pMKO.1-GFP逆病毒载体使用说明

pMKO.1-GFP

pMKO.1-GFP 载体基本信息：

载体名称:

pMKO.1-GFP 质粒类型: 逆病毒载体；RNAi 载体

高拷贝/低拷贝: 低拷贝

克隆方法: 限制性内切酶，多克隆位点

启动子:

U6 载体大小:

6767 bp 5' 测序引物及序列:

pLXSN 5' primer 5' CCCTTGAACCTCCTCGTTCGACC3' 3' 测序引物及序列:

pBABE 3' primer 5'ACCCTAACTGACACACATTCC3' 载体标签: 无

载体抗性: 氨苄青霉素

筛选标记:

EGFP 克隆菌株: DH5α、HB101等

宿主细胞（系）: 常规哺乳动物细胞系

备注: 推荐使用逆病毒包装载体：pUMVC 、pCMV-VSV-G 。

稳定性: 稳表达

组成型/诱导型: 组成型

病毒/非病毒: 逆转录病毒

pMKO.1-GFP 载体质粒图谱和多克隆位点信息：

pMKO.1-GFP载体序列：

ORIGIN

1 CCATGTTCTT TCCTGCGTTA TCCCCTGATT CTGTGGATAA CCGTATTACC GCCTTTGAGT

61 GAGCTGATAC CGCTCGCCGC AGCCGAACGA CCGAGCGCAG CGAGTCAGTG AGCGAGGAAG 121 CGGAAGAGCG CCTGATGCGG TATTTTCTCC TTACGCATCT GTGCGGTATT TCACACCGCA 181 TATGGTGCAC TCTCAGTACA ATCTGCTCTG ATGCCGCATA GTTAAGCCAG TAAGCTTTTT 241 GCAAAAGCCT AGGCCTCCAA AAAAGCCTCC TCACTACTTC TGGAATAGCT CAGAGGCCGA 301 GGCGGCCTCG GCCTCTGCAT AAATAAAAAA AATTAGTCAG CCATGGGGCG GAGAATGGGC 361 GGAACTGGGC GGAGTTAGGG GCGGGATGGG CGGAGTTAGG GGCGGGACTA TGGTTGCTGA 421 CTAATTGAGA TGCATGCTTT GCATACTTCT GCCTGCTGGG GAGCCTGGGG ACTTTCCACA 481 CCTGGTTGCT GACTAATTGA GATGCATGCT TTGCATACTT CTGCCTGCTG GGGAGCCTGG 541 GGACTTTCCA CACCCTAACT GACACACATT CCACAGCCGG ATCTACACTC CGCTATCGCT 601 ACGTGACTGG GTCATGGCTG CGCCCCGACA CCCGCCAACA CCCGCTGACG CGCCCTGACG 661 GGCTTGTCTG CTCCCGGCAT CCGCTTACAG ACAAGCTGTG ACCGTCTCCG GGAGCTGCAT 721 GTGTCAGAGG TTTTCACCGT CATCACCGAA ACGCGCGAGG CAGCCAGCTT ACCTCCCGGT 781 GGTGGGTCGG TGGTCCCTGG GCAGGGGTCT CCCGATCCCG GACGAGCCCC CAAATGAAAG 841 ACCCCCGCTG ACGGGTAGTC AATCACTCAG AGGAGACCCT CCCAAGGAAC AGCGAGACCA 901 CAAGTCGGAT GCAACTGCAA GAGGGTTTAT TGGATACACG GGTACCCGGG CGACTCAGTC 961 AATCGGAGGA CTGGCGCCCC GAGTGAGGGG TTGTGGGCTC TTTTATTGAG CTCGGGGAGC 1021 AGAAGCGCGC GAACAGAAGC GAGAAGCGAA CTGATTGGTT AGTTCAAATA AGGCACAGGG 1081 TCATTTCAGG TCCTTGGGGC ACCCTGGAAA CATCTGATGG TTCTCTAGGG TCGACCCTGT 1141 TCCATCTGTT CCTGACCTTG ATCTGAACTT CTCTATTCTC AGTTATGTAT TTTTCCATGC

1201 CTTGCAAAAT GGCGTTACTT AAGCTAGCTT GCCAAACCTA CAGGTGGGGT CTTTCATTCC 1261 CCCCTTTTTC TGGAGACTAA ATAAAATCTT TTATTTTATC TATGGCTCGT ACTCTATAGG 1321 CTTCAGCTGG TGATATTGTT GAGTCAAAAC TAGAGCCTGG ACCACTGATA TCCTGTCTTT 1381 AACAAATTGG ACTAATCGAA GGTACCCTAT TACACCCACT CGTGCAGGCT GCCCAGGGGC 1441 TTGCCCAGGC TGGTCAGCTG GGCGATGGCG GTCTCGTGCT GCTCCACGAA GCCGCCGTCC

1501 TCCACGTAGG TCTTCTCCAG GCGGTGCTGG ATGAAGTGGT ACTCGGGGAA GTCCTTCACC 1561 ACGCCCTTGC TCTTCATCAG GGTGCGCATG TGGCAGCTGT AGAACTTGCC GCTGTTCAGG 1621 CGGTACACCA GGATCACCTG GCCCACCAGC ACGCCGTCGT TCATGTACAC CACCTCGAAG 1681 CTGGGCTGCA GGCCGGTGAT GGTCTTCTTC ATCACGGGGC CGTCGTTGGG GAAGTTGCGG 1741 CCCTTGTACT CCACGCGGTA CACGAACATC TCCTCGATCA GGTTGATGTC GCTGCGGATC 1801 TCCACCAGGC CGCCGTCCTC GTAGCGCAGG GTGCGCTCGT ACACGAAGCC GGCGGGGAAG 1861 CTCTGGATGA AGAAGTCGCT GATGTCCTCG GGGTACTTGG TGAAGGTGCG GTTGCCGTAC 1921 TGGAAGGCGG GGCTCAGGAT GTCGAAGGCG AAGGGCAGGG GGGCGCCCTT GGTCACGCGG 1981 ATCTGCACCA GCTGGTTGCC GAACAGGATG TTGCCCTTGC CGCAGCCCTC CATGGTGAAC 2041 ACGTGGTTGT TCACCACGCC CTCCAGGTTC ACCTTGAAGC TCATGATCTC CTGCAGGCCG 2101 GTGTTCTTCA GGATCTGCTT GCTCACCATG GTCTCGAGGT CGACGGTATC GATAAGCTTT 2161 TTGCAAAAGC CTAGGCCTCC AAAAAAGCCT CCTCACTACT TCTGGAATAG CTCAGAGGCC 2221 GAGGCGGCCT CGGCCTCTGC ATAAATAAAA AAAATTAGTC AGCCATGGGG CGGAGAATGG 2281 GCGGAACTGG GCGGAGTTAG GGGCGGGATG GGCGGAGTTA GGGGCGGGAC TATGGTTGCT 2341 GACTAATTGA GATGCATGCT TTGCATACTT CTGCCTGCTG GGGAGCCTGG GGACTTTCCA 2401 CACCTGGTTG CTGACTAATT GAGATGCATG CTTTGCATAC TTCTGCCTGC TGGGGAGCCT 2461 GGGGACTTTC CACACCCTAA CTGACACACA TTCCACAGGG TCGACCACTG TGCTGGCGAA 2521 TTCCATATGG GAGTACTAGT ACGCGTACCG GTGTTTCGTC CTTTCCACAA GATATATAAA

