菜园土和近郊土壤中有机质含量丰富，营养充足，且土壤成团粒结构，通气饱水性能好，因而，微生物生长旺盛，数量多，尤其适合于细菌、放线菌生长。山坡上的森林土，植被厚，枯枝落叶多，有机质丰富，且阴暗潮湿，适合霉菌、酵母菌生长繁殖，微生物数量相应也比较少。 从土层的纵剖面看，1～5cm的表层土由于阳光照射，蒸发量大，水分少，

乳酸菌菌种的分离筛选方法

乳酸菌菌种的分离筛选方法乳酸细菌是一类能利用发酵糖产生大量乳酸的细菌通称。为兼性厌氧菌，杆状或球状，革兰氏阳性菌，无芽孢，不运动。营养要求高，需要提供丰富的肽类氨基酸维生素。在琼脂表面或内层形成较小的白色或淡黄色的菌落。 通常用作为有益微生物的菌种有乳酸乳杆菌、干酪乳杆菌、植物乳杆菌、嗜酸乳杆菌、粪肠球菌、乳酸片球菌、双歧杆菌、屎肠球菌、戊糖片球菌等。 乳杆菌常用MRS琼脂作半选择培养基。当乳杆菌仅是复杂区系中的部分菌类 时，SL培养基常用作为选择性培养基。对于芽孢乳杆菌常用GYP培养基，链球菌有TYC培养基、MS培养基。M17培养基被用作乳球菌的分离培养基。 嗜酸乳杆菌属于乳杆菌属的一个种。其特性为：杆菌，两端圆，不运动，无 鞭毛。粪肠球菌为革兰氏阳性，圆形或椭圆形。 乳酸片球菌细胞呈球状，直径0.6~1.0μm，在直角两个平面交替形成四联状，一般细胞成对生，单生者罕见，不成链状排列。革兰氏阳性，不运动，兼性厌氧。在MRS培养基上菌落小，呈白色。沿洋菜穿刺线的生长物呈丝状。 乳酸菌在一般琼脂培养基上形成微小菌落，不易观察，所以分离时先富集培养并选择合适的培养基。分离培养基一般添加西红柿、酵母膏、吐温-80等物质，也常常加入醋酸盐，因醋酸盐能抑制部分细菌生长，对乳酸菌无害。 培养基中添加碳酸钙，乳酸溶解培养基中的碳酸钙形成透明圈，作为分离鉴别的依据，通过对生成的乳酸量进行性能鉴定。 乳酸菌生长繁殖时需要多种氨基酸，维生素及微氧，一般菌落比较小。分离培养基一般可添加西红柿酵母膏油酸吐温等物质，均具有促进生长作用。也常常添加醋酸盐抑制有些细菌的生长，对乳酸菌无害。 一.筛选方法： 1.溶钙圈法： 利用一些产酸类细菌在含CaCO3的培养基上产生CaCO3溶解圈，从而筛选出这些产酸类细菌，可用于乳酸菌的筛选。 其中培养基中加入CaCO3的作用是：①鉴别能产生酸的细菌；②中和产生的酸，以维持培养基的PH。 筛选过程：样品预处理→梯度稀释至10-6→选择合适的稀释度涂布→37℃培养

产淀粉酶的芽孢杆菌的分离和筛选(1)

从土壤中分离和筛选产淀粉酶活性的芽孢杆菌及部分鉴定 试验 一、实验目的 1、通过本实验的学习，学习掌握从环境中分离产淀粉酶菌株以及菌株初步鉴定的方法； 2、巩固微生物分离纯化、细菌生理生化鉴定,对所学习过的微生物学实验方法进行综合技能训练； 3、培养综合利用微生物学、生物化学等相关知识，自行设计、实施并判断实验结果的能力。 4、根据所学知识自主设计实验方案，在实验方案通过审核后组织实施，最终要求获得产淀粉酶的菌株。 二、实验原理 1、土壤中含有各种微生物，其中产淀粉酶的芽孢杆菌含量在不同土壤中含量也不同，因此实验前进行预埋工作，能使土壤中产淀粉酶的细菌含量增加。待实验前取样即可。 2、在只用淀粉充当碳源的选择培养基中，只有能产生淀粉酶利用淀粉的菌体能成为优势菌种。在淀粉选择培养基中，产淀粉酶的菌种可以得到富集及分离。 3、芽孢是菌体生长到一定阶段形成的一种抗逆性很强的休眠体结构，芽孢最主要的特点就是抗性强，对高温、紫外线、干燥、电离辐射和很多有毒的化学物质都有很强的抗性。它帮助菌体度过不良环境，在适宜的条件下可以重新转变成为营养态细胞。细菌富集一段时间后，生长环境不利，会产生芽孢，再在80-90℃温度下杀死菌体，可使芽孢得到富集。 4、芽孢杆菌属的共同特征是：革兰氏阳性；接触酶阳性；水解淀粉；VP试验阳性；不产生吲哚；苯甲氨酸不脱氨；分解酪素；不分解酪氨酸；不产生二羟丙酮；营养体的最高生长温度大约从25℃到75℃以上；最低生长温度大约5℃到45℃；生长最低pH值，从—8到2左右；耐盐范围从低于2%的NaCl到25%NaCl；营养

