PCR-ELISA DIG检测系统生产辣根过氧化物酶共轭的抗地高 辛抗体

PCR-ELISA DIG检测系统生产辣根过氧化物酶共轭的抗地高

辛抗体

Pooria Gill, Mehdi Forouzandeh, Fatemeh Rahbarizadeh,Reihaneh Ramezani, and Mohammad Javad Rasaee

伊朗德黑兰Tarbiat Modarres医药生物科技大学

摘要有几种方法用来观察最终产品的聚合酶链式反应。ELISA-based检测系统(PCRELISA)是其中的一种方法。它是非常敏感的,可以由一个比色法来测量定量PCR产物。根据这种方法, 从基因组复制的DNA片段和用注册的digoxigenin -11-dUTP进行PCR扩增。用碱使微量滴定板中的样品变性并用生物素标记的核酸探针转到链霉亲和素涂层板上。使用所产生的结合辣根过氧化物酶抗地高辛抗体和底物和2,20-azino-di-3-ethylbenzthiazolinsulfonate(ABTS)探测到突变的DNA。这种系统中的一个核心做法是抗体是结合辣根过氧化物酶的抗地高辛抗体。这里描述的是准备,纯化,标记用在PCR-ELISA检测系统中的结合辣根过氧化物酶的抗地高辛抗体。几个生化协议和修改用于增加产品结合的敏感性和特异性及完善性。

关键词:牛血清蛋白地高辛结合物,结合辣根过氧化物酶的抗地高辛抗体

引言

聚合酶链式反应(PCR)是一种最常用的分子生物技术，它是用来扩增核酸的。Tarbiat Modarres,伊朗德黑兰大学Mehdi Forouzandeh生物医药科技部的通信地址：E-mail:foroz@modares.ac.irsequences.[1] 针对不同不敏感性的PCR产品检测程序有所不同。使用一个比色板ELISA-based检测系统开发的提供高敏感性及定量检测PCR产物PCR-ELISA在一个microtiter allele-specific杂交格式增的进行PCR扩组合。[2,3] 通过这种方法检测个别微生物和基因突变的等位基因是有可能的。[4–6] 但是有几个报告显示这种方法很昂贵[4,5] 为克服这一难题, 我们打算在我们实验室生产主要组成部分，以使测试成本降到一个日常使用的合理数目.在本研究中, 我们准备的精确的表征PCR-ELISADIG检测组件最关键的部分，即与辣根过氧化物酶结合的抗地高辛抗体。

实验

挑选Digoxigenin-3-O-methylcarbonyl-1-aminocaproic 结合N-Hydroxysuccinamide 酯酸的牛血清白蛋白为载体蛋白质,为免疫原和digoxigenin-BSA结合做准备。[7]上海的摩尔反应混合物,digoxigenin-3-O-methylcarbonyl -1-aminocaproic酸酯是

N-hydroxysuccinamide 1:70。4.62毫克上海粉(σ)溶解在15毫升的磷酸盐缓冲生理盐水(PBS),pH值为8.5,冷却,在一个冰浴在30分钟内平和搅拌。3.27 mg digoxigenin-3-O-methylcarbonyl-1-aminocaproic acid N-hydroxysuccinamide酯(Roche) 溶解在 8.18 mL 二甲亚砜(DMSO, Sigma) 在暗室搅拌孵育30分钟，在牛血清蛋白中逐滴加入反应混合物搅拌冰浴 4 h。为消除未反应的digoxigenin-3-O-methylcarbonyl-1-aminocaproic acid N-hydroxysuccinamide ester 和溶剂，dialyzed against用PBS (pH 7.0–7.2)缓冲溶液在48C搅拌透析digoxigenin-BSA 共轭溶液 24 h 。200 mL 这种共轭液混入800 mL of 冰硫酸，据记录其吸光波谱波长范围为340 nm 到 450 nm.[8] 可测最终Tdigoxigenin-BSA 共轭的浓度。

[9]

用非特异性酶联免疫吸附定性检测试验准备好的牛血清蛋白共轭的地高辛。

用5毫克/ 100毫升,10毫克/ 100毫升牛血清蛋白共轭的地高辛覆盖微量滴定板(其中PBS的pH值为7.0 ~ -7.2,37℃过夜）

生产辣根过氧化物酶标记的抗地高辛抗体

用5% 脱脂奶封闭(在PBS缓冲液中, pH 7.0–7.2, 37℃ 1 h ).[10]用5毫克/ 100毫升,10毫克/100毫升牛血清蛋白包微量滴定版同时阻遏非特异性结合。在通用共轭缓冲液(罗氏)中准备两种抗地高辛抗体稀释液(1:1,500和1:3,000)，取100毫升添加稀释。用pH 7–7.2磷酸盐缓冲液冲洗5次。在00 mL/well ABTS 基质液(Roche) 37℃热 30 min 用对频道ELISA 检测器(Tecan)在405 nm处检测。[4,5,10]

免疫原剂量及注射后测定时间

150毫克/毫升的免疫原（地高辛BSA物）结合完全弗氏佐剂等体积和注入intradermaly 成1公斤重的的男性德意志兔。助推器预防接种首次给药90天之间，每隔2个星期，不完整的弗氏佐剂，然后，每隔20天90天期间，肌注,1 / 2初始剂量的免疫原。抗血清初次次免疫后5天开始，每抗原注射后继续5-6天。 [11] 44℃离心分离血样，收集血清在-70℃贮存[11]

兔子全部血清中抗地高辛抗体的滴定

用ELISA进行滴定化验。为此，准备16个微量滴定盘，用0.5 mg/100 mL 牛血清蛋白地高辛结合物包盘(PBS中, pH 7.0–7.2, 378C过夜)，并用 5% 脱脂奶在 PBS, pH 7.0–7.2, 37℃封闭1 h。另外16个微量滴定盘也用0.5 mg/100 mL牛血清蛋白包盘作为非特异对照。在缓冲器(Roche)上准备连续稀释兔子血清，每支加入等量的100mL，每支用磷酸盐缓冲液 (pH 7.0–7.2)洗去 5 次，加入抗兔结合HRP抗体(Roche)的鼠抗(1:2000)各100mL，37℃孵育30 min。培育最后洗去，每支加入100mL底物(ABTS)37℃孵育30 min。405 nm处检测光色.[4,5,10]

提纯抗地高辛抗体

采取免疫动物的血液，收集在洁净干燥的玻璃瓶中，4℃过夜至血液完全凝固。用玻璃棒缠绕凝块分开，利用离心机可以直接分离血清。准备好全部血清，在样品中加入等体积的饱和硫酸铵溶液(pH 8)，在电磁搅拌器上逐滴缓慢搅拌[12]。加入硫酸铵后，将混合物置于

4℃1h以上，让免疫球蛋白完全沉淀。离心机10000g离心30 min。 PBS中溶解沉淀物至大约是原来抗血清一般的体积，4℃在 PBS 中透析 2 天。通过生物素亲和素牛血清蛋白结合物的柱进行更深度的提纯，防止生物素亲和素牛血清蛋白的非特异结合。将收集的血清用A 蛋白进行亲和层析进一步提纯。[13]洗涤A蛋白中的血清，在PBS透析4℃过夜。

