基于枯草芽孢杆菌重组菌株构建技术制备海洋源金属硫蛋白

渔业研究 2018，40(2):89 -97 https://www.wendangku.net/doc/9a2314391.html, Journal o f Fislieries Research D O I：10. 14012/https://www.wendangku.net/doc/9a2314391.html,ki.fjsc.2018. 02. 001

阎光宇，孙继鹏，易瑞灶，等?基于枯草芽孢杆菌重组菌株构建技术制备海洋源金属硫蛋白[J]?渔业研究，2018，40(2):89 -97.

基于枯草芽孢杆菌重组菌株构建技术制备

海洋源金属硫蛋白

阎光宇$,5,孙继鹏U,3*，易瑞灶"，3,苏永全4

(1.厦门海洋职业技术学院，福建厦门361100;

2.国家海洋局第三海洋研究所，福建厦门361005;

3.国家海洋局海洋生物资源综合利用工程技术研究中心，福建厦门361005;

4.厦门大学，福建厦门361005;

5.东山出人境检验检疫局综合技术服务中心，福建东山363400)

摘要：为构建安全高效表达海洋源金属硫蛋白的益生菌重组菌株，以海洋源稽牡<内脏团为模 A，P C R B C D E：；<—./01F G(〇p-MT)，H1!324〇p，J p MD19-T K L M B 隆到融合表达载体pHT43 -SUMO中，然后通过电转化法将重组质粒转入八种蛋白酶缺陷的宿 主枯草芽孢杆菌（！"#$&'(%)WB800N中。SDS-P A G E电泳显示诱导表达的融合蛋白 SUMO- Op- M T分子量约为23 kD，与预期一致，说明可溶性融合蛋白SUMO- Op - M T在宿 主菌中得到了表达，且通过Western blotting进一步得到验证。同时，HPLC检测重组枯草芽孢 杆菌发酵液，结果也表明重组枯草芽孢杆菌成功表达了可溶性目的蛋白O p-MT。通过对重组 工程菌中M T活性检测发现，其对重金属镉耐受力增强，说明重组工程菌成功表达出有活性的 金属硫蛋白。这为以后开发天然、高效海洋源重金属解毒剂提供理论基础。

关键词：枯草芽孢杆菌；海洋源金属硫蛋白；可溶性融合蛋白

中图分类号：S986. 2文献标识码：A文章编号：1006 -5601(2018)02 -0089 -09

金属硫蛋白（Metallothionein，MT)是一类 普遍存在于生物体内的、高度可诱导性的内源金 属结合蛋白，具有维持生物体内必须金属含量动 态平衡、重金属解毒、清除自由基，改善机体免 疫力、增强机体抗应激能力等多种作用[1-3]，且 与动物机体的生长发育及部分疾病的发病机理有 着密切的关系。因此，M T在医学、化妆品、保 健食品添加剂、环保等方面得到了广泛应用。

目前，国内市场上常见的M T多数是从兔肝脏中提纯[4]，提取工艺中使用大量有机溶剂[5-7]，且步骤繁复，产量极低，致使M T的价 格极其昂贵，从而使其应用和研究受到限制。采 用基因重组技术规模化生产制备金属硫蛋白，对 其大规模开发和作用机理的研究有重要意义。目前利用大肠杆菌作为工业生产蛋白质的优选宿主 细胞研究M T表达方法多有文献报道[8-9]，但其 缺少蛋白翻译后进行加工和修饰的功能，且目的 蛋白极易形成包涵体，分离纯化繁琐，给生产实

收稿日期：2018 -02-06

基金资助：福建省科技计划项目（2017N0016);国家海洋局第三海洋研究所基本科研业务费专项资金资助项目 (海三科2016031)共同资助。

作者简介：阎光宇（1983 -)，女，助理研究员，博士，研究方向：分子生物技术■E-m a il:guangyu0502@ 163. com

通讯作者：孙继鹏（1980 -)，男，助理研究员，研究方向：海洋药物化学.E-mail: jp s n@t io.o g.c n

枯草芽孢杆菌试验方案

枯草芽孢杆菌浓度测定试验方案 一、材料准备 （1）实验仪器 培养皿、烧杯、天平、玻璃棒、移液枪（5ml 1ml 200ul）、枪头（黄、蓝）、电子天平、250ml锥形瓶、15ml试管、涂布棒、酒精灯、记号笔、封口膜、灭菌锅、漩涡震荡仪 （2）实验试剂 NA培养基： 牛肉膏、蛋白胨、琼脂、水、盐酸、氢氧化钠、无菌水 枯草芽孢杆菌（不同浓度梯度）：101、102、103、104、105 （3）培养基配方 牛肉膏（3g）、蛋白胨（5g）、琼脂（20g）、水（1000ml）、无菌水（100ml）、盐酸、氢氧化钠（调节PH7.0-7.2），121°C下灭菌30 min。 二、实验步骤 （1）制备菌液 称取1.0g枯草芽孢杆菌转移至灭菌试管中，用移液枪分别移取9ml无菌水至试管，并用漩涡震荡仪震荡20-30秒保证完全混匀，标记为①； 用移液枪从①中移取1ml混匀菌液至一新试管，用移液枪分别移取9ml 无菌水，并用漩涡震荡仪震荡20-30秒保证完全混匀，标记为②；同理，分别进行稀释，得到③-⑧; （2）进行涂板 向每个培养皿中倒入约12ml50℃左右的灭菌的NA培养基，排除气泡；

待培养基凝固后，用移液枪分别从①-⑧中吸取200ul菌液，加至已灭菌的培养皿中，用涂布棒进行均匀涂抹，并标记； 每个样品做两个处理，每个稀释度重复3次； 将密封后的培养皿倒置于36℃的恒温培养箱内培养18h—24h，观察记录实验结果。 （3）菌落计数 以平板上出现30个——300个菌落数的稀释度平板为记数标准，并确定为稀释倍数： 当只有一个稀释度，其平均菌落数在30个-300个之间时，则以该平均菌落数乘以其稀释倍数； 若有两个稀释度，其平均菌落数30个-300个之间时，应按两者菌落总数之比值来决定。若其比例小于2应计数两者的平均数，若大于2则计数其中稀释较小的菌落总数； 若三个稀释度的平均菌落数大于300个，则应按稀释度最高的平均菌落数乘以稀释倍数； 若三个稀释度的平均菌落数小于300个，则应按稀释度最低的平均菌落数乘以稀释倍数。5.6若三个稀释度的平均菌落数不在30个-300个之间，则以最接近300个或30个的平均菌落数乘以稀释倍数。 （4）结果统计与计算 有效活菌总数按式（1）计算； A=B×C /D (1)

