双缩脲法定量测定蛋白质

实验46.双缩脲法定量测定蛋白质

一、实验目的

1、学会使用移液管，掌握双缩脲法测定尿蛋白的原理和操作方法。

2、掌握分光光度计的使用，初步了解比色法的基本原理。

二、实验原理

蛋白质是含氮的有机高分子化合物，分子中含有多个与双缩脲分子相似的结构（肽键），碱性硫酸铜溶液中，蛋白质与硫酸铜的Cu2+离子等络合生成紫红色络合物，其颜色深浅与蛋白质含量成正比，可用比色法测定。经比色法求出尿中蛋白质的含量。反应如下：

三、实验试剂与材料仪器

试剂

1.标准酪蛋白溶液（10mg/ml）

酪蛋白预先用微量凯氏定氮法测定蛋白质含量，根据纯度称量配成标准液10.0mg/ml，用0.05N氢氧化钠溶液配制。

2. 双缩肽试剂

取硫酸铜（CuSO4·5H2O.AR）1.5G和酒石酸钾钠（KNaC4H2O·4H2O.AR）6.0g分别用蒸馏水250ml溶解后，一并转入1000ml容量瓶中混合，再加入10%的NAaOH溶液300ml，随加随摇匀。最后用蒸馏水稀释到刻度，贮存于塑料瓶中，可长期保存，如有红色或黑色沉淀出现，需重新配制。

3.未知浓度酪蛋白溶液：称取上述实验中酪蛋白0.5g，放入100ml烧杯中，加25ml0.2NNaOH 溶液，摇匀隔水加热，将溶液转移到50ml容量瓶中。用少量蒸馏水洗烧杯数次，洗液并入容量瓶中，最后加水至刻度，摇匀，置冰箱中保存。

仪器

1.721分光光度计（使用光径为10mm的比色皿）

2.刻度吸管1ml1支、2 ml2支、5ml1支

3.试管（15mm×150mm）7支

4.托盘天平

5.分析天平

6.量筒：500 ml、100 ml各1支

7.容量瓶：50 ml、1000ml各1支

8.恒温水浴（20-250C，如室温接近可不用）。

四、实验方法

1. 标准曲线制定：取6支试管编号，按下表加入试剂

上述试剂加完后，混匀，室温放置30分钟以内测完，比色（540nm ）。记下各管光吸收度，做A 540-蛋白质浓度曲线。

2．样品测定：取未知酪蛋白浓度样品液三管各1.0ml ，同上6号管操作测光密度，在标准曲线上查出其对应蛋白质毫克数，即为所测酪蛋白溶液浓度（mg/ml ）。

3.计算

固体样品蛋白质的含量（%）=%100??C

N Y 其中，Y 为标准曲线查得蛋白质的浓度（mg/ml ），N 为稀释倍数， C 为样品原浓度（mg/ml ）。

五、注意事项

1. 本法应用范围，因不同书籍报道，数值不一。本实验方法测定范围1—10mg

蛋白质。

2. 须于显色后30分钟内比色测定，30分钟后，有可能出现雾状沉淀。各管由显

色到比色的时间应尽可能一致。

3. (3)有大量脂肪性物质同时存在时，会产生混浊的反应混合物，这时可用乙醇或

石油醚使溶液澄清后离心，取清液再测定。

六、思考题

干扰本实验的因素有哪些？

实验五 蛋白质的定量测定

实验五蛋白质的定量测定(凯氏定氮法、考马斯亮蓝法) （4学时+ 4学时） 一、实验目的 学习凯氏定氮法测定总氮含量、考马斯亮蓝法测定蛋白质含量的方法。通过检测添加三聚氰胺的样品的表观蛋白及实际蛋白质的含量，掌握两种方法定量检测蛋白质的原理及特点。 二、实验原理 食品制作需要检测蛋白质含量，但是直接测量蛋白质含量技术上比较复杂，成本比较高，不适合大范围推广，所以业界常常使用“凯氏定氮法（Kjeldahl method）”的方法，通过食品中氮原子的含量来间接推算蛋白质的含量。也就是说，食品中氮原子含量越高，蛋白质含量就越高。一种化工原料——三聚氰胺，因含氮量很高、生产工艺简单、成本很低，给了掺假、造假者极大的利益驱动，所以为了“增加”产品的表观蛋白质含量，出现了非法添加三聚氰胺的诸多案例。 A 凯氏定氮法总氮含量的测定： 凯氏定氮法是测量天然有机物（蛋白质、核酸、氨基酸等）含氮量的常用方法。植物组织中的有机氮化物包括蛋白氮和非蛋白氮。非蛋白氮主要是氨基酸和酰胺，以及少量无机氨化物，是可溶于三氯乙酸溶液的小分子。可加入三氯乙酸，使其最终浓度为5％，将蛋白质沉淀出来，分别测定总氮、蛋白氮或非蛋白氮。 本实验对样品中总氮含量进行测定。 要测定有机物含氮量，通常是设法使其转变为无机氮后再进行测定。 将待测样品与浓硫酸共热，硫酸分解为二氧化硫、水和原子态氧，并将有机物氧化分解成二氧化碳和水；而其中的氮转变成氨，并进一步生成硫酸铵。为了加速有机物质的分解，在消化时通常加入多种催化剂，如硫酸铜、硫酸钾和硒粉等。消化完成后，加入过量的NaOH，将NH4+转变成NH3，通过蒸馏把NH3导入过量的硼酸溶液中，再用标准盐酸滴定，直到硼酸溶液恢复原来的氢离子浓度。

蛋白质测定实验报告

蛋白质测定方法——化学报告

蛋白质的检测 酚试剂法灵敏度较高 20~250mg 费时蛋白质在碱性溶 液中其肽键与 Cu2+螯合，形成 蛋白质一铜复合 物，此复合物使 酚试剂的磷钼酸 还原，产生蓝色 化合物 酚类、柠檬 酸、硫酸铵、 tris缓冲液、 甘氨酸、糖 类、甘油等均 有干扰作用 由上表可大致了解五种检测蛋白质的方法，下面以实验的形式进行详细阐述：