兔源抗地高辛抗体辣根过氧化物酶结合物制备

精制的抗地高辛抗体结合在辣根过氧化物酶上。[14] 7.5 mL 抗地高辛抗体溶液 (0.5 mg/mL, Bradford 化验测量）在1 L0.1 Mcarbonate 缓冲液, pH 9.2, 4℃缓慢搅透析过夜。 6.6 mg 辣根过氧化物酶(Sigma)溶于500 mL 0.1 Mcarbonate 缓冲液, pH 9.2。逐滴加入加入 500 mL 新鲜饱和的高碘酸钠缓冲液 (1.71 mg/mL)，缓慢搅拌，紧密包裹，室温黑暗环境孵育2 h。将透析的抗体溶液在4h逐滴加入准备好的酶溶液中,在黑暗环境中轻柔搅拌。用玻璃管将8 mL 抗体酶混合液加入20 cm × 3㎝ 2 容量的容器中，用保鲜膜封上。然后, 加入2 g G-25葡聚糖凝胶，室温，黑暗环境中孵育3 h。 0.1 M 碳酸盐缓冲液清洗柱直至干净。按照1:20 量在洗提液中加入新配制的 NaBH4 (5 mg/mL in 0.1 mM NaOH)，30 min 后加入另一份(1:10) NaBH4 溶液4℃孵育 1 h 。加入等体积的饱和硫酸铵溶液(pH 8) 4℃轻柔振动30 min。[12] 离心混合物 15 min (10000g ，4℃) ，弃掉上清液。 2.5 mL of TEN 缓冲液 (Tris/EDTA/NaCl buffer, pH 7.2)提取，3 L TEN 缓冲液 4℃透析 24 h 。24 h后, TEN solution 306 P. Gill et al. 变换后继续透析 4 h。然后加入20 mg/mLBSA 和20%甘油4℃保存。[14]

抗地高辛辣根过氧化物结合物鉴定

准备

ELISA,用于辅助化验。[10]简单说，不同牛血清蛋白地高辛结合物包盘于微量滴定盘上，用5% 脱脂奶封闭。大量牛血清蛋白和脱脂奶用于包被和封闭，防止非特异性结合。连续稀释的 anti-digoxigenin-HRP (准备好的结合物and Roche Co. 结合物)各加入100 mL缓冲液，用磷酸盐缓冲液冲5次。 100 mL/well ABTS 底物37℃溶解30 min ，405 nm处测量。测量抗地高辛辣根过氧化物酶的平均亲和力

竞争性的ELISA 用于测量两种抗地高辛辣根过氧化物酶结合物。[15,16] 不同类型的地高辛自由基(0, 0.1, 1, 10, 100, 1,000 ng/well) 需要加入不同的抗地高辛抗体和不同的地高辛牛血清蛋白用以包被。 37℃1 h 后,后续步骤按之前拟定好的方案进行。

细菌菌株

结核分枝杆菌 H37Rv (RIVM) 在Lo¨wenstein-ensen 介质37℃培养21天。

DNA提取

煮沸方法提取结核杆菌 DNA [17]一个菌落细菌加入 150 mL Tris-EDTA 稀释液 (10 mM Tris-base, 1 mM EDTA, pH 8) 尽力混匀, 95 ℃水浴15 min; 10000g 离心菌落产物10 min。上层悬浮物即分离的 DNA, 用作PCR。

寡核苷酸

下面合成的低聚物 (M. W. G. Biotech GmbH,Germany)用于扩增，标记和TUF200 bp 比色：[18]

TUF15 (50CCTGGTGGTCGATGGGCGA 30)

TUF18 (50CCTCTGTCGAGGAACTGATGA 30)

50biotin-modified TUF26 (50ACGAGGAAGTTGAGATCG 30)

地高辛标记PCR

每个反应加入 3 mL 菌落产物 DNA.。反应液有 25 mM TUF15 和TUF18 引物, 1.25 U Taq DNA 聚合酶(Roche), 1X 反应液 (Roche), 1.5 mM MgCl2, 2 mM dATP, dCTP, dGTP, 1.9 mM dTTP 和0.1 mM DIG-dUTP (Roche)。循环如下:1 5 min 95℃,94℃30 s 30个循环周期，30 s 66℃, 72℃,1 min一个循环周期10 min 72℃的Eppendorf主梯度PCR仪。[19]

ELISA检测地高辛

PCR-ELISA 根据Roche 应用科学进行检测试验。运用制备好的anti-digoxigenin-HRP 并和标准的Roche anti-digoxigenin-HRP (作为标准对照)相比较。

加入2.5 mL DIG标记的 PCR 产物于 10 mL 变性溶液(Roche)，混合物在室温孵育 10 min.。112.5 mL 杂化液 (Roche), 包含 5mM生物素修正液 TUF26 探针, 混合了变性的 DIG 标记的PCR产物，100 mL 混合液直接转至微量滴定盘( Roche)。为加强探针和DNA的结合，53 ℃i hybridyzer oven (Techne)孵育75 min, 轻轻振动。非特异的结合物可以用蒸馏水代替包含探针在内的变性的PCR产物检测出来。每支用冲洗液洗涤5次。把100mL不同的anti-digoxigenin HRP(1:100, 1:200, 1:400, 1:800, 1:1,000 and1 : 2,000) 个加入其中，37 ℃30 min. 每支试管用洗涤液冲洗5次，然后，加入 100 mL ABTS底物 (Roche) ，保证精准一致。[19,20]

结果与讨论

地高辛-3-O-methylcarbonyl-1-aminocap酸 N-Hydroxysuccinamide 酯牛血清蛋白结合物380 nm处检测吸光度用于计算牛血清蛋白和地高辛的结合度。假定380 nm 处地高辛的吸光系数3.2。这个免疫原: 蛋白质的摩尔比率是 8.5 (图 1) 溶液浓度为100 mg/mL。非竞争性ELISA定量分析已准备的结合物

从ELISA 检测获得的结果显示：地高辛牛血清蛋白结合物的管比牛血清蛋白的管OD 值高 (表 1)。

免疫法和抗地高辛抗体滴定法

初次免疫应答8周后，可获得适当滴度的抗血清。兔子体内血清中抗地高辛抗体在初次免疫应答50, 65,80, 95, 105, 125, 145, 165天后的滴度分别为9600，64000, 128000, 128000, 192000, 192000, 192000, 192000。（图 2）

图 1. 地高辛-BSA 结合物。

摩尔比率:载体蛋白=结合物OD

380 /载体蛋白OD

380

×3.2

表1. 非竞争性 ELISA 定量检测地高辛-BSA结合物

结果解释的是光密度，所有试验都进行双份对照。

抗地高辛辣根过氧化物酶结合物的鉴定

Anti-Digoxigenin-HRP 结合物棋盘图样

已准备的 anti-digoxigeninantibody HRP 结合物 1 : 6400 稀释液 50%结合在 13.8 ng/well 地高辛牛血清蛋白上的结果（图3)。

Roche HRPconjugatedanti-digoxigenin showed 1 : 200 稀释液 50% 结合在13.8 ng/well xigenin-conjugated BSA 结果(图4)。

图2. 免疫过的兔子抗血清滴度

抗地高辛抗体辣根过氧化物酶共轭

图3. 本研究中已准备的anti-digoxigenin HRP结合物棋盘图样

图 4.anti-digoxigenin HRP conjugate(Roche)棋盘图样

竞争曲线标准和平均亲和力测量

ELISA检测，标准曲线（图5）和抗地高辛抗体辣根过氧化物酶结合物罗吉特日志改造图（图6和7）绘制。被发现的抗地高辛HRP共轭平均亲和力获得由罗氏公司和我们的共轭分别是1.8×1010 M1和1.5×1010 M1。

PCR - ELISA法棋盘检测DIG

属于连续稀释的抗地高辛抗体HRP的共轭光密度如表2所示。这些值表明，我们准备的抗体HRP的共轭的最高稀释掏检测PCR - ELISA法系统中的最佳外径;然而，1：200稀释的罗氏共轭是最终的最佳测试OD，根据罗氏公司制作的。

