真核细胞转染试剂(

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Hifectin I 真核细胞转染试剂（Hifectin I transfection reagent）

货号：M080007

描述：Hifectin I真核细胞转染试剂由阳离子脂质体和辅助脂质以特定比例融合制备而成的单层脂质体悬液，可与DNA或RNA形成稳定的转染复合物进入细胞，并将核酸释放入细胞内。Hifectin I独特的制备方法增加了脂质体对真核细胞转染的高效性、广谱性、低毒性和可靠性，并使试剂在4°C储存至少稳定12个月。Hifectin I可高效转染多种细胞，属于可被生物降解的脂质体因而细胞毒性明显降低，转染效率与Invitrogen 的LipofectAMINE相当，但其价格仅相当同类试剂的1/3。转染时只需将Hifectin I稀释与DNA溶液混合并室温放置15分钟即可转染细胞。1 ml Hifectin I 可转染100-500μg DNA或50-100只35mm培养皿或250-1000孔24孔板细胞。

颜色：清亮或略呈白色胶体溶液。储存：4°C储存12个月。切勿冻存。

适用：将DNA、RNA、寡聚核苷酸转入真核细胞。适用于大多数传代或原代细胞。

转染步骤：以生长于24孔板的一个孔内的贴壁细胞为例，使用其它规格培养皿参见表一。

细胞准备：转染前一天传0.5-2 x 105细胞于24孔板内，加1 ml正常培养基培养。在光镜下观察细胞，当细胞群覆盖培养瓶皿生长表面的85-95%时，为Hifectin I转染的最佳时机。这通常需要18-24小时，但依细胞类型和接种量而变。注意：传代时接种过多的细胞，100%长满的细胞的转化效率明显降低。

制备转染复合物：对特定细胞类型来说，应该优化加入DNA (μg)和Hifectin I (μl)比率和绝对量，参见后面附表。推荐DNA和Hifectin I的初始比例为1:4。DNA (μg) ：Hifectin I (μl) ＝1:2～1:8

转染实际上是人为造成细胞对外源物质的高摄取状态，因此过量摄入DNA和转染试剂将导致细胞毒性而降低转染效率。与细胞接触的转染混合物中Hifectin I 的最大浓度不应超过30 μl/ml，DNA浓度应小于5μg/ml。参考表一制备转染复合物，参照表二进行优化。下面的步骤以生长于24孔板的单孔贴壁细胞为例。悬浮细胞转染参见表一后面的说明。

1. 取1 μg DNA稀释到25 μl 无血清无抗生素培养基，混匀。

2. 取2-8 μl Hifectin I 加入到25 μl 无血清抗生素培养基，轻轻混匀。

3. 吸取稀释的DNA溶液加入到稀释的Hifectin I溶液中，上下吹吸混匀，勿振荡。室温孵育15分钟。如果按照相反的顺序将稀释的Hifectin I溶液与DNA混合，将生成相反类型的DNA转染复合物，有可能会导致转染效率下降。

4. 在此期间用无血清培养基洗涤细胞1-2次，按照表一Step 5加入适宜的无血清无抗生素培养基。

5. 加入步骤3获得的转染复合物于培养瓶皿内，轻轻混合与细胞充分接触，开始转染细胞。

6. 二氧化碳孵箱37C孵育细胞4小时。

7. 吸除转染混合物，加入含血清的正常培养基；或直接将含血清培养基加到孔内，继续培养24小时以上。观察细胞，进行下一步实验。或1:10稀释传代，进行G418筛选。

DNA和转染试剂稀释表

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悬浮细胞转染：悬浮细胞转染与上述步骤类似：(1) 离心收取细胞，用不含血清培养基洗涤2次；将1 x 106 细胞混悬于1ml无血清培养基，加入6孔板内。(2) 按照表一制备转染复合物。将转染复合物加到悬浮细胞的培养基中，轻轻混匀。(3) 二氧化碳孵箱培养4小时。(4) 吸除转染混合物，换常规培养基，继续培养24小时以上。观察细胞或进行下一步实验如G418筛选。

转染优化程序：对特定类型的细胞，欲获得最大转染效率和最低细胞毒性，应该对加入DNA和Hifectin I 的绝对量和比率、浓度等分别进行优化，步骤参见表二。表二是生长于24孔板的单孔细胞为例进行优化操作的。由于可以理解的心理因素，实验人员在转染时常常趋于加入过量的DNA和转染试剂和使用更小的转染复合物体积。从表二可以计算，如果每孔加入1 μg DNA和8 μl Hifectin I，在200 μl转染混合物中，DNA的浓度将为5μg/ml，Hifectin I浓度达到40μl/ml，二者的浓度很容易产生细胞毒性；另外转染混合物体积很少时不利于操作也不利于细胞生长，不利于获得最佳转染效率。作为参考，通常最后的转染混合物中DNA浓度应小于5μg/ml，Hifectin I浓度应<30～40 μl/ml。表二给出DNA和转染试剂的量、比率、浓度等指标仅作为参考。

表二转染优化操作程序

1. 优化DNA:Hifectin I 比率，固定加入0.5 μg DNA

DNA : Hifectin I ratio 1:1 1:2 1:3 1:4 1:5 1:6

DNA μg in 25 μl 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5

Hifectin I μl in 25 μl 0.5 1 1.5 2 2.5 3

Add media μl 150 150 150 150 150 150

Final volume μl 200 200 200 200 200 200

Final DNA concentration μg/ml 2.5 2.5 2.5 2.5 2.5 2.5

Final Hifectin I concentration μl/ml 2.5 5 7.5 10 12.5 15

2. 优化DNA和Hifectin I 绝对剂量，固定DNA:Hifectin I 比率为1:3或1:4

DNA : Hifectin I ratio 1:3 1:3 1:3 1:3 1:3

DNA μg in 25 μl 0.2 0.4 0.8 1.2 1.6

Hifectin I μl in 25 μl 0.6 1.2 2.4 3.6 4.8

Add media μl 150 150 150 150 150

Final volume μl 200 200 200 200 200

Final DNA concentration μg/ml 1 2 4 6 8

Final Hifectin I concentration μl/ml 3 6 12 18 24

3. 优化DNA和Hifectin I 浓度，固定DNA和Hifectin I 绝对量和比率为1:3或1:4

DNA : Hifectin I ratio 1:3 1:3 1:3 1:3 1:3

DNA μg in 25 μl 1 1 1 1 1

Hifectin I μl in 25 μl 3 3 3 3 3

Add media μl 100 150 200 250 300

Final volume μl 150 200 250 300 350

Final DNA concentration μg/ml 6.7 5 4 3.3 2.85

Final Hifectin I concentration μl/ml 20 15 12 10 8.5

说明：使用高纯水和不含内毒素的质粒DNA、溶液、器皿。常规方法制备的质粒DNA含有大量内毒素，可明显降低降低转染效率。使用内毒素清除剂(Endotoxin Removal Reagent)清除内毒素。