明胶（22℃）7天内液化1厘米或1厘米以上。枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌在糖发酵试验用阿拉伯糖，木糖和甘露糖代替葡萄糖可产酸；作为营养生长的最低限培养基是无维生素的，但含有葡萄糖、柠檬酸盐和一个氨态盐作为唯一的碳源和氮源。 5、在含有淀粉的鉴别培养基的平板上，具有产淀粉酶能力的芽孢杆菌，水解淀粉生成小分子糊精和葡萄糖，在淀粉平板上菌落周围出现水解圈，但肉眼不易分辨，滴加碘液，未水解的淀粉呈蓝色，水解圈无色。 二、实验材料 1、土壤样品 实验前三天在距土壤表层5-8厘米左右处填埋馒头，实验前一天用塑料袋在预埋处取样 2、药品 可溶性淀粉、蛋白胨、Nacl、牛肉膏、琼脂粉、碘、碘化钾、磷酸氢二钠、柠檬酸、盐酸 3、试剂： （1）配制稀碘液： 原碘液：称取碘和碘化钾，用少量水使碘完全溶解，定容至500ml，贮存于棕色瓶中。 稀碘液：吸取原碘液，加入碘化钾用水溶解定容至500ml，贮存于棕色瓶中。 （2）可溶性淀粉溶液：称取2.00g可溶性淀粉于烧杯中，用少量水调成浆糊状，边搅拌边缓慢加入70ml沸水中，然后用水冲洗装淀粉的烧杯，洗液倒入其中，搅拌加热至完全透明，冷却定容至100ml。（溶液现配现用） （3）磷酸缓冲液（pH=）：称取45.23g磷酸氢二钠和8.07g柠檬酸，用水溶解并定容到1000ml，用pH计校正后使用

醋酸菌分离及鉴定

醋酸菌分离及鉴定 一、培养基 1、分离培养基（溴甲酚紫显色平板）:葡萄糖1%、酵母膏1%、无 水乙醇3%（体积分数）、0.04%溴甲酚紫5%（体积分数）、琼 脂1.8%、水100 mL，0.1 Mpa 灭菌20 min，无水乙醇在灭菌 后培养基温度降到75 ℃左右时加入。 2 、保藏培养基: 葡萄糖1%、酵母膏0.5%、琼脂2%、丙三醇2.5% （体积分数）、水100 mL，121℃灭菌20 min 备用。 3、液体培养基:葡萄糖1%、酵母膏0.5%、丙三醇2.5%（体积分 数）、水100 mL，调节pH 至6.30，121 ℃灭菌20 min 备用。 二、醋酸菌分离纯化流程 样品→醋酸菌发酵液中富集培养→稀释分离→纯化→斜面试管 保藏→产醋酸定性测试。 三、步骤 1 、菌株分离 取1g 醋醅样品置入无菌试管，装入9 mL 无菌水，振荡均匀后得到10-1 的稀释液，之后10 倍梯度稀释直到10-6 稀释度。取 10-2至10-6 稀释度的样品稀释液分别涂布溴甲酚紫显色平板，每个稀释度涂布2 个平板，每个平板涂布0.2 mL 的样品稀释液，涂布完成后30 ℃倒置培养48 h左右。选取菌落数在30~50 个左右的平板，挑取该平板上的所有单菌落转入斜面保藏培养基中， 30 ℃培养24 h 左右后保存于4 ℃冰箱。

2 、菌株纯化将试管斜面中的菌株平板划线分离后再转接试管斜面， 4℃冰箱保存。 3、菌株归类以上述各菌株划线分离的平板为基准，将形成菌落极 其相似的菌株归为一大类。 4 、菌悬液的制备用接种环挑取新鲜培养的斜面菌株半环，溶于 装有200 μL 无菌超纯水的Eppendorf 管中，于试管振荡器上 混匀后得到菌悬液。 四、鉴定 1、菌株形态特征:镜下细胞呈短杆状,革兰阴性,无芽胞,单个或成 对、成链排列,个体大小为（0.5～0. 7)μm ×(1. 0～1. 5)μm。 2、培养特征:在葡萄糖、酵母膏、乙醇、CaCO3平板培养基上生 长旺盛,菌落圆形、油脂状,表面光滑、凸起,边缘整齐,培养2 d能 产酸,使CaCO3 溶解形成透明圈,继续培养将乙酸氧化分解产生 CO2 和水,菌落周围出现白色透明圈。在斜面培养基上生长良好, 培养2 d后呈油脂状,并产酸。在10% ( v / v)乙醇的培养基上、 Hoyer2Frateur培养液中、30%葡萄糖培养基上均不生长。 五、测试 1、产酸量的测定方法取1 mL 发酵液, 加入10 mL 蒸馏水, 3 滴～ 5 滴0.02 %酚酞酒精溶液, 用标定的0.1 mol/L NaOH 溶液滴定 至浅粉色。由所耗的NaOH 溶液的量来计算样品中的含酸量(以 醋酸计)。 产酸量( %) =( V- V0) ×CNaOH×0.06×100 %