1 材料与方法 1.1 仪器材料 (1)仪器:凯氏定氮仪、紫外分光光度计、可见光分光光度计、工作离心机、布氏漏斗、抽滤泵。 (2)试剂及原材料:牛奶、酸奶、豆浆、0.12mol/LpH=4. 7醋酸- 醋酸钠缓冲液、乙醇-乙醚等体积混合液、浓H2SO4 、40%氢氧化钠、30%过氧化氢、2%硼酸溶液、0. 050molPL标准盐酸溶液、硫酸钾- 硫酸铜接触剂、混合指示剂、标准蛋白溶液、双缩脲试剂、考马斯亮蓝G- 250试剂。 1.2 实验方法 (1)凯氏定氮法测定蛋白质含量 将待测样品与浓硫酸共热,含氮有机物即分解产生氨(消化) ,氨又与硫酸作用,变成硫酸铵。为了加速消化,可以加入CuSO4 作催化剂和加入K2SO4 以提高溶液的沸点,而加入30%过氧化氢有利于消化溶液的澄清。消化好的样品在凯氏定氮仪内经强碱碱化使之分解放出氨,借蒸汽将氨蒸至定量硼酸溶液中,然后用标准盐酸溶液进行滴定,记录,计算出样品含氮量。每个样品做三次重复测定,取平均值。 (2)紫外吸收法测定蛋白质含量 蛋白质分子中,酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸残基的苯环含有共轭双键,使蛋白质具有吸收紫外光的性质,吸收峰在280nm处,其吸光度(即光密度值)与蛋白质含量成正比。此外,蛋白质溶液在238nm的光吸收值与肽键含量成正比。利用一定波长下,蛋白质溶液的光吸收值与蛋白质浓度的正比关系,可以进行蛋白质含量的测定。 紫外吸收法简便、灵敏、快速,不消耗样品,测定后仍能回收使用。低浓度的盐,例如, 生化制备中常用的(NH4)2SO4 等和大多数缓冲液不干扰测定,特别适用于柱层析洗脱液的快速连续检测,因为此时只需测定蛋白质浓度的变化,而不需知道其绝对值。 此法的特点是测定蛋白质含量的准确度较差,干扰物质较多,在用标准曲线法测定蛋白质含量时,对那些与标准蛋白质中酪氨酸和色氨酸含量差异大的蛋白质有一定的误差,故该法适于用测定与标准蛋白质氨基酸组成相似的蛋白质。若样品中含有嘌呤、嘧啶及核酸等吸收紫外光的物质,会出现较大的干扰。核酸的干扰可以通过查校正表,再进行计算的方法加以适当的校正。但是因为不同的蛋白质和核酸的紫外吸收是不相同的,虽然经过校正,测定的结果还是存在一定的误差。 此外,进行紫外吸收法测定时,由于蛋白质吸收高峰常因pH的改变而有变化,因此要注意溶液的pH值,测定样品时的pH要与测定标准曲线的pH相一致。取待测样品制成蛋白浓度大约在0. 1～1. 0mgPmL的蛋白质溶液,用紫外分光光度计进行比色,对照标准曲线得出样品含氮量。每个样品做3次重复测定,取平均值。 (3)双缩脲法测定蛋白质含量

双缩脲法测定蛋白质含量

双缩脲法测定蛋白质含量 实验二十蛋白质含量测定-—双缩脲法测定蛋白质含量一、实验目的 学习和掌握用双缩脲法测定蛋白质含量的原理和方法。 二、实验原理 在碱性溶液中，双缩脲(H2N—CO－NＨ-CO—NH２）与二价铜离子作用形成紫红色的络合物,这一反应称双缩脲反应。凡分子中含二个或二个以上酰胺基（-CＯ—ＮH2），或与此相似的基团［如—CＨ2—ＮH２，—CＳ—ＮH2,—Ｃ（ＮH）NＨ2］的任何化合物，无论这类基团直接相连还是通过一个碳或氮原子间接相连，均可发生上述反应。蛋白质分子含有众多肽键(-ＣO—NＨ—）,可发生双缩脲反应，且呈色强度在一定浓度范围内与肽键数量即与蛋白质含量成正比，可用比色法测定蛋白含量。测定范围为１～10mg蛋白质。干扰这一测定的物质主要有：硫酸铵、Trｉｓ缓冲液和某些氨基酸等。...文档交流仅供参考... 此法的优点是较快速，不同的蛋白质产生颜色的深浅相近,以及干扰物质少。主要的缺点是灵敏度差。因此双缩脲法常用于快速，但并不需要十分精确的蛋白质测定。...文档交流仅供参考... 三、实验试剂和器材 ［试剂］ 1．双缩脲试剂: 取CuSO４·5H20（c。P。)1.5g和酒石酸钾钠(c．P.）６．0g以少量蒸馏水溶解,再加２.5m ｏl/Ｌ NaOH溶液300ml,KI １。0ｇ，然后加水至10００mｌ.棕色瓶中避光保存。长期放置后若有暗红色沉淀

出现,即不能使用。...文档交流仅供参考... 2。标准蛋白质溶液: 用标准的结晶牛血清清蛋白(BSA）或标准酪蛋白,配制成１0g/L的标准蛋白溶液,可用BSA浓度1ｇ/Ｌ的A280为０。66来校正其纯度。如有需要，标准蛋白质还可预先用微量凯氏定氮法测定蛋白氮含量，计算出其纯度，再根据其纯度，称量配制成标准蛋白质溶液。牛血清清蛋白用H２O 或0.９%NaCl配制，酪蛋白用0。05mol/L NａOH配制. ...文档交流仅供参考... ［器材］ 1．试管:15×15０ｍｍ试管7只; 2．１ml，5ml移液管; 3.坐标纸； ４．７2１分光光度计。 四、实验操作 取试管７支,编号，按下表操作： 试剂(m ｌ）\管号空白 管 １２34５测定 管 蛋白 标准 液(1 ０g/ Ｌ) —0。10．２0．30.40.5–