LIPOFECTAMINE 2000转染试剂转染步骤

LIPOFECTAMINE 2000转染试剂转染步骤 24孔板贴壁细胞的瞬时或稳定转染实验步骤： （在生长培养基中直接加入复合物） 1.转染前一天，胰酶消化细胞并计数，将细胞转至24孔板，控制密度使其在转染日密度接近90%。细胞铺板在0.5ml含血清，不含抗生素的正常生长的培养基中。 2.对于每孔细胞，使用50μl OPTI-MEMⅠ培养基稀释1μl-3μl LIPOFECTAMINE 2000试剂。温柔混匀LIPOFECTAMINE 2000，室温温浴5分钟 （在5-25分钟内同稀释的DNA混合。保温时间过长会降低活性。可以批量制备。） 注意：即使LIPOFECTAMINE 2000使用OPTI-MEMⅠ稀释，细胞也可以使用D-MEM培养。 3.对于每孔细胞，使用50μl无血清培养基（如OPTI-MEMⅠ培养基）稀释0.8μg-1.0μg DNA。多孔操作可以批量制备。 4.混合稀释的DNA（由第3步）和稀释的LIPOFECTAMINE 2000（由第2步）。在室温保温20分钟。注意：溶液可能会混浊，但不会影响转染。复合物可以在室温保持6小时稳定。

5.直接将复合物（100μl）加入到每孔中，前后（或左右）摇动培养板，轻轻混匀。 注意：如果在无血清条件下转染，使用含血清的正常生长培养基进行细胞铺板。在加入复合物前移去生长培养基，替换为0.2ml无血清培养基。 6.在37℃，5％的CO2中保温18-48小时，无须去掉复合物或更换培养基或者在4-5小时后更换生长培养基也不会降低转染活性。 7.在细胞中加入复合物18-72小时后，分析细胞抽提物或进行原位细胞染色，检测报告基因活性。这依赖于细胞类型和启动子活性。对稳定表达，在开始转染一天后将细胞传代至新鲜培养基中（1：10），两天后加入筛选抗生素。进行稳定表达需要数天或数周。

转染步骤及经验(精华)

转染步骤及经验（精华） 一、基础理论 转染是将外源性基因导入细胞内的一种专门技术。分类：物理介导方法：电穿孔法、显微注射和基因枪；化学介导方法：如经典的磷酸钙共沉淀法、脂质体转染方法、和多种阳离子物质介导的技术；生物介导方法：有较为原始的原生质体转染，和现在比较多见的各种病毒介导的转染技术。理想细胞转染方法，应该具有转染效率高、细胞毒性小等优点。病毒介导的转染技术，是目前转染效率最高的方法，同时具有细胞毒性很低的优势。但是，病毒转染方法的准备程序复杂，常常对细胞类型有很强的选择性，在一般实验室中很难普及。其它物理和化学介导的转染方法，则各有其特点。需要指出的一点，无论采用哪种转染技术，要获得最优的转染结果，可能都需要对转染条件进行优化。影响转染效率的因素很多，从细胞类型、细胞培养条件和细胞生长状态到转染方法的操作细节（见后文）。 二、转染操作流程（以常用的6孔板为例） (1) 细胞培养： 取6孔培养板，以3x104/cm2密度铺板，37℃5%CO2培养箱中培养至70%～90%汇合。(不同细胞略有不同，根据实验室优化的条件进行，汇合过分，转染后不利筛选细胞)。 (2) 转染液制备： 在EP管中制备以下两液(为转染每一个孔细胞所用的量) A液：用不含血清培养基稀释1-10μg DNA，终量100μL， B液：用不含血清培养基稀释对应量的转染试剂，终量100μL； 轻轻混合A、B液（1:1混匀），室温中置15分钟，稍后会出现微浊现象，但并不妨碍转染。 (3) 转染准备：用2mL不含血清培养液漂洗两次，再加入2mL不含血清及PS的培养液。 (4) 转染：把A/B复合物缓缓加入培养液中（缓慢滴加），轻轻摇匀，37℃温箱置6～8小时，吸除无血清转染液，换入正常培养液继续培养。 三、转染注意事项 1. 血清 A. DNA-阳离子脂质体复合物形成时不能含血清，因为血清会影响复合物的形成。 B．一般细胞对无血清培养可以耐受几个小时没问题，转染用的培养液可以含血清也可以不加，但血清一度曾被认为会降低转染效率，转染培养基中加入血清需要对条件进行优化。 C. 对于对血清缺乏比较敏感的细胞，可以使用一种营养丰富的无血清培养基OPTI-MEMⅠ培养基， 或者在转染培养基中使用血清。对血清缺乏比较敏感的贴壁细胞，建议使用LIPOFECTAMINE 2000。无血清培养基OPTI-MEM(GIBICO)很好用，有条件的话，就用它代替PBS洗细胞两遍，注意洗的时候要轻，靠边缘缓缓加入液体，然后不要吹吸细胞，而是转动培养板让液体滚动在细胞表面。如果洗的太厉害，细胞又损失一部分，加了脂质体后，细胞受影响就更大了，死亡细胞会增多。 2.抗生素（PS） 抗生素，比如青霉素和链霉素，是影响转染的培养基添加物。这些抗生素一般对于真核细胞无毒，但阳离子脂质体试剂增加了细胞的通透性，使抗生素可以进入细胞。这降低了细胞的活性，导致转染效率低。所以，在转染培养基中不能使用抗生素，甚至在准备转染前进行细胞铺板时也要避免使用抗生素。这样，在转染前也不必润洗细胞。对于稳定转染，不要在选择性培养基中使用青霉素和链霉素，因为这些抗生素是GENETICIN选择性抗生素的竞争性抑制剂。另外，为了保证无血

