表位疫苗研究进展
中国生物工程杂志 China B i otechnol ogy,2007,27(11):86～91
综 述
表位疫苗研究进展
3
方 钟 罗文新33
夏宁邵
(厦门大学生命科学学院国家传染病诊断试剂与疫苗工程技术研究中心 厦门 361005)
摘要 表位疫苗是用抗原表位制备的疫苗,是近年来新兴的一种疫苗研制技术,也是今后最具开发前景的疫苗技术之一,在肿瘤、病毒等疾病的防治中有着自身独特的优势。详细阐述了T 表位和B 表位的筛选和鉴定方法、表位疫苗的载体研究及表位疫苗在肿瘤、病毒和微生物感染中的应用等,对表位疫苗的最新研究进展进行了综述。关键词 表位 T 表位 B 表位 表位疫苗
中图分类号 Q819
收稿日期:2007208220 修回日期:2007210210
3国家禽流感防治专项(2004BA519A73),福津省科技重点项目(2005Y020),福建省科技重大专项(2004YZ01-1),国家自然科学基金资助项目(30640017)
33通讯作者,电子信箱:wxluo@x mu .edu .cn
一种有效的疫苗必须在消除其病原体致病性的同时,能够保持其病原体的免疫源性。在疫苗研制的早期人们直接灭活或者降低病原体的活性、毒性来产生疫苗,然而这样的疫苗并不能完全保证其安全性,且有些病毒无法体外培养,或者培养产量有限,无法制备灭活和减毒疫苗。研究者们通过基因工程手段将病毒表面具有免疫源性的蛋白分子大量表达,研制出了基因工程亚单位疫苗,这样的疫苗安全而且有效。但是,不少病毒衣壳蛋白变异快,或者抗原蛋白体外表达困难,不能有效的制备亚单位疫苗。近期世界范围内禽流感快速爆发,也对传统疫苗技术提出了挑战。所以,在面对H I V 、HCV 、肺炎以及肿瘤等传统疫苗技术无法触及的疾病时,迫切需要一种更高效的疫苗技术。表位疫苗因其独特的优势有望成为解决这些问题的有效手段。
1 表位疫苗
当某个外源物质进入体内的时候,通常会被机体的免疫系统识别,并产生相应的免疫反应。传统疫苗正是将病源生物或者其某个蛋白作为外源物质来激活
机体的免疫反应,但是免疫应答反应并不是针对整个外源物质,而仅仅只是外源物质的一小段区域,如蛋白的十几个氨基酸序列或者糖分子的某个侧链,这就是表位(ep itope ),又称抗原决定簇(antigenic
deter m inant )。表位通常可以根据引起体液免疫或细胞
免疫的不同,而分为B 表位和T 表位。表位是抗原引起免疫应答的关键部分,表位疫苗正是基于这一理论基础提出来的。
表位疫苗(ep itope vaccine )是用抗原表位制备的疫苗。根据表位的不同,表位疫苗分为B 表位疫苗、T 表位疫苗和兼具两种表位的多表位疫苗。根据形式的不同,表位疫苗可分为合成肽疫苗(synthetic pep tide
vaccine )、重组表位疫苗(recombinant ep itope based vaccine )及表位核酸疫苗(ep it ope DNA vaccine ,m inigenes/ep igenes )。
2 表位的筛选和鉴定
表位疫苗研制过程中,最首要最重要的任务是表位的筛选和鉴定。表位是一个免疫学概念,因此表位的鉴定可以利用与其相关的免疫反应来实现,T 表位利用细胞免疫应答鉴定,B 表位利用表位与抗体的特异反应鉴定。
2.1 T 表位的筛选和鉴定
T 表位可以直接从展示了T 表位的MHC /HLA 分子上分离,但该方法费时费力,成本高。利用T 细胞应
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答是目前确定T表位最常用的方法。当记忆T细胞在受到抗原T表位刺激后,就会产生一系列的免疫效应。通过检测这些反应,如细胞增殖[1]、胞毒效应[2]或细胞因子(如干扰素)的分泌[3],就可以筛选T表位。
此外,肽库技术可以提供大量不同的抗原区段,成为筛选T表位的一个有力工具。肽库有化学合成肽库及噬菌体肽库两类[4,5]。根据肽序列来源不同又可以分为天然肽库(natural pep tide libraries,NPL s)和随机肽库(random pep tide libraries,RPL s)。RPL s是随机合成肽,序列由随机的氨基酸构成。它不但能模拟多肽表位,也能通过类似的三维结构来模拟糖分子表位。Pashov等[6]发现以RYRY或YPYRY氨基酸残基为核心的肽能够很好的模拟H I V gp120上的糖分子,模拟肽免疫生成的抗体在细胞免疫共沉淀试验中,显示了与gp120的结合活性;且H I V感染者体内针对gp120多糖的抗体能够与模拟肽产生交叉反应。NPL s通常是由蛋白肽链随机打断成的无数短肽分子构成。这些短肽覆盖了整个抗原的氨基酸序列,且相邻短肽之间部分重叠,避免了在打断肽链过程中,可能出现的表位丢失[1]。因为多肽T表位多为线性表位,所以筛选NPL s 即可得到相应序列[7]。
将总RNA反转录得到的cDNA克隆到融合了MHCΟII不变区(invariant chain,Ii)的pTSX载体上,构建成cDNA文库。文库转化能表达Ii的239I M A细胞,用CD4+T细胞筛选此239I M A细胞,可以鉴定T表位[8]。但这种研究方法也存在自身的缺陷。特异亚型的Ii分子与CD4+T细胞的反应强弱,直接影响实验的结果;且不能鉴别没有突变和可以交叉反应的表位。2.2 B表位的筛选和鉴定
B表位是特异与抗体分子结合的分子,利用抗原抗体反应是鉴定B表位的最基本手段。同样肽库技术也被广泛的应用于B表位的筛选,尤其是噬菌体展示肽库。
通过NPL s筛选到的B表位与抗原分子上某段氨基酸序列完全一致。因此,在已知蛋白抗原序列,无法确定表位的情况下,可以应用NPL s筛选鉴定抗原表位分布。Cha等[9]构建了肿瘤细胞NP L s,通过患者血清中的抗体,筛选得到了肿瘤相关抗原表位。筛选自NPL s的表位引起的免疫应答更加接近于蛋白抗原激起的反应[10]。
然而,通过NPL s筛选到的B表位大多是线性表位,而能有效的引起中和效应的B表位常常是构像表位,由抗原上不连续的氨基酸残基通过空间折叠形成[11]。近年来RP L s技术已经被成功的用于筛选各种病原体、过敏源、肿瘤等蛋白抗原表位的模拟表位(m i m ot ope)[12],即在空间构像上模拟抗原表位的三维结构。其中不少工作都很出色,如Yang等[13]利用支原体兔多抗血清,筛选了随机七肽库和带半胱氨酸的环七肽库。筛选到的随机肽在P97等支原体表面抗原中能找到类似或者相同的序列,表明在支原体抗原上,这些肽段区域扮演了表位的角色。
反之,对模拟表位的氨基酸残基序列分析,则可以帮助了解抗原物质的表位分布及空间结构特性[14]。
3 表位疫苗的载体
由于缺乏天然蛋白的三维结构,表位疫苗的分子小,免疫原性差,半衰期短,使机体无法产生免疫反应,还可能引起免疫耐受。因此提高与抗体的亲和力、增加免疫原性与稳定性是近年来表位疫苗的研究热点。目前用于解决这一问题的途径主要有:氨基酸修饰、多表位串连展示到某个载体上。而应用表位展示载体这一方法,在国内外已经取得了不少令人欣喜的研究成果。
应用噬菌体RP L s得到的表位,可以直接展示在噬菌体上作为候选疫苗,简单、成本低而有效。pⅧ展示表位拷贝数多,能在体内产生更加强烈的针对表位的免疫反应。但噬菌体自身不具备很好的Th表位,这成为噬菌体直接作为疫苗的缺陷。因此,不少噬菌体展示肽的研究,都同时展示了Th表位[15]。
选择包含无关Th表位的蛋白分子作为载体,可以避免慢性感染者普遍存在的HLAΟII类限制性耐受,诱导Th1类细胞因子占据优势地位。BS A,GST,匙孔血蓝蛋白(keyhole li m pet hemocyanin,K LH)和破伤风类毒素(tetanus t oxoid,TT)均可成为载体蛋白[16,17]。通过化学偶联或融合表达的方法将表位与蛋白载体连在一起,免疫小鼠可诱导特异针对肽的免疫反应出现[12,18]。此外,表位肽的有效性不仅取决于自身,还与不同的载体蛋白相关,良好的载体有利于加强表位的免疫源性[19]。
在表位肽末端共价连接脂质集团形成稳定的脂肽分子。脂能帮助与其共价连接的肽分子被抗原递程细胞(APC)识别,并防止表位在胞内被水解,从而稳定的呈递到MHC/HLA分子上。不少脂肽疫苗研究已经进入临床试验。如1995年进入临床阶段的HBV脂肽疫
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苗[20]。此外,法国ANRS研究所研制的H I V脂肽疫苗,也在健康志愿者和H I V感染者的免疫实验中验证了有效性[21]。