枯草芽孢杆菌发酵工艺2

(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201510320760.5(22)申请日 2015.06.11 C12N 1/20(2006.01)C12R 1/125(2006.01) (71)申请人山东西王糖业有限公司 地址256209 山东省滨州市邹平县韩店镇驻 地西王工业园电厂路南侧(72)发明人王棣 王居亮 李伟 杨荣玉 唐海静 夏颖颖(74)专利代理机构济南舜源专利事务所有限公 司 37205 代理人宋玉霞(54)发明名称 一种用玉米粗蛋白粉生产枯草芽孢杆菌微生态制剂的方法(57)摘要 本发明提供一种以玉米淀粉生产过程中的副产品玉米粗蛋白粉为原料生产枯草芽孢杆菌微生态制剂的生产方法，采用本方法在不添加其它碳源和氮源的条件下，单纯以玉米粗蛋白粉为营养源经过固态培养可以生产出活菌数为3000亿-5000亿/g 的枯草芽孢杆菌微生态制剂。生产过程不需要通压缩空气，不产生任何废水废气。减少了枯草芽孢杆菌微生态制剂的生产成本。且所得产品以玉米纤维低聚糖为载体具有益生元的功能提高了产品质量。 (51)Int.Cl. (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书4页 (10)申请公布号CN 104988088 A (43)申请公布日2015.10.21 C N 104988088 A

1.一种用玉米粗蛋白粉生产枯草芽孢杆菌微生态制剂的方法，步骤如下： (1)取玉米粗蛋白粉移入固体发酵罐中，加水调到料水比为1：0.7-0.9，加氧化钙调pH 到6.0-7.0； (2)打开循环水使固体发酵罐温度上升到80-90℃后，通入蒸汽消毒30分钟； (3)待原料冷却到40℃-44℃后，加入物料干基重量1/9-1/10培养15h以后的种子液，固含量为5％； (4)维持30-40℃培养50-60h，24h后每隔6h搅拌一次物料； (5)培养到50-60h后，物料明显粘湿，有较浓的枯草芽孢杆菌特有气味，升温到44-56℃继续培养12-22h； (6)共计培养72h后移出物料，65-80℃烘干物料； (7)烘干物料水份到小于6％后，粉碎物料； (8)将粉碎的物料进行包装，取样检测产品质量。 2.根据权利要求1所述的用玉米粗蛋白粉生产枯草芽孢杆菌微生态制剂的方法，其特征在于，所述的步骤(1)中，料水比是指：物料干基质量即无水的物料质量。 3.根据权利要求1所述的用玉米粗蛋白粉生产枯草芽孢杆菌微生态制剂的方法，其特征在于，所述的种子液为将枯草芽孢杆菌菌种在液体培养基中通气搅拌培养15小时以后的液体培养基和菌种的混合物，所述的液体培养基为：葡萄糖5％w/w，玉米浆10％w/w,硫酸镁0.03％w/w,碳酸钙调pH到7.0，其余为黄河水，所述的玉米浆干基含量为26％。 4.根据权利要求1所述的用玉米粗蛋白粉生产枯草芽孢杆菌微生态制剂的方法，其特征在于，所述的步骤(4)中，维持温度为33-38℃。 5.根据权利要求1所述的用玉米粗蛋白粉生产枯草芽孢杆菌微生态制剂的方法，其特征在于，所述的步骤(5)中，升温到45-50℃。 6.根据权利要求1所述的用玉米粗蛋白粉生产枯草芽孢杆菌微生态制剂的方法，其特征在于，所述的步骤(4)(5)中，发酵过程罐体与空气相通，有空气过滤器装置过滤掉空气中的杂菌。 7.根据权利要求1所述的用玉米粗蛋白粉生产枯草芽孢杆菌微生态制剂的方法，其特征在于，得到的枯草芽孢杆菌微生态制剂，活菌数3000-5000亿/g。 8.根据权利要求1所述的用玉米粗蛋白粉生产枯草芽孢杆菌微生态制剂的方法，其特征在于，采用的玉米粗蛋白粉的情况见表1， 表1 玉米粗蛋白粉指标 蛋白质％脂肪％纤维质％淀粉％灰分％木质素％水份％玉米皮1125412 2.612 粗蛋白10 2.41250 4.6—10 胚芽粕1825314 2.3— 。

核酸提取新技术

核酸提取新技术 核酸提取被用于许多分子生物化学试验和诊断，是克隆、转化、酶切、体外转录、扩增、测序等试验的第一个步骤。然而由于细胞内存在大量蛋白质、碳水化合物、原始样品中的代谢物以及其它污染物，提取高质量的核酸并非易事。现阶段的层析柱核酸提取方法有： 1、一种新的层析柱技术-双层柱技术 时间：2012年 人物： 美国科学家丁少峰教授和刘强教授 事件： 发明了一种新的层析柱技术-双层柱技术，以及基于该新双层柱的核酸提取方法，用来克服常用的基于硅胶提取和基于阴离子交换提取核酸两者的缺点，使核酸提取方法更加简单、快速、高效、可靠，特别是在血浆和尿液的液体活检中具有非常重要的应用价值13-14。 结构： 双层柱由2种膜组成：第一层为阴离子交换膜二乙胺（DEAE），第二层为二氧化硅膜 (Fig.1)。 原理： （1）样品中的核酸结合到第一层阴离子交换膜上，起核酸浓缩器的作用， （2）已结合的核酸从第一层膜洗脱, 然后结合到第二层二氧化硅膜, 这是因为采用了双功能洗脱/结合液, 也称为耦联液， （3）最终使用低盐缓冲液将游离核酸从第二层膜洗脱，获得目的产物 (Fig.2)。 优点: （1）特别适用于分离和纯化含有极度稀释的大容量的核酸样品，例如10mL血浆或50mL尿液； （2）游离的小片段DNA（80～250bp）回收率高,可比常规硅胶提取法高出4倍, 适用于血浆及尿液游离核酸的提取； （3）不需要蛋白酶处理； （4）提供更高纯度和更少抑制剂的核酸样品； （5）洗脱的核酸可直接用于下游应用, 包括焦磷酸化激活的聚合反应（Pyrophosphorolysis Activated Polymerization，PAP）和聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）、及二代测序等； （6）此外，本方法快速、简便，无需接触苯酚及氯仿等毒性强烈的有机溶剂，无需复杂繁琐的实验操作，操作全程可在短时间内完成。 以下为常用的两种方法。

浅谈枯草芽孢杆菌(参考内容)

浅谈枯草芽孢杆菌 1. 抗生作用 抗生作用是指拈抗微生物通过产生代谢产物在低浓度下就能够对病原微生物的生长和代谢产生抑制作用，从而来影响病原微生物的生存和活动。近半个世纪以来，人们从枯草芽孢杆菌不同菌株的代谢产物中分离纯化了多种有效的抗菌物质。 2 溶菌作用 枯草芽孢杆菌的溶菌作用主要表现在是通过吸附在病原菌的菌丝上，并随着菌丝生长而生长，而后产生溶菌物质造成原生质泄露使得菌丝体断裂；或者是产生抗菌物质通过溶解病原菌孢子的细胞壁或细胞膜，致使细胞壁穿孔、畸形等现象从而抑制孢子萌发。 3 诱导植物产生抗性及促进植物生长 诱导植物产生抗性作用是指枯草芽孢杆菌不但能够抑制植