蛋白质定量检测方法

Bradford法蛋白定量（Bradford Protein Assay ） Bradford Assay is a rapid and accurate method commonly used to determine the total protein concentration of a sample. The assay is based on the observation that the absorbance maximum for an acidic solution of Coomassie Brilliant Blue G-250 shifts from 465 nm to 595 nm when binding to protein occurs. Both hydrophobic and ionic interactions stabilize the anionic form of the dye, causing a visible color change. Within the linear range of the assay (~5-25 mcg/mL), the more protein present, the more Coomassie binds. Reference Bradford, M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal. Biochem. (1976) 72, 248-254. 考马斯亮蓝染色法(Bradford法)测定蛋白质含量 原理 1976年Bradford建立了用考马斯亮蓝G250与蛋白质结合的原理，迅速、敏感的定量测定蛋白质的方法。染料与蛋白质结合后引起染料最大吸收的改变，从465nm变为595nm，光吸收增加。蛋白质-染料复合物具有高的消光系数，因此大大提高了蛋白质测定的灵敏度，最低检出量为1μg蛋白。染料与蛋白质的结合是很迅速的过程，大约需2min，结合物的颜色在1h内是稳定的。一些阳离子，如K+，Na+，Mg2+，(NH4)2SO4，乙醇等物质不干扰测定，而大量的去污剂如TritonX100，SDS等严重干扰测定，少量的去污剂可通过用适当的对照而消除。由于染色法简单迅速，干扰物质少，灵敏度高，现已广泛应用于蛋白质含量的测定。 操作 一、标准方法 取含10～100μg蛋白质溶液于小试管中，用双蒸水或缓冲液调体积到0.1mL，然后加入5mL蛋白试剂，充分振荡混合，2min后于595nm测定光吸收值。以0.1mL 双蒸水或缓冲液及5mL蛋白试剂作为空白对照。 二、微量蛋白分析法 取含1～10μg蛋白质溶液，用双蒸水调体积到0.8mL，加0.2mL蛋白试剂，充分振荡混合，2min后于595nm测定光吸收值，以0.8mL双蒸水及0.2mL蛋白试剂作为空白对照。用不同浓度的蛋白质溶液作标准曲线，以蛋白质浓度为横坐

双缩脲法测定蛋白质含量

实验二十蛋白质含量测定——双缩脲法测定蛋白质含量一、实验目的 学习和掌握用双缩脲法测定蛋白质含量的原理和方法。 二、实验原理 在碱性溶液中，双缩脲(H2N-CO-NH-CO-NH2) 与二价铜离子作用形成紫红色的络合物，这一反应称双缩脲反应。凡分子中含二个或二个以上酰胺基(—CO-NH2) ，或与此相似的基团［如—CH2-NH2 ，—CS-NH2，—C(NH)NH2］的任何化合物，无论这类基团直接相连还是通过一个碳或氮原子间接相连，均可发生上述反应。蛋白质分子含有众多肽键(—CO-NH —),可发生双缩脲反应，且呈色强度在一定浓度范围内与肽键数量即与蛋白质含量成正比，可用比色法测定蛋白含量。测定范围为1?10mg蛋白质。干扰这一测定 的物质主要有：硫酸铵、Tris 缓冲液和某些氨基酸等。 此法的优点是较快速，不同的蛋白质产生颜色的深浅相近，以及干扰物质少。主要的缺点是灵敏度差。因此双缩脲法常用于快速，但并不需要十分精确的蛋白质测定。 三、实验试剂和器材 ［试剂］ 1 ?双缩脲试剂：取CuSO4 ?5H20.)和酒石酸钾钠.)以少量蒸馏水溶解，再加/ L NaOH 溶液300ml, KI ,然后加水至1000ml。棕色瓶中避光保存。长期放置后若有暗红色沉淀出现，即不能使用。 2. 标准蛋白质溶液：用标准的结晶牛血清清蛋白(BSA)或标准酪蛋白，配制成 10g/L 的标准蛋白溶液，可用BSA 浓度1g/L 的A280 为来校正其纯度。如有需要，标准蛋白质还可预先用微量凯氏定氮法测定蛋白氮含量，计算出其纯度，再根据其纯度，称量配制成标准蛋白质溶液。牛血清清蛋白用H2O或%NaCl配制，酪蛋白用L NaOH配 制。 ［器材］ 1. 试管：15X 150mm试管7只； 2. 1ml，5ml 移液管； 3. 坐标纸；

蛋白质含量测定——双缩脲试剂法-实验报告

生物化学实验报告 姓名： 学号： 专业年级： 组别： 生物化学与分子生物学实验教学中心

实验名称蛋白质含量测定——双缩脲试剂法 实验日期实验地点 合作者指导老师 评分教师签名批改日期 一、实验目的 1.1.掌握双缩脲测定血清总蛋白的基本原理、操作； 1.2.掌握双缩脲试剂的配制； 1.3.熟悉血清总蛋白的临床意义； 1.4.了解双缩脲法测定血清总蛋白的特点和注意事项。 二、实验原理 2.1.两分子尿素加热脱氨缩合成的双缩脲（H2N-OC-NH-CO-NH2），因分子内含有两个邻接的肽键，在碱性溶液中可与Cu2+发生双缩脲反应，生成紫红色络合物。 2.2.蛋白质分子含有大量彼此相连的肽键（-CO-NH-），同样能在碱性条件下与Cu2+发生双缩脲反应，生成的紫红色络合物，且在540nm处的吸光度与蛋白质的含量在10～120g/L范围内有良好的线性关系。 三、材料与方法： 3.1.实验材料： 3.1.1.实验试剂：①小牛血清；②6.0mol/LNaOH溶液；③双缩脲试剂:硫酸酮、酒石酸钾钠、碘化钾；④蛋白质标准液（70g/L）；⑤0.9%NaCl；⑥蒸馏水。 3.1.2.实验器材：①试管；②烧杯；③容量瓶；④加样枪；⑤刻度吸管；⑥玻璃棒；⑥1100分光光度计；⑦电子天平；⑧水浴锅。

3.2.实验步骤 四、结果与讨论： 4.1.实验现象： ①选取三支洁净无损的试管，从左往右依次加入0.9%氯化钠溶液、蛋白质标准液、相应的小牛血清各0.5ml，分别命名为B试管、S试管和U试管，再分别向三支试管内加入4ml的双缩脲试剂，溶液均成蓝色透明状。

测定次数 1 2 3 平均吸光度 ②将三支试管放入37℃水浴锅中加热20min，取出后，B试管呈淡蓝色，S试管和U 试管均成浅紫色，且S试管的颜色比U试管的颜色深。（如图一） 图一水浴后三支试管颜色图二分光计读数 S 0.185 0.184 0.185 0.1847 U 0.152 0.151 0.152 0.1517 结果计算：代入公式：血清总蛋白（g/L)=(Au/As)X蛋白质标准液浓度（g/L)，得出结果：血清总蛋白=57.493g/L。 4.3.结果讨论 经查阅资料得：正常成人血清总蛋白含量为60～80g/L，而小牛血清总蛋白含量比正常成人血清总蛋白含量略低一点，本次结果得出小牛血清总蛋白含量为57.493g/L，符合情况。 4.3.1.成功原因： ①本次试验的试剂混合水浴后出现了预期效果：B试管呈淡蓝色，S试管和U试管均成浅紫色，且S试管的颜色比U试管的颜色深。B试管呈淡蓝色是因为B试管中没有发生任何反应，所以呈现双缩脲试剂本来的淡蓝色，而S试管和U试管呈浅紫色是因为试剂中的蛋白质和双缩脲发生了双缩脲反应而呈浅紫色。 管号