类病毒颗粒(virusΟlike particles,VLPs)作为免疫原,与病毒颗粒一样,即使没有佐剂也能激起高效的免疫反应,因此,VLP也被用来作为表位肽的载体。本实验室曾以HBc VLP作为载体展示了HEV中和表位[22]。另一研究利用原核表达组装的HBc VLP载体,展示疟原虫CS蛋白表位,已经进入动物试验和一期临床试验,有效性、安全性都得到了验证[23]。利用I R I V 病毒颗粒作为载体的研究也进入了临床阶段[24]。因此,VLP作为表位展示载体成为了最近研究的热点。人乳头瘤病毒HPV衣壳蛋白L1、L2在体外也能组装VLP,且能够展示较大的肽[25]。S m ith等[26]利用烟草花叶病毒(tobacco mosaic virus,T MV)建立了另外一个展示长肽的方法。
以VLP展示表位最大的优点在于免疫原性高,低剂量能激起强烈的免疫反应。不仅对啮齿类而且对灵掌类,有利于打破肿瘤和病毒慢性感染所产生的免疫耐受,这将使VLP展示表位疫苗具备直接用于治疗的特性[27]。此外,不少以HPV或HBV VLP作为载体的候选疫苗,可同时引起针对外源肽和载体的免疫反应,具有双重免疫效果。
4 表位疫苗的应用
传统疫苗技术在针对肿瘤和不少病毒引起的疾病时作用不大。新兴的表位疫苗技术在过去的十几年中已经得到了很大发展,利用抗原表位和模拟表位引起针对病原的免疫应答研究,也已经在肿瘤、H I V及疟疾等疾病中得到了初步应用。
4.1 病毒性疾病
引起未成年人细支气管炎和肺炎的呼吸道融合病毒(res p irat ory syncytial virus,RS V)是一种世界范围内传播的病毒。基于噬菌体展示技术,得到了该病毒的模拟肽S1(WHYI SKPQ),研究者进一步对S1进行了点突变,其中四种突变显示出了明显高于S1的抗体亲和力,混合不同的肽形成MAPs(multip le antigen pep tides)免疫小鼠,产生了高滴度的中和抗体,攻毒实验也显示了肽对小鼠良好的保护效果[28]。
I nfluenza virus、H I V、HCV等病毒变异快,体外培养难,至今没有研制出有效的疫苗。HCV能引起慢性肝炎、肝硬化、肝癌等,严重威胁着人类健康,病毒超变区
(hypervariable region,HVR)1是主要的中和位点,也是发生高变异的区域,且难分离纯化。找到能够激起广谱中和效应的HVR1表位,是HCV疫苗研究的基础。研究人员采用大容量的HVR1NPL s,经HCV感染者血清筛选,得到了8个不同的肽段,再与30份血清反应鉴定广谱性,得到肽p13显示出最广的反应活性,而且肽p13和p23亲和力最高。序列分析发现,这两个克隆分别与HVR1的C端和N端具有很高的同源性[29]。同样HCV HVR1保守表位做为候选疫苗的研究,显示了肽免疫抗血清的病毒捕获能力和在细胞模型中的中和效果[30]。另一和A I V有关的研究,也得到了保守T表位[31]。这些试验结果让人们意识到,即使是变异非常快的病毒也有保守或者是极少变异的位点,这有望成为有效、广谱疫苗研究的突破点。
H I V表面抗原蛋白变异快,在感染细胞过程中首先与受体分子结合的gp120是一种糖蛋白,糖分子与整个结合过程密切相关。模拟H I V糖蛋白得到糖分子模拟表位,刺激机体产生有效的免疫反应,就能阻止病毒入侵宿主细胞。目前不少H I V模拟表位疫苗研究,已经深入到动物实验。用人血清筛选得到多种gp120和gp41的模拟肽,其中5种混合接种恒河猴,产生了特异的抗体,攻毒实验也显示了保护效果[32]。利用随机肽库筛选得到了gp41和p6非中和表位,这些表位在病毒初始感染细胞时,就能被免疫系统识别,基于这一性质,可以开发能有效区分病毒感染和接受疫苗者的诊断试剂[33]。
4.2 肿 瘤
与肿瘤有关的研究主要集中在肿瘤相关抗原(tumorΟass ociated antigens,T AA)分子上。T AA是在恶性瘤细胞中特异或过量表达的抗原分子。T AA通常在肿瘤细胞内表达水平低,或本身具有较低的抗原性,产生低水平的免疫应答反应,所以常常引起体内耐受。因此T AA表位的鉴定显得格外重要,表位疫苗的研究有利于打破这一耐受。
表皮生长因子受体的模拟表位偶联TT和K LH免疫小鼠都得到了很好的免疫效果,出现特异体液和细胞免疫应答[34,35]。黑素瘤细胞黏附分子的模拟表位,不仅在体外能够刺激淋巴细胞增殖,偶联TT后免疫小鼠产生了与黏附分子交叉反应的特异抗体,并刺激产生了相关的Th细胞反应[36]。
对于肿瘤治疗而言,能够直接杀死癌变细胞的细胞免疫反应远比体液免疫重要。一旦打破耐受,肿瘤T
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表位就能够引起细胞免疫反应,有效的清除病变细胞。在不同肿瘤细胞中广泛表达的RGS5蛋白被证实具有CT L表位的存在,成为潜在的疫苗设计表位[37]。Tumengargal等[38]利用筛选到的皮肤淋巴瘤(cutaneous ly mphoma)T表位,开展了临床实验,表位肽与Th表位一起接种两例患者,恶性细胞几乎全部受到抑制。在病人外周血中检测到表位特异的CT L细胞,CT L细胞在体外实验中被证实具有胞毒活性和肿瘤杀伤活性。
4.3 微生物与寄生虫感染
表位疫苗技术不仅在病毒、肿瘤疫苗研制中得到应用,对炭疽杆菌、致病真菌、支原体等微生物感染的研究也有报道[13,39,40]。肉毒杆菌的保护性单抗筛选随机十二肽库,得到了能在体内激活B细胞的表位肽[41]。在寄生虫相关研究中,表位疫苗也值得关注。A rnon 等[18]鉴定了3个血吸虫模拟B表位,偶联BS A接种小鼠,再感染血吸虫,一周后虫体数目远远少于未接种的阴性组,与直接接种灭活虫体的阳性组基本一致,且其中的模拟肽p30能引起补体效应。疟疾由疟原虫引起,虫体表面的T表位在免疫应答中起着重要作用, Aguilar等[42]鉴定了6个T表位混合B表位免疫小鼠,出现了高效持久的细胞、体液免疫应答反应。中国医学科学院关于疟疾多表位联合疫苗的研究也取得了巨大的成功,疟疾表位疫苗有希望成为最早上市的表位疫苗之一。
5 展 望
表位疫苗具备不少传统疫苗技术所不具备的优势,相对灭活减毒疫苗而言,它容易生产,摆脱了体外培养的限制;相对基因工程亚单位疫苗而言,它不包含任何病原生物的完整组分,彻底摆脱了潜在的威胁。且表位疫苗能通过随机肽模拟糖分子表位,这是基因工程亚单位疫苗所无法实现的。表位疫苗及相关技术已经被成功的用于表位的鉴定和初步设计候选疫苗。而利用B表位或T表位构成的疫苗能够在体内引起体液免疫和细胞免疫应答,进而开发有效的治疗性疫苗,因此,表位疫苗技术被认为是今后最具开发前景的疫苗技术之一。但是,表位疫苗的研究仍旧面临许多难题:如何建立更加有效的表位鉴定手段;如何确定具有广谱效应的表位;如何有效的选择载体分子,高效的引起免疫应答;如何打破慢性感染和肿瘤MHC/HLA分子引起的耐受,都是人们在以后的研究中必须面对的问题。虽然,表位疫苗的动物实验给出了令人欣喜的实验结果,也有数十种T表位疫苗进入临床研究,但构像模拟B表位疫苗却鲜见临床报道。因此,作为一种新兴的技术,表位疫苗依然需要更多的深入研究,才能真正造福于人类。
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F AN
G Zhong LUO W enΟxin X I A N ingΟshao
(Nati onal I nstitute of D iagnostics and Vaccine Devel opment in I nfecti ous D iseases,
School of life Sciences,Xia men University,Xia men 361005,China)
Abstract Ep it ope vaccine is one of the e merging vaccine techniques devel op ing in past decade years. Particularly the advantages of this vaccine on p reventing and therapy illness,as cancer and virus,are es pacially outstanding.The most i m portent ele ments about the vaccine,na mely T/BΟep it opes obtainment and identificati on, vehicles f or ep it ope and vaccine constructi on,are revie wed.I n additi on,app licati ons of the vaccine technique in s ome refract ory diseases,such as cancer,virus and pathogen infecti on,are dep icted.