2581 GCCAAGAAAT CGAAATACTT TCAAGTTACG GTAAGCATAT GATAGTCCAT TTTAAAACAT 2641 AATTTTAAAA CTGCAAACTA CCCAAGAAAT TATTACTTTC TACGTCACGT ATTTTGTACT

2701 AATATCTTTG TGTTTGCAGT CAAATTAATT CTAATTATCT CTCTAACAGC CTTGTATCGT

2761 ATATGCAAAT ATGAAGGAAT CATGGGAAAT AGGCCCTCTT CCTGCCCGAC CTTGTCGACA 2821 GATCTTCAAT TCCGGCGCCT AGAGAAGGAG TGAGGGCTGG ATAAAGGGAG GATCGAGGCG 2881 GGGTCGAACG AGGAGGTTCA AGGGGGAGAG ACGGGGCGGA TGGAGGAAGA GGAGGCGGAG 2941 GCTTAGGGTG TACAAAGGGC TTGACCCAGG GAGGGGGGTC AAAAGCCAAG GCTTCCCAGG 3001 TCACGATGTA GGGGACCTGG TCTGGGTGTC CATGCGGGCC AGGTGAAAAG ACCTTGATCT 3061 TAACCTGGGT GATGAGGTCT CGGTTAAAGG TGCCGTCTCG CGGCCATCCG ACGTTAAAGG 3121 TTGGCCATTC TGCAGAGCAG AAGGTAACCC AACGTCTCTT CTTGACATCT ACCGACTGGT 3181 TGTGAGCGAT CCGCTCGACA TCTTTCCAGT GACCTAAGGT CAAACTTAAG GGAGTGGTAA 3241 CAGTCTGGCC CTAATTTTCA GACAAATACA GAAACACAGT CAGACAGAGA CAACACAGAA 3301 CGATGCTGCA GCGCTGCAGC AGACAAGACG CGCGGCTTCG GTTCCAAACC GAAAGCAAAA 3361 ATTCAGACGG AGGCGGGAAC TGTTTTAGGT TCTCGTCTCC TACCAGAACC ACATATCCTG 3421 ACGGGGTCGG ATTCCACATC GACTCCCTTC CTCAGGTCGG GCCACAAAAA CGGCCCCCAA 3481 AGTCCCTGGG ACGTCTCCCA GGGTTGCGGC CGGGTGTTCA GAACTCGTCA GTTCCACCAC 3541 GGGTCCGCCA GATACAGAGC TAGTTAGCTA ACTAGTACAG ACGCAGGCGC ATAACATCAA 3601 ACATAGACAC TAGACAATCG GACAGACACA GATAAGTTGC TGGCCAGCTT ACCTCCCGGT 3661 GGTGGGTCGG TGGTCCCTGG GCAGGGGTCT CCAAATCCCG GACGAGCCCC CAAATGAAAG 3721 ACCCCCGTCG TGGGTAGTCA ATCACTCAGA GGAGACCCTC CCAAGGAACA GCGAGACCAC 3781 GATTCGGATG CAAACAGCAA GAGGCTTTAT TGGGAATACG GGTACCCGGG CGACGCAGTC 3841 TATCGGAAGA CTGGCGCGCC GAGTGAGGGG TTGTGGGCTC TTTTATTGAG CTCTGCTTAT 3901 ATAGACCTCC CACCGTACAC GCCTACCGCC CATTTGCGTC AATGGGGCGG AGTTGTTACG 3961 ACATTTTGGA AAGTCCCGTT GATTTTGGTG CCAAAACAAA CTCCCATTGA CGTCAATGGG 4021 GTGGAGACTT GGAAATCCCC GTGAGTCAAA CCGCTATCCA CGCCCATTGA TGTACTGCCA 4081 AAACCGCATC ACCATGGTAA TAGCGATGAC TAATACGTAG ATGTACTGCC AAGTAGGAAA

4141 GTCCCATAAG GTCATGTACT GGGCATAATG CCAGGCGGGC CATTTACCGT CATTGACGTC 4201 AATAGGGGGC GTACTTGGCA TATGATACAC TTGATGTACT GCCAAGTGGG CAGTTTACCG 4261 TAAATACTCC ACCCATTGAC GTCAATGGAA AGTCCCTATT GGCGTTACTA TGGGAACATA 4321 CGTCATTATT GACGTCAATG GGCGGGGGTC GTTGGGCGGT CAGCCAGGCG GGCCATTTAC 4381 CGTAAGTTAT GTAACGCGGA ACTCCATATA TGGGCTATGA ACTAATGACC CCGTAATTGA 4441 TTACTATTAA TAACTAGTCA ATAATCAATG TCAACATGGC GGTAATGTTG GACATGAGCC 4501 AATATAAATG TACATATTAT GATATGGATA CAACGTATGC AATGGCCAAG CTAATTCTTG 4561 AAGACGAAAG GGCCTCGTGA TACGCCTATT TTTATAGGTT AATGTCATGA TAATAATGGT 4621 TTCTTAGACG TCAGGTGGCA CTTTTCGGGG AAATGTGCGC GGAACCCCTA TTTGTTTATT 4681 TTTCTAAATA CATTCAAATA TGTATCCGCT CATGAGACAA TAACCCTGAT AAATGCTTCA 4741 ATAATTAAGG GATTTTGCCG ATTTCGGCCT ATTGGTTAAA AAATGAGCTG ATTTAACAAA 4801 AATTTAACGC GAATTTTAAC AAAATATTAA CGCTTACAAT TTAGGTGGCA CTTTTCGGGG 4861 AAATGTGCGC GGAACCCCTA TTTGTTTATT TTTCTAAATA CATTCAAATA TGTATCCGCT 4921 CATGAGACAA TAACCCTGAT AAATGCTTCA ATAATATTGA AAAAGGAAGA GTATGAGTAT 4981 TCAACATTTC CGTGTCGCCC TTATTCCCTT TTTTGCGGCA TTTTGCCTTC CTGTTTTTGC