蛋白质含量测定方法汇总

实验七蛋白质含量测定 测定蛋白质的定量方法有很多，目前常用的有染料法，双缩脲(Biuret)法，酚试剂法(Lowry)法及紫外吸收法。 [目的要求] 1．掌握测定蛋白质的含量基本方法。 2．了解染料法、双缩脲法、Lowry法和紫外吸收法测定原理。 一、染料法 [实验原理] 在酸性溶液中染料考马斯亮蓝G-250与蛋白质结合，此时考马斯亮蓝G-250颜色从红色变为蓝色，吸收高峰从460nm移至595nm。利用这个原理可以测定蛋白质含量。 该法近年在某些方面有取代经典的Lowry法趋势，因为它操作简单，反应时间短，染料-蛋白质颜色稳定，抗干扰性强。本法的缺点是：对于那些与标准蛋白氨基酸组成有较大差异的蛋白质，有一定误差，因为不同的蛋白质与染料的结合是不同的，故该法适合测定与标准蛋白质氨基酸组成相近的蛋白质。 [器材] 吸量管；试管；721型分光光度计 [试剂] 1.标准牛血清白蛋白溶液：配成0.1mg/ml的溶液。 2.待测蛋白质溶液。 3.染料溶液：称取考马斯亮蓝G-250 0.1g溶于95%的酒精50ml，再加入85%的浓磷酸100ml，用水稀释至1000ml,混匀备用。 [操作步骤] 按上表分别向各支试管内加入各种试剂，充分混匀，5min后在595nm波长处以0号管调零,测定各管吸光度值（A）。以吸光度值为纵坐标,蛋白质浓度为横坐标绘制标准曲线。 2．样品测定：

取1ml样品溶液（约含25～250微克蛋白质），加入染料溶液5ml混匀，5min后测定其595nm吸光度值，对照标准曲线求得蛋白质浓度。 二、双缩脲(Biuret)法测定蛋白质含量 [实验原理] 在碱性溶液中，双缩脲(H2N-CO-NH-CO-NH2)与二价铜离子作用形成紫红色的络合物，这一反应称双缩脲反应。凡分子中含二个或二个以上酰胺基(—CO-NH2)，或与此相似的基团[如—CH2-NH2，—CS-NH2，—C(NH)NH2]的任何化合物，无论这类基团直接相连还是通过一个碳或氮原子间接相连，均可发生上述反应。蛋白质分子含有众多肽键(—CO-NH—)，可发生双缩脲反应，且呈色强度在一定浓度范围内与肽键数量即与蛋白质含量成正比，可用比色法测定蛋白含量。测定范围为1～10mg蛋白质。干扰这一测定的物质主要有：硫酸铵、Tris缓冲液和某些氨基酸等。 此法的优点是较快速，不同的蛋白质产生颜色的深浅相近，以及干扰物质少。主要的缺点是灵敏度差。因此双缩脲法常用于快速，但并不需要十分精确的蛋白质测定。 [试剂] 1．双缩脲试剂：取CuSO4·5H20(c.P.)1.5g和酒石酸钾钠(c.P.)6.0g以少量蒸馏水溶解，再加2.5mol／L NaOH溶液300ml，KI 1.0g，然后加水至1000ml。棕色瓶中避光保存。长期放置后若有暗红色沉淀出现，即不能使用。 2．标准蛋白质溶液：用标准的结晶牛血清清蛋白（BSA）或标准酪蛋白，配制成10g/L的标准蛋白溶液，可用BSA浓度1g/L的A280为0.66来校正其纯度。如有需要，标准蛋白质还可预先用微量凯氏定氮法测定蛋白氮含量，计算出其纯度，再根据其纯度，称量配制成标准蛋白质溶液。牛血清清蛋白用H2O 或0.9%NaCl配制，酪蛋白用0.05mol/L NaOH配制。 [器材] 1．试管：15×150mm 试管7只； 2．1ml，5ml移液管； 3．坐标纸； 4．721分光光度计。 [操作步骤]

蛋白质测定方法之双缩脲法(Biuret法)

一）实验原理 双缩脲（NH3CONHCONH3）是两个分子脲经180℃左右加热，放出一个分子氨后得到的产物。在强碱性溶液中，双缩脲与CuSO4形成紫色络合物，称为双缩脲反应。凡具有两个酰胺基或两个直接连接的肽键，或能过一个中间碳原子相连的肽键，这类化合物都有双缩脲反应。 紫色络合物颜色的深浅与蛋白质浓度成正比，而与蛋白质分子量及氨基酸成分无关，故可用来测定蛋白质含量。测定范围为1~10mg蛋白质。干扰这一测定的物质主要有：硫酸铵、Tris 缓冲液和某些氨基酸等。 此法的优点是较快速，不同的蛋白质产生颜色的深浅相近，以及干扰物质少。主要的缺点是灵敏度差。因此双缩脲法常用于需要快速，但并不需要十分精确的蛋白质测定。 （二）试剂与器材 1.试剂： （1）标准蛋白质溶液：用标准的结晶牛血清清蛋白（BSA）或标准酪蛋白，配制成10mg/ml 的标准蛋白溶液，可用BSA浓度1mg/ml的A280为0.66来校正其纯度。如有需要，标准蛋白质还可预先用微量凯氏定氮法测定蛋白氮含量，计算出其纯度，再根据其纯度，称量配制成标准蛋白质溶液。牛血清清蛋白用H2O 或0.9%NaCl配制，酪蛋白用0．05N NaOH配制。 （2）双缩脲试剂：称以1.50克硫酸铜（CuSO4?5H2O）和6.0克酒石酸钾钠（KNaC4H4O6?4H2O），用500毫升水溶解，在搅拌下加入300毫升10% NaOH溶液，用水稀释到1升，贮存于塑料瓶中（或内壁涂以石蜡的瓶中）。此试剂可长期保存。若贮存瓶中有黑色沉淀出现，则需要重新配制。 2.器材： 可见光分光光度计、大试管15支、旋涡混合器等。 （三）操作方法 1.标准曲线的测定：取12支试管分两组，分别加入0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0毫升的标准蛋白质溶液，用水补足到1毫升，然后加入4毫升双缩脲试剂。充分摇匀后，在室温（20~25℃）下放置30分钟，于540nm处进行比色测定。用未加蛋白质溶液的第一支试管作为空白对照液。取两组测定的平均值，以蛋白质的含量为横座标，光吸收值为纵座标绘制标准曲线。 2、样品的测定：取2~3个试管，用上述同样的方法，测定未知样品的蛋白质浓度。注意样品浓度不要超过10mg/ml。 三、Folin—酚试剂法（Lowry法） （一）实验原理