Key words Ep it ope TΟep it ope BΟep it ope Ep it ope vaccine
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新型乙肝疫苗的研究进展
新型乙肝疫苗的研究进展 摘要：乙型病毒性肝炎（简称乙肝）是由乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）。乙肝流行范围广泛，危害严重。至今尚无根治乙肝的特效药物，所以接 种疫苗是预防乙肝最有效的方法。现将研究新型乙肝疫苗的相关进展作一综述。 关键词：乙肝疫苗；重组疫苗；DNA疫苗 乙型肝炎是由乙肝病毒（HBV）引起的以肝脏损害为主要病变的传染病［1］。据统计， 全球现有20 多亿人感染过HBV，其中（3.5 ～ 4）亿人为慢性 HBV携带者［2］。接种疫苗是目前预防乙肝最有效的方法，乙肝疫苗分为血源性乙肝疫苗和基因工程乙肝疫苗，国际上称 为第一代疫苗和第二代疫苗，新型乙肝疫苗是第三代疫苗。 1.血源性乙肝疫苗 血源性乙肝疫苗即从乙肝抗原（HBsAg）阳性者的血浆中提取抗原制成的疫苗，故又称血源性乙肝抗原疫苗［3，4］。我国在1985 年正式批准大量生产该疫苗[5]，但是由于来源困难，难以满足普遍接种的需要，逐渐被重组疫苗所代替。我国于 1998 年 7 月 1 日停止生产血源性乙肝疫苗，并于 2000 年 1 月 1 日停止使用该疫苗。 2.基因工程疫苗 基因工程疫苗亦称重组疫苗，是采用基因工程技术将HBsAg的基因片段插入到受体细胞，在体外培养增殖过程中分泌 HBsAg，将其收集、提纯加工后制成乙肝疫苗，曾先后采用过大 肠杆菌系统、啤酒酵母细胞系统、哺乳动物细胞系统[6]的重组乙肝疫苗。含前 S 基因的重组 乙肝疫苗是第三代重组疫苗［7］。含有HBV PreS2 和 Pre S1 抗原成分或 HBV 的 S 基因变异株核心蛋白成分的各种新型重组乙肝疫苗具有更大的免疫原性，能诱导更高效的免疫应答和抗 体产生，中和 HBV，保护机体免受病毒攻击。 3.新型乙肝疫苗 基因工程疫苗效果比较理想，但是还存在一定的问题。随着科技不断进步，近年来国内 外对乙肝疫苗进行了大量的研究，开发各种新型疫苗，以降低生产成本、提高免疫效果。 3.1 DNA乙肝疫苗 DNA疫苗（质粒）在注射部位被细胞摄取后通过转录翻译生成蛋白质，蛋白质通过胞内 处理后，把信息递呈给I类MHC限制性CD8十T细胞，表达I类MHC分子或共刺激分子。 摄取质粒的细胞能分泌释放抗原，刺激B细胞生成抗体。同时抗原被APC细胞（抗原递呈细胞）摄取，通过II类MHC分子，递呈给CD4十T细胞和B细胞，识别病毒感染的细胞[8]。 我国食品药品监督局首个批准应用于临床研究的治疗性DNA疫苗为双质粒乙肝DNA疫苗， 在I期试验中，30名健康志愿者都未出现不良反应，证明该疫苗有较好的安全性和耐受性。 3.2新佐剂疫苗 佐剂指能够特异性地通过物理或化学方式与抗原结合而增强其特异性免疫的物质。目前 世界上广泛使用的是铝佐剂，基因工程乙肝疫苗与铝佐剂协同作用。近几年可以增强免疫刺激、平衡 Th1/Th2型免疫应答的 CpG ODN（CpG oligonucleotide）佐剂逐渐进入乙肝疫苗研究 者的视线。但CpG ODN 进入体内会被快速代谢，因此与铝佐剂协同使用，通过铝佐剂的作用 在体内形成 CpG ODN 库，延长其在体内的作用时间是十分必要的。 3.3联合疫苗 乙肝疫苗可与其他疫苗（尤其是儿童期疫苗）联合使用，这样只须注射一针，即可达到 2 种或多种疫苗的免疫效果，其结果无疑会提高免疫覆盖率。因此，国内外已经开发出诸如 百白破－乙肝联合疫苗、甲乙型肝炎联合疫苗等新型疫苗。 3.4口服疫苗 从上世纪 90 年代起，世界各国的研究者开始致力于转基因植物口服乙肝 疫苗的研究工作，希望由此开发出一种更加经济、有效、安全的乙肝疫苗。目前转基因植物 口服乙肝疫苗研究中最被看好的生产材料是香蕉。据报道，已有研究小组在香蕉幼苗中成功 表达了HBsAg，相信不久将会有转 HBsAg 基因的香蕉问世。 4.结束语 乙型肝炎病毒感染目前尚无有效的方法治愈。推行乙肝疫苗接种是预防和阻断HBV传播
猪瘟疫苗的研究进展
猪瘟疫苗的研究进展 刘萍 (中农威特生物科技股份有限公司,兰州 730046) 摘要:猪瘟(classical swine fever,CSF)是危害世界养猪业的主要传染病之一,以很强的传染性和高致死率为特征。目前猪瘟的流行趋势发生了很大变化,呈现典型猪瘟和非典型猪瘟共存、持续感染与隐性感染共存、免疫耐受和带毒综合征共存等现象,给猪瘟的防制带来新的挑战。目前,免疫接种依然是猪瘟防制的主要措施,因而开发新型、高效、稳定的猪瘟标记疫苗具有重要的现实意义。 关键词:猪瘟;标记疫苗 中图分类号:S852.65+1 文献标识码:B 文章编号:167127236(2008)0720095204 猪瘟是由猪瘟病毒(classical swine fever virus, CSFV)引起的一种高度接触性传染病,它对全世界的养猪业构成巨大威胁。不同年龄、性别和品种的猪均能感染,死亡率高达80%～90%。近年来,该病在美洲、亚洲、欧洲等国家和地区呈现复发的趋势,一些宣布已消灭猪瘟的国家(如法国、荷兰、德国、比利时等)又见猪瘟复发的报道。在我国,猪瘟流行呈现典型猪瘟和非典型猪瘟共存、持续感染与隐性感染共存、免疫耐受和带毒综合征共存等现象。猪瘟新的流行形式给全世界养猪业提出了新的挑战,在我国,免疫接种仍是防制猪瘟的重要措施,疫苗对预防猪瘟起重大作用。因而研制新型、安全、高效、稳定的猪瘟疫苗对于预防和控制猪瘟具有重要意义(仇华吉等,2005;Morilla2 G onzfih,2002)。 1 猪瘟疫苗的现状 当前使用的猪瘟疫苗均是用兔化弱毒株C株生产的活疫苗,根据生产工艺的不同分为:猪瘟活疫苗(细胞源),即猪瘟细胞苗;猪瘟活疫苗(兔源),即猪瘟组织苗,猪瘟组织苗又根据生产用成年兔还是乳兔分为猪瘟脾淋苗和猪瘟乳兔苗。世界公认中国C株兔化弱毒的突出优点是,用其接种的猪不产生 收稿日期:2008201208病毒血症和脑炎病变,可以安全地免疫接种任何怀孕期的母猪和哺乳仔猪,不影响受精率及存活率,不引起流产、死胎,可安全地用于建立种猪群(Tesmer 等,1973)。常用的还有日本GPE株、法国Thiver2 val株等都是广泛应用的CSFV疫苗株,一般均可提供终生免疫。 由于近年来猪瘟流行和发病特点在世界范围内发生了很大变化,出现呈周期性、波浪形的地区性散发流行的温和型猪瘟,其特点是:无名高热、症状不典型,持续性感染,新生仔猪先天性震颤和母猪繁殖障碍。用传统疫苗免疫常常造成免疫失败,甚至免疫次数增加和免疫剂量加大到600个兔体反应(我国规定是150个兔体反应)也不能预防其感染,且有蔓延之势。在妊娠早期接种疫苗常可通过胎盘感染胎儿,造成死胎或弱仔并成为持续性带毒者,成为新疫源。因此,必须研制安全有效的新型疫苗来加强猪瘟的免疫防制(Uttenst hal等,2001;Stegeman 等,2000)。弱毒疫苗已延用了近40年,在长期的免疫压力下,猪瘟流行毒株已向远离疫苗毒的方向演化,这种流行毒株的变化趋势在国内外情况基本一致,所以研制针对当前流行毒株的新型疫苗迫在眉睫(Dong等,2002)。 另外,注射普通弱毒疫苗已影响到国际贸易,因为在美国、欧盟等国家停止了弱毒疫苗免疫,他们采 肺炎的直接原因。仔猪的抵抗力较弱,许多外界刺激(如长途运输、天气变化、冲洗降温以及转栏等因素),极易造成散发性的仔猪感冒,在饲养员忽视的情况下,极易继发肺炎。建仪养猪场在饲养过程中,重视外界因素引起的致病环节,以免造成损失。 地塞米松具有抗炎、抗病毒和抗过敏的作用,与青霉素配伍,可产生较大的药物协同作用,治疗效果显著增强。银翘柴芩汤、鱼腥草水煮液合用,具有较好的抗炎、抗病毒效果,主要用来治疗猪风热性感冒和由感冒引起的继发性肺炎,辨证加减对预防仔猪的流行性感冒和肺炎,也可以产生较好的预防作用。