各种转染试剂的中文转染方法

各种转染试剂的中文转染方法 FuGENE6（Roche）转染步骤： 转染前一天将细胞分至培养板，转染当天细胞应50-80％融合。将细胞以1-3×105/2 ml接种于6孔板后孵育过夜将达到如此密度。 将FuGENE6 Reagent在室温孵育10-15分钟。使用之前将FuGENE6颠倒混匀一下。 1. 在PCR管中加入不含血清和双抗的营养液以稀释FuGENE6，直至总体积到100 ul。 2. 将3-6 ul FuGENE6 Reagent直接加入营养液，轻弹管壁混合。 3. 加入1-2 ug的DNA溶液（0.02－2.0 ug/ul），轻弹管壁混合。 4. 室温孵育20分钟。 5. 将6孔板中的旧营养液吸出，加入约1 ml不含血清和双抗的营养液洗涤一次，再加入2 ml不含血清和双抗的营养液。 6. 将转染复合物加入细胞，混匀使之均匀分布。 7. 3-8小时后，加入血清或换成含血清的营养液。 Lipofectamine 2000(Invitrogen)转染试剂转染步骤（6孔板）： 1. 转染前一天，胰酶消化细胞并计数，细胞铺板，使其在转染日密度为90-95％。细胞铺板在2 ml含血清，不含抗生素的正常生长的培养基中。 2. 对于每孔细胞，使用250 ul无血清培养基（如OPTI-MEM I培养基）稀释4.0 ugDNA，轻轻混匀。 3. 使用前将Lipofectamine 2000转染试剂轻轻混匀，用250 ul无血清培养基（如OPTI-MEM I培养基）稀释10 ul Lipofectamine 2000转染试剂，轻轻混匀。Lipofectamine 2000稀释后，在5分钟内同稀释的DNA混合（<30分钟）。NOTE：若使用DMEM培养基，则需在5分钟内同稀释的DNA混合。 4. 混合稀释的DNA（第二步）和稀释的Lipofectamine 2000（第三步）。室温放置20分钟。 5. （optional）将6孔板中的旧营养液吸出，用无血清培养基清洗两次。加入2 ml无血清配养基。 6. 直接将复合物加入到每孔中，摇动培养板，轻轻混匀。 中保温24-48小时。无需去掉复合物或更换培养基。 7. 在37℃，5％CO 2 或者在4-5小时后更换培养生长基也不会降低转染活性。 8. 在细胞中加入复合物24-72小时后，分析细胞抽提物或进行原位细胞染色，检测报告基因活性。这依赖于细胞类型和启动子活性。对稳定表达，在开始转染一天后将细胞传代至新鲜培养基中，两天后加入筛选抗生素。进行稳定表达需要数天或数周。 贴壁细胞的稳定转染： 转染后24小时，将细胞以≥1:10的比例传代至新鲜培养基中，次日加入选择性培养基。 Lipofectamine 2000转染试剂转染步骤（24孔板）：

磷酸钙法细胞转染试剂盒

磷酸钙法细胞转染试剂盒 简介： 外源基因导入真核细胞的方法有很多种，如磷酸钙转染法、DEAE-葡聚糖转染法、脂质体法、电穿孔法、显微注射法等。Leagene 磷酸钙法细胞转染试剂盒(Calcium Phosphate Cell Transfection Kit)是在传统的磷酸钙细胞转染方法的基础上进行了改良，提高了转染效率，并降低了毒性，可用于磷酸钙法转染细胞，不仅可以瞬时表达，也可以筛选稳定株。 组成： 操作步骤(仅供参考)： (一)贴壁细胞转染： 1、 在转染前24h 用胰蛋白酶消化培养细胞，取适量对数期细胞转移至新的培养器皿中，待细胞密度大70～80%满时即可进行转染。后续操作步骤均按6孔板计算，如果转染器皿不同，请按比例自行调节用量。 2、 在加入DNA 之前2～4h ，加入2ml 不含抗生素的完全培养液，置于37℃ 5% CO 2培养箱培养。 3、 取DNA(体积不宜超过20μl)加入100μl Calcium chloride solution ，混匀，即为DNA-CaCl 2溶液。 4、 取BBS solution 100μl ，用移液器一边吹打BBS solution ，一边逐滴加入DNA-CaCl 2溶液(操作缓慢，一般在1～2min)。 5、 室温静置20～30min ，即为DNA-CaCl 2-BBS 溶液，此时可能出现极其微小颗粒沉淀。 6、 取DNA-CaCl 2-BBS 溶液底部物质均匀加入到6孔板细胞中，轻轻晃动混匀。 7、 置于37℃ 5% CO 2培养箱培养。 8、 去除培养液，用PBS 清洗细胞2次，加入2ml 完全培养液继续培养，一般24h 后可见转染细胞的表达。 (二)悬浮细胞转染： 1、 低速离心收集悬浮细胞，用PBS 洗涤1次。 2、 取DNA(体积不宜超过20μl)加Calcium chloride solution ，混匀，即为DNA-CaCl 2溶液。 编号 名称 CZ0008 100T CZ0008 200T Storage 试剂(A): Calcium chloride solution 10ml 20ml -20℃ 试剂(B): BBS solution 10ml 20ml -20℃ 使用说明书 1份