5041 TCACCCAGAA ACGCTGGTGA AAGTAAAAGA TGCTGAAGAT CAGTTGGGTG CACGAGTGGG 5101 TTACATCGAA CTGGATCTCA ACAGCGGTAA GATCCTTGAG AGTTTTCGCC CCGAAGAACG 5161 TTTTCCAATG ATGAGCACTT TTAAAGTTCT GCTATGTGGC GCGGTATTAT CCCGTATTGA 5221 CGCCGGGCAA GAGCAACTCG GTCGCCGCAT ACACTATTCT CAGAATGACT TGGTTGAGTA 5281 CTCACCAGTC ACAGAAAAGC ATCTTACGGA TGGCATGACA GTAAGAGAAT TATGCAGTGC 5341 TGCCATAACC ATGAGTGATA ACACTGCGGC CAACTTACTT CTGACAACGA TCGGAGGACC 5401 GAAGGAGCTA ACCGCTTTTT TGCACAACAT GGGGGATCAT GTAACTCGCC TTGATCGTTG 5461 GGAACCGGAG CTGAATGAAG CCATACCAAA CGACGAGCGT GACACCACGA TGCCTGTAGC 5521 AATGGCAACA ACGTTGCGCA AACTATTAAC TGGCGAACTA CTTACTCTAG CTTCCCGGCA 5581 ACAATTAATA GACTGGATGG AGGCGGATAA AGTTGCAGGA CCACTTCTGC GCTCGGCCCT 5641 TCCGGCTGGC TGGTTTATTG CTGATAAATC TGGAGCCGGT GAGCGTGGGT CTCGCGGTAT 5701 CATTGCAGCA CTGGGGCCAG ATGGTAAGCC CTCCCGTATC GTAGTTATCT ACACGACGGG 5761 GAGTCAGGCA ACTATGGATG AACGAAATAG ACAGATCGCT GAGATAGGTG CCTCACTGAT 5821 TAAGCATTGG TAACTGTCAG ACCAAGTTTA CTCATATATA CTTTAGATTG ATTTAAAACT 5881 TCATTTTTAA TTTAAAAGGA TCTAGGTGAA GATCCTTTTT GATAATCTCA TGACCAAAAT 5941 CCCTTAACGT GAGTTTTCGT TCCACTGAGC GTCAGACCCC GTAGAAAAGA TCAAAGGATC 6001 TTCTTGAGAT CCTTTTTTTC TGCGCGTAAT CTGCTGCTTG CAAACAAAAA AACCACCGCT 6061 ACCAGCGGTG GTTTGTTTGC CGGATCAAGA GCTACCAACT CTTTTTCCGA AGGTAACTGG 6121 CTTCAGCAGA GCGCAGATAC CAAATACTGT TCTTCTAGTG TAGCCGTAGT TAGGCCACCA 6181 CTTCAAGAAC TCTGTAGCAC CGCCTACATA CCTCGCTCTG CTAATCCTGT TACCAGTGGC 6241 TGCTGCCAGT GGCGATAAGT CGTGTCTTAC CGGGTTGGAC TCAAGACGAT AGTTACCGGA 6301 TAAGGCGCAG CGGTCGGGCT GAACGGGGGG TTCGTGCACA CAGCCCAGCT TGGAGCGAAC 6361 GACCTACACC GAACTGAGAT ACCTACAGCG TGAGCTATGA GAAAGCGCCA CGCTTCCCGA 6421 AGGGAGAAAG GCGGACAGGT ATCCGGTAAG CGGCAGGGTC GGAACAGGAG AGCGCACGAG 6481 GGAGCTTCCA GGGGGAAACG CCTGGTATCT TTATAGTCCT GTCGGGTTTC GCCACCTCTG 6541 ACTTGAGCGT CGATTTTTGT GATGCTCGTC AGGGGGGCGG AGCCTATGGA AAAACGCCAG 6601 CAACGCGGCC TTTTTACGGT TCCTGGCCTT TTGCTGGCCT TTTGCTCACA TGTTCTTTCC 6661 TGCGTTATCC CCTGATTCTG TGGATAACCG TATTACCGCC TTTGAGTGAG CTGATACCGC 6721 TCGCCGCAGC CGAACGACCG AGCGCAGCGA GTCAGTGAGC GAGGAAG//

过表达慢病毒载体构建和包装手册 version1

过表达慢病毒载体构建和包装手册 Version1.0 吉凯基因 二零一一年五月

目录 简介 (3) 第一部分过表达慢病毒载体的制备 实验流程 (4) 实验材料 (5) 过表达克隆制备 (6) 第二部分慢病毒包装与滴度检测 实验流程 (17) 实验材料 (18) L e n t i v i r u s病毒包装 (21) 病毒的收获及浓缩 (22) L e n t i v i r u s滴度测定 (24) 参考文献 (33)

简介 慢病毒（Lentivirus）载体是以人类免疫缺陷型病毒（HIV）为基础发展起来的基因治疗载体，它对分裂细胞和非分裂细胞均具有感染能力，并可以在体内较长期的表达且安全性高。吉凯基因提供的慢病毒为“自杀”性病毒，即病毒感染目的细胞后不会再感染其他细胞，也不会利用宿主细胞产生新的病毒颗粒。慢病毒中的毒性基因已经被剔除并被外源性目的基因所取代，属于假型病毒。但该病毒仍然具有可能的潜在的生物学危险，吉凯基因建议不要使用编码已知或可能会致癌的基因的假型病毒，除非已经完全公认某个基因肯定没有致癌性，否则均不建议采用假型病毒进行生物学实验。 吉凯基因慢病毒载体系统由GV慢病毒载体系列、pHelper 1.0载体和pHelper 2.0载体三质粒组成。GV慢载体中含有HIV的基本元件5’LTR和3’LTR以及其他辅助元件，例如WRE (woodchuck hepatitis virus posttranscriptional regulatory element)。通常根据不同的实验目的针对GV载体改造以进行基因功能研究。pHelper 1.0载体中含有HIV病毒的gag基因，编码病毒主要的结构蛋白；pol基因，编码病毒特异性的酶；rev基因，编码调节gag和pol基因表达的调节因子。pHelper 2.0载体中含有单纯疱疹病毒来源的VSV-G基因，提供病毒包装所需要的包膜蛋白。 吉凯基因过表达慢病毒产品可通过对GV慢病毒载体的改造和病毒包装，获得带有特定基因序列的慢病毒颗粒，以满足不同的实验需求。 本手册为吉凯基因RNAi慢病毒载体的构建和病毒包装的通用操作流程，目的是为了方便大家交流使用，部分细节内容未能做到一一详述，敬请谅解。同时希望大家能够针对手册中的错误和问题，提出宝贵的意见。