EV71疫苗的研究进展
第27卷第4期2010年8月 生物医学工程学杂志 Journal of Biomedical Engineer ing Vol.27No.4 August2010 EV71疫苗的研究进展* 李明1,2尹怡1,2综述李晋涛2$审校 1(第三军医大学学员旅,重庆400038) 2(第三军医大学全军免疫学研究所,重庆400038) 摘要:EV71引起的手足口病(H FM D)已经严重威胁婴幼儿的健康,但目前仍无特效抗病毒药物问世。许多科技工作者正在研发各种类型的EV71疫苗,包括灭活疫苗、类病毒颗粒疫苗、合成肽疫苗、DNA疫苗及转基因口服疫苗。本文就EV71疫苗的研究进展做一简要综述并对各自优劣和发展前景进行讨论。 关键词:手足口病;EV71;疫苗 中图分类号R512.5文献标识码A文章编号100125515(2010)0420933204 An Overview of the Evolution of EV71Vaccine Li Ming1,2Yin Yi1,2Li Jintao2 1(Student Brigad e,T hird Military Med ical University,Chongqin g400038,China) 2(I nstitution of I mmunolog y,PLA,Thir d Military Med ical University,Chongqing400038,Ch ina) Abstr act:EV71infection has become a ser ious public healt h threat especially among young childr en.Yet,at pr esent, no specific antiviral drug against EV71infection is available.A number of scientists are st udying various kinds of vaccines,including inactivated vaccine,virus2like par ticle vaccine,DNA vaccine,synthetic pept ide vaccines,and transgenic or al vaccine.T his article reviews the recent advancement in t he design of va rious kinds of vaccine aga inst EV71as well as their prospect ive usefulness,effectiveness,weakness and developments in the for egr ound. Key words:H and2foot2mouth disease(HF MD);Enterovir us71(EV71);Vaccine 引言 手足口病(hand2foot2mouth disease,H FMD)是一种临床表现为手、足、口腔等部位的疱疹及中枢神经系统并发症的婴幼儿疾病。近年来,引起H FMD 的主要病原体为肠道病毒71型(EV71)[1]。EV71属于小RNA病毒科,由单链RNA和衣壳蛋白VP12VP4构成,目前已发现其两种受体:人类清道夫受体B2(SCARB2)和P选择素的糖蛋白配体1 (PSGL21)[1]。自1969年EV71在加利福尼亚H FMD中首次被报道后[2],EV71已在世界范围内引起十余次爆发和流行,且死亡病例趋于增多[3,4]。最近在亚太地区的流行也呈上升趋势,1998年我国台湾的EV71大爆发,有129000例病例,重症病例多达400例,死亡78例[5]。随后,在山东、北京、上 *国家自然科学基金资助项目(30400402,30571708);国家科技支撑计划资助项目(2006BAI03B12) $通讯作者。E2mail:ljtqm s@yah https://www.wendangku.net/doc/913221037.html, 海等多个城市相继有疫情的报道,其中2008年全国就有488955人被感染,126人死亡[6,7]。EV71引起的H FMD给人类特别是婴儿健康造成了巨大的威胁,但目前仍无特效抗病毒药物问世,科技工作者主要致力于各种EV71疫苗的研究,本文拟将基于EV71的疫苗研究及其存在问题做一简要综述,以期把握其研究脉搏。 1灭活疫苗 灭活疫苗是用物理、化学方法杀死病原体,但仍保持其免疫原性的一种生物制剂。最早的EV71灭活疫苗被发展用以应对1975年保加利亚的H FMD 流行[8]。但之后一直没有被使用和继续深入研究,因此没有数据证明其有效性。直到1998年台湾H FMD疫情流行后,灭活疫苗再度被研究。Wu 等[9]用灭活EV71疫苗、重组VP1蛋白、DNA疫苗分别免疫接种实验母鼠,并比较其新生小鼠对野生型EV71的免疫保护效果。结果显示三种疫苗都提
肿瘤疫苗研究进展介绍
肿瘤疫苗研究进展介绍 摘要：肿瘤疫苗，即含肿瘤抗原基因或肿瘤抗原肽的疫苗，是近年的研究热点之一。与传统疫苗防止疾病的作用不同，癌症疫苗通过促使自身免疫系统攻击已经生成的肿瘤达到治疗效果。现在已取得一定研究进展的肿瘤疫苗有宫颈癌HPV疫苗、黑色素瘤疫苗、淋巴瘤疫苗、白血病DNA疫苗、前列腺癌疫苗、肺癌疫苗等，本文对上述疫苗一一进行了介绍。此外，本文还对肿瘤疫苗研究过程中几个重大的突破进行了介绍，如MUC1蛋白与肿瘤疫苗的关系、DC疫苗的原理及应用等。 关键词：肿瘤疫苗宫颈癌HPV疫苗黑色素瘤疫苗淋巴瘤疫苗白血病DNA疫苗前列腺癌疫苗肺癌疫苗 MUC1蛋白 DC疫苗 Abstract：The tumor vaccine，which contains tumor associated antigen encoding gene or tumor associated antigen(peptide), has become one of the research hotspots in recent years. Unlike the function of the traditional vaccine, the tumor vaccine treat a tumor through making the immune system attack the tumor. Up to now，three are several tumor vaccines has made progress，including the cervical cancer HPV vaccine ，melanoma vaccine，lymphoma vaccine，leukemia DNA vaccine，prostate cancer vaccine，lung cancer vaccine, which is also talked about in this article. Besides, several breakthroughs will be included in this article, which contains the MUC1 and the dc vaccine. Key words：tumor vaccine，cervical cancer HPV vaccine ，melanoma vaccine，lymphoma vaccine，leukemia DNA vaccine，prostate cancer vaccine，lung cancer vaccine, MUC1，dc vaccine （一）肿瘤疫苗的定义及分类 肿瘤疫苗，即含肿瘤抗原基因或肿瘤抗原肽的疫苗，是近年的研究热点之一。