物病原菌，而且还能够诱发植物自身抗病机制从而增强植物的抗病性能的作用。什么是PGPR国际上把土壤中能促进植物生长的根际自生细菌通称为植物促生根圈细菌(Plant growth promoting rhizobaceria)，简称为PGPR。 其中以枯草芽孢杆菌的抗逆性最强、功能最多、适应性最广、效果最稳定。枯草芽孢杆菌能够产生类似细胞分裂素、植物生长激素的物质，促进植物的生长使植物抵抗病原菌的侵害。 4保护环境。 枯草芽孢杆菌大量应用于生物肥料。当作用于作物或土壤时，能够在作物根际或体内定殖，并起到特定肥料效应。目前，微生物肥料在培肥地力，提高化肥利用率，抑制农作物对硝态氮、重金属、农药的吸收，净化和修复土壤，降低农作物病害发生，促进农作物秸秆和城市垃圾的腐熟利用。提高农作物产品品质和食品安全等方面表现出了不可替代的作用。

5 枯草芽孢杆菌对土壤中的菲与苯并芘的吸附及生物降解功能 土壤与其相连的水环境称为土壤-水环境系统，其中存在着大量的土壤固有微生物，并在表面存在生物膜，因为生物膜形成了隔离层，有机污染物在接触到支撑生物膜的固体基底之前，必须首先到达并且穿过这个隔离层，这样就强烈地改变矿物颗粒或基底的吸附行为，对吸附作用有重要的影响，近年的研究表明，由于受污染影响，导致土壤中含有多环芳烃（PAHs），沉积物中PAHs主要为原油污染以及工业或民用煤不完全燃烧所致，枯草芽孢杆菌对菲与苯并芘的吸附及生物降解研究，研究表明以枯草芽孢杆菌为接种微生物，对菲与苯并芘都可进行吸附或生物降解，48h液相PAHs浓度达到平衡时，微生物对菲消除了98％，对苯并芘消除85％；接种的样品48h吸附等温线均呈线形，能较好地符合线性方程；在接种微生物情况下，沉积物与土壤对菲和苯并芘吸附特征均发生较大变化，对菲的吸附量增大约35倍，而对苯并芘的吸附量却降低了2／3左右；未接种微生物的土壤和沉积物对菲解吸率为20％，接种的样品组为2.9％，而对苯并芘的解吸结果与菲相反，未接种

枯草芽孢杆菌使用技术

枯草芽孢杆菌使用技术 制剂：1000亿活芽孢/克可湿性粉剂毒性：低毒级 枯草芽孢杆菌特点： 1、绿色环保――对人畜微毒、对环境无污染、对作物安全（本剂虽属细菌活体杀菌剂，但不会侵染作物引起病 害，亦不会对作物产生药害） 2、高效广谱――对水稻稻瘟病，西瓜、黄瓜、草莓、番茄等多种作物白粉病、灰霉病，马铃薯晚疫病，大豆、油菜菌核病，瓜类、谷物、三七等作物根腐病等多种真菌性病 害具有优良防效。 3、增产提质――枯草芽孢杆菌还能够分泌促进作物生长的活性物质，使植株叶片浓绿肥厚，提高作物免疫力，增产提质效果显著，发酵过程中产生多种氨基酸，对作物有生 长调节的作用。 枯草芽孢杆菌防治机理 １、竞争作用：通过生物间争夺氧气、营养物质及竞争

排它性，形成局部生物优势种群，防止其它菌侵入；同时争夺周围菌的营养，抑制病原菌生长―起到疫苗的作用。 ２、溶菌作用：枯草芽孢杆菌吸附于病原菌的菌丝上，随着菌丝生长而生长，从而消耗病原菌的营养，使病原菌菌丝发生断裂、解体、细胞质消解，使病原菌失去进一步侵染 能力―起到寄生作用。 3、生物拮抗作用：枯草芽孢杆菌生长过程中能产生细菌素（枯草菌素、多粘菌素、制霉菌素、短杆菌素）、有机酸、天然脂肽类化合物等，对病原菌抑制其生长或溶解其细胞壁、使细胞穿孔、畸形，最终杀死病原菌，。 ４、杀灭作用诱导作物产生抗病性、促进作物生长，增产提质。据统计，使用枯草芽孢杆菌可有效增产 5.6-20.2%。 枯草芽孢杆菌使用方法 1、稻瘟病、纹枯病、稻曲病。施药方法：水稻孕穗破口期和齐穗期各施药一次。每亩用枯草芽孢杆菌10克均匀 喷雾，喷药药间隔7-12天，

2、枯草芽孢杆菌与咪鲜胺、三环唑、井冈霉素等混用，有明显的相互增效作用。在病害集中、急性暴发时，更能显 示出混用的效果。 枯草芽孢杆菌使用注意事项 1、本品用量少，为减少浪费，兑药时应用小容器将所需用量药剂充分溶解后再倒入喷雾器中，加水至喷雾器最佳 水平线进行喷雾； 2、早上10点前或下午4点后施药，避免阳光直射，杀死芽孢。尤其是4点后用药，夜间潮湿的环境更有利于芽孢 萌发。 3、不能与铜制剂、链霉素等杀菌剂及碱性农药混用； 4、病害初期或发病前施药效果最佳，施药时注意使药 液均匀喷至作物各部位。

枯草芽孢杆菌酶在发酵工艺上的应用

枯草芽孢杆菌酶在发酵工艺上的应用 王伟王上俞志敏丛丽娜* （大连工业大学生物工程学院辽宁大连 116034） 摘要：枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）是当今工业酶的主要生产菌种之一，由于其产酶量高、种类多、安全性好、环保等优点在现代发酵工业生产中被广泛应用，其发酵生产的酶在工业、医学、食品、饲料、洗涤、纺织、皮革、造纸、水产养殖等领域均发挥着十分重要的作用。 关键词：枯草芽孢杆菌；发酵；酶 B. subtilis enzyme used in the fermentation process WANG Wei WANG Shang YU Zhi-Min CONG Li-Na* (School of Biological Engineering,Dalian polytechnic University,Dalian,Liaoning 116034, China) Abstract:Bacillus subtilis (Bacillus subtilis) is one of today's major producing strain of industrial enzymes,enzyme production because of its high volume,variety,safety, environmental protection,etc.are widely used in modern industrial production fermentation,fermentation enzymes produced in the fields of industry,medicine,food, feed,wash,textile,leather,paper,aquaculture and other have played a very important role. Keywords:Bacillus subtilis; fermentation; Enzyme 长期以来，枯草芽孢杆菌一直是工业微生物的主力军之一，它的使用可追溯到一千多年前，早在日本平安时代（794～1192年）日本人就已经利用枯草芽孢杆菌在大豆中采用固态发酵的方法生产他们的传统食品——纳豆，开创了利用枯草芽孢杆菌的历史[1]。由于其具有发酵周期短、产物丰富、可利用开发价值高以及作为食品药品安全性好等显著优点，使得它的应用一直延续至今，并在过去的一百多年中有了长足的进步。近年来，由于分子生物学的飞速发展，新的分子手段和技术的不断介入使得枯草芽孢杆菌的研究利用进入了新时期，在食品加工、农业生产、能源开发等方面不断地涌现新突破，在工业微生物中的地位不断得到