慢病毒转染手册

慢病毒（Lentivirus）载体是以HIV-1（人类免疫缺陷I型病毒）为基础发展起来的基因治疗载体。区别一般的逆转录病毒载体，它对分裂细胞和非分裂细胞均具有感染能力。 基本概述 慢病毒载体的研究发展得很快，研究的也非常深入。该载体可以将外源基因有效地整合到宿主染色体上，从而达到持久性表达。在感染能力方面可有效地感染神经元细胞、肝细胞、心肌细胞、肿瘤细胞、内皮细胞、干细胞等多种类型的细胞，从而达到良好的的基因治疗效果，在美国已经开展了临床研究，效果非常理想，因此具有广阔的应用前景。 慢病毒的应用 目前慢病毒也被广泛地应用于表达RNAi的研究中。由于有些类型细胞脂质体转染效果差，转移到细胞内的siRNA半衰期短，体外合成siRNA对基因表达的抑制作用通常是短暂的，因而使其应用受到较大的限制。采用事先在体外构建能够表达siRNA的载体, 然后转移到细胞内转录siRNA的策略，不但使脂质体有效转染的细胞种类增加，而且对基因表达抑制效果也不逊色于体外合成siRNA，在长期稳定表达载体的细胞中，甚至可以发挥长期阻断基因表达的作用。在所构建的siRNA表达载体中，是由RNA聚合酶Ⅲ启动子来指导RNA合成的，这是因为RNA聚合酶Ⅲ有明确的起始和终止序列，而且合成的RNA不会带poly A尾。当RNA聚合酶Ⅲ遇到连续4个或5个T时，它指导的转录就会停止，在转录产物3’端形成1~4个U。U6和H1 RNA启动子是两种RNA聚合酶Ⅲ依赖的启动子，其特点是启动子自身元素均位于转录区的上游，适合于表达～21ntRNA和～50ntRNA茎环结构（stem loop）。在siRNA表达载体中，构成siRNA的正义与反义链，可由各自的启动子分别转录,然后两条链互补结合形成siRNA；也可由载体直接表达小发卡状RNA(small hairpin RNA, shRNA), 载体包含位于RNA聚合酶Ⅲ启动子和4～5T转录终止位点之间的茎环结构序列，转录后即可折叠成具有1~4 个U 3 ’ 突出端的茎环结构，在细胞内进一步加工成siRNA。构建载体前通常要通过合成siRNA的方法，寻找高效的siRNA，然后从中挑选符合载体要求的序列，将其引入siRNA表达载体。 慢病毒载体 慢病毒载体（Lentiviral vector）较逆转录病毒载体有更广的宿主范围，慢病毒能够有效感染非周期性和有丝分裂后的细胞。慢病毒载体能够产生表达shRNA的高滴度的慢病毒，在周期性和非周期性细胞、干细胞、受精卵以及分化的后代细胞中表达shRNA，实现在多种类型的细胞和转基因

腺病毒中文操作手册

腺病毒载体操作手册中文版 腺病毒重组系统 AdEasyTM操作手册 目录 第一章简介 1 第二章应用重组腺病毒的优点 2 第三章 AdEasyTM 技术 3 3.1 技术概况 3 3.2 AdEasyTM系统中产生重组腺病毒的时程 3 第四章主要流程 4 4.1 将基因克隆入AdEasyTM转移载体4 4.1.1 克隆的一般原则 4 4.1.2 构建重组AdEasyTM转移载体 5 4.2 细菌内AdEasyTM重组子的产生 5 4.2.1 共转化的一般原则 5 4.2.2 共转化方法 5 4.2.3 预期结果 5 4.3 AdEasyTM重组质粒的筛选和扩增6 4.4 AdEasyTM重组子转染QBI-293A 细胞 6 4.4.1 细胞铺板 6 4.4.2 磷酸钙转化技术 7 第五章常用技术 8 5.1 QBI-293A细胞培养 8 5.1.1 QBI-293A细胞的初始培养8 5.1.2 QBI-293A细胞的维持培养和增殖 8 5.1.3 QBI-293A细胞的冻存 8 5.2 QBI-293A细胞的转染和病毒空斑的产生 9 5.2.1 感染QBI-293A细胞 9 5.2.2 病毒空斑形成 9 5.2.3 琼脂糖覆盖被感染细胞 9 5.3 MOI测定 10 5.4 腺病毒感染力测定 10

5.4.1 X-Gal染色 11 5.5 重组腺病毒的筛选和纯化 11 5.5.1 挑选最佳重组腺病毒：表达和基因输送 11 5.5.2 病毒空斑挑选和小量扩增12 5.5.3 Western杂交 13 5.5.4 Southern杂交和点杂交 13 5.5.5 病毒裂解产物PCR 14 5.5.6 免疫测定 14 5.5.7 功能测定 14 5.6 病毒颗粒在QBI-293A细胞中的大量扩增 15 5.7 两次氯化铯密度梯度离心纯化重组腺病毒 16 5.7.1 不连续密度梯度离心 17 5.7.2 连续密度梯度离心 17 5.7.3 病毒溶液去盐和浓集 17 5.8 病毒滴度测定 18 5.8.1 O.D.260 nm (VP/ml) 19 5.8.2 空斑测定法 20 5.8.3 50%组织培养感染剂量法 20 第六章疑难解答 22 6.1 QBI-293A细胞培养 22 6.2 感染力测定 22 6.3 转移载体克隆 23 6.4 在BJ5183细胞中共转化和重组24 6.5 转染QBI-293A细胞 25 6.6 筛选和测定 25 6.7 在QBI-293A细胞中表达 26 6.8 重组腺病毒的扩增 26 6.9 纯化 26 6.10 病毒滴度测定 27 缩写英文全称中文全称 Ad Adenovirus 腺病毒 Ad5 Adenovirus serotype 5 血清5型腺病毒 AdV Adenoviral Vector 腺病毒载体Amp Ampicillin 氨苄青霉素 β-Gal β-Galactosidase β-半乳糖苷酶 bp Base Pair 碱基对

EBVLMP2A和BZLF1融合基因重组腺病毒表达载体的构建

EBV LMP2A和BZLF1融合基因重组腺病毒表 达载体的构建 【摘要】目的构建EB病毒（EBV）潜伏膜蛋白2A(LMP2A)编码基因和即刻早期基因(BZLF1)融合基因的重组腺病毒表达载体。方法逆转录聚合酶链反应分别获得LMP2A和BZLF1编码序列的cDNA，采用剪接式重叠延伸（SOE）技术将两段基因通过多肽接头(Gly4Ser)3 的DNA 序列进行连接，构建融合基因Z2A。将融合基因Z2A定向亚克隆到pAdTrack CMV 质粒上，在原核细胞E.coli BJ5183中完成穿梭质粒与骨架质粒pAdEasy1的同源重组，构建融合基因Z2A真核表达载体pAd Z2A。经抗生素培养板筛选重组体，然后转染293细胞，获得复制缺陷型重组腺病毒vAd Z2A。结果重组腺病毒载体经限制性核酸内切酶酶切，电泳后可观察到长31 kb和4.5 kb 两条DNA条带，测序鉴定结果表明序列正确；从感染重组腺病毒vAd Z2A的293细胞中检测到融合基因Z2A的表达。结论本研究成功地构建了EBV LMP2A和BZLF1融合基因Z2A重组腺病毒表达载体，为进一步研究Z2A的功能提供了实验基础。 【关键词】疱疹病毒4型人潜伏膜蛋白2A 基因BZLF1 基因融合表达载体 ［ABSTRACT］ObjectiveTo construct Z2A recombinant adenovirus vector and study the effect of Z2A expression on EBV associated tumor. MethodsBoth LMP2A and BZLF1 cDNA were cloned from B958 cell line by RT PCR, and the fusion gene (LMP2A linker BZLF1) was