蛋白质含量测定方法比较

. 蛋白质含量测定主要有五种方法，分别是凯式定氮法、双缩脲法、紫外吸收法、酚试剂法和考马斯亮蓝法。这五种方法各有特点，优缺点明确。 凯氏定氮法 蛋白质是含氮的化合物。食品与浓硫酸和催化剂共同加热消化，使蛋白质分解，产生的氨与硫酸结合生成硫酸铵，留在消化液中，然后加碱蒸馏使氨游离，用硼酸吸收后，再用盐酸标准溶液滴定，根据酸的消耗量来乘以蛋白质换算系数，即得蛋白质含量。因为食品中除蛋白质外，还含有其它含氮物质，所以此蛋白质称为粗蛋白。 优点：重现性好，是目前分析有机化合物含氮量常用的方法,是一种蛋白质测定的经典方法, ,测试结果准确。 缺点：操作比较繁复，费时,试剂消耗量大。且此法测定的蛋白质含量实际上包括了核酸，生物碱，含氮类脂，卟啉，含氮色素等非蛋白质含氮化合物。 双缩脲定氮法 双缩脲（NHCONHCONH）是两个分子脲经180℃左右加热，放出一个33分子氨后得到的产物。在强碱性溶液中，双缩脲与CuSO形成紫色络合物，称4为双缩脲反应。凡具有两个酰胺基或两个直接连接的肽键，或能过一个中间碳原子相连的肽键，这类化合物都有双缩脲反应。紫色络合物颜色的深浅与蛋白质浓度成正比，而与蛋白质分子量及氨基酸成分无关，故可用来测定蛋白质含量。测定范围为1~10mg蛋白质。干扰这一测定的物质主要有：硫酸铵、Tris缓冲液和某些氨基酸等。 优点：较快速，不同的蛋白质产生颜色的深浅相近，以及干扰物质少。主要的

缺点是灵敏度差。因此双缩脲法常用于需要快速，但并不需要十分精确的蛋1 / 5 . 白质测定。 缺点：不太灵敏；不同蛋白质显色相似。 紫外吸收定氮法 双缩脲法是传统的分光光度法测定蛋白质的方法,当含有两个或者两个以上肽键的物质和碱性的硫酸铜反应时,形成紫色的络合物,这个颜色产物是肽键中的氮原子和铜离子配价结合的结果。蛋白质分子中，酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸残基的苯环含有共轭双键，使蛋白质具有吸收紫外光的性质。形成颜色产物的量取决于蛋白质的浓度。实际测定时,必须预先用标准蛋白质溶液制作一个标准校正曲线,通常用牛血清白蛋白水溶液做蛋白质标准溶液。不同浓度的标准蛋白质溶液加入双缩脲试剂后,反应生成的颜色产物用紫外-可见分光光度计在540nm 波长下测定吸光度,以双缩脲试剂加缓冲或水作空白对照。然后将测得的值分别对蛋白浓度(mg/ ml) 作图,得标准曲线。未知蛋白样品用双缩脲试剂做同样处理,根据测得吸光度值在标准曲线上直接查得未知蛋白质样品中得蛋白质浓度。 优点：对各种蛋白质呈色基本相同;特异性和准确度好,精密度好;呈色稳定性好,试剂单一,方法简便。快速，不消耗样品，测定后仍能回收使用。 缺点：准确度较差，干扰物质多，在用标准曲线法测定蛋白质含量时，对那些与标准蛋白质中酪氨酸和色氨酸含量差异大的蛋白质，有一定的误差。故该法适于用测定与标准蛋白质氨基酸组成相似的蛋白质。若样品中含有嘌呤、嘧啶及核酸等吸收紫外光的物质，会出现较大的干扰。核酸的干扰可以通过查校正表，再进行计算的方法，加以适当的校正。但是因为不同的蛋白质和核酸的紫外吸收是不相同的，虽然经过校正，测定的结果还是存在一定的误差。此外，进行紫外吸收

双缩脲法蛋白质含量检测试剂盒说明书 微量法

双缩脲法蛋白质含量检测试剂盒说明书微量法 注意：正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定。 货号:BC3185 规格:100T/96S 产品简介: 样品可溶性蛋白质含量常常用于酶活性计算。此外，可溶性蛋白质含量也用于食品等质量分析。 强碱性溶液中，双缩脲与CuSO 形成紫色络合物；紫色络合物颜色的深浅与蛋白质浓度成正比，而与蛋 4 白质分子量及氨基酸成分无关，故可用来测定蛋白质含量。该方法测定范围为1~10mg蛋白质，适用于蛋白质浓度高的样品，尤其是动物材料。 自备仪器和用品: 可见分光光度计/酶标仪、移液器、微量玻璃比色皿/96孔板和蒸馏水。 试剂组成和配制： 试剂一：液体20mL×1瓶，4℃保存。 标准品：液体1mL×1支，5mg/mL，-20℃保存。 样品中可溶性蛋白质提取: 1.液体样品：澄清无色液体样品可以直接测定。 2.组织样品：按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1mL 提取液（自备，根据需要选用酶提取缓冲液或者蒸馏水或者生理盐水））冰浴匀浆，10000rpm，4℃离心10min，取上清，即待测液。（动物样品常常需要稀释） 3.细菌、真菌：按照细胞数量（104个）：提取液体积（mL）为500~1000：1的比例（建议500万细胞加入