枯草芽孢杆菌产淀粉酶试验要点

枯草芽孢杆菌产α-淀粉酶发酵试验 化学与生命科学学院 摘要：以枯草芽孢杆菌（BacilusSubtilisBF—7658）为实验菌株，通过种子扩大培养，选出生长力旺盛的菌株进行液体摇瓶发酵。通过测定不同发酵时间生产的酶活，来初步估计发酵最佳时期和终点。 关键词：枯草芽孢杆菌，α-淀粉酶，液体摇瓶发酵，酶活 淀粉酶是能够分解淀粉糖苷键的一类酶的总称，包括α-淀粉酶、β-淀粉酶、糖化酶和异淀粉酶。芽孢杆菌主要用来产生α-淀粉酶和异淀粉酶，其中α-淀粉酶又称淀粉1，4-糊精酶，能够切开淀粉链内部的α-1，4-糖苷键，将淀粉水解为麦芽糖、含有6 个葡萄糖单位的寡糖和带有支链的寡糖；而异淀粉酶又称淀粉α-1，6-葡萄糖苷酶、分枝酶，此酶作用于支链淀粉分子分枝点处的α-1，6-糖苷键，将支链淀粉的整个侧链切下变成直链淀粉。通过发酵实验，我们可以以酶活为依据，初步估计发酵的最佳时期和发酵终点。 实验材料和方法 一、实验材料： （一）实验菌株：以枯草芽孢杆菌（BacilusSubtilisBF—7658） （二）培养基： 1、种子培养液 葡萄糖 1% Tryptone(胰蛋白胨)：1%, Yeast Extract(酵母提取物)：0.5%, NaCl(氯化钠)：1% 调pH7.2 若配置固体培养基，则再加入1.5% 琼脂。 2、产淀粉酶发酵培养液 玉米粉 2 .0 % 黄豆饼粉1 .5% CaCl 2 0 .02 % MgSO4 0 .02% NaCl 0 .25% K2HPO4 0 .2% 柠檬酸钠0 .2% 硫酸铵0 .075% Na2HPO4 0 .2 % 调节pH 值7 .0

枯草芽孢杆菌实验报告

微生物技术综合实验 年级：13级生物工程（专升本）班级：2013011201 学号：1301014026 姓名：徐红贞 指导老师：刘凤霞教授 日期：二零一三十月五号

目录 1实验目的及原理 (1) 1.1实验目的 (1) 1.2实验原理 (1) 2实验材料 (1) 2.1实验仪器 (1) 2.2实验试剂 (1) 2.3培养基 (2) 2.3.1 生长培养基 (2) 2.3.2鉴定培养基 (2) 2.3.3摇瓶培养基 (2) 3试验方法 (2) 3.1仪器的准备 (2) 3.2培养基的配置 (2) 3.3初步筛选及鉴定 (2) 3.3.1采集土样 (3) 3.3.2富集培养 (3) 3.3.3稀释分离、纯化 (3) 3.3.4初筛 (3) 3.4复筛及鉴定 (4) 3.4.1革兰染色 (4) 3.5酶活力的测定 (4) 3.5.1摇瓶培养 (4) 3.5.2酶液稀释 (4) 3.5.3酶液测定 (4) 4结果分析 (5) 4.1平板涂布分离 (5) 4.2平板划线分离 (5) 4.3初筛 (5) 4.4复筛 (5) 4.5摇瓶培养 (6) 4.6酶活力测定 (6) 5参考资料 (7) 6附录 (8)

微生物上游技术综合实验 枯草芽孢杆菌的分离、纯化、筛选及鉴定 1.实验目的及原理 1.1实验目的 （1）学习从土壤中分离、纯化枯草芽孢杆菌的原理和方法。 （2）学习掌握枯草芽孢杆菌的鉴定方法。 （3）掌握微生物的摇瓶培养方法及淀粉酶活力的测定的原理和方法。 （4）培养学生综合应用微生物实验方法的能力。 （5）培养学生自行设计实验流程、综合分析问题解决问题和判断实验结果的能力。 1.2实验原理 选择合适与待分离微生物的生长条件，如营养成分、酸碱度、温度和氧等要求，或加入某种抑制剂造成只利于该微生物生长，而抑制其他微生物的环境，从而淘汰一些不需要的微生物。 将土壤稀释液倒在不同类型的培养基平板上，在适宜的环境中培养几天，细菌或是其他的微生物便能在平板上生长繁殖，形成菌落。将初次筛选得到的微生物接到淀粉培养基上培养，因为只有能够产生淀粉酶的细菌才能够利用培养基中的淀粉成分来完成自身的生命活动，才能够生存。故在淀粉部分不显现蓝色，出现透明圈，可以通过透明圈的大小来初步判断培养物中是否有产淀粉酶微生物及产淀粉酶的能力。 2. 实验材料 2.1实验仪器 无菌玻璃涂棒无菌移液管接种环无菌培养皿土样电子天平三角瓶烧杯试管酒精灯擦镜纸载玻片吸水纸恒温摇床恒温培养箱高压蒸汽灭菌锅玻璃珠显微镜无菌铲胶头滴管记号笔试管架棉塞牛皮纸报纸细绳无菌纸袋电炉搪瓷缸分光光度计恒温水浴锅白瓷皿等。 2.2 实验试剂 ○1碘液储备液：称取22.0g碘化钾溶于约300mL水中，加入11.0g碘，搅拌溶液，移入500mL容量瓶，用水定容，贮于棕色瓶中备用（每月配制一次）。 ○2碘液使用液：称取20.0g碘化钾，溶于约300mL水中，移入500mL容量瓶中，