新型原代细胞转染试剂

简介 人们尝试过很多方法将质粒DNA 导入细胞，常用的有DEAE 右旋糖苷，磷酸钙沉淀，脂质体，显微注射和电击等物理方法。现有的转染技术都或多或少的有各种不足，其中转染效率低，细胞毒性高是研究者最常遇到的困扰；而许多细胞系，特别是原代细胞是很难获得理想的转染效果的。现有的转染试剂产品在应用中还有一个普遍的问题，就是不太可能采用单一一种试剂在各种细胞上都获得较高转染效率；因此研究者不得不尝试很多种类的转染试剂而获得特定细胞的最佳转染效果。如果某种转染试剂盒可以在各种细胞——包括哪些“抗拒转染”的细胞?——的转染实验中都能获得好结果，对于广大研究者来说将是一个福音。 为了达到研究者的这种期望，默克Novagen 经验丰富的研究团队开发了NanoJuice?转染试剂盒，其两种组分互相促进，可以提高各种哺乳动物细胞的转染效果。采用最新的纳米科学技术Priostar? dendrimers （树枝状聚合物） 和多价阳离子脂质体的特别设计，NanoJuice 转染试剂混合物可以确保获得卓越的转染效率而细胞毒性极低。这种新的转染方法会帮助研究者在原代细胞和那些“顽固抵抗转染”的细胞上轻易获得成功。NanoJuice 试剂盒中的两种试剂经过调节配比，很方便为不同的细胞设定最佳转染效果的使用方法。有了NanoJuice 转染试剂盒就再也不需要不断地为每一种细胞从头摸索不同转染方法或尝试各种产品了。我们建议您采用预试验为特定的细胞找到最佳试剂用量，通常这个小试可以在24孔板中进行；一旦最优化的转染试剂用量确定了，后续的操作可以在此基础上非常方便地用等比缩放来轻松获得稳定的高效转染。 确定最佳转染条件预实验 我们在一些原代细胞和其它较难转染的细胞上做了预试验，以便摸索试剂的最佳用量和配比。每个试验设定6种条件，包括每ug DNA 采用2种不同用量的NanoJuice 核心转染试剂和4种不同用量的转染增强试剂（图1）。通常，NanoJuice 的最适使用量范围是：核心转染试剂1-2ul / ug DNA ，转染增强试剂1-4ul / ug DNA 。预试验结果显示，每种细胞的最佳转染效果采用的两种转染试剂成分的比例可能差别甚大（图2）。我们的尝试表明每一种细胞均需设置预试验以获得最优化的实验条件，同时这些数据也证明了NanoJuice?转染试剂盒是一种多功能转染工具，可以作为各种细胞高效转染的首选。不断在各种细胞上尝试NanoJuice 转染试剂盒发现其两种试剂成分的用量可以根据不同细胞的实际情况有更大幅度的调整。例如：Caco-2细胞的预试验中，NanoJuice 核心转染试剂和转染增强试剂都是1ul / ug DNA 。而进一步的尝试发现两种试剂的用量可以更低一些，分别为1ul 和0.75ul ，而转染效率有小幅提高（图3）。 图1 确定最佳转染条件的预实验，尝试8种转染核心试剂与转染增强试剂的不同配比，每种做3个重复。 https://www.wendangku.net/doc/9b2431534.html, 第 2 页，共 21 页 下一页 返回

RFect小核酸转染试剂说明(单核细胞 转染)

RFect 小核酸转染试剂 货 号：11011: 0.5ml 11012: 1.0ml 储存条件：-20℃ 11013: 1.5ml 产品特点 应 用 产品介绍 RFect 小核酸转染试剂是国际知名科学家崔坤元博士领导我公司研发团队在美国西雅图实验室研发成功的一种新型的小核酸转染试剂。RFect 可用来转染siRNA 、antisense RNA 、microRNA 等200bp 以内的小分子RNA 和DNA ，转染细胞包括绝大多数贴壁生长的细胞，如一般细胞株、肿瘤细胞株等。目前，无论国外还是国内，转染试剂的主要成分均为脂质体或聚乙烯亚胺(Polyethylenimine, PEI)，这两种成分都具有很大的细胞毒性，并且转染效果不好。RFect 采用新型的动物源性的纳米材料，毒性很低并且拥有非常卓越的转染性能。与其它品牌的小核酸转染试剂相比，RFect 的细胞转染阳性率一般在90%以上，Lamin A/C 基因抑制效率在95%以上，而其它品牌转染试剂的细胞转染阳性率一般不超过70%，Lamin A/C 基因抑制效率不超过75%。RFect 细胞毒性很低，转染细胞死亡率不到10%，而其它品牌试剂的转染细胞死亡率一般在30%以上。血清对转染效果没有影响，不必刻意添加或更换培养液。有关RFect 小核酸转染试剂的材料合成和试剂配制我们已申请了国际专利，并通过PCT 覆盖国际上多个国家和地区。 操作步骤：本说明书适用于24孔培养板的转染实验，其他规格的培养板的用量参照下面表格，表格给出的是每孔的用量与体积。 A. 细胞接种：转染前一天接种细胞，每孔 500 μl 培养基（不可加抗生素），使细胞在转染时密度在30-50% 。 B. siRNA-RFect 混合物准备： 1. 6pmol siRNA 用50μl 无血清培养基稀释。 2. 2μl RFect 用50μl 无血清培养基稀释。轻轻混匀，室温孵育5min 。注意：确保在25 min 内执行第三步操作，不要过于延迟。 3. 孵育5min 后，将siRNA 稀释液与RFect 稀释液混合（总体积100μl ）。轻轻混匀，室温孵育20 min 。 C. 将混合物加到培养的细胞内（完全培养基培养）： 1. 将100μl 混合物加入培养孔内，培养孔内含有0.5ml 培养的细胞。轻轻晃动培养板，混匀。 2. 37°C 培养18-72h ，检测基因抑制效果。如果需要，细胞培养4-6h 时可以更换培养基，但不是必须。孵育时间的长短，取决于细胞类型、 所干扰基因本身及分析方法。可设置不同的孵育时间进行实验以确定最佳孵育时间。 转染实验要点： ● 转染过程不可添加抗生素，否则会导致细胞死亡； ● 首次实验siRNA 的用量可稍大（一般10 nM ） ，后续实验根据实验结果修改。 RFect Transfection Reagent Formats for Various Cell Culture Vessels Culture vessel Surface area/well (cm 2) Vol. of growth medium (μl) Vol. of dilution medium (μl) siRNA Amount (pmol) RFect (μl) 96-well 0.3 100 2 x 10 1.2 0.4 48-well 0.8 250 2 x 25 3 1 24-well 2 500 2 x 50 6 2 12-well 4 1000 2 x 100 12 4 ◎卓越的细胞转染性能：细胞转染阳性率高达90%以上，基因敲除效果明显，A549细胞Lamin A/C 基因敲除效率在95%以上 ◎极低的细胞毒性：转染细胞死亡率不到10%，大大降低了因细胞毒性对实验结果的影响 ◎转染细胞范围广，绝大多数贴壁细胞株都能获得比较理想的转染结果 ◎siRNA 转染 ◎antisense RNA 转染 ◎200bp 内的小分子DNA 转染