图5 辣根过氧化物酶的抗地高辛结合物的竞争标准曲线

图6 罗吉特日志改造我们准备抗地高辛HRP共轭

和地高辛BSA。 Y：B％，X：B（NM）。

图7 罗吉特日志改造，罗氏公司的抗地高辛HRP共轭物和

地高辛BSA。 Y：B％，X：B（NM））。

图8 罗氏公司的抗地高辛HRP共轭和地高辛BSA Skatchard情节

B/U= (B–NSB)/T–(B–NSB). B (nM) =B/U 地高辛体积摩尔浓度(nM). Ka = Y-截距/X-截距。

图9 Skatchard准备抗地高辛HRP共轭物和地高辛BSA的情节

B/U =(B-NSB)/T-(B-NSB). B (nM) =B/U 地高辛体积摩尔浓度

(nM). Ka =Y-截距/X-截距

结果以光密度表示

所有结果为重复实验结果

结论

酶联免疫吸附测定法(ELISA)检测是一种普遍的实验室测试可用于定性、定量检测的具体地区的DNA,称为目标。[2]PCR-ELISA可能有多种应用分子诊断病原微生物的突变检测基因紊乱,包括单点核苷酸多型性,提供使用的材料为测试成为符合成本效益的。在许多出版物报道说,这是一个昂贵的方法PCR-ELISA[2、4、5],因为所有的在PCR-ELISA试剂的商业。必须得到有简化协议可以被使用,一些修改,准备最多试剂参与这次的考试。本研究中这个系统关键部件之一抗体是已准备好从一只兔子源的anti-digoxigenin HRP共轭程序及准备其他组件，(如变性解、杂交缓冲、洗涤缓冲区,和共轭缓冲)[6,21]。

据所取得的成果，对地高辛BSA免疫家兔共轭提出了高滴度的抗血清。所以，准备免疫原和注射的时间剂量已有效执行.两个酶结合物的酶联免疫吸附棋盘结果显示两个稀释（1：6,400准备抗- DIG - HRP和1：200罗氏材料）抗- DIG -辣根过氧化物酶结合物了相同的结果适合平均亲和力comparisions。随后的标准曲线和亲和力测量结果显示，平均产生抗体的亲和力，适合准备使用PCR - ELISA检测的一种有效的酶共轭。 PCR - ELISA法棋盘结果表明，所制备的抗地高辛HRP共轭可以给相同的结果，在更高的稀释，可与商业可用共轭相比。

在这项研究中，从5毫升抗血清，我们可以产生抗地高辛HRP共轭量，这足以执行4000 PCR - ELISA法测试，用低得多的预算比可用于市售试剂盒的数目相等。因此，可以匹配的PCR - ELISA检测的要求的规格生产的高品质抗地高辛抗体HRP的共轭可以在任何实验室的准备基础设施建设。

缩略语

DIG,地高辛;OD,光密度OD; PCR,聚合酶链反应;ELISA,酶联免疫吸附法;DNA,脱氧核糖核酸;DMSO,二甲基亚砜，;BSA, 牛血清蛋白; HRP,辣根过氧化物酶;ABTS, 2,20-azino-di-3-ethylbenzthiazolinsulfonate; PBS,磷酸缓冲液; TEN, Tris/EDTA/NaCl; EDTA, ethylen二胺。

生产的抗地高辛抗体辣根过氧化物酶的共轭

四乙酸; RIVM，国家公众健康研究所环境，荷兰，脱氧腺苷三磷酸的dATP，dGTP ,脱氧鸟苷三磷酸; dCTP，三磷酸胞苷; dTTP,deoxytymidine;dUTP;三,三磷酸核,简称NSB，非特异性结合指标。

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PH0728 DAB辣根过氧化物酶显色试剂盒实验方法与常见问题

PH0728|DAB辣根过氧化物酶显色试剂盒 DAB Horseradish Peroxidase Color Development Kit Catalog No：PH0728Size：?2×50mL|?2×100mL Store at-20℃ DAB辣根过氧化物酶显色试剂盒(DAB Horseradish Peroxidase Color Development Kit)是一种借助辣根过氧化物酶(HRP)，用于免疫组化显色、原位杂交显色或Western、Southern、Northern、EMSA等膜显色的试剂盒。 DAB，即3,3N-Diaminobenzidine Tertrahydrochloride，是辣根过氧化物酶的常用底物。在辣根过氧化物酶的催化下，DAB会产生棕色沉淀。该棕色沉淀不溶于水和乙醇。因此在DAB显色后，还可以使用溶于乙醇的染料进行后续染色。 本试剂盒可以用于细胞或组织在免疫组化或原位杂交时结合的辣根过氧化物酶显色，也可以用于Western等结合有辣根过氧化物酶的膜的显色检测。同时也可以用于细胞或组织内源性的辣根过氧化物酶显色。 组分 Component2×50mL2×100mL Storage DAB显色液A50mL100mL-20℃避光 DAB显色液B50mL100mL-20℃ 使用参考 1.对于组织切片或细胞样品或膜，在与辣根过氧化物酶标记的抗体或其它形式的探针孵育后，用适当洗涤液洗涤3-5次，每次3-5分钟。对于检测内源性辣根过氧化物酶的组织或细胞样品，在适当固定后，也用适当洗涤液洗涤3-5次，每次3-5分钟。 2.按照1:1的比例将显色液A、B液混匀，混匀后即配制成DAB染色工作液。 3.最后一次洗涤完毕后，去除洗涤液，加入适量DAB染色工作液，确保能充分覆盖样品。 4.室温避光孵育3-30分钟或更长时间(可长达24小时)，直至显色至预期深浅。 5.去除DAB染色工作液，用蒸馏水洗涤1-2次即可终止显色反应。 6.对于组织切片或细胞样品，显色反应终止后，如有必要可以用中性红染色液(neutral red staining solution)染色，以便于观察。对于膜，显色反应终止后，可以室温晾干避光保存。 注意事项 DAB对人体有害，请注意适当防护。为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

PH0728 DAB辣根过氧化物酶显色试剂盒使用手册

1PH0728|DAB 辣根过氧化物酶显色试剂盒 Catalog No ：PH0728 Size ：?100mL Storage ：Store@-20℃避光保存 ◆产品简介DAB 辣根过氧化物酶显色液(DAB Horseradish Peroxidase Color Development Kit)是一种依据辣根过氧化物酶(HRP)结合显色，用于免疫组化显色、原位杂交显色或Western、Southern、Northern、EMSA 等膜显色的试剂盒。 DAB 即3,3N-Diaminobenzidine Tertrahydrochloride,是辣根过氧化物酶的常用底物。在辣根过氧化物酶的催化下,DAB 会产生棕色沉淀。该棕色沉淀丌溶于水和乙醇。因此在DAB 显色后,还可以使用溶于乙醇的染料进行后续染色。 本显色液可以用于细胞或组织在免疫组化或原位杂交时结合的辣根过氧化物酶显色，也可用于Western 等结合有辣根过氧化物酶的膜的显色检测。同时也可以用于细胞或组织内源性的辣根过氧化物酶显色。 ◆试剂组分 试剂(A):DAB 显色液A---50mL (-20℃避光) 试剂(B):DAB 显色液B---50mL (-20℃避光) 试剂(C):DAB 显色液C---100uL (RT) 自备材料： 1、洗涤液 2、蒸馏水◆使用参考 1、常规组织切片、细胞样品、膜不辣根过氧化物酶标记的抗体或其它形式的探针孵育后，用适当洗涤液洗涤3～5次，每次3～5min。对于检测内源性辣根过氧化物酶的组织或细胞样品，在适当固定后，也可用洗涤液洗涤3～5次，每次3～5min。 2、按(A):试剂(B):试剂(C)=5000:5000:3的比例混合,即为DAB 染色工作液，即配即用。 3、洗涤过组织后，去除洗涤液，加入适量DAB 染色工作液，确保覆盖样品。 4、室温避光孵育或更长时间，直至显色至预期深浅。 5、去除DAB 染色工作液，用蒸馏水清洗1～2次即可终止显色反应。 6、对组织切片或细胞样品，反应终止后，如有必要可用中性红染色液染色，便于观察。对于膜染色，反终止后可室温晾干避光保存。 ◆注意事项 1、DAB 是致癌物，请注意适当防护。 2、试剂(A)、试剂(B)避免反复冻融。 3、为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。 ◆常见问题 1、背景显色太深 ①在免疫组化时如果背景显色太深，考虑使用适当的封闭液进行封闭，例如选购适当的封闭液或使用和一抗相同来源的血清(10%)进行封闭。②在进行含内源性过氧化氢酶的免疫组化时，如果背景显色太深，需注意灭活内源性过氧化氢酶。 ③可以考虑缩短显色时间，或降低二抗浓度。 ④选择适当强度的洗涤液，或延长洗涤时间。 2、没有显色或显色太弱 ①当提高一抗或二抗的浓度。检测二抗效果，滴一滴稀释二抗在膜上，检测二抗是否可以被正常显色。 ②考虑使用更加灵敏的放大检测体系，例如使用生物素检测体系。 ③适当延长显色时间，另外确定抗原修复是否对于使用的一抗是必需的。