慢病毒载体使用手册

LentiCRISPRv2 and lentiGuide-Puro: lentiviral CRISPR/Cas9 and single guide RNA CRISPR (C lustered R egularly I nterspaced S hort P alindromic R epeats) is a microbial nuclease system involved in defense against invading phages and plasmids. CRISPR loci in microbial hosts contain a combination of CRISPR-associated (Cas) genes as well as non-coding RNA elements capable of programming the specificity of the CRISPR-mediated nucleic acid cleavage. Lentiviral CRISPR/Cas can infect a broad variety of mammalian cells by co-expressing a mammalian codon-optimized Cas9 nuclease along with a single guide RNA (sgRNA) to facilitate genome editing (Shalem*, Sanjana*, et al., Science 2014). Protocols for cloning into the lentiviral transfer plasmid and general considerations for producing lentivirus are described below. Separate protocols are available for amplifying the genome-scale CRISPR knock-out (GeCKO) libraries. This protocol is for creating individual lentiviral CRISPR plasmids targeting a single genomic locus. lentiCRISPRv2 (one vector system): This plasmid contains two expression cassettes, hSpCas9 and the chimeric guide RNA. The vector can be digested using BsmB I, and a pair of annealed oligos can be cloned into the single guide RNA scaffold. The oligos are designed based on the target site sequence (20bp) and needs to be flanked on the 3' end by a 3bp NGG PAM sequence, as shown on the next page. lentiGuide-Puro (two vector system): This plasmid expressed only the chimeric guide RNA. It does not contain Cas9. Please use lentiCas9-Blast (a separate lentiviral construct that delivers hSpCas9 and blasticidin resistance) to first integrate Cas9 into your cell line. The lentiGuide-Puro vector can be digested using BsmB I, and a pair of annealed oligos can be cloned into the single guide RNA scaffold. The oligos are designed based on the target site sequence (20bp) and needs to be flanked on the 3' end by a 3bp NGG PAM sequence, as shown on the next page. Which vector to use: lentiCRISPRv2 is identical to the original lentiCRISPRv1 but produces nearly 10X higher titer virus. lentiGuide-Puro produces >100X higher titer virus over lentiCRISPRv1 and should be used in cell lines where Cas9 has already been integrated in (e.g. using the separate lentiCas9-Blast lentivirus). For applications where Cas9 cannot first be introduced (e.g. primary cells), lentiCRISPRv2 is recommended. After transduction, use puromycin to select for cells with lentiCRISPRv2 or lentiGuide-Puro. Lentiviral production: Before starting any lentiviral work, please ensure compliance with your Environmental Health and Safety office and government/organization/university. Briefly, to make lentivirus, a transfer plasmid (e.g. lentiCRISPRv2 or lentiGuide-Puro) must be co-transfected into HEK293(F)T cells with the packaging plasmids pVSVg (AddGene 8454) and psPAX2 (AddGene 12260). As a positive control for viral production, we often use a CMV-EGFP lentiviral transfer plasmid (eg. AddGene 19319). Target design notes and online resources: For application of Cas9 for site-specific genome editing in eukaryotic cells and organisms, we have computationally identified suitable target sites for the S. pyogenes Cas9 and calculated most likely off-targets within the genome. Please visit https://www.wendangku.net/doc/923620263.html, to access these Cas9 target design tools. Complete plasmid sequences, protocols, a discussion forum and additional information can be found at the Zhang Lab GeCKO website: https://www.wendangku.net/doc/923620263.html,/gecko/ . Citation: Please reference the following publications for the use of this material. Improved lentiviral vectors and genome-wide libraries for CRISPR screening. Sanjana NE*, Shalem O*, Zhang F. Nature Methods (2014). Genome-scale CRISPR-Cas9 knockout screening in human cells. Shalem O*, Sanjana NE*, Hartenian E, Shi X, Scott DA, Mikkelsen T, Heckl D, Ebert BL, Root DE, Doench JG, Zhang F (2014). Science, 343, 83-7. DOI: 10.1126/science.1247005

腺病毒中文操作手册

腺病毒载体操作手册中文版腺病毒重组系统 AdEasyTM操作手册 目录 第一章简介1 第二章应用重组腺病毒的优点2 第三章AdEasyTM技术3 3.1技术概况3 3.2AdEasyTM系统中产生重组腺病毒的时程3 第四章主要流程4 4.1将基因克隆入AdEasyTM转移载体4 4.1.1 缩写英文全称中文全称 AdAdenovirus腺病毒 Ad5Adenovirusserotype5血清5型腺病毒AdVAdenoviralVector腺病毒载体 AmpAmpicillin氨苄青霉素 β-Galβ-Galactosidaseβ-半乳糖苷酶 bpBasePair碱基对 BSABovineSerumAlbumin小牛血清白蛋白cDNAComplementaryDNA互补DNA cccDNAClosedCircularCoiledDNA闭环螺旋DNA CPECytopathicEffect细胞病理效应CsClCesiumChloride氯化铯 DMEMDulbecco’sModifiedEagleMediumDMEM培养基DMSODimethylSulfoxide二甲基亚砜DTTDithiothreitol二硫苏糖醇EDTAEthyleneDiamineTetraaceticAcid乙二胺四乙酸EtBrEthidiumBromide溴化乙锭FBSFetalBovineSerum胎牛血清 HrHour小时 ITRInvertedTerminalRepeat反向末端重复KanKanamycin卡那霉素 kbKilobases千碱基对 KDaKiloDaltons千道尔顿LBLuria-Bertani(broth)LB培养基MCSMultipleCloningSite多克隆位点 MinMinute分钟 MOIMultiplicityofInfection(Virus/Cell)感染复数mRNAMessengerRNA信使RNA MWCOMOIecularWeightCut-off PAGEPolyAcrylamideGelElectrophoresis聚丙烯凝胶电泳PBSPhosphateBufferedSaline磷酸盐缓冲液PFUPlaqueFormingUnit空斑形成单位 piPostInfection感染后RCAReplicationCompetentAdenovirus增殖性腺病毒RITRRightInvertedTerminalRepeat右侧反向末端重复SDSSodiumDodecylSulfate十二烷基硫酸钠TBETrisBorate/EDTA三羟甲基氨基甲烷硼酸盐/乙二胺四乙酸 TCID50TissueCultureInfectiousDose5050%组织培养感染剂量 TCPTotalCellularProtein细胞总蛋白 TETris/EDTATE溶液 wtWildType野生型 X-Gal5-bromo-4-chloro-3-indolyl-D-Galactopyranoside5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷 第一章简介 当今基因输送技术的发展日趋复杂，一些治疗药物（生长激素、干扰素、抗病毒和抗癌复合物）和诊断性蛋白（单克隆抗体）的设计、发展与合成需要更高效的基因输送工具。人类基因组计划和正不断发展的基因治疗同样急需发展快速有效和治疗性的分析工具。为解决这一问题，基因输送技术(通常使用病毒载体如增殖缺陷的腺病毒)通过基因工程不断发展，致力于生产基因表型药物。重组腺病毒提供了一类在基因转移系统发展中有极大潜力的新的生物治疗剂。 1953年对普通感冒病因的探索和研究导致了腺病毒的发现。迄今为止已发现了40多种不同血清型和93种不同种类的腺病毒，它们通常感染眼、呼吸道或胃肠上皮（Fields等，1996）。1977年，FrankGraham博士建立了一种细胞株，可在无辅助病毒的情况下产生重组腺病毒（Graham等，1977）。此后，腺病毒载体作为极具潜力的哺乳动物基因转移载体而得到广