乳酸菌菌种的分离筛选办法

精心整理 乳酸菌菌种的分离筛选方法 乳酸细菌是一类能利用发酵糖产生大量乳酸的细菌通称。为兼性厌氧菌，杆状或球状，革兰氏阳性菌，无芽孢，不运动。营养要求高，需要提供丰富的肽类氨基酸维生素。在琼脂表面或内层形成较小的白色或淡黄色的菌落。 通常用作为有益微生物的菌种有乳酸乳杆菌、干酪乳杆菌、植物乳杆菌、嗜酸乳杆菌、粪肠球菌、乳酸片球菌、双歧杆菌、屎肠球菌、戊糖片球菌等。 时，SL 培养基、MS 对乳酸菌无害。一.筛选方法： 1.溶钙圈法： 利用一些产酸类细菌在含CaCO3的培养基上产生CaCO3溶解圈，从而筛选出这些产酸类细菌，可用于乳酸菌的筛选。 其中培养基中加入CaCO3的作用是：①鉴别能产生酸的细菌；②中和产生的酸，以维持培养基的PH 。 筛选过程：样品预处理→梯度稀释至10-6→选择合适的稀释度涂布→37℃培养48h →挑选产生溶

钙圈的菌落反复在MRS培养基上划线→挑起单菌落染色，经镜检确认为纯种→挑选革兰氏阳性单菌落→试管穿刺4℃冰箱保存。 2.溴甲酚绿指示剂法： 培养基：MRS培养基（含溴甲酚绿酒精溶液） 筛选过程：同上，不同之处是稀释涂布后长出菌落，挑取使溴甲酚绿变色的菌落。 二.菌种的分离筛选 1.培养基： ★1.1麦芽汁碳酸钙培养基：麦芽汁（10BX）1L预先灭菌碳酸钙5-10g/LPH自然（分离用） ★★1.2吐温 ★1.3 酵母膏（分离用） 1.4 1.5 MgSO 4 1.6 ★★1.7 蛋白胨 葡萄糖、琼 脂18.0g 酸钙, 1.8BCP 乳糖5.0g蛋白胨5.0g酵母膏3.0g0.5℅溴甲酚紫10ml自来水1000ml pH6.5-7.0（分离用） 1.9BCG牛乳营养琼脂：脱脂奶粉10g，溶于50ml水中，加入1.6℅溴甲酚绿酒 精溶液0.07ml，0.075Mpa20min。另取琼脂2.0g，溶于50ml水中，加酵母膏 1.0g溶解后调pH6.5-6.8，0.1Mpa20min.趁热在无菌操作下两者混合均匀， 倒平板，37℃培养24h，检查是否有杂菌。

技能点3细菌的分离培养及培养特性观察(精)

技能点3 细菌的分离培养及培养性状的观察 实训目标能对不同的被检材料进行细菌的分离培养，观察细菌的培养特性，并会进一步移植培养。 仪器及材料温箱、病料、实验用菌种、营养琼脂培养基、肉渣汤(疱肉)培养基、接种环、酒精灯、烙刀、镊子、剪子等。 方法与步骤 一、细菌的分离培养 1．平板划线分离法平板划线是通过将被检材料连续划线而获得独立的单个菌落，因而划线愈长，获得单个菌落机会也愈多。具体操作步骤如下： (1)右手持接种环于酒精灯上烧灼灭菌，待冷。 (2)无菌操作取病料若为液体病料，可直接用灭菌的接种环取病料一环；若为固体病料，首先将烙刀在酒精灯上灭菌，并立即用其将病料表面烧烙灭菌，然后用灭菌接种环从烧烙部位插入组织中缓缓转动接种环，取少量组织或液体。 (3)左手持平皿，用拇指、食指及中指将皿盖打开一侧(角度大小以能顺利划线为宜，但以角度小为佳，以免空气中细菌污染培养基)。 (4)将已取被检材料的接种环伸入平皿，并涂于培养基一侧，然后自涂抹处成30～40°角，以腕力在平板表面轻轻地分区划线。 在细菌病诊断或药敏试验时，为了提高效率，常可将皿盖放于酒精灯附近，左手持培养基，使划线的平面与台面垂直且在酒精灯附近，右手持接种环取病料连续划线。 (5)划线完毕，烧灼接种环，将培养皿盖好，用记号笔在培养皿底部注明被检材料及日期，倒置37℃温箱中，培养18～24h观察结果。凡是分离菌应在划线上生长，否则为污染菌。 2．倾注分离法取3支融化后冷至50℃左右的琼脂管，用灭菌的接种环取一环培养物(或被检材料)移至第一管中，随即用掌心搓转均匀，再由第一管取一环至第二管，搓转均匀后，再由第二管取一环至第三管经同样处理后，分别倒入三个灭菌培养皿中，待凝固后，倒置于37℃温箱中培养24h观察结果。(实图6)