其原理是通过激活患者自身免疫系统，利用肿瘤细胞或肿瘤抗原物质诱导机体的特异性细胞免疫和体液免疫反应，增强机体的抗癌能力，阻止肿瘤的生长、扩散和复发，以达到清除或控制肿瘤的目的。它来源于自体或异体肿瘤细胞或其粗提取物，带有肿瘤特异性抗原(tumor specific antigen，TSA)或肿瘤相关抗原(tumor associated antigen，TAA)。可通过激发特异性免疫功能来攻击肿瘤细胞，克服肿瘤产物所引起的免疫抑制状态，增强TAA的免疫原性，提高自身免疫力来消灭肿瘤。其中，TSA的免疫治疗在肿瘤综合治疗中占有重要地位，因为它可以启动以肿瘤特异性细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxic Tlymphocyte，CTL)反应为主的抗肿瘤效应，有效打击肿瘤，防止转移、复发且不伤及无关组织。它既可以独立地治疗肿瘤，又可与手术及放、化疔结合，具有疗效高、特异性强、不良反应小等优点，尤其对于中晚期已经发生转移的恶性肿瘤而言，具有独到的治疗作用。（1） 根据肿瘤疫苗的用途不同，可以把它分为两种：预防性疫苗和治疗性疫苗。其中，预防性疫苗是用与某些特殊肿瘤发生有关的基因制备的疫苗，可接种于具有遗传易感性的健康人群，进而控制肿瘤的发生；而治疗性疫苗是以肿瘤相关抗原为基础，主要用于化疗后的辅助治疗的。 而根据它的来源，又可以把它分为肿瘤细胞疫苗、基因疫苗、多肽疫苗、树突状细胞疫苗、CTL表位肽疫苗等。其中，肿瘤细胞疫苗是从机体肿瘤组织中提取肿瘤细胞，经灭活处理后使瘤细胞丧失致瘤性，但仍保持其免疫原性，然后对机体进行主动免疫。但由于肿瘤细胞肿瘤抗原抗原TSA表达低下，并缺乏一些免疫辅助因
禽流感疫苗研究进展
禽流感疫苗研究进展 摘要对禽流感的预防，必须在采取严格的生物安全措施的同时，加强必要的免疫措施。对不同类型禽流感疫苗的研究现状、优越性与局限性进行了综述。 关键词禽流感；疫苗；研究进展 最近，亚洲一些国家不断暴发的禽流感（Avian influenza，AI）事件引起了人们对全球一系列动物和公众健康问题的极大关注，最近的联合国粮农组织（FAO）罗马提交会议指出[1]，当面临AI大流行威胁时，采取大规模扑杀感染动物的措施会丧失很大一部分食物来源，使地方养禽业遭受严重打击，显得不太合理。对禽流感的预防，必须努力集中在采取严格的生物安全措施的同时，加强必要的免疫措施。免疫能减轻临床症状，降低死亡率，减少病毒的扩散和提高群体对感染的抵抗力，从而控制禽流感病毒（Avian influenza vinus，AIV）的广泛传播[2]。然而，如果疫苗的使用和管理不当，不仅达不到预期的效果，还会污染环境，威胁公众健康。因此，研制安全、高效的AIV疫苗是专家们为之不懈努力的目标。 理想的疫苗应具有高的生物保护容量，同时消除环境污
染和易感动物感染的可能性。总的来说，对于AIV疫苗的发展，以下几种设计思路均已被采用或尝试。 1全病毒灭活疫苗 由于AIV基因组的抗原漂移，AIV疫苗仅能提供70%的保护力。针对这种特点，AIV灭活疫苗通常制备成针对几种不同亚型AIV的多价疫苗，己证明1种灭活疫苗可以至少包括4种不同的AIV亚型。同只含单一亚型的疫苗比，多价疫苗并没有减弱对同一种HA亚型AIV攻击的有效保护[3]，而且各亚型抗原之间不产生免疫干扰。AIV灭活疫苗能使免疫鸡群在感染AIV野毒时有效地减轻损失，并显著减少可能存在于鸡群和环境中的病毒数量，缩短其存活时间，是AI 防治的主动措施、关键环节和最后防线。而且灭活疫苗具有制备工艺简单、免疫效果确实、免疫持续期长等特点，许多国家已将其作为商品化的AIV疫苗应用于家禽中。我国己研制成功不同亚型的AIV疫苗，且证明具有良好的免疫保护作用。但灭活苗本身存在一些缺陷[4]，主要是：影响疫情监测；存在散播病毒的风险；免疫剂量较大，制备成本高。其最突出的缺点是不能诱导产生有效的粘膜免疫抗体和细胞免疫 应答，因而无法有效地抑制呼吸道中AIV的复制。近年来，人们试图从技术上突破此缺点，筛选并利用同亚型弱毒疫苗
猪瘟病毒及疫苗应用研究概况
50 青海畜牧兽医杂志 2010年第40卷第4期(总第208期)猪瘟病毒及疫苗应用研究概况 衣翠玲 (青海省畜牧兽医科学院,西宁,810016) 中图分类号:S859.79 文献标识码:A 文章编号:100327950(2010)0420050202 猪瘟(classical s wine fever,CSF)最早发生于1833年美国的俄亥俄州,初称猪霍乱,1903年被证明病原体是一种病毒,欧洲则称之为古典猪瘟。我国最早1925年在东南大学农科有免疫血清方面的研究报告。猪瘟是世界范围内猪的最严重的疾病之一,因而被O I E(国际兽医局)列为A类传染病。其病原为猪瘟病毒(CSF V)。以出血和发热为主要特征,呈急性或慢性经过,是一种对猪危害极大的传染病〔1～4〕。 1 猪瘟流行特点 从20世纪70年代末开始,各养猪国家猪瘟流行的特点以温和型猪瘟为主,为周期性,波浪型的地区散发流行〔3〕。其特点是无名高热,症状不典型,持续性感染。在我国猪瘟流行呈典型和非典型猪瘟共存;持续感染与隐性感染共存。本病呈世界性流行,为高度接触性传染病。 程喜莱报道〔5〕,2001年1～3月湖北某种猪场免疫猪群暴发了一种以高热,高死亡率为特征的传染病,经检查确诊为猪瘟。郭麦芳报道〔6〕,2008年初陕西某区养猪场免疫注射过的200余头后备猪发病,经实验室检查确诊为猪瘟和附红细胞体混合感染。一些发达国家采取严格卫生防疫措施和净化猪群来控制和消灭了猪瘟。如美国,加拿大,澳大利亚,日本,巴西等〔7〕造成猪瘟流行原因还有①疫苗的质量存在问题,免疫后,抗体水平不能防止亚临床感染水平,可使强毒在猪体内复制和散毒;②联苗效果不确实,据有关资料报道应用三联苗免疫的猪群不断出现免疫失败的病例,使养猪业造成较大的损失。 2 病原 CSF V是黄病毒科(Flaviviriclac)瘟病毒属(pcstivirus)中的一个成员,属于有囊膜的RNA病毒,基因组为单股正链,相对分子质量约为12300,含有一个大的开放性阅读框(openreading fra me,ORF),其两侧分别为5’-非翻译区(5’-UTR)和3’-非翻译区(3’-URT)CSF V的所有结构蛋白和非结构蛋白均由ORF所编码,翻译成1～3898个氨基酸的多聚前体蛋白,其结构蛋白和非结构蛋白在病毒RNA上的编码顺序为5’-N p r o、C、E0、E1、E2、P7、N s2、N s3、N s4A、N s4B、N s5—3’。