枯草芽孢杆菌生产工艺

枯草芽孢杆菌生产工艺-实验室操作 1. 培养基 1.1 种子培养基蛋白胨1 %，酵母浸出物0. 5 %，氯化钠1 % ，自然pH。 1.2 基础发酵培养基蔗糖1 %，蛋白胨1 %，磷酸氢二钠0. 2 %，磷酸二氢钠0. 2 %，pH 7. 0。 1.3 主要试剂 蔗糖、葡萄糖、淀粉、玉米淀粉、麦芽糖、酵母浸出物、胰蛋白胨、牛肉膏、尿素、氯化铵、硫酸锰、硫酸镁、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、硫酸亚铁、氯化钠和氯化钙。 1.4 仪器设备 控温摇床、高压蒸气灭菌锅、电子天平、pH 测定仪、无菌操作台和紫外分光光度计。 2.方法 2. 1培养方法 2. 1. 1菌种活化 将保存的菌种转接到斜面培养基，37 ℃培养24 h，备用。 2. 1. 2种子液的制备 取一环活化的菌种，接入装量为50 mL种子培养基的250mL三角瓶中，37℃，180 r/ min 培养18 h。 2. 1. 3摇瓶培养 分别取1 mL 种子液，接入盛有50 mL 发酵培养基的200 mL三角瓶中(接种量为2 % ，V/ V) 。置摇床中，30 ℃振荡培养12 h，转速为160 r/ min 3. 培养条件 3.1碳源 以葡萄糖、蔗糖和麦芽糖为碳源时枯草芽孢杆菌的生长明显优于可溶性淀粉和玉米淀粉。最佳碳源是葡萄糖，其次是蔗糖。 3.2氮源 氮源为有机氮源时枯草芽孢杆菌的生长明显优于无机氮源。最适氮源是酵母浸出物，从发酵成本考虑，酵母浸出物、胰蛋白胨及氯化铵组成的复合氮源较合适。

4.发酵条件 4.1生长曲线 接种12 h后细菌数量开始减少，枯草芽孢杆菌进入生长衰亡期。因此，采用8～12 h 时的菌液作为菌种较合适，此时枯草芽孢杆菌为对数生长末期，既可保持高的细胞活力，又可获得尽可能多的细胞数。 4.2 初始PH 在初始pH 5. 5～8范围内枯草芽孢杆菌均可良好生长，pH 为6. 0 时生长最好，说明枯草芽孢杆菌对pH 的适应性较宽，但随pH 的增大，活菌数呈下降趋势。 4.3温度 枯草芽孢杆菌在25～40℃均可良好生长，其生长的最适温度为35℃。 4.4装液量及接种量 枯草芽孢杆菌为需养菌，在生长过程中需要大量的氧气，装液量不可过多，培养液与容器体积比可设定为2:25；接种量3 % (V/ V) 较适合其生长。 5.干燥方式 采用喷雾干燥和低温冷冻干燥。低温冷冻干燥更利于芽孢的形成，但其操作复杂、成本高，不利于规模化工业生产。而喷雾干燥同样可产生高芽孢率，且成本相对低，更适合工业生产。

蛋白质提取与制备的原理和方法

蛋白质提取与制备的原理和方法 蛋白质提取与制备蛋白质种类很多，性质上的差异很大，既或是同类蛋白质，因选用材料不同，使用方法差别也很大，且又处于不同的体系中，因此不可能有一个固定的程序适用各类蛋白质的分离。但多数分离工作中的关键部分基本手段还是共同的，大部分蛋白质均可溶于水、稀盐、稀酸或稀碱溶液中，少数与脂类结合的蛋白质溶于乙醇、丙酮及丁醇等有机溶剂中。因此可采用不同溶剂提取、分离及纯化蛋白质和酶。 蛋白质与酶在不同溶剂中溶解度的差异，主要取决于蛋白分子中非极性疏水基团与极性亲水基团的比例，其次取决于这些基团的排列和偶极矩。故分子结构性质是不同蛋白质溶解差异的内因。温度、pH、离子强度等是影响蛋白质溶解度的外界条件。提取蛋白质时常根据这些内外因素综合加以利用。将细胞内蛋白质提取出来。并与其它不需要的物质分开。但动物材料中的蛋白质有些可溶性的形式存在于体液（如血浆、消化硫等）中，可以不必经过提取直接进行分离。蛋白质中的角蛋白、胶原及丝蛋白等不溶性蛋白质，只需要适当的溶剂洗去可溶性的伴随物，如脂类、糖类以及其他可溶性蛋白质，最后剩下的就是不溶性蛋白质。这些蛋白质经细胞破碎后，用水、稀盐酸及缓冲液等适当溶剂，将蛋白质溶解出来，再用离心法除去不溶物，即得粗提取液。水适用于白蛋白类蛋白质的抽提。如果抽提物的pH用适当缓冲液控制时，共稳定性及溶解度均能增加。如球蛋白 类能溶于稀盐溶液中，脂蛋白可用 稀的去垢剂溶液如十二烷基硫酸钠、洋地黄皂苷（Digitonin）溶液或有机溶剂来抽提。其它不溶于水的蛋白质通常用稀碱溶液抽提。 蛋白质类别和溶解性质 白蛋白和球蛋白: 溶于水及稀盐、稀酸、稀碱溶液，可被50%饱和度硫酸铵析出。 真球蛋白: 一般在等电点时不溶于水，但加入少量的盐、酸、碱则可溶解。 拟球蛋白: 溶于水，可为50%饱和度硫酸铵析出 醇溶蛋白: 溶于70～80%乙醇中，不溶于水及无水乙醇 壳蛋白: 在等电点不溶于水，也不溶于稀盐酸，易溶于稀酸、稀碱溶液 精蛋白: 溶于水和稀酸，易在稀氨水中沉淀 组蛋白: 溶于水和稀酸，易在稀氨水中沉淀 硬蛋白质: 不溶于水、盐、稀酸及稀碱 缀合蛋白(包括磷蛋白、粘蛋白、糖蛋白、核蛋白、脂蛋白、血红蛋白、金属蛋白、黄素蛋白和氮苯蛋白等) : 此类蛋白质溶解性质随蛋白质与非蛋白质结合部分的不同而异，除脂蛋白外，一般可溶于稀酸、稀碱及盐溶液中，脂蛋白如

枯草芽孢杆菌的发酵

枯草芽孢杆菌的发酵学院：化工学院 专业：生物工程 班级：生物10-2 ：霞

摘要 枯草芽孢杆菌是我国农业部允许作为饲料添加剂的15种菌种之一 ,其已被越来越多地制成饲用微生态制剂。因其制剂是无毒、无残留、无污染的“绿色”添加剂，故具有广阔的发展前景，并已在畜牧业、饲料业广泛应用，显示巨大的社会效益和生态效益。通过摇床培养筛选出较适宜于枯草芽孢杆菌发酵的培养基配方，发酵培养基配方确定后，在摇床条件下，通过对温度、初始ｐＨ值、初始接种量、装液量、摇床转速等发酵条件的摸索，确定最佳发酵条件。在摇瓶条件下优化发酵培养基和发酵工艺后，采用发酵罐进行发酵培养，对枯草芽孢杆菌在液体发酵过程中的菌体数量、ｐＨ值、总糖含量和总氮含量四个因素随时间的变化进行了观察。 枯草芽孢杆菌，是芽孢杆菌属的一种。单个细胞 0.7～0.8×2～3微米，着色均匀。无荚膜，周生鞭毛，能运动。革兰氏阳性菌，芽孢0.6～0.9×1.0～1.5微米，椭圆到柱状，位于菌体中央或稍偏，芽孢形成后菌体不膨大。菌落表面粗糙不透明，污白色或微黄色。枯草芽孢杆菌菌体生长过程中产生的枯草菌素、多粘菌素、制霉菌素、短杆菌肽等活性物质，这些物质对致病菌或源性感染的条件致病菌有明显的抑制作用。枯草芽孢杆菌迅速消耗环境中的游离氧，造成肠道低氧，促进有益厌氧菌生长，并产生乳酸等有机酸类，降低肠道pH值，间接抑制其它致病菌生长。枯草芽孢杆菌菌体自身合成α-淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶、纤维素酶等酶类，在消化道中与动物体的消化酶类一同发挥作用，能合成维生素 B1、B2、B6、烟酸等多种B族维生素，提高动物体干扰素和巨噬细胞的活性，在饲料中应用广泛。它还可以用来改善水质，应用在污水处理和环境保护中。和其它微生物混合使用，还可以用于生物肥料和土地改良等 关键词：枯草芽孢杆菌生长发酵活菌数