痢疾杆菌分离与鉴定培训

痢疾杆菌的分离与鉴定 濮阳市疾病预防控制中心 许银怀 第一节概述 志贺菌属（Shigellae）细菌又称痢疾杆菌，引起人类及灵长类动物细菌性痢疾。 1899年由日本人志贺首先发现。 全球每年感染人次约为1.65亿，死亡110万，发病率、死亡率居感染性腹泻之首位。 发展中国家发病率较高，如阿根廷990.6／10万、印度972.3／10万；发达国家相对较低，如美国6～12／10万、德国2.7／10万、法国0.3／10万；我国上世纪50～80年代发病率在46.37～1018.93／10万之间。 近20年痢疾发病率在法定传染病中由第一位降至第三位，但在卫生状况不良的地区，发病率仍居高不下。 人群对细菌性痢疾普遍易感，各年龄组均可受到感染，5岁以下儿童发病率最高。 据估计，在临床就诊的腹泻病人中的5%～15%是志贺菌引起的，而因腹泻死亡病例中有75%是志贺菌感染造成的。 发展中国家福氏志贺菌最常见，发达国家以宋内志贺菌为主。美国

宋内志贺菌>75%，但在男-男性行为人群仍以福氏志贺菌常见。 鲍氏志贺菌最先在印度发现，除印度次大陆地区较为常见外，其它地区较为少见。 细菌性痢疾发病有明显的季节性，发病高峰为夏秋季，通常在7～9月份。 细菌性痢疾防治仍需探索、研究内容： 细菌性痢疾在不同地区、不同人群的发病强度、分布特征、病原学特点缺乏全面、准确的数据； 缺乏快速、简便的病原学诊断方法，细菌性痢疾漏诊和误诊现象普遍； 志贺菌耐药性谱的不断扩大，细菌性痢疾抗菌治疗难度加大； 洗手、母乳喂养、安全饮水、粪便无害化处理等行之有效的干预措施的落实需要强化； 目前所用痢疾菌苗免疫保护效果仍需进一步评价。 第二节病原学 一、抗原分类 志贺菌属细菌有菌体（O）抗原，某些新分离菌株有表面（K）抗原。 (一) 菌体（O）抗原 1.型特异性抗原：多糖，光滑型菌株主要抗原；分A、B、C、D 4个群及35个抗原型。 2.群特异性抗原：光滑型菌株次要抗原，主要存在于B群，籍此将菌型分

从土壤中分离产淀粉酶的芽孢杆菌实验方案解析

土壤中产淀粉酶芽胞杆菌的筛选及其淀粉酶活力的测定设计性实验方案 一、综述： 淀粉酶是淀粉降解酶。它们广泛存在于微生物、植物和动物体中。它们将淀粉及相关的聚合物分解为带有具体淀粉分解酶特征的产品。淀粉酶广泛存在于动植物和微生物中,是最早用于工业生产并且迄今仍是用途最广、产量最大的酶制剂产品之一。淀粉酶种类繁多,特点各异,可应用于造纸、印染、酿造、果汁和食品加工、医药、洗涤剂、工业副产品及废料的处理、青贮饲料及微生态制剂]等多种领域。在酿造发酵工业如酒精生产、啤酒制造、发酵原料液化及糖化工艺过程中均有重要价值,如添加淀粉酶分布非常广泛，是人们经常研 【】究的一种酶。从纺织工业到废水处理，这些酶都有不同规模的应用1。 常见产淀粉酶的主要为芽孢杆菌属。其中的常见产淀粉酶的芽孢杆菌菌种有：地衣芽 【】【】孢杆菌、枯草芽孢杆菌、蜡样芽孢杆菌和纳豆芽孢杆菌2、凝结芽孢3。由于芽孢杆菌属 是一类好氧或兼性厌氧、产生抗逆性内生抱子的杆状细菌，许多为腐生菌，主要分布于土壤【】和植物体表面及水体中4。所以此次实验从土壤中分离产淀粉酶的芽孢杆菌。 二、实验目的要求 1．了解生物分离提纯的原理和方法技术 2．掌握从土壤中筛选产淀粉酶菌株的原理和方法 3.掌握微生物摇瓶培养方法及淀粉酶活力测定的原理和方法 4.培养学生的综合应用微生物实验方法的能力 5.培养学生自行设计实验流程、综合分析问题解决问题和判断实验结果的能力。 三、实验原理 自然界中，土壤是微生物生活最适宜的环境。土壤具有微生物进行生长繁殖和生命活动中所需的各种条件。 土壤中微生物的数量因土壤类型、季节、土层深度与层次等不同而异。一般地说，在土壤表面，由于日光照射及干燥等因素的影响，微生物不易生存，离地表10 cm～30 cm的 【】土层中菌数最多，随土层加深，菌的数量减少5。 从混杂微生物群体中获得只含有某一种或某一株微生物的过程称为微生物分离与纯化。平板分离法普遍用于微生物的分离与纯化。其基本原理是选择适合与待分离微生物的生长条件，如营养成分、酸碱度、温度和氧等要求，或加入某种抑制剂造成只利于该微生物生长，而抑制其他微生物生长的环境，从而淘汰一些不需要的微生物。