细胞转染的详细过程

细胞转染的详细过程 1、准备工作如下： 1)从pFastBacTM construct中纯化重组的bacmind DNA(500ng/μl溶于TE中) 从相应的pFastBacTM construct对照中纯化bacmind DNA(500ng/μl溶于TE中)。 细胞培养在适合的培养基中。 细胞转染剂Cellfectin（4℃储存）无任何添加物（例如：FBS，抗生素等）的细胞培养基。用于细胞培养的完全生长培养基（例如：Sf-900ⅡSFM TNMFH 或其他适合的培养基）。2)在6孔板或是35毫米dish上，每孔培养9*105Sf9细胞，细胞培养于2ml含抗生素的生长培养基中。 3)细胞在27℃孵育至少一小时。 4)对于每一个转染的样品，准备bacmid DNA：与细胞转染剂在12*75mm消毒管中进行如下混合： 用100μl无血清培养基稀释1μl纯化的bacmid DNA。 用100μl无血清培养基稀释6μl 细胞转染剂。 将bacmind DNA与细胞转染剂进行混合，动作要轻柔，混合物在室温下孵育45分钟。 5)当DNA与脂质体进行孵育时，移去细胞原有的培养基并用2ml无血清培养基洗一次，移去用来清洗的无血清培养基。 6)在每一个含有DNA与脂质体混合物的管子中加入0.8ml无血清培养基，轻柔混合，分别把DNA与脂质体混合物加入含有细胞的孔中。 7)细胞在27℃孵育5小时。 8)从细胞中移去DNA与脂质体混合物加入2ml完全生长培养基。 9)将细胞在27℃进行孵育，实验人员必须每日观察，记录转染细胞的生长状态，细胞在转染后48小时长势应该比较良好，但72小时后直至可以看到明显的病毒感染的细胞病变。 2、第一代代病毒的收集与保存 1)当转染的细胞呈现出感染后期的形态时，收集每孔含有病毒的上清，转移到灭菌的15ml 压盖管中。 2)以500*g离心5分钟，从而移去上清中所含有的细胞及大的碎片。 3)将离心后的上清移到新的15ml压盖管中，用来保存第一代病毒，存放于4℃避光保存。 3、病毒的保存 1)病毒存放于4℃避光保存。 2)如果用的是无血清培养基，则加入终浓度为2%的FBS 。血清蛋白可以作为蛋白酶的底物。 3)长期保存时将一部分病毒储存在-80℃用于病毒的重新扩增。 4)病毒的常规储存不要低于4 ℃.病毒经过反复冻融会使其滴度下降10 到100倍。 4、杆状病毒的扩增 1)准备sf9细胞，2*106/孔，在室温孵育1小时。 2)在孵育1小时以后，用倒置显微镜观察昆虫细胞的贴壁情况。 3)在每孔中加入适量的P1代病毒。 4)在27℃进行孵育48小时。 5)在感染后48小时，收集每孔含有病毒的上清，转移到灭菌的15ml压盖管中。以1000*g 离心5分钟，从而移去上清中所含有的细胞及大的碎片。 5、病毒空斑分析 1)准备工作如下： 澄清的杆状病毒保存于4℃ 培养在适当培养基中的sf9细胞（30ml 5*105/ml对数生长期的细胞用于每一个滴度的杆状

各种转染试剂中文说明

FuGENE6（Roche）转染步骤: 转染前一天将细胞分至培养板，转染当天细胞应50-80％融合。将细胞以1-3×105/2ml接种于6孔板后孵育过夜将达到如此密度。 将FuGENE6 Reagent在室温孵育10-15分钟。使用之前将FuGENE6颠倒混匀一下。 1.在PCR管中加入不含血清和双抗的营养液以稀释FuGENE6，直至总 体积到100ul。 2.将3-6ul FuGENE6 Reagent直接加入营养液，轻弹管壁混合。 3.加入1-2ug的DNA溶液（0.02－2.0ug/ul），轻弹管壁混合。 4.室温孵育20分钟。 5.将6孔板中的旧营养液吸出，加入约1ml不含血清和双抗的营养液 洗涤一次，再加入2ml不含血清和双抗的营养液。 6.将转染复合物加入细胞，混匀使之均匀分布。 7.3-8小时后，加入血清或换成含血清的营养液。 Lipofectamine 2000(Invitrogen)转染试剂转染步骤（6孔板）： 1.转染前一天，胰酶消化细胞并计数，细胞铺板，使其在转染日密度为90-95％。 细胞铺板在2ml含血清，不含抗生素的正常生长的培养基中。 2.对于每孔细胞，使用250ul无血清培养基（如OPTI-MEM I培养基）稀释 4.0ugDNA，轻轻混匀。 3.使用前将Lipofectamine 2000转染试剂轻轻混匀，用250ul无血清培养基（如 OPTI-MEM I培养基）稀释10ul Lipofectamine 2000转染试剂，轻轻混匀。 Lipofectamine 2000稀释后，在5分钟内同稀释的DNA混合（<30分钟）。 NOTE：若使用DMEM培养基，则需在5分钟内同稀释的DNA混合。 4.混合稀释的DNA（第二步）和稀释的Lipofectamine 2000（第三步）。室温放 置20分钟。 5.（optional）将6孔板中的旧营养液吸出，用无血清培养基清洗两次。加入 2ml无血清配养基。 6.直接将复合物加入到每孔中，摇动培养板，轻轻混匀。