辣根过氧化物酶制作过程

过氧化物酶体与溶酶体不同，过氧化物酶体不是来自内质网和高尔基体，因此它不属于内膜 系统的膜结合细胞器。过氧化物酶体普遍存在于真核生物的各类细胞中，但在肝细胞和肾细 胞中数量特别多。过氧化物酶体含有丰富的酶类，主要是氧化酶，过氧化氢酶和过氧化物酶。氧化酶可作用于不同的底物，其共同特征是氧化底物的同时，将氧还原成过氧化氢。过氧化 物酶体的标志酶是过氧化氢酶，它的作用主要是将过氧化氢（H2O2，Hydrogen Peroxide）水解。氧化酶与过氧化氢酶都存在于过氧化物酶体中，从而对细胞起保护作用。 HRP的制备 ⒈水提取： 称取 10斤用水冲刷干净的鲜辣根（辣根皮中亦含有丰富的HRP），用菜刀切成小碎块，在 搅肉机中搅碎1~2次。碎渣浆用1倍体积的水在低温下搅拌提取过夜（亦可采用高速抽提法）。次日用甩干机（或离心机）甩干，收集滤液，碎渣再用1/4倍体积水浸泡提取一次， 合并两次滤液，量总体积和度，0。 ⒉硫酸铵分级分离： 在不断搅拌下，每升滤液中慢慢加入226克硫酸铵粉末（相当于0.40饱和度），大约在1~2 小时内加完，置冷室中放置过夜。次日将上清液小心地用虹吸管移出，下面浑浊液以3000转/分离心15分钟，弃沉淀，合并上清液。再按每升上清液加258克硫酸铵粉末（0.8饱和度） 随加随搅拌，当硫酸铵全部溶解后，置冷室过夜。次日，虹吸出上清液，沉淀部分在冰冻离 心机中以13000转/分离心20分钟，弃去上清液，收集沉淀。将沉淀悬浮于100~150毫升蒸 馏水中（加水量要使沉淀全部溶解为止），分装于透析袋内，放在流动自来水中进行透析 1~2天，直到硫酸铵透析完毕为止（可用5%乙酸钡溶液或奈氏试剂进行检查）。然后改换成 用蒸馏水透析，中间更换2~3次，用0.1 mol/L硝酸银溶液检查透析外液无氯离子为止。 将透析液合并，在冰冻离心机中以 4000转/分离心 15分钟；去沉淀，量上清液的体积。 ⒊丙酮分级分离： 将上清液倒入烧杯并置冰盐浴中，在不断搅拌下，用细滴管沿杯壁加入1倍体积预冷至-15℃ 的丙酮，放置片刻，在冰冻离心机中以4，000/分离心15分钟，弃去沉淀。上清液再加入0.8体积（按原上清液体积）-15℃丙酮，（操作同上），静置后，在冰冻离心机中离心收集沉淀。将沉淀溶于少量蒸馏水中，透析除丙酮。可得Rz值近于1的酶溶液。 ⒋精制： 将上步酶液适当稀释，滴加1M硫酸锌溶液，使酶液中锌离子浓度为10-3M，5000转/分离心10分钟，得上清液。再将沉淀用少量蒸馏水洗涤，离心，洗液与清液合并，分装于透析袋内，对水透析除盐，用微孔滤膜过滤，进行真空冷冻干燥（约得20毫克），产品呈米黄色纤维状松软物，HRP产品的Rz值可达3.0左右，置真空干燥器中低温保存。

辣根过氧化物酶标记 Streptavidin

辣根过氧化物酶标记Streptavidin 产品简介： 本辣根过氧化物酶标记Streptavidin (HRP-labeled Streptavidin)也称HRP-Streptavidin、Streptavidin-HRP或辣根过氧化物酶标记链霉亲和素，为进口分装，可以用于生物素(Biotin)标记的抗体、核酸、蛋白或其它生物素标记分子的检测。具体用途包括Western、ELISA、免疫组化或免疫细胞化学、原位杂交、Southern、Northern、EMSA等。 本HRP-Streptavidin用高纯度的Streptavidin和超纯的辣根过氧化物酶交联而成，确保产生最低的本底和最高的灵敏度。本产品的浓度为1mg/ml。 Streptavidin的分子量为66kD，可以高度特异性地和生物素(Biotin)结合。Streptavidin和生物素的亲和常数为K d=10-15M。 Streptavidin是一个4聚体蛋白，可以同时结合4个生物素分子。Streptavidin的中文名为链霉亲和素，从Streptomyces adidinii 中纯化获得，和鸡蛋清来源的Avidin(亲和素)在空间结构以及与生物素的亲和力方面具有高度的相似性。和Avidin不同的是，Streptavidin是一种非糖基化蛋白，并且基本不带电荷。Avidin的pI= ~10.5，在中性pH条件下呈碱性。由于Streptavidin 和Avidin相比在中性条件下不带电荷，因此Streptavidin的非特异性结合比Avidin低很多，这样检测时的非特异性背景就低很多。因此目前在生物素检测时通常使用Streptavidin替代Avidin。 辣根过氧化物酶即horseradish peroxidase (HRP)，可以在Western、EMSA、Southern或Northern等检测时催化ECL类试剂(如ECL、BeyoECL等)产生化学发光，可以在ELISA时催化TMB产生蓝色，也可以在免疫组化、免疫细胞化学或Western blot 检测时催化DAB产生棕色沉淀。 本辣根过氧化物酶标记Streptavidin用于各种常规用途的推荐稀释比例参考下表，实际实验操作过程中需根据具体情况适当调节辣根过氧化物酶标记Streptavidin的稀释比例。对于Western，推荐的稀释范围为1:2000-10000。 本产品如果用于常规的Western检测，以每次检测需10毫升1:2000稀释的本产品计，可以检测40次。 保存条件： -20℃保存，一年有效。 注意事项： 叠氮钠会抑制辣根过氧化物酶的活性，在含有辣根过氧化物酶的溶液中不可加入叠氮钠。 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。 使用说明： 1.Western、ELISA、免疫组化或免疫细胞化学、原位杂交、Southern、Northern、EMSA等请参考相关实验步骤进行。起始 稀释浓度按照产品简介中推荐的稀释比例进行稀释。 使用本产品的文献： 1. Liu H, Jiang C, Xiong C, Ruan J. DEDC, a new flavonoid induces apoptosis via a ROS-dependent mechanism in humanneuroblastoma SH-SY5Y cells. Toxicol In Vitro. 2012 Feb;26(1):16-23. 2. Liu J, Qian X, Chen Z, Xu X, Gao F, Zhang S, Zhang R, Qi J, Gao GF, Yan J. Crystal structure of cell adhesion molecule nectin-2/CD112 and its binding to immune receptorDNAM-1/CD226. J Immunol. 2012 Jun 1;188(11):5511-20. 3.P Xiao, X Lv. Immobilization of Chymotrypsin on Silica Beads Based on High Affinity and Specificity Aptamer and Its Applications.