乳酸菌菌种分离筛选方法

乳酸菌菌种的分离筛选方法 乳酸细菌是一类能利用发酵糖产生大量乳酸的细菌通称。为兼性厌氧菌，杆状或球状，革兰氏阳性菌，无芽孢，不运动。营养要求高，需要提供丰富的肽类氨基酸维生素。在琼脂表面或内层形成较小的白色或淡黄色的菌落。 通常用作为有益微生物的菌种有乳酸乳杆菌、干酪乳杆菌、植物乳杆菌、嗜酸乳杆菌、粪肠球菌、乳酸片球菌、双歧杆菌、屎肠球菌、戊糖片球菌等。 乳杆菌常用MRS琼脂作半选择培养基。当乳杆菌仅是复杂区系中的部分菌类 时，SL培养基常用作为选择性培养基。对于芽孢乳杆菌常用GYP培养基，链球菌有TYC培养基、MS培养基。M17培养基被用作乳球菌的分离培养基。 嗜酸乳杆菌属于乳杆菌属的一个种。其特性为：杆菌，两端圆，不运动，无 鞭毛。粪肠球菌为革兰氏阳性，圆形或椭圆形。 乳酸片球菌细胞呈球状，直径0.6~1.0μm，在直角两个平面交替形成四联状， 一般细胞成对生，单生者罕见，不成链状排列。革兰氏阳性，不运动，兼性厌氧。在MRS培养基上菌落小，呈白色。沿洋菜穿刺线的生长物呈丝状。 乳酸菌在一般琼脂培养基上形成微小菌落，不易观察，所以分离时先富集培养并选择合适的培养基。分离培养基一般添加西红柿、酵母膏、吐温-80等物质，也常常加入醋酸盐，因醋酸盐能抑制部分细菌生长，对乳酸菌无害。 培养基中添加碳酸钙，乳酸溶解培养基中的碳酸钙形成透明圈，作为分离鉴别的依据，通过对生成的乳酸量进行性能鉴定。 乳酸菌生长繁殖时需要多种氨基酸，维生素及微氧，一般菌落比较小。分离培养基一般可添加西红柿酵母膏油酸吐温等物质，均具有促进生长作用。也常常 添加醋酸盐抑制有些细菌的生长，对乳酸菌无害。 一.筛选方法： 1.溶钙圈法： 利用一些产酸类细菌在含CaCO3的培养基上产生CaCO3溶解圈，从而筛选出这些产酸类细菌，可用于乳酸菌的筛选。 其中培养基中加入CaCO3的作用是：①鉴别能产生酸的细菌；②中和产生的酸， 以维持培养基的PH。 筛选过程：样品预处理→梯度稀释至10-6→选择合适的稀释度涂布→37℃培养

降低NO和培养厌氧菌的几种方法

降低N O3和培养厌氧菌的几种方法 （注：相关资料来源于网络，仅供参考。如有冒犯作者之处还望告知并谅解。）养虾可以说是淡水水族养殖里的最高境界之一,如果你能养好虾,养别的水族生物应该都不会遇到太多难题,而且养虾需要对整个水体的生态环境都有了解才能养的好. 养虾第一步就是建立硝化系统,其实大家不管用滤筒,滴流过滤还是上过滤水妖精,有足够的滤材够硝化细菌生殖并且有足够的耐心(通常建立好的硝化系统需要1个月左右)等待硝化细菌繁殖,建立硝化系统应该都不是难题. 难的是硝化系统建立以后,虾子每日吃喝拉撒,硝化细菌分解这些有机物剩下的NO3却很难除掉,NO3在自然界中是厌氧菌来分解的,自然界中的厌氧菌是藏在厚厚的河沙和淤泥的底层,因为与氧气隔绝形成厌氧区,厌氧菌就会在这里大量繁殖,分解NO3释放出氮气和氧气,可是厌氧菌在水族箱中很难培养出来,尤其养虾来说,底土铺太厚时间长了容易败坏.如果NO3堆积过多,常见的结果是母虾踢卵,小虾成活率低等 要创造一个绝对的厌氧环境,本人总结下来有几个办法可以实现厌氧菌的培养. 1、每周定期换水,换1/3,可以有效降低NO3,好处是简单,缺点是对于水质比较硬的地区,换水成本太高,需要用RO软水机或者桶装RO水来换. 不换水的方法如下:? 2、买一根50米长的水管,一端接在潜水泵,一端放到虾缸中.让水流经过50米的水管流回虾缸,在这个漫长的过程中,氧气消耗大部分,在水管的后半段就可以培养出厌氧区,厌氧菌就会繁殖,他们就会把NO3分解掉,回到缸子中的水NO3会接近与0.注意问题:如果50米管子过细,时间长了可能会阻塞,管子要用深色的,不能用透明的,因为厌氧菌需要不能见光.入水口管子最好抬高,离水面有5公分以上的距离,以免反硝化作用不彻底产生硫化氢毁掉虾缸（这个方法我没有试过，大家有心的可以试试，曾经有网友发帖说过效果还不错） 3、台湾KU大发明的三串滤筒法： 台湾KU大曾经有发明过一个三串滤筒法,原理是前两个滤筒放满培菌滤材,让硝化细菌大量繁殖,因为硝化细菌进行硝化作用需要消耗氧气,水流流经前两个滤筒到第三个滤筒的时候氧气消耗差不多了,在第三个滤筒营造出厌氧区,用来培养厌氧菌。 好处是：因为滤筒水流速度较快，流到第三个滤筒时仍然速度不减，不会因为脱氮作用不彻底产生硫化氢 不足的地方： 第一、滤筒的容积要足够大,这个足够大是一个很虚的概念,这个要和你的缸子的容积大小匹配,比如说我用三个AT-3338带一个一米的缸子.对于一个60的缸子可能三个3338有点大,但是对于一个1米5的缸子可能3338又不够--这里只是举个例子具体大小要在实际应用中总结， 二、是取决于滤材,如果有足够的空间没有好的滤材也不行,如果滤材不好培菌效果有限也无法在滤筒里产生足够的硝化细菌,我用的是伊罕的石英球和陶瓷环.但是具体滤材要多少,这个KU大也没有给答案,因为大家具体应用的缸的尺寸和环境各异,没有办法统一三,跟虾口的数量有关,这个应该很好理解,虾越多产生的废物越多,硝化作用下来的NO3也就越多. 四,NO3是厌氧菌-脱氮菌在无氧条件下通过脱氮作用将NO3分解成氮气和氧气,但是如果在绝对无氧的环境下,脱氮菌就会开始以硫化物为食产生硫化氢,硫化氢就会毁掉虾缸,三串滤筒的好处是水流速度快到最后一个滤筒也能带去少量氧气和足够的NO3源,所以不至于产生硫化氢,但是不好的地方是你也不知道他具体会带多少氧气进到第三个滤筒,如果带的太多了第三个滤筒仍然是硝化菌的天下,进行的还是硝化作用.第三个滤筒仍然会成为又一个硝化菌的培菌桶.或者是在第三个滤筒里形成的厌氧区域很小,不足以处理大量的NO3.