抗生素标记枯草芽孢杆菌实验

利福平标记枯草芽孢杆菌实验 1、实验材料 1.1试剂 利福平溶液：用95%乙醇配制10mg/mL的利福平溶液，配好后经0.22um无菌滤膜除菌。 1.2培养基 NA（牛肉膏蛋白胨培养基）培养基：牛肉膏5.0g，蛋白胨10.0g，氯化钠5.0g，蒸馏水1.0L，琼脂18.0g，pH7.0-7.2 200μg/mL利福平NA培养基：NA培养基经高温灭菌，冷却至50-55℃时加入利福平（1LNA培养基加入20mL10mg/mL利福平溶液）。 液体培养基为对应固体培养基不添加琼脂，其余成分一致。 2、抗生素标记试验 首先制备利福平浓度为100μg/mLNA平板，检测枯草芽孢杆菌天然抗药性。 根据天然抗药性检测结果，进行抗生素标记实验（杜立新等，2004），取纯化好的枯草芽孢杆菌单菌落接种到含有5ug/mL利福平NA液体培养基中，150r/min，28℃培养，待出现浑浊后稀释菌液，取三个不同浓度的稀释液100μL 加到含有相同浓度抗生素的NA细菌平板，涂匀，继代培养一次，待长出单菌落后转入下一高浓度的利福平NA培养基，依次经过利福平5、10、20、40、80、120、160、200ug/mLNA液体培养基诱导，直至筛选出能耐受的最高利福平浓度200ug/mL。筛选耐药枯草芽孢杆菌能否应用于研究，还必须验证其耐药的稳定性及拮抗性能。耐药稳定性试验参考吴春胜等（1994）方法。（1）将筛选的枯草芽孢杆菌在利福平含量依次升高的NA培养基上连续传代6次，观察其是否始终有菌落出现。（2）将筛选枯草芽孢杆菌接种至不含利福平NA培养基中，连续传代3-5次，然后将其涂布于含200μg/mL利福平的NA培养基上，观察其是否有菌落出现。（3）将抗药菌株置于4℃的低温中保藏2-3周，然后接种于含200μg/mL 利福平的NA液体培养基上进行培养，观察是否出现浑浊，并在含200μg/mL利福平的NA培养基上划线培养，观察其是否有菌落出现。

蛋白质的提取与纯化

蛋白质的提取与纯化 一，蛋白质的提取 大部分蛋白质都可溶于水、稀盐、稀酸或碱溶液，少数与脂类结合的蛋白质则溶于乙醇、丙酮、丁醇等有机溶剂中，因些，可采用不同溶剂提取分离和纯化蛋白质及酶。 （一）水溶液提取法 稀盐和缓冲系统的水溶液对蛋白质稳定性好、溶解度大、是提取蛋白质最常用的溶剂，通常用量是原材料体积的1-5倍，提取时需要均匀的搅拌，以利于蛋白质的溶解。提取的温度要视有效成份性质而定。一方面，多数蛋白质的溶解度随着温度的升高而增大，因此，温度高利于溶解，缩短提取时间。但另一方面，温度升高会使蛋白质变性失活，因此，基于这一点考虑提取蛋白质和酶时一般采用低温（5度以下）操作。为了避免蛋白质提以过程中的降解，可加入蛋白水解酶抑制剂（如二异丙基氟磷酸，碘乙酸等）。 下面着重讨论提取液的pH值和盐浓度的选择。 1、pH值 蛋白质，酶是具有等电点的两性电解质，提取液的pH值应选择在偏离等电点两侧的pH 范围内。用稀酸或稀碱提取时，应防止过酸或过碱而引起蛋白质可解离基团发生变化，从而导致蛋白质构象的不可逆变化，一般来说，碱性蛋白质用偏酸性的提取液提取，而酸性蛋白质用偏碱性的提取液。 2、盐浓度 稀浓度可促进蛋白质的溶，称为盐溶作用。同时稀盐溶液因盐离子与蛋白质部分结合，具有保护蛋白质不易变性的优点，因此在提取液中加入少量NaCl等

中性盐，一般以0.15摩尔。升浓度为宜。缓冲液常采用0.02-0.05M磷酸盐和碳酸盐等渗盐溶液。 （二）有机溶剂提取法 一些和脂质结合比较牢固或分子中非极性侧链较多的蛋白质和酶，不溶于水、稀盐溶液、稀酸或稀碱中，可用乙醇、丙酮和丁醇等有机溶剂，它们具的一定的亲水性，还有较强的亲脂性、是理想的提脂蛋白的提取液。但必须在低温下操作。丁醇提取法对提取一些与脂质结合紧密的蛋白质和酶特别优越，一是因为丁醇亲脂性强，特别是溶解磷脂的能力强；二是丁醇兼具亲水性，在溶解度范围内（度为10%，40度为6.6%）不会引起酶的变性失活。另外，丁醇提取法的pH及温度选择范围较广，也适用于动植物及微生物材料。 二、蛋白质的分离纯化 蛋白质的分离纯化方法很多，主要有： （一）根据蛋白质溶解度不同的分离方法 1、蛋白质的盐析 中性盐对蛋白质的溶解度有显著影响，一般在低盐浓度下随着盐浓度升高，蛋白质的溶解度增加，此称盐溶；当盐浓度继续升高时，蛋白质的溶解度不同程度下降并先后析出，这种现象称盐析，将大量盐加到蛋白质溶液中，高浓度的盐离子（如硫酸铵的SO4和NH4)有很强的水化力，可夺取蛋白质分子的水化层，使之“失水”，于是蛋白质胶粒凝结并沉淀析出。盐析时若溶液pH在蛋白质等电点则效果更好。由于各种蛋白质分子颗粒大小、亲水程度不同，故盐析所需的盐浓度也不一样，因此调节混合蛋白质溶液中的中性盐浓度可使各种蛋白质分段沉淀。