其中C为核衣壳蛋白,E0、E1、E2为结构糖蛋白,其余均为非结构蛋白。在结构蛋白中最具有免疫防制研究价值的是E0和E2〔2,4〕。E0由227个氨基酸残基构成,相对分子质量为44000～48000,可诱导产生中和谱很窄的中和抗体。E0不仅是一种结构蛋白,而且也是一种功能蛋白,它与CSF V对宿主细胞的嗜性以及致病力有密切关系,可降解病毒和细胞的RNA,可导致免疫抑制,引起动物和淋巴细胞凋亡〔4〕。E2的相对分子质量约为了53000～55000,E2参与病毒对细胞的感染过程,携带有能刺激机体产生保护性免疫的抗原决定簇,其编码的gp55蛋白是猪瘟的主要保护性抗原。E2囊膜蛋白共包含371个氨基酸残基,是主要的抗原表位集中区。A/D区中69011～766aa区域是一段高抗原性的表位集中区〔8〕。刘珂等以E2基因阳性质粒为模板。PCR 扩增出E2囊膜糖蛋白上A/D抗原区B细胞表位8788aa～938aa,构建出表达质粒PEF AD,转化到BL21大肠埃希菌原核表达系统中进行诱导表达。猪瘟病毒的分离一般采取病死猪的脾或淋巴结等含毒量高的组织,研磨过滤,将滤液接种于原代细胞或细胞系进行病毒分离。CSF V能在猪肾细胞和其他一些哺乳动物细胞内增殖。〔9〕 3 猪瘟诊断方法 诊断方法有很多种,介绍几种常用方法。 3.1 病毒分离 猪瘟病毒的分离一般采取病死猪的脾或淋巴结等含毒量高的组织,研磨过滤,将滤液接种于原代细胞或细胞系进行病毒分离。CSF V能在猪肾细胞和其他一些哺乳动物细胞内增殖。〔9〕 此法具有准确诊断的优点,但不利于对病毒核酸序列的分析。 3.2 荧光抗体试验 Roberts on等〔10〕首次将荧光抗体(Fluorescent antibody,F A)运用于猪瘟病料和组织培养物的检测,利用高效价的特异性免疫血清,提取1gG,进行荧光标记。 F A法简单、快捷、可靠。许多国家将它作为猪瘟消灭计划的法定诊断试验〔11〕。 3.3 血清中和试验 该实验可检出动物体内的抗体。按不同稀释度血清抑制病毒产生细胞病变的瓶数,计算被检血清的中和效价。 3.4 间接血凝实验 用该方法检测猪瘟抗体消长动态。此方法操作简单,无需特殊仪器设备,特异性强而不与其他传染病阳性血清发生交叉凝聚,快速(2h内可判定结果)和重复性好等特点。 3.5 免疫酶测定技术 saunder等〔12〕报道应用快速酶标记抗体微量技术检测猪瘟抗体的方法。通过对640份血清进行检测表明,酶标记抗体法和血清中和试验的符合率在99%以上,而且仅需2h就可获得试验结果。 3.6 斑点E L I S A 此方法简便、快捷。谷均相等,利用次法对丹东种猪场2718头猪进行了检测,并根据抗体效价情况对其猪进行了免疫接种。 3.7 RT-PCR 是以病毒RNA为模版进行反转录后,再以PCR进行核酸扩增来检测CSF V的方法。具有特异性强、灵敏度高、重复性好、检测时间短等特点,适合临床应用。 3.8 鉴别PCR 此方法简化了检测步骤,缩短了检测时间,提高了病毒的检出率,可用于疾病的诊断和流行病学调查。 4 猪瘟疫苗的应用 20世纪40年代人们开始了对猪瘟病毒进行兔体适应的试验研究。1903年〔7〕DeSch weinitz和Dorset首次证明CSF V是一种滤过性病毒。人们采用各种免疫方法预防和控制猪瘟。其中应用最广泛的有中国的兔化弱毒疫苗株,又称中国株或C 株。日本的细胞弱毒疫苗株GPE及法国的Thivervat株。它们在猪瘟的控制中都发挥了重要作用〔13〕。大多数弱毒活疫苗是在C株的基础上开发形成的。孙伟等〔14〕对不同日龄的猪用不同剂量猪瘟兔化弱毒疫苗进行免疫,通过正向间接血凝试验进行猪抗体监测。结果表明:仔猪在吃乳前和60日龄进行免疫效果较好,其抗体使仔猪在整个饲养期内可以得到保护。所以猪瘟疫苗的三大品系疫苗(中国的C株,日本的CPE株和法国 ①收稿日期:2010203220
疫苗的研究现状
疫苗的研究现状 专业：生物工程班级：09级1班作者：马志双指导老师：吴光杰 摘要:通过比较国内外疫苗行业的发展情况,从分析疫苗流通体系,调研传统疫苗和新型疫苗的品种和质量,以及评价我国疫苗制品和疫苗生产企业的双重竞争等三方面,综述了我国疫苗制品、疫苗市场与疫苗生产企业的发展现状,指出了我国疫苗产业的市场前景与发展方向。 关键词: 发展趋势; 疫苗研究; 发展现状。 1 引言 疫苗是指为了预防、控制传染病的发生、流行，用于人体预防接种的疫苗类预防性生物制品。生物制品，是指用微生物或其毒素、酶，人或动物的血清、细胞等制备的供预防、诊断和治疗用的制剂。预防接种用的生物制品包括疫苗、菌苗和类毒素。其中，由细菌制成的为菌苗；由病毒、立克次体、螺旋体制成的为疫苗，有时也统称为疫苗。将病原微生物（如细菌、立克次氏体、病毒等）及其代谢产物，经过人工减毒、灭活或利用基因工程等方法制成的用于预防传染病的自动免疫制剂。疫苗保留了病原菌刺激动物体免疫系统的特性。当动物体接触到这种不具伤害力的病原菌后，免疫系统便会产生一定的保护物质，如免疫激素、活性生理物质、特殊抗体等；当动物再次接触到这种病原菌时，动物体的免疫系统便会依循其原有的记忆，制造更多的保护物质来阻止病原菌的伤害。 2 我国疫苗的发展现状 我国疫苗流通领域的开放和计划免疫范围的扩大, 加强计划疫苗需求,激活有价疫苗市场。我国主要的有价疫苗品种包括流感病毒裂解疫苗、Vero 细胞乙脑疫苗、狂犬疫苗、水痘疫苗等。其中, 流感疫苗市场最大, 年销售额达8亿元。国产疫苗虽然在价格上拥有明显的竞争优势, 但国际医药企业凭借技术、资金和品牌优势, 以及研发、生产、包装、销售的完整体系,占据国内有价疫苗市场的一半份额。我国加大传统疫苗的技术改良与新型疫苗品种的开发力度。我国开发的疫苗品种大多为单价疫苗、减毒疫苗等传统疫苗品种, 而国外上市的疫苗多以联苗、灭活疫苗等新型疫苗为主, 国产疫苗品种在稳定性、产能及关键技术上与发达国家相比还有一定差距。近两年, 我国在传统疫苗技术提升、新型基因工程疫苗品种开发等方面取得突破性进展, 治疗性乙肝疫苗、SARS疫苗等新产品已
肿瘤基因疫苗研究进展
肿瘤基因疫苗研究进展 基因疫苗是指将编码外源抗原的基因与质粒重组，构建出真核表达载体，导入人或动物细胞后，利用宿主细胞的蛋白质合成系统合成外源抗原蛋白，并诱导机体产生对该抗原的免疫应答，以达到预防和治疗疾病的目的。[1]肿瘤的治疗目前仍是世界性的难题, 随着免疫学和分子生物学的发展, 肿瘤疫苗的发展经历了肿瘤细胞疫苗、重组蛋白疫苗和基因疫苗三个阶段。 肿瘤基因疫苗也称DNA疫苗, 是目前研究的热点, 主要包括与肿瘤相关抗原(Tumor Associated Antigen，TAAs)有关的全长、表位、独特型(Idiotype，Id)和融合脱氧核糖核酸（Deaxyribonucleic Acid，DNA）疫苗, 能够自主复制的核糖核酸（Ribonucleic Acid，RNA）疫苗，与树突细胞（Dendric Cell，DC）相关的肿瘤基因疫苗等。 近年来, 肿瘤基因疫苗在动物基础研究和临床前研究, 甚至I期及II期临床 试验中取得了可喜的成果, 显示出广阔的应用前景。1990年Wolff等[2]首次发现将编码报告基因的DNA质粒直接肌肉注射, 能在肌细胞内获得较持久的蛋白表达。1992年Tang等[3]将表达人生长激素基因的质粒DNA导入小鼠细胞后, 诱导小鼠产 生了特异的抗人生长激素的抗体, 从而提出了基因免疫的概念。