1mL提取液），冰浴超声波破碎细胞（功率300w，超声3秒，间隔7秒，总时间3min）；然后8000rpm，4℃，离心10min，取上清置于冰上待测。 测定步骤: 1.分光光度计/酶标仪预热30min以上，调节波长到540nm，蒸馏水调零。 2.空白管：取0.5mLEP管，加入40μL蒸馏水，200μL试剂一，混匀后室温静置15min，取200μL于 微量玻璃比色皿/96孔板，540nm比色，记为A1空白管。 3.标准管：取0.5mLEP管，加入40μL标准液，200μL试剂一，混匀后室温静置15min，取200μL于 微量玻璃比色皿/96孔板，540nm比色，记为A2标准管。 4.测定管：取0.5mLEP管，加入40μL待测液，200μL试剂一，混匀后室温静置15min，取200μL于 微量玻璃比色皿/96孔板，540nm比色，记为A3测定管。 样品中蛋白质浓度计算： 1、按液体体积计算： 蛋白质（mg/mL）=C标准管÷(A标准管－A空白管)×(A测定管－A空白管) =5÷(A标准管－A空白管)×(A测定管－A空白管) 2、按样本鲜重计算： 蛋白质（mg/g鲜重）=C标准管÷(A标准管－A空白管)×(A测定管－A空白管)×V样总÷W =5÷(A标准管－A空白管)×(A测定管－A空白管)÷W 3、按细胞数量计算： 蛋白质（mg/104cell）=C标准管÷(A标准管－A空白管)×(A测定管－A空白管)×V样总÷500 =0.01÷(A标准管－A空白管)×(A测定管－A空白管)

双缩脲法测定蛋白质浓度

双缩脲法测定蛋白质浓度 ――生物化学实验 一、目的 了解并掌握双缩脲法测定蛋白质浓度的原理和方法。 二、原理 具有两个或两个以上肽键的化合物皆有双缩脲反应(蛋白质分子中有-CS-NH2, -CH2-NH2, -CHNH2CH2OH等基团，这些基团亦可与碱性高价铜呈颜色反应)，在碱性溶液中蛋白质与Cu2+形成紫色配合物，在540m处有最大吸收。在一定浓度的范围内，蛋白质浓度与双缩脲反应所呈的颜色深浅成正比，可用比色法定量测定。 双缩脲法最常用于需要快速但不要求十分精确的测定。硫酸铵不干扰此呈色反应，但Cu2＋离子容易被还原，有时会出现红色沉淀。 三、实验仪器 1．容量瓶10ml(×6)。 2．试管1.5cm×15cm(×8)。 3．吸管5.0ml(×3)、2.0ml(×1)。 4．722型(或7220型)分光光度计。 四、实验试剂 1、双缩脲试剂：将0.175g CuSO4·5H20溶于约15ml蒸馏水，置于l00ml 容量瓶中，加入30ml浓氨水30ml冰冷的蒸馏水和20ml饱和氢氧化钠溶液，摇匀，室温放置1～2h，再加蒸馏水至刻度，摇匀备用。 2、卵清蛋白液：约lg卵清蛋白溶于l00ml 0.9％NaCl溶液，离心，取上清液，用克氏定氮法测定其蛋白质含量。根据测定结果，用0.9％NaCl溶液稀释卵清蛋白溶液，使其蛋白质含量为2rng/ml。亦可用2mg/ml的牛血清白蛋白溶液。 3、未知液：可用酪蛋白配制。 五、操作 1、标准曲线的绘制：将6只10ml容量瓶编号，按下表加入试剂，即得6种不同浓度的蛋白质溶液。

取干净试管7支，按0、1、2、3、4、5、6编号，1～6号管分别加人上述不同浓度的蛋白质溶液3.0ml。0号为对照管，加入3.0ml蒸馏水。各管加人双缩脲试剂2.0ml，充分混匀，即有紫红色出现，用540nm光测定各管吸光度(须在显色后30min内比色，30min后可能有雾状沉淀产生；各管由显色到比色的时间尽可能一致)。绘制浓度一吸光度曲线。 2、样液测定： 取未知浓度的蛋白质溶液3.0ml(样品液浓度控制在0.05-1.25mg/ml范围内)置试管内，加入双缩脲试剂2．0ml，混匀，测其540hm的吸光度，对照标准曲线求得未知液蛋白质浓度。 六、思考题 1、写出双缩脲反应的方程式。 2、简述用分光光度法测定蛋白质浓度的原理。 3、总结本实验应该注意的主要问题。

蛋白质含量测定

食品中蛋白质含量测定（凯氏定氮法） 一、实验目的 1.学习凯氏定氮法测定蛋白质的原理。 2.掌握凯氏定氮法的操作技术，包括样品的消化处理、蒸馏、滴定及蛋白质含量计算等。 二、实验原理 蛋白质是含氮的化合物。食品与浓硫酸和催化剂共同加热消化，使蛋白质分解，产生的氨与硫酸结合生成硫酸铵，留在消化液中，然后加碱蒸馏使氨游离，用硼酸吸收后，再用盐酸标准溶液滴定，根据酸的消耗量来乘以蛋白质换算系数，即得蛋白质含量。 因为食品中除蛋白质外，还含有其它含氮物质，所以此蛋白质称为粗蛋白。 1.消化：有机物中的胺根在强热和CuSO4/K2SO4，浓H2SO4 作用下，消化生成 （NH4）2SO4； 2NH3+H2S04+2H+=(NH4)2S04（其中CuSO4做催化剂） 2.蒸馏：在凯氏定氮器中与碱作用，通过蒸馏释放出NH3，收集于H3BO3溶液中； (NH4)2SO4+2NaOH=2NH3+2H2O+Na2SO4 2NH3+4H3BO3=(NH4)2B4O7+5H2O 3.滴定：用已知浓度的HCl标准溶液滴定，根据HCI消耗的量计算出氮的含量，然后乘以相应的换算因子，既得蛋白质的含量。 (NH4)2B4O7+2HCl+5H2O＝2NH4Cl+4H3BO3 三、仪器与试剂 （一）试剂 1．硫酸铜（CuSO4·5H2O）（催化剂） 2．硫酸钾（提高沸点） 3．浓硫酸（A.R） 4．硼酸溶液（2%）：称量2g硼酸（H3BO3）粉末溶于蒸馏水100mL，（容量瓶）定容100 mL。5．氢氧化钠溶液（30%）：30克氢氧化钠溶于蒸馏水，（容量瓶）定容100 mL。 6．0.01mol/L盐酸标准滴定溶液。 7．混合指示试剂：0.1%甲基红乙醇溶液1份，与0.1%溴甲酚绿乙醇溶液5份临用时混合。 0.1%的甲基红乙醇溶液：0.1g甲基红指示剂溶于100 mL 60％乙醇中； 0.1%的溴甲酚绿乙醇溶液：0.1g溴甲酚绿指示剂溶于100mL 20％乙醇中。 四、实验步骤