细胞转染的操作步骤

细胞转染的操作步骤 转染，是将外源性基因导入细胞内的一种专门技术。随着基因与蛋白功能研究的深入，转染目前已成为实验室工作中经常涉及的基本方法。转染大致可分为物理介导、化学介导和生物介导三类途径。电穿孔法、显微注射和基因枪属于通过物理方法将基因导入细胞的范例；化学介导方法很多，如经典的磷酸钙共沉淀法、脂质体转染方法、和多种阳离子物质介导的技术；生物介导方法，有较为原始的原生质体转染，和现在比较多见的各种病毒介导的转染技术。红外碳硫仪理想细胞转染方法，应该具有转染效率高、细胞毒性小等优点。病毒介导的转染技术，是目前转染效率最高的方法，同时具有细胞毒性很低的优势。但是，病毒转染方法的准备程序复杂，常常对细胞类型有很强的选择性，在一般实验室中很难普及。其它物理和化学介导的转染方法，则各有其特点。 >需要指出的一点，无论采用哪种转染技术，要获得最优的转染结果，可能都需要对转染条件进行优化。影响转染效率的因素很多，从细胞类型、细胞培养条件和细胞生长状态，到转染方法的操作细节，都需要考虑。 一、细胞传代 1. 试验准备：200ul/1mlTip头各一盒（以上物品均需高压灭菌），酒精棉球，废液缸，试管架，微量移液器，记号笔，培养皿，离心管。 2. 弃掉培养皿中的培养基，用1ml的PBS溶液洗涤两次。 3. 用Tip头加入1ml Trypsin液，消化1分钟。用手轻拍培养瓶壁，观察到细胞完全从壁上脱落下来为止。 4. 加入1ml的含血清培养基终止反应。 5. 用Tip头多次吹吸，使细胞完全分散开。 6. 将培养液装入离心管中，1000rpm离心5min。 7. 用培养液重悬细胞，细胞计数后选择0.8X10⁶个细胞加入一个35mm培养皿。8. 将合适体积完全培养液加入离心管中，混匀细胞后轻轻加入培养皿中，使其均匀分布。 9. 将培养皿转入培养箱中培养，第二天转染。 二、细胞转染 1. 转染试剂的准备 ①将400ul去核酸酶水加入管中，震荡10秒钟，溶解脂状物。 ②震荡后将试剂放在－20摄氏度保存，使用前还需震荡。 2. 选择合适的混合比例（1：1－1：2/脂质体体积：DNA质量）来转染细胞。在一个转染管中加入合适体积的无血清培养基。加入合适质量的MyoD或者EGFP的DNA，震荡后在加入合适体积的转染试剂，再次震荡。 3. 将混合液在室温放置10―15分钟。 4. 吸去培养板中的培养基，用PBS或者无血清培养基清洗一次。 5. 加入混合液，将细胞放回培养箱中培养一个小时。 6. 到时后，红外碳硫仪根据细胞种类决定是否移除混合液，之后加入完全培养基继续培养24－48小时。三、第二次细胞传代1. 在转染后24小时，观察实验结果并记录绿色荧光蛋白表达情况。 2. 再次进行细胞传代，按照免疫染色合适的密度0.8X10 个细胞/35mm培养皿将细胞重新转入培养皿中。 3. 在正常条件下培养24小时后按照染色要求条件固定。

jetPRIME转染试剂说明

Polyplus-transfection S.A. - Bioparc - 850 Bd S. Brant - 67400 Illkirch - France - Phone: +33 3 90 40 61 80 - Fax: +33 3 90 40 61 81 Polyplus-transfection Inc. - 1251 Ave of the Americas - 34th fl. - New-York - NY 10020 - USA https://www.wendangku.net/doc/9b2431534.html, jetPRIME? in vitro DNA & siRNA transfection reagent PROTOCOL DESCRIPTION jetPRIME? is a novel powerful molecule based on a polymer formulation manufactured at Polyplus-transfection?. jetPRIME? ensures effective and reproducible DNA and siRNA transfection into mammalian cells. jetPRIME? is extremely efficient on a wide variety of cell lines. This powerful reagent only requires low amounts of nucleic acid per transfection, hence resulting in very low cytotoxicity . 1 Transient DNA transfection protocol (2) 1.1 Cell seeding .......................................................................................................................................... 2 1.2 DNA transfection protocol ................................................................................................................... 2 1.3 Virus production in adherent cells ....................................................................................................... 5 1.4 Optimization guidelines (5) 2 siRNA transfection protocol (6) 2.1 Cell seeding .......................................................................................................................................... 6 2.2 siRNA transfection protocol .. (7) 3 DNA & siRNA cotransfection protocol (7) 3.1 Cell seeding .......................................................................................................................................... 7 3.2 DNA & siRNA cotransfection protocol . (8) 4 Transfection of CRISPR/Cas9 ..................................................................................... 9 5 Stable DNA transfection ............................................................................................. 9 6 Troubleshooting ....................................................................................................... 10 7 Product information (11)

转染试剂使用注意事项.doc

转染试剂使用注意事项 1.细胞密度：转染DNA（质粒）时，细胞密度为80-100%，转染RNA(siRNA 或miRNA)时，细胞密度为60-80%，具体细胞密度必须结合考虑核酸种类、转染试剂种类和细胞生长密度极限； 2.DNA用量：0.5-1ug/孔（以24孔板为例），具体用量根据转染效率检测实验 确定； 3.RNA用量：10-30 pmol/孔（以24孔板为例），具体用量根据转染效率检测实 验确定； 4.转染试剂的用量：转染试剂说明书推荐了一个使用范围，具体用量根据转染 效率检测实验确定； 5.根据转染效率检测实验确定核酸的用量及转染试剂的用量（核酸与转染试剂 的比例关系），转染效率检测实验一般在24孔板中进行，其他格式的培养器皿请根据底面积的比例（表1）进行计算； 6.转染试剂使用前才从4℃中取出，取用前，先短暂离心（转速达到3000RPM 时即可停止），然后放在涡旋振荡器上点动混匀三次，每次持续1秒，混匀后短暂离心（转速达到3000RPM时即可停止），上述措施是为了混匀转染试剂，保证使用效果，使用后立即放回4℃保存； 7.核酸和转染试剂分别用Opti-MEM（这是专用的转染稀释培养基，如果没有 Opti-MEM，可以用细胞对应的基础培养基代替）稀释，稀释的核酸可以通过弹匀，吹打均匀，颠倒混匀或涡旋点动混匀（三次，每次持续1秒），稀释的转染试剂可以通过弹匀，颠倒混匀或涡旋点动混匀（三次，每次持续1秒），不可使用吹打均匀；混匀后均需短暂离心； 8.把稀释的核酸和稀释的转染试剂复合混匀时，应该把稀释的核酸加入稀释的 转染试剂中（顺序不可调转）；加入后立即进行（不要耽搁）弹匀或颠倒混匀（稀释的核酸和稀释的转染试剂一旦复合，转染复合物的形成立即启动，如果不及时混匀，所形成的转染复合物的效率就会很低），先不进行短暂离心，待所有的管子复合完毕后，在一起进行涡旋点动混匀三次，每次持续1秒，然后短暂离心； 9.转染复合物孵育形成时尽量避光室温或37℃放置；