辣根过氧化物酶在纤维材料生物整理中的应用研究进展

第40卷一第4期2019年4月纺一织一学一报Journal of Textile Research Vol.40,No.4Apr.,2019DOI :10.13475/j.fzxb.20180300407 辣根过氧化物酶在纤维材料生物整理中的 应用研究进展 周步光,王一平,王一强,范雪荣,袁久刚 (生态纺织教育部重点实验室(江南大学),江苏无锡一214122) 摘一要一针对化学法整理纤维材料存在能耗高二纤维损伤大的缺陷,提出借助酶法在温和条件下对纤维材料进行生物整理加工三介绍了辣根过氧化物酶/双氧水/β-二酮类引发剂乙酰丙酮(HRP /H 2O 2/ACAC)三元催化体系的氧化机制,综述了该体系在淀粉二黄麻和丝蛋白生物改性中的应用,包括:通过酶促反应使丙烯酸甲酯与淀粉接枝共聚,提高淀粉浆料对疏水性纤维的成膜性;通过催化黄麻与丙烯酰胺或甲基丙烯酸六氟丁酯接枝,实现黄麻亲水或疏水化整理;通过酶促反应使丝素与丙烯酸接枝共聚,提升丝素材料的仿生矿化效果;通过催化丝胶与甲基丙烯酸甲酯接枝共聚,改善丝胶基生物材料的成型性三指出HRP 在纤维整理及生物材料制备中具有潜在的应用前景三 关键词一辣根过氧化物酶;三元催化体系;乙烯基单体;淀粉;黄麻;丝蛋白;生物材料 中图分类号:TS 195.5一一一文献标志码:A一一一 Research progress of horseradish peroxidase in bio-finishing of fiber materials ZHOU Buguang,WANG Ping,WANG Qiang,FAN Xuerong,YUAN Jiugang (Key Laboratory of Eco-Textiles (Jiangnan University ),Ministry of Education ,Wuxi ,Jiangsu 一214122,China )Abstract 一Considering the defects that chemical finishing on fiber materials has large energy consumption and potential fiber damages,enzymatic finishing of fiber materials under mild treating conditions were suggested.The oxidation mechanism of the ternary catalyst system of horseradish peroxidase (HRP ),hydrogen peroxide (H 2O 2)and β-diketone initiator acetylacetone (ACAC)were introduced,and its applications in bio-modifications of starch size,jute,silk protein were reviewed as follows.Methyl acrylate was graft copolymerized with starch to improve its film forming property onto the hydrophobic fibers.Acrylamide and hexafluorobutyl methacrylate were applied to modify jute fiber by enzymatic graft-copolymerization,respectively,realizing the hydrophilic or hydrophobic modification of jute fiber.Acrylic acid was used to enzymatically graft copolymerized onto silk fibroin to enhance the biomimetic mineralization effect of fibroin-based biomaterial.Furthermore,HRP-mediated graft copolymerization of methyl methacrylate onto silk sericin was also investigated to improve the formability of sericin-based biomaterials.In conclusion,HRP exhibits potential applications in bio-finishing of textile fibers and preparation of biomaterials.Keywords 一horseradish peroxidase;ternary catalyst system;vinyl monomer;starch;jute;silk protein;biomaterial 收稿日期:2018-03-01一一一修回日期:2018-12-12 基金项目:国家自然科学基金项目(51373071,31771039);青蓝工程资助项目(苏教师[2016]15号);中央高校基本科研业务费 专项资金项目(JUSRP51717A );高等学校学科创新引智计划项目(B17021) 第一作者:周步光(1994 ),男,硕士生三主要研究方向为纺织品生态加工技术三 通信作者:王平(1971 ),男,教授,博士三主要研究方向为纺织生物技术三E-mail :wxwping@https://www.wendangku.net/doc/9f2914768.html, 三一一由于淀粉分子结构本身的特点,使得淀粉浆料 对疏水性纤维的黏附力不足[1]二成膜性差,为改善淀粉浆料对经纱的上浆性能,需要对淀粉进行接枝 改性三黄麻纤维存在刚度大二刺痒二易成褶二染色深度不高二染鲜艳色难等缺点,并且植物纤维与非极性二疏水性树脂间的界面黏结性差,使其应用受到很

DAB辣根过氧化物酶显色试剂盒

DAB 辣根过氧化物酶显色试剂盒 简介： DAB 辣根过氧化物酶显色液(DAB Horseradish Peroxidase Color Development Kit)是一种依据辣根过氧化物酶(HRP)结合显色，用于免疫组化显色、原位杂交显色或Western 、Southern 、Northern 、EMSA 等膜显色的试剂盒。DAB 即3,3N-Diaminobenzidine T ertrahydrochloride, 是辣根过氧化物酶的常用底物。本显色液可以用于细胞或组织在免疫组化或原位杂交时结合的辣根过氧化物酶显色，也可用于Western 等结合有辣根过氧化物酶的膜的显色检测。 组成： 操作步骤(仅供参考)： 1、常规组织切片、细胞样品、膜与辣根过氧化物酶标记的抗体或其它形式的探针孵育后，用适当洗涤液洗涤3～5次。 2、按(A):试剂(B):试剂(C)=5000:5000:3的比例混合, 即为DAB 染色工作液，即配即用。 3、洗涤过组织后，去除洗涤液，加入适量DAB 染色工作液，确保覆盖样品。 4、室温避光孵育或更长时间，直至显色至预期深浅。 5、去除DAB 染色工作液，用蒸馏水清洗1～2次即可终止显色反应。 6、对组织切片或细胞样品，反应终止后，如有必要可用中性红染色液染色，便于观察。对于膜染色，反终止后可室温晾干避光保存。 注意事项： 1、 DAB 是致癌物，请注意适当防护。 2、 试剂(A)、试剂(B)避免反复冻融。 2、为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。 编号 名称 PW0072 2×50ml Storage 试剂(A): DAB 显色液A 50ml -20℃ 避光 试剂(B): DAB 显色液B 50ml -20℃ 避光 试剂(C): DAB 显色液C 100ul RT 使用说明书 1份

辣根过氧化物酶

辣根过氧化物酶（HRP） 一种糖蛋白，由于在辣根中该酶的含量很高，故名。它以铁卟啉为辅基，在过氧化氢存在时能催化苯酚、苯胺及其取代物聚合。通常用做光学和电子显微镜的组织化学示踪物。 简介： 过氧化物酶，通常来源于辣根（因此称辣根过氧化物酶），是临床检验试剂中的常用酶。该产品不但广泛用于多个生化检测项目，也广泛运用于免疫类（ELISA）试剂盒。过氧化物酶作为多个试剂盒显色体系的关键成分，对试剂盒的质量有重要影响。 辣根过氧化物酶(Horseradish Peroxidase, HRP)比活性高，稳定，分子量小，纯酶容易制备，所以最常用。HRP广泛分布于植物界，辣根中含量高，它是由无色的酶蛋白和棕色的铁卟啉结合而成的糖蛋白，糖含量18%。HRP由多个同功酶组成，分子量为40,000,等电点为PH3～9,酶催化的最适PH因供氢体不同而稍有差异，但多在PH5左右。酶溶于水和58%以下饱和度硫酸铵溶液。HRP的辅基和酶蛋白最大吸收光谱分别为403nm和275nm，一般以OD403nm /OD275nm的比值RZ(德文Reinheit Zahl)表示酶的纯度。高纯度的酶RZ值应在3.0左右(最高可达3.4)。RZ值越小，非酶蛋白就越多。 用途： 1) RZ>3 活性 >250u/mg，主要应用于免疫学，是高纯度的过氧化酶。采用特殊色谱纯化技术以除去会影响免疫学反应的同工酶B . 2) RZ>2 活性>180u/mg ，主要应用于临床化学，我们的客户也有将这个规格的产品应用于免疫学研究的。此时，一个标准化的分析方法就变得尤为重要。 3) RZ>1 活性>100u/mg，主要应用于血糖试纸和尿液分析试纸。 4) RZ>0.6 活性>60u/mg ，主要应用于尿液分析试纸。 实验原理： 过氧化物酶催化以下反应： 2 H2O2 ─→ O2+2H2O