1993 年，Ulmer[4]等将可表达甲型流行性感冒（流感）病毒核蛋（Nucleoprotein，NP）的质粒DNA 注射小鼠，发现可有效地保护小鼠抗不同亚型、分离时间相隔34年的流感病毒的攻击。随后的大量动物实验都说明，在合适的条件下，DNA接种后既能产生细胞免疫又能引起体液免疫。于是，核酸疫苗技术应运而生。随后的几年其在肿瘤综合治疗中显示出很好的应用前景，从而使基因免疫的研究更加深入。 1 肿瘤基因疫苗的免疫学机制 肿瘤基因疫苗诱导的抗肿瘤免疫反应机理可能是DNA疫苗转染至宿主细胞后, 将其编码的抗原蛋白提呈给免疫系统,诱导MHC-I限制性CD8+ 的CTL和MHC-II限制性的TH以及抗体产生,引起广泛的免疫应答。质粒DNA进入组织后,通过胞饮方式被摄入宿主细胞,在细胞内表达产生抗原蛋白, 细胞将表达蛋白转运至近的抗原提呈细胞(APC), 然后蛋白被多蛋白酶体系降解成为有不同抗原表位的短肽进入内质网腔内, 与MHC-I类分子结合,形成MHC-I肽复合物,递呈给并激活CD8+T细胞, 诱导产生细胞免疫反应。辅助性T细胞( HTL)则诱导和维持CTL效应。动物实验证明了抗原特异性的HTL在CTL清除肿瘤过程中所起的重要作用[2]。而另一些短肽则与MHC-I结合, 形成MHC-II肽复合物, 提呈给CD4+ T细胞使其激活,刺激抗原特异性的B细胞分泌抗体, 产生体液免疫。[5] 2 肿瘤核酸疫苗的构建 核酸疫苗的构建方法是将编码保护性抗原的目的基因片段重组到真核表达载体上，主要包括真核表达载体的选择、外源抗原基因的选择与分析、抗原基因与表达载体的连接与鉴定几个方面。 2.1 载体的选择 构建核酸疫苗的载体主要有重组质粒型载体和病毒载体（包括逆转录病毒），尤以前者较多。质粒载体必须是能在大肠杆菌中高拷贝地扩增，而在动物细胞内则能高效表达，但不复制，也不含有向宿主细胞基因组内整合的序列，一般以PBR322 或PUC 质粒为基本骨架，带有细菌复制子，真核生物的启动子（有的含
基因工程疫苗的研究进展及应用
基因工程疫苗的研究进展及应用 摘要随着生物技术的发展基因工程疫苗的研究不断深入，传统疫苗一出现诸多缺陷，利用基因工程开发新疫苗是当前解决这个问题的最好途径之一。目前开发的主要有基因工程亚单位疫苗，基因工程活载体疫苗，核酸疫苗，合成肽疫苗，转基因植物可食疫苗，独特性疫苗。本文对新型疫苗的研究进展和应用情况作一综述。 关键词基因工程疫苗生物制品免疫系统病毒样颗粒基因工程疫苗应用 1 基因工程疫苗的概念 使用DNA重组生物技术，把天然的或人工合成的遗传物质定向插入细菌、酵母菌或哺乳动物细胞中，使之充分表达，经纯化后而制得的疫苗。应用基因工程技术能制出不含感染性物质的亚单位疫苗、稳定的减毒疫苗及能预防多种疾病的多价疫苗。如把编码乙型肝炎表面抗原的基因插入酵母菌基因组，制成DNA重组乙型肝炎疫苗；把乙肝表面抗原、流感病毒血凝素、单纯疱疹病毒基因插入牛痘苗基因组中制成的多价疫苗等。 基因工程疫苗是将病原的保护性抗原编码的基因片段克隆入表达载体,用以转染细胞或真核细胞微生物及原核细胞微生物后得到的产物.或者将病原的毒力相关基因删除掉, 使成为不带毒力相关基因的基因缺失苗。 2 各种基因工程疫苗简介 目前利用基因基因工程技术已经使用和正在研制开发生物新型疫苗主要有基因工程亚单位疫苗，基因工程活载体疫苗，核酸疫苗，合成肽疫苗，转基因植物可食疫苗，独特性疫苗等。这些疫苗统称为基因工程疫苗。 2.1基因工程亚单位疫苗 基因工程亚单位疫苗又称生物合成亚单位疫苗或重组亚单位疫苗，指只含有一种或几种抗原而不含有病原体的其他遗传信息。能利用体外表达系统大量表达病原体主要保护性蛋白作为免疫原。因此具有良好的安全性便于大规模生产。 在研制亚单位疫苗时，首先要明确免疫原活性的目的DNA片段。其次还必须选择合适的表达系统用来表达基因产物。迄今研制出的亚单位疫苗有预防毒性和细菌性疾病的，也有激素类亚单位疫苗。比较成功的重组亚单位疫苗有人乙型肝炎病毒亚单位疫苗（酵母表达系统）口蹄疫病毒亚单位疫苗，牛瘟病毒亚单位疫苗，猪细小病毒亚单位疫苗等。基因工程亚单位疫苗分为三类：细菌性疾病亚单位疫苗，现已研制出预防产肠毒素大肠埃希氏菌，炭瘯菌，链球菌等都能对相应的疾病产生有效的保护作用[1]；病毒性亚单位疫苗，病毒病原体只编码少数几种基因产物，大部分分析类病毒基因组已被克隆测序。目前已商品化和中试验阶段的病毒性疾病亚单位疫苗主要有乙型肝炎、口蹄疫、狂犬病等十几种亚单位疫苗；激素类亚单位疫苗。动物的生长受生长激素的调节。而生长激素的分泌受生长抑制素的抑制。所谓生长抑制素疫苗是以生长抑制素作免疫原，使免疫动物的生长抑制素水平下降，生长激素释放增多，使牛、羊等家畜获得显著的增重效果[5]。 2.2 基因工程活载体疫苗 基因工程活载体疫苗可以是非致病性微生物通过基因工程的方法使之表达某种特定病原物的抗原决定簇基因，产生免疫原性。也可以是致病性微生物通过基因工程的方法修饰或去掉毒性基因但仍保持免疫原性。在这种疫苗中，抗原决定簇的构像与致病性病原体抗原的构象相同或者非常相似，兼有活疫苗和死疫苗的优点。在免疫力上很有优势。主要有基因突变疫苗和复制性活载体疫苗。基因突变体疫苗，这类疫苗是认为的将病原体的某个或某些基因全部或部分删除，使其毒力下降不在引起临床疾病但仍能感染宿主并诱发保护性免疫力[2]。这种疫苗的突出特点是不易返祖而重新获得毒力。缺失的基因可以作为一种遗传标志用于建立鉴别诊断方法。虽然到目前为止这类疫苗的成功例子还不多，但的确是研制疫苗的一
非洲猪瘟疫苗研究进展
118广西牧兽医医2019年Vol.35(3) C,Sanchez-Vizcaino JM.Survival of several porcine viru-ses in Pifferent Spanish Pry-cureP meat products,J].Food Chem.1997；54：555—9. [9]Penrith ML,Vosloo W.Review of African swine fevee: transmission spread and control,J].J S Afriv Vet Assoc. 2009；80：58-62. [10-EFSA.Scientific review on African swine fever[EB/ OL].2010.http：//www.efsa.europa.eu/sites/default/ files/scientific_output/Wiles/main_documents/1556.pdi. Accessed21Mar2016. [11]Wilkinson PJ.African swine fever virus[M-.In:Pen- saert MB,editor.Virus infections of porcines.New York: Elsevier Sciencc；1989.p.17-35. [12-Guinat C,Reiz A,Netherton CL,Goatlev L,Pfeiffer DU,Dixon L.Dynamics of African swine fever virus shed-ding and excretion in domestic pies infected by intramuscu-lar inoculation and contact transmission[J-.Vet Res. 2014；45：93.