细胞转染操作步骤

RNAi or siRNA Transfection 以24孔板为例，其余规格的转染见表1 1 中板，细胞密度为30-50%适宜。 注意：根据转染后细胞检测时间长短决定细胞中板密度，如果转染后需要长时间后检测，则细胞中板密度适当降低，已避免细胞过度生长导致存活降低。 2 第二天（24-36小时后）每个孔转染方式如下： A 将20pmol siRNA溶于50ul Opti-mem无血清培养基中。 B 将1ul lipo2000溶于50ul Opti-mem无血清培养基中，混匀室温放置5min。 C 将A B两管混合，放置20min。 3 转染期间，将24孔板培养基换成无血清培养基，每孔400ul。将C管mix加入24孔板对应孔中，4-6小时候换成有血清培养基。 Plasmid DNA Transfection DNA(ug):lipo 2000(ul)=1:2-3 转染时细胞密度越高，转染效率，表达效率也越高，并且可以降低细胞毒性。 1 中板。 贴壁细胞：0.5-2X105 cells/well，第二天待细胞密度达到90%以上时转染 悬浮细胞：4-8X105 cells/well，中板后随即转染。 2 转染。 A 将0.8ug DNA溶于50ul Opti-mem无血清培养基中。 B 将2ul lipo2000溶于50ul Opti-mem无血清培养基中，混匀室温放置5min。 C 将A B两管混合，放置20min。 转染期间，将24孔板培养基换成无血清培养基，每孔400ul。将C管mix

加入24孔板对应孔中，4-6小时候换成有血清培养基。 Table 1. Culture Shared reagents DNA transfection RNAi transfection 中板密度*Culture vessel Surf. area per well Vol. of plating medium Vol. of dilution medium DNA Lipofectamine ?2000 cell/well 96-well0.3cm2100ul2X25ul0.2ug0.5ul 0.5-2X105 cell/well 24-well2cm2500ul2X50ul0.8ug 2.0ul 1-3X105 cell/well 12-well4cm21ml2X100ul 1.6ug 4.0ul 2-3X105 cell/well 6-well (35mm) 10cm22ml2X250ul 4.0ug**10ul 8-10X105 cell/dish 60mm20cm24ml2X0.5ml8.0ug***20ul 2-3X106 cell/dish 10cm60cm215ml2X1.5ml24ug60ul *：中板密度根据不同细胞不同实验有所不同，这里仅提的数据仅供参

蛋白质专用转染试剂

蛋白质专用转染试剂 ● 多肽及小蛋白（如组蛋白，~11 kDa ）， ● 大蛋白（如抗体，~150 kDa ） ● 多分子蛋白复合物（半乳糖苷酶四聚体，~465 kDa ） 将蛋白导入细胞可以用于蛋白－蛋白相互作用，蛋白运转，细胞周期，信号传导通路，细胞凋亡通路，转录因子介导的基因调节等研究。将蛋白直接转染到细胞里也是研究特定蛋白对哺乳动物细胞的影响的最为迅速的方法。Novagen 的ProteoJuice TM 和Stratagene 的 BioTrek TM 是目前市售产品中适用细胞品种较多，对于哺乳动物细胞毒性极小的两种经过广泛测试的高效蛋白转染试剂。 BioTrek TM 蛋白转染试剂 已成功转染的细胞：293 B16-F0，BHK-21，CHO-K1，COS-1，COS-7， CV-1， HeLa ，HeLa-S3，HepG2，Jurkat ， K562Ki-Ras 267 β1， MDCK ，NIH 3T3，P19 转染试剂冻干粉 β-半乳糖苷酶对照10 μg FITC 标记山羊IgG 对照10 ug 包装 货号 24rxn #204140 ProteoJuice 蛋白转染试剂 已成功转染的细胞：A549，COS-7，HepG2，MCF-7，PC12，BHK-21，CV-1，HEK-293，Neuro2A ，Raw 264.7，CHO-K1，HeLa L6，NIH-3T3 包装 货号 0.125 ml 71281-3 4 × 0.125 ml 71281-4 质谱法（MS ）是蛋白质组学中鉴定蛋白品种的核心技术。蛋白MS 分析需要将蛋白按特定要求消化成多肽，再利用软件得到其序列及特性信息。胰蛋白酶能特异性地从赖氨酸和精氨酸残基的羧基端进行切割，产生符MS 分析所需要大小的肽段，因此胰蛋白酶是MS 实验中的重要工具之一。 Stratagene 的MS 级胰蛋白酶 纯度极高，克服了天然胰蛋白酶和非MS 级的胰蛋白酶的主要缺限，成为MS 的必然之选： ● 决无自我消化之虞：不会干扰目的蛋白的分析 经过甲基化修饰，消化活性只会针对目的蛋白；更不会产生糜蛋白酶这种活性更广的副产物 ● 杜绝任何可能的糜蛋白酶活性干扰 特别经过TCPK 处理，解决了其它胰蛋白酶产品的主要质量问题 ● 专为MS 应用而设计 Stratagene 著名的QuikChange 定点突变试剂盒家族的新成员 QuikChange TM Multi 多点突变试剂盒 用QuikChange TM Multi 多点突变试剂盒可以在短短1天时间内完成克 隆在如何质粒上多达5个点的突变，而不是通常方法的几天甚至数周！ ● 简单、高效、1天完成多点突变的全新方法 ● 可以从任何质粒开始，完全没有任何前处理步骤（如：亚克隆） ● 每个突变点设计一条引物，可以使用简并引物，省钱省时 ● 决无意外突变 ● 提供高效XL-10 Gold 超级感受态细胞 第1步 生成突变链 进行温度循环： 1) 模板DNA 变性 2) 突变引物退火 (所有的引物结合于同一条链) 3) 引物延伸，并用QuikChange Multi enzyme TM 封闭缺刻 第2步 Dpn I 消化模板DNA 用Dpn I 消化甲基化和半甲基化DNA 第3步 转化 将突变产物ssDNA 转入XL10-Gold 超级感受态细胞 QuikChange TM Multi 多点突变试剂盒