慢病毒系统简介及应用

慢病毒包装系统简介及应用 一、慢病毒包装简介及其用途 慢病毒（Lentivirus）载体是以HIV-1（人类免疫缺陷I 型病毒）为基础发展起来的基因治疗载体。区别一般的逆转录病毒载体，它对分裂细胞和非分裂细胞均具有感染能力。慢病毒载体的研究发展得很快，研究的也非常深入。该载体可以将外源基因有效地整合到宿主染色体上，从而达到持久性表达。在感染能力方面可有效地感染神经元细胞、肝细胞、心肌细胞、肿瘤细胞、内皮细胞、干细胞等多种类型的细胞，从而达到良好的基因治疗效果，在美国已经开展了临床研究，效果非常理想，因此具有广阔的应用前景。 目前慢病毒也被广泛地应用于表达RNAi的研究中。由于有些类型细胞脂质体转染效果差，转移到细胞内的siRNA半衰期短，体外合成siRNA对基因表达的抑制作用通常是短暂的，因而使其应用受到较大的限制。采用事先在体外构建能够表达siRNA的载体，然后转移到细胞内转录siRNA的策略，不但使脂质体有效转染的细胞种类增加，而且对基因表达抑制效果也不逊色于体外合成siRNA，在长期稳定表达载体的细胞中，甚至可以发挥长期阻断基因表达的作用。在所构建的siRNA表达载体中，是由RNA聚合酶Ⅲ启动子来指导RNA合成的，这是因为RNA聚合酶Ⅲ有明确的起始和终止序列，而且合成的RNA不会带poly A尾。当RNA聚合酶Ⅲ遇到连续4个或5个T时，它指导的转录就会停止，在转录产物3' 端形成1~4个U。U6和H1 RNA启动子是两种RNA聚合酶Ⅲ依赖的启动子，其特点是启动子自身元素均位于转录区的上游，适合于表达～21ntRNA和～50ntRNA茎环结构（stem loop）。在siRNA表达载体中，构成siRNA 的正义与反义链，可由各自的启动子分别转录，然后两条链互补结合形成siRNA；也可由载体直接表达小发卡状RNA(small hairpin RNA, shRNA)，载体包含位于RNA聚合酶Ⅲ启动子和4～5T转录终止位点之间的茎环结构序列，转录后即可折叠成具有1~4个U 3 '突出端的茎环结构，在细胞内进一步加工成siRNA。构建载体前通常要通过合成siRNA的方法，寻找高效的siRNA，然后从中挑选符合载体要求的序列，将其引入siRNA表达载体。 慢病毒载体（Lentiviral vector）较逆转录病毒载体有更广的宿主范围，慢病毒能够有效感染非周期性和有丝分裂后的细胞。慢病毒载体能够产生表达shRNA的高滴度的慢病毒，在周期性和非周期性细胞、干细胞、受精卵以及分化的后代细胞中表达shRNA，实现在多种类型的细胞和转基因小鼠中特异而稳定的基因表达的功能性沉默，为在原代的人和动物细胞组织中快速而高效地研究基因功能，以及产生特定基因表达降低的动物提供了可能性。 慢病毒表达载体包含了包装、转染、稳定整合所需要的遗传信息。慢病毒包装质粒可提供所有的转录并包装RNA到重组的假病毒载体所需要的所有辅助蛋白。为产生高滴度的病毒颗粒，需要利用表达载体和包装质粒同时共转染细胞，在细胞中进行病毒的包装，包装好的假病毒颗粒分泌到细胞外的培养基中，离心取得上清液后，可以直接用于宿主细胞的感染，目的基因进入到宿主细胞之后，经过反转录，整合到基因组，从而高水平的表达效应分子。 二、这一系统的目的，主要是为了解决以下问题： 1. 对于一些较难转染的细胞，如原代细胞、干细胞、不分化的细胞等，能大大提高目的基因转导效率，而且目的基因整合到宿主细胞基因组的几率大大增加，这就为RNAi，cDNA克隆以及报告基因的研究提供了一个有利的途径。 2. 进行稳转细胞株的筛选；

pLVX-TetOne-Puro慢病毒载体使用说明

pLVX-TetOne-Puro pLVX-TetOne-Puro 载体基本信息： 载体名称: pLVX-TetOne-Puro 质粒类型: 慢病毒载体；四环素调控载体 高拷贝/低拷贝: 高拷贝 克隆方法: 限制性内切酶，多克隆位点 启动子: TRE3GS 载体大小: 9227 bp 5' 测序引物及序列: -- 3' 测序引物及序列: -- 载体标签: 无 载体抗性: 氨苄青霉素 筛选标记: 嘌呤霉素（Puromycin ） 克隆菌株: Stbl3 宿主细胞（系）: 常规细胞系（293、CV-1、CHO 等） 备注: 慢病毒载体pLVX-TetOne-Puro 是集调控与应答功能于一体的四环素诱导载体。 稳定性: 稳表达 组成型/诱导型: 诱导型 病毒/非病毒: 慢病毒 pLVX-TetOne-Puro 载体质粒图谱和多克隆位点信息：

pLVX-TetOne-Puro载体序列： ORIGIN 1 TGGAAGGGCT AATTCACTCC CAAAGAAGAC AAGATATCCT TGATCTGTGG ATCTACCACA 61 CACAAGGCTA CTTCCCTGAT TAGCAGAACT ACACACCAGG GCCAGGGGTC AGATATCCAC 121 TGACCTTTGG ATGGTGCTAC AAGCTAGTAC CAGTTGAGCC AGATAAGGTA GAAGAGGCCA 181 ATAAAGGAGA GAACACCAGC TTGTTACACC CTGTGAGCCT GCATGGGATG GATGACCCGG 241 AGAGAGAAGT GTTAGAGTGG AGGTTTGACA GCCGCCTAGC ATTTCATCAC GTGGCCCGAG 301 AGCTGCATCC GGAGTACTTC AAGAACTGCT GATATCGAGC TTGCTACAAG GGACTTTCCG 361 CTGGGGACTT TCCAGGGAGG CGTGGCCTGG GCGGGACTGG GGAGTGGCGA GCCCTCAGAT 421 CCTGCATATA AGCAGCTGCT TTTTGCCTGT ACTGGGTCTC TCTGGTTAGA CCAGATCTGA 481 GCCTGGGAGC TCTCTGGCTA ACTAGGGAAC CCACTGCTTA AGCCTCAATA AAGCTTGCCT 541 TGAGTGCTTC AAGTAGTGTG TGCCCGTCTG TTGTGTGACT CTGGTAACTA GAGATCCCTC 601 AGACCCTTTT AGTCAGTGTG GAAAATCTCT AGCAGTGGCG CCCGAACAGG GACTTGAAAG 661 CGAAAGGGAA ACCAGAGGAG CTCTCTCGAC GCAGGACTCG GCTTGCTGAA GCGCGCACGG 721 CAAGAGGCGA GGGGCGGCGA CTGGTGAGTA CGCCAAAAAT TTTGACTAGC GGAGGCTAGA 781 AGGAGAGAGA TGGGTGCGAG AGCGTCAGTA TTAAGCGGGG GAGAATTAGA TCGCGATGGG 841 AAAAAATTCG GTTAAGGCCA GGGGGAAAGA AAAAATATAA ATTAAAACAT ATAGTATGGG 901 CAAGCAGGGA GCTAGAACGA TTCGCAGTTA ATCCTGGCCT GTTAGAAACA TCAGAAGGCT