芽孢杆菌的分离鉴定2

芽孢杆菌的分离与鉴定 实验器材：铲子（1）,盆（1）,电子天平（1），洗耳球(1)，接种勾和环（1）,1ml吸管（7）,玻璃涂棒（1）,平皿（12）,250ml带玻璃珠三角瓶（1）,双层纱布（1）,试管（7），标签纸（1）,恒温箱，显微镜（4）。 实验试剂：无菌水，1mol/L NaOH、1mol/L HCL、草酸铵结晶紫染色液、卢戈氏碘液、95%乙醇、复红液、5%孔雀绿、沙黄、乙醚、吲哚试剂、40%NaOH、肌酸 牛肉蛋白胨培养基：牛肉膏1g，蛋白胨2g，Nacl 1g，水200ml，ph7.2，琼脂3.0-4.0g；生孢培养基：0.1%蛋白胨，0.1%葡萄糖，0.07%酵母粉，0.02%硫酸镁晶体（七水），0.02%硫酸铵，0.1%磷酸氢二钾（3水），1.5%琼脂； 一、土壤中芽孢杆菌的筛选 A.培养基配置步骤：（1）称量：按比例称取牛肉膏、蛋白胨、氯化钠，共置于烧杯中； （2）溶解：先加入适量无菌水，加热使其溶解，再补足水至总量； （3）调pH：用1mol/L NaOH或1mol/L HCL调PH至7.6； （4）过滤：用滤纸过滤； （5）融化琼脂：加入3.5克琼脂，继续加热至完全溶解，补足因加热蒸发失去的水分； （6）分装与包扎：摆斜面 （7）灭菌：121℃，灭菌20min B.实验步骤： （一）采集土样: 每个采样点选取土壤较肥沃、有代表性的地块约0．2 cm2，五点法采集。取5～10cm深土壤，每一个土样约500 g。将土样放入无菌的纸袋中，并记录采集的时间、地点、植被类型，4℃保存备用。 （二）土壤悬液制备：称取10g土样，放入盛有99ml无菌水并带有玻璃珠的250ml三角瓶中，振荡摇晃20min，使土样与水充分混合，将细胞分散，两层纱布过滤，然后将锥形瓶置于90℃水浴锅，加热20min，制备成土壤悬液。 （三）土壤悬液稀释：用一支1ml的无菌吸管从锥形瓶吸取过滤的土壤悬液1ml加入盛有9ml 无菌水的大试管中，震荡均匀，然后用无菌吸管从此试管中吸取1ml加入另一只盛有9ml无菌水的试管中，混合均匀，以此类推制成10-1 、 10-2 、 10-3、 10-4、10-5、 10-6 不同的稀释度。 （四）倒平板：将牛肉膏蛋白胨培养基加热融化，冷却至45-50度倒平板，每个梯度两个平行，共12个，每皿15ml左右。平皿凝固后，在平皿底部分别用记号笔用：10-1 、 10-1、10-2、 10-2 、 10-3、 10-3、10-4、 10-4、10-5、 10-5、10-6、10-6。 （五）涂布：用无菌吸管分别将10-1 、 10-2、10-3、10-4、10-5、10-6的土壤稀释液各吸取0.2ml，将菌悬液小心的对号滴入已写好稀释度的平皿表面中央，再用无菌玻璃棒在培养基表面轻轻的涂布均匀，倒置放置，待培养。 （六）培养：将接种好的平皿倒置于37℃温箱中培养，大约1-2天。 （七）平板划线分离纯化：将培养好的单个菌落分别挑取少许细胞接种到牛肉膏蛋白胨培养基斜面培养基上，置于37℃温箱中培养24小时左右，待长出菌苔，镜检其特征是否一致，有杂菌，需再一次分离纯化，直至获得纯培养。 (八)生孢培养：再分别挑取单个菌落划线接种于生孢培养基，于37度培养箱培养，直至长出单个菌落。 二、纯化菌株的鉴定： （一）观察菌落形态：观察平板菌落形态：菌落为扁平、边缘不整齐、白色、表面粗糙皱褶，（二）观察菌体形态：