辣根过氧化物酶直接电化学传感器检测过氧化物的研究

第38卷第3期2019年3月 分析测试学报 FENXI CESHI XUEBAO(Journal of Instrum ental Analysis) Vol.38 N o.3 345-349 doi: 10. 3969/j.issn.1004 -4957. 2019. 03. 015 辣根过氧化物酶直接电化学传感器检测 过氧化物的研究 曹嫱，杨绍明*，杨杰，张小荣，柏朝朋，滕澈 (华东交通大学材料学院，江西南昌330013) 摘要：该文以高比表面积的泡沫镍电极（N f o m)为基础，通过电沉积碳纳米管（CNT S)制备了C N T s/N i f o m。然后在十六烧基三甲基溴化铵（C T A B)的辅助下，通过一步法电沉积纳米金（A u N P s)将辣根过氧化物 酶（H R P)固定到电极表面，制备了H R P-A u N P s/C N T s/N i f o m直接电化学酶传感器。并采用SEM、能谱 (E D S)和电化学方法对该电极进行了表征，优化了测试电位和p H值，将该传感器对过氧化氢及2种有机过 氧化物进行了检测。结果表明，该传感器性能良好，对过氧化氢、过氧化氢异丙苯、2-过氧化丁酮具有良好 的催化检测性能，其检出限分别为1.2X10—7、4.5X10—7、2.5x l0_7m〇l/L。 关键词：过氧化物；辣根酶；碳纳米管；传感器 中图分类号：0657.1文献标识码：A文章编号：1004 -4957(2019)03-0345-05 R e s e a r c h o n D e t e c t i o n of P e r o x i d e s w i t h H o r s e r a d i s h P e r o x i d a s e Direct E l e c t r o c h e m i c a l S e n s o r C A O Q i a n g，Y A N G S h a o-ming*，Y A N G J i e，Z H A N G Xiao-rong，BAI Chao-peng，T E N G Y u (School o f Materials Science and Engineering，East China Jiaotong U niversity，Nanchang 330013，China) Abstract:Based on the surface of nickel foam electrode(Ni foam)with high specific surface area，a carbon nanotubes(CNTs)/Ni foam was prepared t hrough the electrodeposition of C N help of cetyltrimethylammonium bromide(C T A B)，horseradish peroxidase(H R P)was immobilized onto the surface of CNTs/Ni foam by one - step electrodeposition of A u nanoparticles(A u N P s)，and an H R P - A u NPs/CNTs/Ni foam direct electrochemical enzyme sensor was prepared.S E M，electron dispersive spectroscopy(E D S)and electrochemical methods were adopted to characterize the modified electrode，and the t est conditions for p H value and work potential were also optimized.The sensor was applied in the detection of hydrogen peroxide and two organic peroxides.Re sensor has a good c atalytic detection performance toward hydrogen peroxide，cumene hydroperoxide and 2-butanone peroxide with the d etection limits of 1. 2 X10 7， 4. 5 X10 7and 2. 5 X10 7mol/L， respectively. K e y w o r d s:peroxides；horseradish peroxidase；carbon nanotubes；sensor 过氧化物广泛应用于化工、造纸、医药等领域，对人们的生产生活造成很大影响[1-2]，如过氧化 氢异丙苯溶于水后，不仅污染环境，若被生物体吸入，则会引起中毒，破坏正常的生物机理，阻碍正 常的生物代谢[3]。目前，过氧化物检测的方法主要有分光光度法[4]、化学发光法[5]、荧光法[6]和酶传 感器法[7-8]等，而基于辣根过氧化物酶的电化学传感器法，以灵敏度高、选择性好和仪器设备简单等 优点，受到广大研究者的密切关注。辣根过氧化物酶电化学传感器检测过氧化物一般通过电子介体的 中介作用，或酶的直接电化学法实现酶与电极之间的电子传递。直接电化学法的酶传感器法无需电子 介体，可简化电极制备，但由于酶的电活性中心被蛋白质本体包覆，一般难以实现与电极之间的直接 电化学。因此，纳米材料如碳纳米管[9]、石墨烯[10]、金纳米粒子[11]及复合纳米材料[12]等常被用来修 饰电极表面以促进酶与电极之间的电子传递。如Yagati等[13]先将石墨稀/金纳米粒子复合物修饰到氧 收稿日期：2018-08-14;修回日期：2018 -09-15 基金项目：国家自然科学基金项目（21465012);江西省自然科学基金项目（20171BAB203017) *通讯作者：杨绍明，博士，教授，研究方向：电分析化学及生物传感器，E-m a il: yangsm79@https://www.wendangku.net/doc/9f2914768.html,

辣根过氧化物酶的色原底物

辣根过氧化物酶的色原底物 HRP最常用的色原底物有邻苯二胺(OPD)、2，2’—吖嗪—(3—乙酰苯基噻唑磺酸—6)[2， 2’—azino-di(3—ethylben2thiazolinesulphonicacid-6)，ABTS](杂环吖嗪)、四甲基联苯胺(TMB)和4—氨基安替比林：苯酚耦联底物对等。上述色原底物受HRP作用主要有两种形式的反应：①氧化还原底物的氧化作用，如OPD、ABTS等；②一个氨基芳香剂与另一个芳香基化合物的氧化耦联，如4—氨基安替比林：苯酚等。 (一)氧化还原色原底物 OPD被认为是HRP最为敏感的色原底物之一，其在HRP的作用下，由过氧化氢(H202) 氧化而聚合成2，2’—二氨基偶氮苯(DAB)。在pH5．0左右时，DAB在波长450nm处有广范围的最大吸收，当pH值降为1．0时，最大吸收波长移动至492nm，同时摩尔消光系数变大，显色加深(图4—2)。因而常用强酸如硫酸或盐酸终止反应。实际工作中，用强酸尤其是盐酸终止反应后，显色并不稳定，常随时间增长而颜色加深，这是由于反应后剩余的过氧化氢继续氧化OPD而产生非酶催化的DAB的结果。有人在强酸反应终止液中加入还原剂如亚硫酸钠，因还原剂可迅速完全地将剩余的过氧化氢还原而阻止了OPD 的非酶氧化，结果显色稳定，数十小时内不变，而且无需避光。OPD的缺点是其对机体具有致突变作用。由于OPD的不稳定性，现在的商品试剂盒中，OPD均以片剂或粉剂供应，临用时再溶解于相应的缓冲液。 在ELISA测定时，OPD色原底物的具体配方为①显色底物溶液：在0．1mol／L枸橼酸盐缓冲液(pH5．0)中含20 mmol／L OPD和12 mmo!／L H202，或10 mmol／L OPD和5．5mmol／L H202；②终止液：2 mol ／L硫酸(含0．1 mol／L亚硫酸钠)；③测定波长：492nm。 TMB是一种优于OPD的新型HRP色原底物。其氧化产物联苯醌在波长450nm处有最大消光系数，如果HRP量少，过氧化氢溶液和TMB过量时，则形成蓝色的阳离子根。降低pH，即可使蓝色的阳离子根转变为黄色的联苯醌(图4—3)。使用硫酸作为终止剂可使产物稳定90min，但随后本底显色就不断加深，国内有人认为使用1％SDS作为终止剂，可使鲜蓝色24h内保持不变，阴阳性对比十分明显，但在我们实验室发现1％SDS对上述显色有较强的褪色作用，目前仍以硫酸作为终止剂较为理想。ELISA中，底物反应显色后，常选择其具最大吸收的波长450nm比色测定结果。而’Madersbacher和Berger等为提高以TMB作底物的ELISA测定的敏感性，选择显色呈指数加深时的波长405nm比色测定。他们首先测定一系列已知浓度的标准品在450nm和405nm的值，证实A450nm／A405nm之比为3．2，然后在使用波长405nm测定含低浓度待测物的标本得到的OD值再乘以常数3．2，即为待测标本在波长450nm处的真值。该种双波长测定方法可使ELISA测定范围提高3倍。TMB的显色反应虽与OPD一样同属氧化还原反应，但前者的反应是可逆的，如终止液中存在还原剂(维生素C及亚硫酸钠、SDS等)，则可反应显色迅速消退。TMB虽然溶解度相对较低，但由于其高检测敏感性及无致突变作用，现已基本上取代了OPD而成为HRP最为常的色原底物。