枯草芽孢杆菌使用说明

枯草芽孢杆菌(活菌数200亿/400亿) 一、枯草杆菌概述：枯草芽孢杆菌是芽孢杆菌属的一种。单个细胞 0.7～0.8×2～3微米，着色均匀。无荚膜，周生鞭毛，能运动。革兰氏阳性菌，芽孢0.6～0.9×1.0～1.5微米，椭圆到柱状，位于菌体中央或稍偏，芽孢形成后菌体不膨大。菌落表面粗糙不透明，污白色或微黄色，在液体培养基中生长时，常形成皱醭。需氧菌。可利用蛋白质、多种糖及淀粉，分解色氨酸形成吲哚。在遗传学研究中应用广泛，对此菌的嘌呤核苷酸的合成途径与其调节机制研究较清楚。广泛分布在土壤及腐败的有机物中，易在枯草浸汁中繁殖，故名。 二、枯草芽孢杆菌的作用机理：枯草芽孢杆菌大量应用于生物肥料。当作用于作物或土壤时．能够在作物根际或体内定殖，并起到特定肥料效应。目前，微生物肥料在培肥地力，提高化肥利用率，抑制农作物对硝态氮、重金属、农药的吸收，净化和修复土壤，降低农作物病害发生，促进农作物秸秆和城市垃圾的腐熟利用．保护环境。以及提高农作物产品品质和食品安全等方面表现出了不可替代的作用。 三、枯草芽孢杆菌的使用说明： 特点：1.肠道定殖能力强。 2.耐氧化、耐高温、耐酸碱、耐挤压和耐温度变化，满足不同的肥料生产需求。 3.绿色、安全、高效、较少抗生素药物的使用。 成分含量：枯草芽胞杆菌有效活菌数大于200亿/克 用法用量：

贮藏：阴凉、干燥处密封保存。 保质期：密封保存不少于18个月。 四、枯草芽孢杆菌的应用范围：枯草芽孢杆菌不仅在肥料中应用比较广泛，在污水处理及生物肥发酵或发酵床制作中应用也相当广泛，是一种多功能的微生物。 1、市政和工业污水处理，工业循环水处理，腐化槽、化粪池等处理，畜牧养殖动物废料、臭味处理，粪便处理系统，垃圾、粪坑、粪池等处理； 2、畜牧、家禽、特种动物及宠物养殖，水产养殖； 3、可以与多种菌种混配，在农业生产中具有重要作用。

枯草芽孢杆菌发酵探讨

[转载]枯草芽孢杆菌发酵探讨 枯草芽孢杆菌是我国农业部允许作为饲料添加剂的两 种芽孢杆菌之一，已被越来越多地研制成饲用微生态制剂。因其制剂是无毒、无残留、无污染的“绿色”添加剂，故具有 广阔的发展前景，并已在畜牧业、饲料业广泛应用，显示巨大的社会效益和生态效益。枯草芽孢杆菌具有很强的蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶等活性，能产生抗菌素，在动物肠道内具有较强生物夺氧能力。这些特性对促进动物营养的消化吸收、提高动物的饲料转化率、防病和促进生长起到重要作用。鉴于此，国内外专家学者对研究开发枯草芽孢杆菌制剂用于畜禽养殖日趋关注，从而也促进了这一产业的迅猛发展，但在现阶段的工业化生产中，存在着制约枯草芽孢杆菌发酵的诸多因素。 1、枯草芽孢杆菌的生物学特点 杆菌：一般（0.7～0.8）×（2.0～3.0）μm，电子显微镜测 量为（0.5～0.6）×（1.1～3.5）μm，革兰氏阳性，运动， 有长而又丰富的周生鞭毛。 芽孢：椭圆形，中生或偏中生，即使孢囊膨大也不显著。 生长温度：最高温度45～55℃；最低温度5～20℃。 阳性反应：接触酶；V-P反应；在7％的氯化钠中生长；pH5.7生长；分解葡萄糖、阿拉伯糖、木糖和甘露醇产酸；水解淀

粉；利用柠檬酸作为碳源；还原硝酸盐为亚硝酸盐；分解酪素；石蕊牛奶产碱胨化。 阴性反应：厌氧生长； 卵黄反应：在葡萄糖洋菜上或酪氨酸洋菜上形成可溶性黑色素；28℃4星期水解马尿酸盐；利用丙酸盐并分解酪氨酸。在55℃生长的菌株被0.02％的叠氮化合物抑制。 变化的性质：在V-P液中产酸(pH5.0～8.0)；对溶菌酶的抗性；在10％的氯化钠中生长。2、芽孢杆菌制剂的作用机理2.1可产生酶类和营养物质 研究表明芽孢杆菌能够分泌大量的胞外酶，如蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶等，有助动物对饲料的降解、消化，提高饲料利用率。饲料中未被消化的蛋白质和一些含氮物质在肠道中被大肠杆菌和其他细菌脱梭生成具有潜在的毒性的腐胺、吲哚、酚类等物质。一些芽孢杆菌可产生氨基氧化、SOD酶、分解硫化氢的酶以及其他抗菌物质如过氧化氢，起到杀菌作用，从而减少动物体内有害物质的产生。研究表明一些芽孢杆菌产生SOD酶，SOD可以清除生物体内活性氧自由基，减少其对细胞的毒害作用，使生物体免受伤害。芽孢杆菌在 生长繁殖过程中可以产生挥发性脂肪酸，如乙酸、丙酸、丁酸等，一些脂肪酸可降低动物肠道的pH，从而为乳酸菌的 生长创造条件，并且抑制病菌的生长。其中丙酸还可以参与三梭酸循环，为动物的新陈代谢提供能量。同时，能够产生