腺病毒中文操作手册

腺病毒中文操作手 册

腺病毒载体操作手册中文版腺病毒重组系统 AdEasyTM操作手册 目录 第一章简介 1 第二章应用重组腺病毒的优点 2 第三章AdEasyTM 技术 3 3.1 技术概况 3 3.2 AdEasyTM系统中产生重组腺病毒的时程 3 第四章主要流程 4 4.1 将基因克隆入AdEasyTM转移载体 4 4.1.1 克隆的一般原则 4 4.1.2 构建重组AdEasyTM转移载体5 4.2 细菌内AdEasyTM重组子的产生5 4.2.1 共转化的一般原则 5 4.2.2 共转化方法 5 4.2.3 预期结果 5 4.3 AdEasyTM重组质粒的筛选和扩增 6 4.4 AdEasyTM重组子转染QBI-293A 细胞 6 4.4.1 细胞铺板 6 4.4.2 磷酸钙转化技术7 第五章常见技术8 5.1 QBI-293A细胞培养8 5.1.1 QBI-293A细胞的初始培养8 5.1.2 QBI-293A细胞的维持培养和增殖8 5.1.3 QBI-293A细胞的冻存8 5.2 QBI-293A细胞的转染和病毒空斑的产生9 5.2.1 感染QBI-293A细胞9 5.2.2 病毒空斑形成9 5.2.3 琼脂糖覆盖被感染细胞9 5.3 MOI测定10 5.4 腺病毒感染力测定10

5.4.1 X-Gal染色11 5.5 重组腺病毒的筛选和纯化11 5.5.1 挑选最佳重组腺病毒：表示和基因输送11 5.5.2 病毒空斑挑选和小量扩增12 5.5.3 Western杂交13 5.5.4 Southern杂交和点杂交13 5.5.5 病毒裂解产物PCR 14 5.5.6 免疫测定14 5.5.7 功能测定14 5.6 病毒颗粒在QBI-293A细胞中的大量扩增15 5.7 两次氯化铯密度梯度离心纯化重组腺病毒16 5.7.1 不连续密度梯度离心17 5.7.2 连续密度梯度离心17 5.7.3 病毒溶液去盐和浓集17 5.8 病毒滴度测定18 5.8.1 O.D.260 nm (VP/ml) 19 5.8.2 空斑测定法20 5.8.3 50%组织培养感染剂量法20 第六章疑难解答22 6.1 QBI-293A细胞培养22 6.2 感染力测定22 6.3 转移载体克隆23 6.4 在BJ5183细胞中共转化和重组24 6.5 转染QBI-293A细胞25 6.6 筛选和测定25 6.7 在QBI-293A细胞中表示26 6.8 重组腺病毒的扩增26 6.9 纯化26 6.10 病毒滴度测定 27 缩写英文全称中文全称 Ad Adenovirus 腺病毒Ad5 Adenovirus serotype 5 血清5型腺病毒AdV Adenoviral Vector 腺病毒载体Amp Ampicillin 氨苄青霉素β-Gal β-Galactosidase β-半乳糖苷酶bp Base Pair 碱基对BSA Bovine Serum Albumin 小牛血清

pAAV-CMV-iRFP腺病毒载体说明(图)

pAAV--‐CMV--‐iRFP 编号 载体名称 北京华越洋VECT10016 pAAV--‐CMV--‐iRFP pAAV--‐CMV--‐iRFP载体基本信息 载体名称: pAAV--‐CMV--‐iRFP 质粒类型: 腺病毒载体；荧光蛋白报告载体 高拷贝/低拷贝: 高拷贝 克隆方法: 限制性内切酶，多克隆位点 启动子: CMV 载体大小: 5603 b p 5' 测序引物及序列: pCAX--‐F (CAGCTCCTGGGCAACGTGC) 3' 测序引物及序列: C--‐CMV--‐24 (TATTAGGACAAGGCTGGTGGGCAC) 载体标签: --‐--‐ 载体抗性: 氨苄青霉素 筛选标记: 红外荧光蛋白iRFP 克隆菌株: Stbl3 或 NEB S tble 宿主细胞（系）: 常规哺乳动物细胞系 备注: --‐--‐ 稳定性: 稳表达 组成型/诱导型: 组成型 病毒/非病毒: 腺病毒 pAAV--‐CMV--‐iRFP载体质粒图谱和多克隆位点信息