院感细菌培养操作

1.目的: 医院是病原微生物较集中,抵抗力低的人群密集的地方,加之化疗、放疗等手段的采用，影响病人免疫机能下降，大量使用抗生素，引起耐药菌株增多，菌群失调，以及先进医疗仪器广泛应用等原因，增加消毒灭菌的难度，致使院内感染已成为当前医疗实践的严重障碍，直接影响医疗效果。进一步规范院内感染监测标本的程序，更好、更快检测病原微生物的生长情况，预防医院感染的发生。 2.设备、试剂与材料 VITEK 2 compact鉴定药敏分析系统 VITEK 32鉴定药敏分析系统 美国FORMAⅡ级生物安全柜 显微镜 酒精灯 接种环 恒温培养箱 各种培养基 革兰氏染色液 触酶试剂 氧化酶试剂 移液器 无菌吸嘴 3.院感标本采集 3．1空气的采样 3．1．1采样时间选择消毒处理后与进行医疗活动之前期间采样。 3．1．2采样高度与地面垂直高度80-150CM。 3．1．3布点方法室内面积＜30m2，设一条对角线上取三点，即中心一点，两端各距墙1m 处各取一点；室内面积＞30m2，设东、西、南、北、中5点，其中东、西、南、北点均距墙1m。 3．1．4采样方法用9cm直径普通营养琼脂平板在采样点暴露5min后送检。

3．2．1采样时间选择消毒处理后4小时内进行采样。 3．2．2采样面积被采表面＜100cm2，取全部表面；被采表面＞100cm2，则取100cm2。3．2．3采样方法用5×5 cm2的标准来灭菌规格板，放在被检物体表面，用无菌规格板，放在被检物体表面，用浸有无菌生理盐水采样液的棉拭子1支，在规格板内横竖往返各涂抹5次，并随之转动棉拭子，连续采样1-4个规格板面积，剪支手接触部位，将棉拭子放入装10ml采样液的试管中送检。门把手等小型物体则采用棉拭子直接涂抹物体的方法采样。3．3医护人员手采样 3．3．1采样时间在接触病人、从事医疗活动前进行采样。 3．3．2采样面积及方法被检人五指并拢，将浸有无菌生理盐水采样液的棉拭子一枝在双手指曲面从指跟到指端来回涂擦各两次（一只手涂擦面积30 cm2），并随之转动采样棉拭子，剪去手接触部位，将棉拭子放入装有10ml采样液的试管内送检。采样面积按平方厘米（cm2）计算。 3．4医疗用品采样 3．4．1采样时间在消毒或灭菌处理后，存放有效期内采样。 3．4．2采样方法右用破坏性方法取样的医疗用品，如输液（血）器、注射器和注射针等，取其中的一部分放培养液中培养。对不能用破坏性方法取样的特殊医疗用品，可用浸有无菌生理盐水采样液的棉拭子在被检物体表面涂抹采样，被采表面＜100cm2，取全部表面；被采表面≥100cm2，取100cm2。 3．5使用中消毒剂的采集 3．5．1采样时间采取使用中的消毒剂。 3．5．2采样方法在无菌条件下，用无菌注射器抽取1ml被检样品，加入10ml稀释液混匀。（对于醇类与酚类消毒剂稀释液用灭菌生长盐水；对于含氯消毒剂、含碘消毒剂、过氧化物消毒剂，需在灭菌生理盐水中加入%硫代硫酸钠；对于洗必泰、季铵盐类消毒剂，需在灭菌生理盐水中加入3%（w/v）吐温80和%卵磷脂；对于醛类消毒剂，需在灭菌生理盐水中加入%甘氨酸；对于含有表面活性剂的各种消毒剂，需在灭菌生理盐水中加入3%（w/v）吐温80，以中和被检样液的残效作用。）