枯草芽孢杆菌分离及筛选实验方案

微生物设计性实验 枯 草 芽 孢 杆 菌 的 分 离 及 筛 选 第二小组 组长：杨泽升 组员：王亭亭 叶宁 霍克

枯草芽孢杆菌的分离和筛选 1 实验目的 掌握枯草芽孢杆菌的分离筛选的基本原理，熟练掌握无菌接种技术、微生物分离筛选技术和微生物形态观察技术。了解枯草芽孢杆菌的分布、营养、生长等特点，以及它所具有的产淀粉酶的功能。根据这些特点进行分离和筛选，从而得到纯菌株。 2 实验原理 枯草芽孢杆菌属革兰氏阳性菌，芽孢0.6～0.9×1.0～1.5微米，椭圆到柱状，位于菌体中央或稍偏，芽孢形成后菌体不膨大。菌落表面粗糙不透明，污白色或微黄色，在液体培养基中生长时，常形成皱醭。需氧菌。有的菌株是α-淀粉酶和中性蛋白酶的重要生产菌；有的菌株具有强烈降解核苷酸的酶系。广泛分布在土壤及腐败的有机物中，易在枯草浸汁中繁殖，故名。选择含淀粉丰富的土壤为最佳，80度的水浴处理样品1小时，目的是杀死微生物营养体，残留芽胞。利用稀释涂步法，在淀粉的培养基培养，培养1-3天后，观察。然后，进行初筛与纯化，鉴定参照《伯杰氏细菌手册》鉴定或者利用显微镜进行革兰氏染色，确认是否为枯草芽孢杆菌。再复筛，测定其淀粉酶活，最后确定菌株。 3实验材料 3.1选择培养基 本次实验进行产淀粉酶的枯草芽孢杆菌的筛选，所以应选淀粉培养基， 配方： 牛肉膏 5.0g 蛋白胨 10.0g 氯化钠 5.0g 可溶性淀粉10.0g 琼脂 20g 蒸馏水 1000ml 调整pH至7.2 配置时应先把淀粉用少量蒸馏水调成糊状，再加入到融化好的培养基中。 3.2溶液或试剂 牛肉膏 1.25g 蛋白胨 2.5g 氯化钠 1.25g 可溶性淀粉 2.5g 琼脂 5g 碘11克，碘原液2毫升，碘化钾42克，可溶性淀粉2克，磷酸氢二钠45.23克，柠檬酸8.068克，氯化钴25克，重铬酸钾3.34克， 100毫升0.01NHCL。 3.4仪器或其他用品 平板培养皿 10个、试管15支、三角瓶2个、烧杯3个、称量纸、高压蒸汽灭菌锅、干燥箱、恒温培养箱、超净工作台、无菌涂布器、电热恒温水浴、500ml 量筒、显微镜、无菌吸管、无菌培养皿、无菌刻度吸管、酒精灯、记号笔、火柴、试管架、接种钩、滴管等。 4 实验流程

分离纯化蛋白质的方法及原理

（二）利用溶解度差别 影响蛋白质溶解度的外部因素有：1、溶液的pH；2、离子强度；3、介电常数；4、温度。但在同一的特定外部条件下，不同蛋白质具有不同的溶解度。 1、等电点沉淀：原理：蛋白质处于等电点时，其净电荷为零，由于相邻蛋白质分子之间没有静电斥力而趋于聚集沉淀。因此在其他条件相同时，他的溶解度达到最低点。在等电点之上或者之下时，蛋白质分子携带同种符号的净电荷而互相排斥，阻止了单个分子聚集成沉淀，因此溶解度较大。不同蛋白质具有不同的等电点，利用蛋白质在等电点时的溶解度最低的原理，可以把蛋白质混合物分开。当pH被调到蛋白质混合物中其中一种蛋白质的等电点时，这种蛋白质大部分和全部被沉淀下来，那些等电点高于或低于该pH的蛋白质则仍留在溶液中。这样沉淀出来的蛋白质保持着天然的构象，能重新溶解于适当的pH和一定浓度的盐溶液中。 5、盐析与盐溶：原理：低浓度时，中性盐可以增加蛋白质溶解度这种现象称为盐溶.盐溶作用主要是由于蛋白质分子吸附某种盐类离子后，带电层使蛋白质分子彼此排斥，而蛋白质与水分子之间的相互作用却加强，因而溶解度增高。球蛋白溶液在透析过程中往往沉淀析出，这就是因为透析除去了盐类离子，使蛋白质分子之间的相互吸引增加，引起蛋白质分子的凝集并沉淀。当溶液的离子强度增加到一定程度时，蛋白质溶解程度开始下降。当离子强度增加到足够高时，例如饱和或半饱和程度，很多蛋白质可以从水中沉淀出来，这种现象称为盐析。盐析作用主要是由于大量中性盐的加入使水的活度降低，原来溶液中的大部分甚至全部的自由水转变为盐离子的水化水。此时那些被迫与蛋白质表面的疏水集团接触并掩盖他们的水分子成为下一步最自由的可利用的水分子，因此被移去以溶剂化盐离子，留下暴露出来的疏水基团。蛋白质疏水表面进一步暴露，由于疏水作用蛋白质聚集而沉淀。 盐析沉淀的蛋白质保持着他的天然构象，能再溶解。盐析的中性盐以硫酸铵为最佳，在水中的溶解度很高，而溶解度的温度系数较低。 3、有机溶剂分级分离法：与水互溶的有机溶剂（甲醇、乙醇和丙酮等）能使蛋白质在水中的溶解度显著降低。在室温下有机溶剂会引起蛋白质变性，如果预先将有机溶剂冷却到-40°C以下，然后在不断搅拌下逐滴加入有机溶剂，以防局部浓度过高，那么变性可以得到很大程度缓解。蛋白质在有机溶剂中的溶解度也随温度、pH和离子强度而变化。在一定温度、pH和离子强度条件下，引起蛋白质沉淀的有机溶剂的浓度不同，因此控制有机溶剂浓度也可以分

枯草芽孢杆菌常用培养基配方

枯草芽孢杆菌常用培养基配方： 1L蒸馏水+20g葡萄糖+15g蛋白胨+5g氯化钠+0.5g牛肉膏+20g琼脂 枯草芽孢杆菌原生质体的制备 1 培养枯草芽孢杆菌 取亲本菌株T4412、TT2 新鲜斜面分别接一环到装有液体完全培养基(CM)的试管中，36℃振荡培养14 h，各取1 mL 菌液转接入装有20 mL 液体完全培养基的250 mL 锥形瓶中，36℃振荡培养 3 h，使细胞生长进入对数前期，各加入25 u/mL 青霉素，使其终浓度为0.3 u/mL，继续振荡培养2 h。 2. 收集细胞 各取菌液10 mL，4000 r/min 离心10 min，弃上清液，将菌体悬浮于磷酸缓冲液中，离心。如此洗涤两次，将菌体悬浮10 mL SMM 中，每mL 约含108～109 活菌为宜。 3. 总菌数测定 各取菌液0.5 mL，用生理盐水稀释，取10-5、10-6、10-7 各1mL(每稀释度作两个平板)、倾注完全培养基，36℃培养24 h 后计数。此为未经酶处理的总菌数。 4. 脱壁 二株亲本菌株各取5 mL 菌悬液，加入5 mL 溶菌酶溶液，溶菌酶浓度为100 ug/mL，混匀后于36℃水浴保温处理30 min，定时取样，镜检观察原生质体形成情况，当95%以上细胞变成球状原生质体时，用4000 r/min 离心10 min，弃上清液，用高渗缓冲液洗涤除酶，然后将原生质体悬浮于5 mL 高渗缓冲液中。立即进行剩余菌数的测定。 5. 剩余菌数测定 取0.5 mL 上述原生质体悬液，用无菌水稀释，使原生质体裂解死亡，取10-2、10-3、10-4 稀释液各0.1 mL，涂布于完全培养基平板上，36℃培养24～48 h，生长出的菌落应是未被酶裂解的剩余细胞。 计算酶处理后剩余细胞数，并分别计算二亲株的原生质体形成率。原生质体形成率＝未经酶处理的总菌数一酶处理后剩余细胞数。