实验一 双缩脲法测定蛋白质含量

实验一:双缩脲法测定蛋白质含量 一目的掌握双缩脲法测定蛋白质含量的原理及方法。 二原理 双缩脲( )是两分子尿素经180℃左右加热,放出一分子氨( NH3)后得到的产物。在强碱溶液中，双缩脲与CUSO4形成紫色络合物，称为双缩脲反应。其原因是含有两个及以上肽键或类似肽键有化合物都具有类似双缩脲反应。蛋白质含有多个肽键，在碱性溶液中能与CU2+络合成紫红色的络合物。其颜色的深浅与被测样品中蛋白质浓度呈正比，而与蛋白质分子量和氨基酸成分无关，故可用来测定蛋白质含量。该法对样品中蛋白质含量要求相对较高，一般在1—10mg/L蛋白质。tris（三甲羟基氨基甲烷）、一些氨基酸、EDTA（乙二胺四乙酸）、草二酰胺、多肽等会于扰该测定。 在一定浓度范围内，反应后颜色与被测样品蛋白质含量呈线性关系，即蛋白质浓度越高，体系的颜色越深。反应产物在540nm处有最大吸收峰（吸光度）。 将未知浓度的样品溶液与一系列已知浓度的标准蛋白质溶液同时与双缩脲试剂反应，并在540nm处比色，可通过标准浓度蛋白质绘制的标准曲线，求得未知样品中的蛋白质含量（浓度）。 由于本法操作简便、迅速、蛋白质浓度与光密度的线性关系好，故对蛋白质快速而不需要十分精确的测定可用此法。 三仪器与器材 可见光分光光度计、水浴锅、分析天平、振荡机（器）、漏斗、试管架、具塞三角瓶（100ml）容量瓶（250 ml、500 ml、1000 ml）、刻度吸管（1.0 ml 2.0 ml 5.0 ml）试管（1.5cmX15cm）。 四试剂 1、双缩脲试剂称取硫酸铜（CUSO4·5H2O）1.5g，酒石酸钾钠（）6.0g，分别用250 ml蒸馏水溶解后，一并转入1000 m l容量瓶中，在搅拌下（可用旋涡混合器或摇动）加入30 ml10%(质量分数)NaOH溶液，然后用蒸馏水稀释至刻度（1000ml）。将该试剂贮存于塑料瓶或内壁涂以石蜡的瓶内。此试剂可长期保存（须无红色或黑色沉淀出现），长期使用。 2、0.05 ml/L的NaOH（需标定）。 3、标准酪蛋白溶液准确称取0.5 g酪蛋白（干酪素）溶于0.05 ml/L的NaOH溶液中，并定容于100ml，即为5mg/L的标准溶液。 4、未知蛋白质溶液浓度应在1—10mg/L范围内。可根据条件选用小麦粉或家畜血清，后者需用水稀释10倍，置于冰箱保存备用。 五方法与步骤 1、标准曲线的绘制取12支试管分两组，分别加入0. 0ml、0.2 ml、0.4 ml、0.6 ml、 0.8ml、1.0ml的标准蛋白质溶液，然后分别加入1.0ml、0.8ml、0.6 ml、0.4 ml、、0.2 ml、0 .0ml蒸馏水，使每支试管总液量为1.0ml，最后分别加入4 ml双缩脲试剂。 充分摇匀后，室温下（20—25℃）放置30min，于540nm处进行比色测定，用未加 蛋白质溶液的第一支试管作为空白对照液，并取两组测定的平均值。以蛋白质的含 量作为横坐标，光吸收值为纵坐标绘制标准曲线。标准曲线绘制操作表见下。（共 12支管，分两组，只列出一组。）

蛋白质的定量测定(一)─紫外吸收测定法

实验名称：蛋白质的定量测定（一)─紫外吸收测定法 【实验原理】 蛋白质分子中含有酪氨酸、色氨酸等芳香族氨基酸残基，使蛋白质在280nm处有最大吸收峰。在一定浓度范围内，蛋白质溶液280nm吸光度与蛋白质浓度成正比，可以用这一性质用作蛋白质定量测定。 【实验准备】 一、材料 （1）血清 （2）待测蛋白质溶液 二、试剂 （1）标准蛋白质溶液：牛血清白蛋白预先经微量凯氏定氮法测定蛋白氮含量，再根据其纯度用0.9%NaCl配制成浓度为1.0mg/ml蛋白质溶液。 （2）0.9%NaCl溶液 （3）饱和（NH4）2SO4溶液 三、器材 （1）紫外分光光度计 （2）试管和试管架 （3）吸量管 （4）离心机 （5）移液枪 【实验步骤】 一、制作标准曲线 取8支试管，编号，按下表加入试剂。 测定各管溶液的吸光度值（A280）。以吸光度值为纵坐标，蛋白质浓度为横坐标，绘出标准曲线。 二、样品测定 （1）待测蛋白质溶液含量测定：取待测蛋白质溶液1ml置于10ml试管中，加入3ml0.9%NaCl 溶液，混匀。以0.9%NaCl溶液为空白溶液，用紫外分光光度计测出待测蛋白质溶液280nm 的吸光度值（A280）。 （2）血清球蛋白含量测定：取新鲜血清100μｌ，边播边缓慢滴入饱和硫酸铵溶液100μｌ，混匀后室温放置10min，3000rpm离心10min，弃去含清蛋白的上清液，于淀中加入0.9%NaCl 溶液0.5ml，振摇使其溶解，即为粗提球蛋白溶液，再加0.9%NaCl溶液7.5ml，混匀，以0.9%NaCl溶液为空白溶液，测出血清球蛋白溶液280nm的吸光值（A280）。 【实验结果】 （1）测出数据如下图所示

双缩脲法蛋白质含量测定试剂盒使用说明

双缩脲法蛋白质含量测定试剂盒使用说明 货号:PC0040 产品简介: 样品可溶性蛋白质含量常常用于酶活性计算。此外，可溶性蛋白质含量也用于食品等质量分析。 形成紫色络合物；紫色络合物颜色的深浅与蛋白质浓度强碱性溶液中，双缩脲与CuSO 4 成正比，而与蛋白质分子量及氨基酸成分无关，故可用来测定蛋白质含量。该方法测定范围为1~10mg蛋白质，适用于蛋白质浓度高的样品，尤其是动物材料。 自备仪器和用品: 可见分光光度计、移液器、1mL玻璃比色皿和蒸馏水。 试剂组成和配制： 试剂一：液体×1瓶，4℃保存。 标准品：液体×1瓶，5mg/mL，4℃保存。 样品中可溶性蛋白质提取: 1.液体样品：澄清无色液体样品可以直接测定。 2.组织样品：按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取 约0.1g组织，加入1mL提取液（自备，根据需要选用酶提取缓冲液或者蒸馏水或者生理盐水））冰浴匀浆，10000rpm，4℃离心10min，取上清，即待测液。（动物样品常常需要稀释） 3.细菌、真菌：按照细胞数量（104个）：提取液体积（mL）为500~1000：1的比 例（建议500万细胞加入1mL提取液），冰浴超声波破碎细胞（功率300w，超声3秒，间隔7秒，总时间3min）；然后10000rpm，4℃，离心10min，取上清置于冰上待测。