辣根过氧化物酶(HRP)标记蛋白的方法

HRP 的NaIO4标记法 一．原理：HRP为一种糖蛋白（glycoprotein），其所带的糖基上的糖环能被氧化开环，在2，3—位的—C—C—断开。在适当的氧化条件下，2，3—位羟基能被氧化为醛基。醛基在碱性条件下可与被标记物的自由氨基（—NH2）形成Shiff碱（—N=CH—），Shiff碱不稳定，可由逆反应解离。Shiff碱可由还原剂还原成—CH2—NH—，在HRP与被标记物间形成稳定的共价交联。HRP的NaIO4标记法所用氧化剂为NaIO4，还原剂采用NaBH4。 Note: 1.产物A不稳定，故用NaBH4还原为产物B。 2.HRP的氧化要适度，氧化不够不能产生足够量的醛基，如氧化过度，醛基可 被进一步氧化为羧基，同样也得不到够量的醛基。可通过控制NaIO4的量或控 制氧化的时间来调节HRP糖基的氧化度。当糖基的氧化度为20～25%时，有 较高的结合效率。 3.为了防止HRP的过度氧化，在整个标酶的过程中应尽量避光。光照可加快过 碘酸钠对HRP糖基的氧化，如在标记过程中不避光，则不可控因素太多。 4.反应的最后一步用NaBH4来还原的反应比较剧烈，对酶活性的影响比较大。 有时可考虑在酶与糖基之间添加一个手臂，如联苯胺反应。 二．酶量的确定：被标记物在本实验室主要为抗原与抗体。抗原与HRP的比值通常为摩尔比1：1。而抗体与HRP的比值通常为质量比1.6：1。当然，这只是一个基点，可根据需要上下调整比率。统计本次标记所需酶的总量，设为x mg。 三．酶的氧化（全过程避光，操作中力防污染。酶的终浓度为10mg/mL，总体积为x/10mL）

1.称取HRP x mg。当HRP从-20℃取出后，一定要平衡到室温，否则HRP冻干品易潮 解。称量时不要用称量纸，不要用工具取HRP，应将HRP直接小心地倒入要用来溶 解HRP的器具中。在倒HRP时，不要在风口（如电风扇风，自然风，呼吸）操作，因为HRP冻干品质轻易飞扬；尽量不要说话，以防污染。HRP尽量不要回倒，以防 污染。当HRP量小于10 mg时，溶解器具可用干净Eppendoff tube，HRP量大于 10 mg时，则要求用体积稍大的小玻璃瓶。 2.加ddH2O（x/20-z）mL溶解（颜色为褐色）。量小可用枪轻轻吹打溶解，量大可用 搅拌子适速搅拌溶解。注意不要太剧烈，不要起泡沫，否则HRP易失活。 3.称取x mg NaIO4，加ddH2O x/20 mL溶解（一个原则为NaIO4的量应大于x mg，可 先配制成20 mg/mL，取适当体积来使用）。 4.往HRP溶液中逐滴加入NaIO4溶液，边加边搅拌。 5.将混合好的溶液置于4℃，静置20 min（颜色为绿色）。 6.取x μL乙二醇溶于z mL DDW中，逐滴加入上述混合溶液中，边加边搅拌，z值 尽量小，大约为总体积的1/20。 7.室温静置20min（颜色应回复为最初的褐色）。 8.酶氧化过程完成，HRP终浓度为10mg/mL。 Note: 在酶的活化的过程中，注意NaIO4的浓度，不可太高，氧化时间不能太长，z值尽量的小，活化后的酶要马上使用。活化酶所用的溶解水应为Ulterpure water。 四．待标记蛋白的准备及标记（避光。防污染） 1.样品的处理：蛋白浓度选择最佳浓度（抗体一般要求5mg/mL 左右，抗原一般要 求1mg/mL左右，蛋白浓度过低可用PEG20000浓缩）。 2.用pH9.6左右的50mM CB（1×CB）透析去甘油或杂质（如Tris），换液视情况而定。 如样品中含有SDS，应在室温下透析去SDS。 （HRP活化的时间应掌握好，以便能与此步接上。一个原则是不能让氧化好的HRP 等样品的处理，应HRP一氧化好就可进行此步。） 3.将蛋白（抗原或抗体）与HRP按所需比例混合，于50mM pH9.5 CB中透析6小时 以上，头两个小时换液一次。 4.用新鲜配置的NaBH4溶液终止，NaBH4量为0.2x mg。摇匀，4℃静置2小时，每半 小时摇一次，NaBH4溶液加入的量要合适。（NaBH4溶液浓度自定，一个原则是加 到透析袋的体积是一个合适的体积。袋子满，所能容纳的体积小，NaBH4可配浓一 点，反之亦然。） 5.用pH8.0的20mM TBS或pH7.2的10mM PBS透析过夜。应换液多次，尽量除去NaBH4 （NaBH4可影响酶联试剂的热稳定性）。如受条件限制，一次也可。 Note: 拿捏透析袋应戴手套。 五．成品酶的保存： 加等量的甘油，混匀后-20℃保存。 六．附录： 附录1：（标酶过程所用Buffer） TBS为Tris-HCl等渗缓冲液，PBS为磷酸盐等渗缓冲液，CB为碳酸盐缓冲液。 10×（pH8.0 20mM）TBS的配制：

HRP辣根过氧化物酶标记抗体的方法

HRP(辣根过氧化物酶)标记抗体的方法 酶标记抗体－HRP标记抗体原理及方法，戊二醛二步法和过碘酸钠法【医学基础免疫学实验指导】 来源： 医学基础免疫学实验指导,主编金伯泉李恩善,第1版.北京:世界图书出版社,1990 酶标记物包括酶标记抗原、酶标记抗体和酶标记SPA等。酶标记物质量的好坏直接关 系到免疫酶技术的成功与否，因此被称为关键的试剂。酶标记物中最常用的是酶标记抗 体，它是将酶与特异性抗体经适当方法连接而成。酶标记抗体的质量主要取决于纯度好、 活性强及亲和力高的酶和抗体，其次要有良好的制备方法。目前，高质量的酶(如辣根过氧 化物酶，简称HRP)国内已有商品供应。高质量的抗体则可通过提取纯化而获得。在制备方 法上，宜选用产率高、不影响结合物的活性和不混杂干扰性物质且操作简便易行的方法。 (一)酶制剂及其底物