转染试剂

自1978年William Linton 先生在美国威斯康辛州麦迪逊市（就是《廊桥遗梦》那里哦）创立Promega以来，今年已经是第26个年头了，也是Promega进驻中国的20周年――这个几乎可以说是国内生物技术最早的启蒙者之一的品牌非常了解国内科研经费来之不易，在进口品牌中以价格算可亲而广受欢迎。Promega的转染试剂产品由于市场定位较准确，获得的业内评价不错，尤其是在其价格经济实惠前提下，产品质量并没有因此打折扣（就是性价比高咯）。 1. siRNA转染试剂 CodeBreaker? siRNA转染试剂是Promega的专利配方产品，专门为有效转染siRNA而优化设计。这一试剂能有效促进siRNA转染哺乳动物细胞，促进基因沉默，而且毒性小，细胞死亡率低，比如转染CHO与HeLa细胞，使用CodeBreaker基因沉默率达到80%或更多，比起同类产品毒性小50%以上。这一产品操作简便，买来后即可使用，不用溶解。将CodeBreaker转染试剂与合适的siRNA二聚物混合后孵育几分钟，然后加到培养细胞即可。而且转染可在完全生长培养基中进行，不需要更换培养基或再加血清，简化了操纵步骤（见下）。CodeBreaker试剂适用的细胞有HeLa、HEK293、293T、CHO 和 3T3细胞等。价格1800/0.4ml，以24孔板为例，按照推荐剂量可以可以做200次，6孔板大约可用40次左右。Day One：细胞铺板 (in complete growth medium). Day Two 1. 将CodeBreaker? Reagent加到无血清培养基中，混合均匀，室温孵育15—20分钟。。 2. 制成复合物：加入siRNA到第二步中，轻微混合。室温孵育15—20分钟。 3. 然后与细胞混合，37°C培育24—72小时，OK，检测吧。 2. DNA转染试剂 Transfast? 是一种特殊的脂质体转染试剂，由阳离子脂类（+） -N,N[bis(2-hydroxyethyl)]-N-methyl-N-[2,3-di(tetradecanoyloxy)propyl]和中性脂类DOPE（用于加强转染能力）组成。TransFast试剂是干脂膜，一旦水化后就形成多层脂质体，因此也就具有更多优势，尤其表现在可以传递多种生物大分子－－小的从寡聚核苷酸，到质

细胞转染的步骤

【试剂与仪器】 1 ．小牛血清。 2 ．双抗溶液（链霉素100μg+ 青霉素100 单位）。 3 ．DMEM 培养基。 4 ．转染试剂（LIPOFECTAMINE 2000 ）。 5 ．细胞培养基（DMEM+10%NCS ）。 6 ．PBS 。 7 ．无血清培养基。 8 ．胰酶（Trypsin ）。 9 ．培养皿，移液管，量筒，恒温水浴箱，离心机，15ml 离心管，微量移液器，荧光显微镜和CCD 。 【操作步骤】 1 ．转染前一天，胰酶消化细胞并计数，细胞铺板，使其在转染日密度为90% 。细胞铺板在0.5ml 含血清，不含抗生素的正常生长的培养基中。 2. 对于每孔细胞，使用50μl 无血清DMEM 培养基稀释0.8μg-1.0μg DNA 。多孔操作可以批量制备。 3. 对于每孔细胞，使用50μl DMEM 培养基稀释1μl-3μl LIPOFECTAMINE 2000 试剂。LIPOFECTAMINE 2000 稀释后，在5 分钟内同稀释的DNA 混合。保温时间过长会降低活性。 4. 混合稀释的DNA （由第2 步）和稀释的LIPOFECTAMINE 2000 （由第3 步）。在室温保温20 分钟。注意：溶液可能会混浊，但不会影响转染。复合物可以在室温保持6 小时稳定。 5. 直接将复合物加入到每孔中，摇动培养板，轻轻混匀。注意：如果在无血清条件下转染，使用含血清的正常生长培养基进行细胞铺板。在加入复合物前移去生长培养基，替换为0.5ml 无血清培养基。 6. 在37℃，5 ％的CO 2 中保温24-48 小时，无须去掉复合物或更换培养基或者在4-5 小时后更换生长培养基也不会降低转染活性。 7. 在细胞中加入复合物24-72 小时后，分析细胞抽提物或进行原位细胞染色，检测报告基因活性。这依赖于细胞类型和启动子活性。对稳定表达，在开始转染一天后将细胞传代至新鲜培养基中，两天后加入筛选抗生素。进行稳定表达需要数天或数周。

Hieff TransTM脂质体核酸转染试剂说明书

Hieff Trans TM脂质体核酸转染试剂说明书 产品描述 Hieff Trans TM脂质体核酸转染试剂是一种多用途的脂质体转染试剂，适用于DNA、RNA 和寡核苷酸的转染，对大多数真核细胞具有很高的转染效率。其独特的配方使其可直接加入培养基中，血清的存在不会影响转染效率，这样可以减少去除血清对细胞的损伤。转染后不需要除去核酸-Hieff Trans TM复合物或更换新鲜培养基，也可在4～6小时后除去。 Hieff Trans TM以无菌的液体形式提供。通常情况下对于 24 孔板转染，每次用1.5μl左右，则1ml Hieff Trans TM约可做660次转染；对于6孔板，每次用6μl左右，则1ml Hieff Trans TM约可做160 次转染； 运输与保存方法 冰袋（wet ice）运输。产品4oC保存，一年有效。不可冷冻！ 注意事项 1）Hieff Trans TM脂质体核酸转染试剂要求细胞铺板密度较高，以90%-95%为佳，这有助于减少阳离子脂质体细胞毒性造成的影响；如果你研究的基因要求比较长的表达时间，比如细胞周期相关基因，或者细胞表面蛋白，最好选择细胞铺板密度要求较低的转染试剂，不适合用脂质体核酸转染试剂。 2）Hieff Trans TM脂质体核酸转染试剂可用于有血清培养基的转染，并且转染前后不需要换培养基。但是，制备转染复合物时要求用无血清培养基稀释DNA和转染试剂，因为血清会影响复合物的形成。另外，要检测所用的无血清培养基与脂质体核酸转染试剂的相容性，已知CD293, SFMII, VP-SFM 就不相容。 3）转染的时候培养基中不能添加抗生素。 4）使用高纯度的DNA或RNA有助于获得较高的转染效率，质粒中的内毒素是转染的大敌。 5）阳离子脂质体应该在4度保存，要注意避免多次反复长时间开盖，因为可能会导致脂质体氧化而影响转染效率。 6）初次使用应优化DNA浓度和阳离子脂质体试剂量以得到最大的转染效率。DNA 和转染试剂的比例，通常推荐是1:2-1:3，比如24孔板内接种0.5-2×105个细胞，使用0.5 μg DNA 和1-1.5 μl 转染试剂。通过调整DNA/Hieff Trans TM脂质体核酸转染试剂比例优化转染效率，保证细胞密度大于90%，DNA（μg）: Hieff Trans TM（μl）比值在1：0.5-1：5。