醋酸菌菌种分离筛选方法

醋酸菌菌种分离筛选方法 醋酸菌的细胞为椭圆至杆状，单个成双或成链，鞭毛周生或端生，运动或不运动，革兰氏阴性菌，好氧菌，一般在乙醇或其他可氧化物的酵母煮液或酵母消化液培养基生长旺盛。 醋酸的钠盐和钙盐与三氯化铁共热，生成红褐色沉淀，原液变成无色。 可进行分离菌鉴别。 1.培养基： 1.1米曲汁乙醇碳酸钙培养基：米曲汁（10-12BX）1000mlCaCO 310-15g95℅乙醇30-40ml（灭菌后加入）PH自然 1.2葡萄糖碳酸钙培养基：葡萄糖15g/L酵母膏10g/L CaCO 315g/LPH 6.8 1.3乙醇30mL/L酵母膏10g/L葡萄糖10g/L CaCO 310-15g/L（常规筛选培养基）PH 6.8-7.0注：常规培养基中的碳酸钙易沉淀，平板不易观察到透明圈，选择米曲汁乙醇碳酸钙培养基为好。 1.4醋酸菌保存培养基：酵母膏15g/L葡萄糖10g/L CaCO 315-20g/L琼脂15-20 g/L 3-4滴乙醇/试管。 1.5液体种子和发酵培养基：乙醇30-35mL/L膏酵母10g/葡萄糖10g/L KH 2PO 40.5g/L MgSO 40.5g/L PH 6.5-6.8 2.菌种筛选：

2.1集菌：1-2g（5ml）样品，在无菌下加入30-50ml/250ml米曲汁乙醇液体培养基（0.5ml 0.02℅结晶紫醋酸溶液/100ml培养液）中， 130-33℃震荡培养24-48h，集菌液PH明显下降，有醋味，镜检细胞革兰氏染色阴性。形态与醋酸菌相符即可分离。 2.2混菌法分离：（分离及初筛） 适度稀释10-5、10-6、10-7取1.0ml菌液置于无菌平板或涂布中，每个梯度平行两次，米曲汁乙醇碳酸钙培养基倒平板，30℃24-48h，观察有小菌落出现，菌落周围形成透明圈，圈的大小因菌而异。挑透明圈出现早且菌落丰厚，边缘整齐，生长旺盛不同的菌落转接于曲汁乙醇碳酸钙斜面，30-33℃24-48h。根据菌落周围溶解透明圈大小初步筛选出产酸高的菌种。 2.3性能测定：（复筛） 不同菌落接种于液体曲汁乙醇培养基（30-50ml/250ml）中，30℃震荡培养24-48h。2.3.1镜检：染色镜检细胞整齐，椭圆或短杆状，革兰氏阴性菌。 2.3.2性能测定： 醋酸定性分析：取发酵液（离心去菌体）5.0ml于洁净试管中，用10℅氢氧化钠中和PH至7.0，加入1℅三氯化铁溶液2-3滴，摇匀，观察溶液是否变黄褐色，加热共沸，形成红褐色沉淀，原液变无色者为产醋酸细菌。 生酸量测定：1.0ml发酵液于150ml三角瓶中，加中性蒸馏水10-20ml，酚酞指示剂2滴，用0.1mol/l氢氧化钠滴定至微红色。 醋酸量（g/100mL）=氢氧化钠摩尔浓度.Vx60.06x10-3/样品毫升数x100 2同时，进行单因素试验，分别考察醋酸速度，耐高温，耐酒精度，耐低酸度等主要生产性能，选择优势菌株。 3

细菌分离培养及移植

细菌分离培养及移植 在细菌学诊断中，分离培养是不可缺少的一环。分离培养的目的主要是在含多种细菌的病料或培养物中挑选出某种细菌。在分离培养时应注意：选择适合于所分离细菌生长的培养基、培养温度、气体条件等。同时应严格按无菌操作程序进行实验，并做好标记。 [目的要求] (1)掌握细菌分离培养的基本要领和方法。 (2)掌握厌氧菌培养的原理及其方法。 [实验材料] 菌种：大肠杆菌斜面、大肠杆菌与金黄色葡萄球菌混合培养肉汤等。 器械：剪刀、记号笔(以上小组共用)。 培养基：普通肉汤和普通琼脂斜面、普通琼脂和鲜血琼脂平板、酒精灯、接种环(以上每人一套)。 [需氧性细菌分离培养法] 1．划线分离培养法此法为常用的细菌分离培养法。平板划线培养的方法甚多，可按各人的习惯选择应用，其目的都是达到使被检材料适当的稀释，以求获得独立单在的菌落，防止发育成菌苔，以致不易鉴别其菌落性状。划线培养时须注意以下几点：

(1)左手持皿，用左手的拇指、食指及 中指将皿盖揭开呈20。左右的角度(角度愈小愈好，以免空气中的细菌进入皿中将培养基污染)。 (2)右手持接种环，从大肠杆菌与金黄色葡萄球菌混合培养肉汤中取少许材料涂布于培养基边缘，然后将接种环上多余的材料在火焰中烧毁，待接种环冷却后，再与所涂材料的地方轻轻接触，开始划线，方法如图(5-l)。 (3)划线前先将接种环稍稍弯曲，这样易和平皿内琼脂面平行，不致划破培养基。 (4)划线中不宜过多地重复旧线，以免形成菌苔。 (5)接种完毕，在皿底上作好菌名、日期和接种者等标记，平皿倒扣，置37℃培养。 2．纯培养的获得与移植法将划线分离培养37℃24h的平板从温箱取出，挑取单个菌落，经染色镜检，证明不含杂菌，此时用接种环挑取单个菌落，移植于琼脂斜面培养，得到的培养物，即为纯培养物，再作其他各项试验检查和致病性试验等。具体操作方法如下：