凡无毒性又能呈现有色化学反应的酶，原则上均可作为标记用。但作为标记抗体用的 酶应满足下列要求：(1)来源方便，易于纯化；(2)比活性高，性质稳定；(3)酶活性和量能 用简单方法测定。目前在免疫酶技术中常用的酶为辣根过氧化物酶(HRP)和硷性磷酸酶 (AP)，其次还有葡萄糖氧化酶，β-半乳糖苷酶、溶菌酶和苹果酸脱氢酶等。 由于辣根过氧化物酶(Horseradish Peroxidase,HRP)比活性高，稳定，分子量小，纯酶容 易制备，所以最常用。HRP广泛分布于植物界，辣根中含量高，它是由无色的酶蛋白和棕 色的铁卟啉结合而成的糖蛋白，糖含量18％。HRP由多个同功酶组成，分子量为40,000,等 电点为PH3～9,酶催化的最适PH因供氢体不同而稍有差异，但多在PH5左右。酶溶于水和 58％以下饱和度硫酸铵溶液。HRP的辅基和酶蛋白最大吸收光谱分别为403nm和275nm，一 般以OD403nm／OD275nm的比值RZ(德文Reinheit Zahl)表示酶的纯度。高纯度的酶RZ值应 在3.0左右(最高可达3.4)。RZ值越小，非酶蛋白就越多。值得注意的是，纯度并不表示酶活 性，如当酶变性后，RZ值仍可不变。

辣根过氧化物酶

用辣根过氧化物酶追溯周围神经联系法 辣根过氧化物酶(Herseradish Peroxidase)最早由Richard(1960)等人[1]用来研究肾近端小管的早期吸收情况，将HRP注入鼠静脉内，离隔一定时间进行观察。70年代Kristensen是将HRP用于神经系统联系的创妙人[2]，他的第一部分工作即是将HRP注入腓肠肌内而观察中枢（前角运动细胞）的HRP阳性标记颗粒。1972年Lavai和Lavai et al[3]首次将HRP用于中枢神经系统。他将HRP注入小鸡的中脑顶盖部分,30小时后取材, 观察视网膜节细胞内的HRP阳性标记细胞。1973年以后, 此法用于中枢神经系统者逐渐增多。 将HRP注入周围神经末梢部分, 观察其向中枢的联系, 近年来开展了各方面的探索：里见肇及山本悌司等人进行的试验：是将HRP 注入胃壁包括胃体、胃底、幽门等处,观察延髓迷走背核及孤束核的内侧部的酶标颗粒, 以及将HRP注入猫心脏窦房结观察延髓迷走背核及孤束核的酶标颗粒[1,5]。 Dalsgaard, Elfvin(6)等人将HRP注入肠系膜下节及交感颈上节, 观察脊髓内五个交感核的酶标颗粒及其节段性。 至于用HRP法追踪周围神经联系的研究工作, 目前国内外开展很少。只有Lowrence[7]将HRP注入一侧牙髓后观察同侧三叉神经半月神经节细胞内的HRP阳性颗粒；此外他还切断坐骨神经将断端浸入HRP液内, 在后根脊神经节细胞内找到HRP阳性颗粒。Elfvin还将HRP 注入荷兰猪的肠系膜下节, 观察脊神经细胞内HRP阳性细胞的节段性。国内从事HRP法研究的学者也多是研究中枢神经系内各核团的联

辣根过氧化物酶在表面活性剂膜中的直接电化学

辣根过氧化物酶在表面活性剂膜中的直接电化学 刘慧宏3　陈显堂　李　俊 Hill H.A.O.(襄樊学院化学化工系,襄樊441053)(牛津大学无机化学实验室,英国牛津) 摘　要　利用3种表面活性剂分别将辣根过氧化氢酶固定在裂解石墨棱面(edge 2plane pyrolytic graphite , EPG )电极表面,研究了辣根过氧化物酶(HRP )中Fe ?/Fe Χ电对与电极之间的直接电子传递过程以及酶 催化双氧水还原过程。实验结果表明:(1)表面活性剂是一种固定酶的理想材料;(2)这种体系可能构造 第三代生物传感器,对解释生物体代谢过程具有理论意义,对制备第三代生物传感器具有应用价值。 关键词　辣根过氧化物酶,表面活性剂,直接电化学,化学修饰电极 　2000206226收稿;2000212210接受 本文系湖北省教委资助课题 1　引 言 研究氧化还原蛋白质与电极之间的电子传递过程具有重要意义。一方面它为理解生物电化学和生物代谢过程提供有价值的信息,另一方面,利用电极探讨氧化还原蛋白质与底物分子之间的电子传递过 程,为制备生物传感器提供实验基础〔1,2〕。 HRP 含有辅基血红素,它是研究过氧化物酶的结构、动力学和热力学性质的代表。另外,HRP 修饰 电极广泛运用于分析过氧化氢、有机过氧化物、酚类化合物、芳香化合物以及一些环境污染物〔3〕。近几 年,利用各种材料的电极对HRP 的直接电子传递过程及催化性能进行了深入的研究,但HRP 修饰电极 的催化电子传递机理仍存在着争议〔4,5〕。而且只有少数文献描述了酶中Fe (Ⅲ )/Fe Χ氧化还原对的电化学行为〔6〕。原因是HRP 中的电活性中心与电极之间的电子传递速度很慢。因此,研究酶的固定化材 料和方法、使酶具有适宜的环境、保持其活性、具有良好的取向以加速电子传递过程是当前十分活跃的研究课题。表面活性剂膜具有与生物体磷酯膜十分近似的结构。因而可能成为研究蛋白质的电化学提 供良好的微环境,为构造生物传感器提供新型材料〔7,8〕。 本文研究了在表面活性剂膜内的HRP 的电化学性质。实验结果证明:(1)表面活性剂是一种固定酶的理想材料;(2)这种体系可能构造第三代生物传感器。 2　实验部分 2.1　试剂和仪器 HRP (G rade Ⅱ,德国Boehringer 公司),使用时未经提纯。双十二碳烯基溴化二甲基铵(DDAB ,Aldrich 公司),双十四酰基磷酯酰胆碱(DMPC ,Signa 公司),双十六烷基磷酸(DHP ,Fluka 公司)。其它化学试剂均为分析纯,所有溶液用Milli 2Q 水配制而成。缓冲溶液(离子强度为0.1)配制:酒石酸盐pH 3.0～6.0;磷酸盐pH 7.0～8.0;硼砂pH =9.0～10.0;磷酸盐:pH =11.0。电化学测量使用计算机控制的Autolab 电化学系统(荷兰Eco.Chemie 公司)。 2.2　实验方法 2.2.1　电极的修饰　表面活性剂DDAB (10mm ol/L ),DMPC (10mm ol/L )和DHP (2.5mm ol/L )的悬浊液,超声波振荡形成分散液。等体积的表面活性剂分散液和HRP (165g/L )的磷酸盐溶液混合。取10μL 该混合液平铺于电极表面,空气干燥约12h 。制得的修饰电极分别表示为:DDAB/HRP ,DMPC/HRP ,DHP/HRP 。 2.2.2　电化学测量　电化学池由参比电极池和电化学反应池(体积约400μL )两部分构成,其间由鲁金(Lugging )毛细管连接。参比电极为饱和甘汞电极(vs .SCE K 401,Radiometer )。铂丝网为辅助电极,工作电极为EPG (Le Carbone 2Lorraine ),电化学面积由Randles 2Sevcik 方程求得为0.075cm 2。每次实验前,EPG 第29卷 2001年5月 分析化学(FE NXI H UAX UE )　研究报告Chinese Journal of Analytical Chemistry 第5期511～515