pAAV--‐CMV--‐iRFP载体序列: ORIGIN 1 C CTGCAGGCA G CTGCGCGCT C GCTCGCTCA C TGAGGCCGC C CGGGCGTCG G GCGACCTTT 61 G GTCGCCCGG C CTCAGTGAG C GAGCGAGCG C GCAGAGAGG G AGTGGCCAA C TCCATCACT 121 A GGGGTTCCT G CGGCCGCAC G CGTGGAGCT A GTTATTAAT A GTAATCAAT T ACGGGGTCA 181 T TAGTTCATA G CCCATATAT G GAGTTCCGC G TTACATAAC T TACGGTAAA T GGCCCGCCT 241 G GCTGACCGC C CAACGACCC C CGCCCATTG A CGTCAATAA T GACGTATGT T CCCATAGTA 301 A CGTCAATAG G GACTTTCCA T TGACGTCAA T GGGTGGAGT A TTTACGGTA A ACTGCCCAC 361 T TGGCAGTAC A TCAAGTGTA T CATATGCCA A GTACGCCCC C TATTGACGT C AATGACGGT 421 A AATGGCCCG C CTGGCATTA T GCCCAGTAC A TGACCTTAT G GGACTTTCC T ACTTGGCAG 481 T ACATCTACG T ATTAGTCAT C GCTATTACC A TGGTGATGC G GTTTTGGCA G TACATCAAT 541 G GGCGTGGAT A GCGGTTTGA C TCACGGGGA T TTCCAAGTC T CCACCCCAT T GACGTCAAT 601 G GGAGTTTGT T TTGCACCAA A ATCAACGGG A CTTTCCAAA A TGTCGTAAC A ACTCCGCCC 661 C ATTGACGCA A ATGGGCGGT A GGCGTGTAC G GTGGGAGGT C TATATAAGC A GAGCTCGTT 721 T AGTGAACCG T CAGATCGCC T GGAGACGCC A TCCACGCTG T TTTGACCTC C ATAGAAGAC 781 A CCGGGACCG A TCCAGCCTC C GCGGATTCG A ATCCCGGCC G GGAACGGTG C ATTGGAACG 841 C GGATTCCCC G TGCCAAGAG T GACGTAAGT A CCGCCTATA G AGTCTATAG G CCCACAAAA 901 A ATGCTTTCT T CTTTTAATA T ACTTTTTTG T TTATCTTAT T TCTAATACT T TCCCTAATC 961 T CTTTCTTTC A GGGCAATAA T GATACAATG T ATCATGCCT C TTTGCACCA T TCTAAAGAA 1021 T AACAGTGAT A ATTTCTGGG T TAAGGCAAT A GCAATATTT C TGCATATAA A TATTTCTGC 1081 A TATAAATTG T AACTGATGT A AGAGGTTTC A TATTGCTAA T AGCAGCTAC A ATCCAGCTA 1141 C CATTCTGCT T TTATTTTAT G GTTGGGATA A GGCTGGATT A TTCTGAGTC C AAGCTAGGC 1201 C CTTTTGCTA A TCATGTTCA T ACCTCTTAT C TTCCTCCCA C AGCTCCTGG G CAACGTGCT 1261 G GTCTGTGTG C TGGCCCATC A CTTTGGCAA A GAATTGGGA T TCGAACATC G ATTGAATTC 1321 C CCGGGGATC T GCCGCCACC A TGGCGGAAG G ATCCGTCGC C AGGCAGCCT G ACCTCTTGA 1381 C CTGCGACGA T GAGCCGATC C ATATCCCCG G TGCCATCCA A CCGCATGGA C TGCTGCTCG 1441 C CCTCGCCGC C GACATGACG A TCGTTGCCG G CAGCGACAA C CTTCCCGAA C TCACCGGAC 1501 T GGCGATCGG C GCCCTGATC G GCCGCTCTG C GGCCGATGT C TTCGACTCG G AGACGCACA 1561 A CCGTCTGAC G ATCGCCTTG G CCGAGCCCG G GGCGGCCGT C GGAGCACCG A TCACTGTCG 1621 G CTtCACGAT G CGAAAGgAC G CAGGCTTCA T CGGCTCCTG G CATCGCCAT G ATCAGCTCA 1681 T CTtccTCGA G CTCGAGCCT C CCCAGCGGG A CGTCgccga g ccgcaggcg t tcttccgcc 1741 g caCCAACAG C GCCATCCGC C GCCTGCAGG C CGCCGAAAC C TTGGAAAGC G CCTGCGCCG 1801 C CGCGGCGCA A GAGGTGCGG A AGATTACCG G CTTCGATCG G GTGATGATC T ATCGCTTCG 1861 C CTCCGACTT C AGCGGCGAA G TGATCGCAG A GGATCGGTG C GCCGAGGTC G AGTCAAAAC 1921 T AGGCCTGCA C TATCCTGCC T CAACCGTGC C GGCGCAGGC C CGTCGGCTC T ATACCATCA 1981 A CCCGGTACG G ATCATTCCC G ATATCAATT A TCGGCCGGT G CCGGTCACC C CAGACCTCA 2041 A TCCGGTCAC C GGGCGGCCG A TTGATCTTA G CTTCGCCAT C CTGCGCAGC G TCTCGCCCG 2101 T CCATCTGGA A TTCATGCGC A ACATAGGCA T GCACGGCAC G ATGTCGATC T CGATTTTGC 2161 G CGGCGAGCG A CTGTGGGGA T TGATCGTTT G CCATCACCG A ACGCCGTAC T ACGTCGATC 2221 T CGATGGCCG C CAAGCCTGC G AGCTAGTCG C CCAGGTTCT G GCCTGGCAG A TCGGCGTGA 2281 T GGAAGAGTG A GTCGACGCG G CCGCTCGAG C CTAAGCTTG C CTCGAGCAG C GCTGCTCGA 2341 G AGATCTACG G GTGGCATCC C TGTGACCCC T CCCCAGTGC C TCTCCTGGC C CTGGAAGTT

慢病毒载体包装构建过程

慢病毒载体包装构建过程 原理：慢病毒载体可以将外源基因或外源的shRNA有效地整合到宿主染色体上，从而达到持久性表达目的序列的效果。在感染能力方面可有效地感染神经元细胞、肝细胞、心肌细胞、肿瘤细胞、内皮细胞、干细胞等多种类型的细胞，从而达到良好的的基因治疗效果。对于一些较难转染的细胞，如原代细胞、干细胞、不分化的细胞等，使用慢病毒载体，能大大提高目的基因或目的shRNA的转导效率，且目的基因或目的shRNA整合到宿主细胞基因组的几率大大增加，能够比较方便快捷地实现目的基因或目的shRNA的长期、稳定表达。 概念：慢病毒载体是指以人类免疫缺陷病毒-1 (H IV-1) 来源的一种病毒载体，慢病毒载体包含了包装、转染、稳定整合所需要的遗传信息，是慢病毒载体系统的主要组成部分。携带有外源基因的慢病毒载体在慢病毒包装质粒、细胞系的辅助下，经过病毒包装成为有感染力的病毒颗粒，通过感染细胞或活体组织，实现外源基因在细胞或活体组织中表达。 辅助成分：慢病毒载体辅助成分包括：慢病毒包装质粒和可产生病毒颗粒的细胞系。 慢病毒载体包含了包装、转染、稳定整合所需要的遗传信息。慢病毒包装质粒可提供所有的转录并包装RNA 到重组的假病毒载体所需要的所有辅助蛋白。为产生高滴度的病毒颗粒，需要利用表达载体和包装质粒同时共转染细胞，在细胞中进行病毒的包装，包装好的假病毒颗粒分泌到细胞外的培养基中，离心取得上清液后，可以直接用于宿主细胞的感染，目的基因进入到宿主细胞之后，经过反转录，整合到基因组，从而高水平的表达效应分子。 基本原理：慢病毒载体系统由两部分组成，即包装成分和载体成分。

包装成分：由HIV-1基因组去除了包装、逆转录和整合所需的顺式作用序列而构建，能够反式提供产生病毒颗粒所必需的蛋白。包装成分通常被分开构建到两个质粒上，一个质粒表达Gag和Pol蛋白，另一个质粒表达Env蛋白，其目的也是降低恢复成野生型病毒的可能。将包装成分与载体成分的3个质粒共转染细胞(如人肾293T细胞)，即可在细胞上清中收获只有一次性感染能力而无复制能力的、携带目的基因的HIV-1载体颗粒。 载体成分：与包装成分互补，即含有包装、逆转录和整合所需的HIV顺式作用序列，同时具有异源启动子控制下的多克隆位点及在此位点插入的目的基因。 为降低两种成分同源重组恢复成野生型病毒的可能，需尽量减少二者的同源性，如将包装成分上5′LTR换成巨细胞病毒(CMV)立即早期启动子、3′LTR换成SV40 polyA等。 一、实验流程（1和2为并列步骤） 1.慢病毒过表达质粒载体的构建 设计上下游特异性扩增引物，同时引入酶切位点，PCR(采用高保真KOD酶，3K内突变率为0%)从模板中（CDNA质粒或者文库）调取目的基因CDS区（coding sequence）连入T载体。将CDS区从T载体上切下，装入慢病毒过表达质粒载体。 2.慢病毒干扰质粒载体的构建 合成siRNA对应的DNA颈环结构，退火后连入慢病毒干扰质粒载体 3. 慢病毒载体的包装与浓缩纯化 制备慢病毒穿梭质粒及其辅助包装原件载体质粒，三种质粒载体分别进行高纯度无内毒素抽提，共转染293T细胞，转染后6 h 更换为完全培养基，培养24和48h后，分别收集富含