[13]EFSA.Ewluation of possible mitigation measures I o pre- vent introduction and spread of African swine fevee through wile boai EB/OL].2014.http：//www.efsa.europa.eu/ sites/default/Wiles/scient-Vic_output/files/main_docu-ments/3616.pdf.Accessed23Mar2015. [14]Ribeiro R,0X0J,Madeiro S,Hutchings GH,Boinas F. Experimentae infection of Ornithodoros erraticus sensu stheto with too Portuguese African swine fevee strains. Study of factors involved in the dynamics of infection in ticks[J].PLoS ONE.2015；14：20.dot：10.1371/foua nal.pone.0137718. [15]EFSA.Scientific opinion on the role of tick vectors in the epidemiology of,0x682-0^0haemorrhaaic fevee and Af-rican swine fever in Eurasia.2010.http：//www.efsa.eu-ropa.ex/s ites/d efault/file/s cientificoutput/files/m ain_ documents/1703H pde Accessed18Noe2015H [16-非洲猪瘟防控远程培训[EB/OL].农业农村部畜牧兽医局,2019.1.9. 非洲猪瘟疫苗研究进展 张丹琳 (广西柳州畜牧兽医学校，广西柳州545000) 中图分类号：S858.282.4文献标识码：B 非洲猪瘟(African swina fevar,ASF)是由非洲猪瘟病毒(African swina fevar virus,ASFV)引起猪的一种急性、烈性传染病。ASFV是非洲猪瘟病毒科、非洲猪瘟病毒属的唯一成员，是目前唯一已知的虫媒DNA病毒［1］。ASFV基因组为线性的双链DNA分子，根据病毒株的不同其大小约为170-190kb,包含151-167个开放阅读框，可编码150 ~200种蛋白［2］。ASF的急性临床症状为咼热、呼吸急促、全身广泛性出血,死亡率可高达100%,因此，世界动物卫生组织(OIE)将其列为必须报告动物疫病,我国将其列为一类动物疫病。 1921年非洲肯尼亚首次报道ASF疫情,1957年传入葡萄牙并在西班牙、法国、意大利、马耳他、比利时等欧洲国家广泛传播;19世纪70年代ASF 传入西半球南美洲及中美洲地区;2007年ASF在 收稿日期：2019-03-14 作者简介:张丹琳(1987-)，女，汉族，讲师，硕士，研究方向：动物传染病。文章编号：1002-5235(2019)03-0118-05 高加索地区和俄罗斯联邦暴发;2014年ASF蔓延至东欧多国家并持续流行;2018年8月3日我国辽宁省沈阳市某养殖场发生ASF疫情，这是我国历史上首次暴发ASF疫情叫截至2019年3月1日，我国已经确诊111起疫情，其中108起是生猪的疫情,3起是野猪的疫情。我国是养猪大国，养猪数超过世界一半，突如其来的ASF给我国养猪业带来了空前的危机，对我国养猪业、国民经济和国计民生的影响都是非常大的。 由于ASFV基因组可编码的蛋白很多,且基因组变异频繁，抗ASFV感染的免疫机制也复杂,AS-FV还可可避机体的免疫应应，给ASF疫苗研发工作造成很多困难,至今无有效的ASF疫苗。但是疫苗对于ASF的防控具有重大意义，国内外科学家一直在努力，随着现代技术发展,ASF疫苗的研发取得一定的进展。本文对ASFV免疫机制的认识,ASF灭活疫苗、弱毒疫苗、基因缺失疫苗、DNA 疫苗、亚单位疫苗、病毒活载体疫苗的研究进展进行综述，以期为我国ASF疫苗的研发提供参考。
生物技术疫苗研究进展
生物技术疫苗的研究进展 摘要：随着分子生物学及重组DNA技术的发展，出现了生物技术疫苗，生物技术疫苗是利用生物技术制备的分子水平的疫苗，包括基因工程亚单位疫苗、合成肽疫苗、基因缺失或突变疫苗、基因工程活载体疫苗、DNA疫苗。 关键词：基因工程亚单位疫苗、合成肽疫苗、基因缺失或突变疫苗、基因工程活载体疫苗、DNA疫苗 1生物技术疫苗 上世纪，常规疫苗的局限性日益明显：原始疫苗不安全，人工灭活疫苗免疫持续时间短，生产成本高，灭活不彻底往往容易散毒；体外培养细菌或病毒容易污染其它病原，长期存在于环境中，难与自然感染动物鉴别，使疾病流行复杂化等[1]。生物技术疫苗是分子生物学发展的产物，是用基因工程方法或分子克隆技术分离出病原的保护性抗原基因，将其转人原核或真核系统使其表达出该病原的保护性抗原，制成疫苗或者将病原的毒力相关基因删除掉或进行突变，使成为不带毒力相关基因的基因缺失苗或突变苗。生物技术疫苗只含有病原的部分组成，而常规疫苗往往是一个完整的病原体，因此生物技术疫苗的最大优点是安全性好，对致病力强的病原更是如此。生物技术疫苗可以降低生产成本，更廉价更大批地生产；易于区分感染动物和免疫动物，由于生物技术疫苗中只含有病原的一种蛋白成份，或者缺失某一蛋白成份，因此通过检测野毒中含有，而生物技术疫苗中没有的病毒蛋白的抗体可以方便地从免疫动物中区分出野毒感染者；利用活载体可制成多价疫苗，达到一针防多病的目的。就其应用前景而言生物技术疫苗的优势在于克服了常规疫苗的大量培养病原微生物、灭活不彻底、活疫苗的毒力返强等缺点；动物机体免疫系统更集中产生免疫应答；有利于制成多价苗和多联苗，简化免疫接种程序；易于工业化生产，可以大幅度降低成本；有利于区分疫苗抗体和野毒感染抗体，不影响疫病的监测与诊断，利于疫病的控制、净化和消灭；使用方便，便于保存等。生物技术疫苗为一种理想疫苗，它只能在细胞中剌激合成抗源，从而引发细胞的免疫应答。与传统疫苗相比，生物技术疫苗还有独特明显的优势：①具备可操作性，如BCG卡介活疫苗，是构成一次免疫产生对多种疾病持久防御的疫苗，将刺激机体对各病原体产生保护性免疫；②安全广泛性，1949 年以来全世界有35 亿人接种BCG,并发症极少，安全性高；③免疫应答范围广，植物可表达动物和人类病原体，一种植物可以同时表达几种抗原；④稳定、成本低，种子或块茎中的抗原可以长期保存而不失去活性，基因疫苗生产成本低，价廉，适宜于广大农村；⑤卫生无病原污染，可直接食用免疫，避免了使用注射器的疾病传染，易于推广，易被人们所接受；⑥经济性好，大规模种植疫苗无需提取纯化过程和冷藏，长途运输方便，种植者也无需反复购买种子和种苗；⑦母体抗体存在时新生儿免疫也是可能的；③易获得多价疫苗，将不同抗原基因的转基因植物进行杂交，很容易获得多价转基因植物疫苗；⑨免疫期持久；⑩能同时使用多种疫苗[2]。 2生物技术疫苗的分类 根据生物技术疫苗研制的技术路线和疫苗组成的不同，目前可分为四大类：①基因工程亚单位苗②基因缺失苗或突变苗③活载体苗④DNA疫苗⑤合成肽疫苗。 各种生物技术疫苗的性质见表[3] 项目基因工程亚基因缺失或活载体苗DNA苗合成肽疫苗