测定步骤: 1.分光光度计预热30min以上，调节波长到540nm，蒸馏水调零。 2.空白管：取1mL玻璃比色皿，加入200μL蒸馏水，1000μL试剂一，混匀后 室温静置15min，于540nm比色，记为A空白管。 3.标准管：取1mL玻璃比色皿，加入200μL标准液，1000μL试剂一，混匀后 室温静置15min，于540nm比色，记为A标准管。 4.测定管：取1mL玻璃比色皿，加入200μL待测液，1000μL试剂一，混匀后 室温静置15min，于540nm比色，记为A测定管。 样品中蛋白质浓度计算： C待测（mg/mL）=C标准管×(A测定管－A空白管)÷(A标准管－A空白管) =5×(A测定管－A空白管)÷(A标准管－A空白管) 注意事项： 1.样品蛋白浓度须在1~10mg/ml范围内，低于1mg/ml不能用此法，高于10mg/ml 须做相应稀释。因此测定前用1~2个样做预实验，确保蛋白浓度在1~10mg/ml范围内。 2.待测样品蛋白提取可用生理盐水、双蒸水或不含蛋白的PBS提取。该法受硫酸 铵、Tris缓冲液干扰，提取液中应不含这些物质；否则改用BCA蛋白质含量测定试剂盒。

蛋白质含量测定

实验十六蛋白质含量的测定 衡量食品的营养成分时，要测定蛋白质含量，但由于蛋白质组成及其性质的复杂性，在食品分析中，通常用食品的总氮量表示，蛋白质是食品含氮物质的主要形式，每一蛋白质都有其恒定的含氮量，用实验方法求得某样品中的含氮量后，通过一定的换算系数。即可计算该样品的蛋白质含量。 一般食品蛋白质含氮量为l0％如肉、蛋、豌豆、玉米等，其换算系数为6.25，小麦取5.70，大米5.95、乳制品6.38、大豆5.17，动物胶5.55。 一、目的与要求： 掌握微量凯氏法测定蛋白质总氮量的原理及操作技术。包括样品的消 化，蒸馏吸收及滴定与含氮量的计算。 二、原理： 凯氏定氮法：食品经加硫酸消化使蛋白质分解，其中氮素与硫酸化合成硫酸铵。然后加碱蒸馏使氨游离，用硼酸液吸收后，再用盐酸或硫酸滴定根据盐酸消耗量，再乘以一定的数值即为蛋白含量，其化学反应式如下。 ( 1 ) 2NH2(CH2)2COOH+13H2S04(NH4)2S04+6C02+12S02+ 16H2 (2)(NH4)2SO4+2NAOH-----2NH2+2H2O+NA2SO4 (3)2NH3+4H3BO3----(NH4)2B4O7+5H2O (4) (NH4)2B407+H2S04+5H20-(NH4)9SO4+4H2BO2 三、试剂与仪器： 1、硫酸钾 2、硫酸铜 3、硫酸 4、2％硼酸溶液 5、40％氢氧化钠溶液 6、混合指示剂：把溶解于95％乙醇的0.l％溴甲酚绿溶液10毫升和溶于95％乙醇的0.l％甲基红溶液2毫升混合而成． 7、0.01mol/LHCL标准溶液或0．01mol/L硫酸标准溶液． 8、KDN-08A(04A)定氮仪 10、三角瓶250ml 3只。 11、量筒50ml、l0ml、l00ml。

实验一 双缩脲法测定蛋白质含量

创作编号： GB8878185555334563BT9125XW 创作者：凤呜大王* 实验一:双缩脲法测定蛋白质含量 一目的掌握双缩脲法测定蛋白质含量的原理及方法。 二原理 双缩脲( )是两分子尿素经180℃左右加热,放出一分子氨( NH3)后得到的产物。在强碱溶液中，双缩脲与CUSO4形成紫色络合物，称为双缩脲反应。其原因是含有两个及以上肽键或类似肽键有化合物都具有类似双缩脲反应。蛋白质含有多个肽键，在碱性溶液中能与CU2+络合成紫红色的络合物。其颜色的深浅与被测样品中蛋白质浓度呈正比，而与蛋白质分子量和氨基酸成分无关，故可用来测定蛋白质含量。该法对样品中蛋白质含量要求相对较高，一般在1—10mg/L蛋白质。tris（三甲羟基氨基甲烷）、一些氨基酸、EDTA（乙二胺四乙酸）、草二酰胺、多肽等会于扰该测定。 在一定浓度范围内，反应后颜色与被测样品蛋白质含量呈线性关系，即蛋白质浓度越高，体系的颜色越深。反应产物在540nm处有最大吸收峰（吸光度）。 将未知浓度的样品溶液与一系列已知浓度的标准蛋白质溶液同时与双缩脲试剂反应，并在540nm处比色，可通过标准浓度蛋白质绘制的标准曲线，求得未知样品中的蛋白质含量（浓度）。 由于本法操作简便、迅速、蛋白质浓度与光密度的线性关系好，故对蛋白质快速而不需要十分精确的测定可用此法。 三仪器与器材 可见光分光光度计、水浴锅、分析天平、振荡机（器）、漏斗、试管架、具塞三角瓶（100ml） 容量瓶（250 ml、500 ml、1000 ml）、刻度吸管（1.0 ml 2.0 ml 5.0 ml）试管（1.5cmX15cm）。 四试剂 1、双缩脲试剂称取硫酸铜（CUSO4·5H2O）1.5g，酒石酸钾钠（）6.0g，分别用250 ml蒸馏水溶解后，一并转入1000 m l容量瓶中，在搅拌下（可用旋涡混合器或摇动）加入30 ml10%(质量分数)NaOH溶液，然后用蒸馏水稀释至刻度（1000ml）。将该试剂贮存于塑料瓶或内壁涂以石蜡的瓶内。此试剂可长期保存（须无红色或黑色沉淀出现），长期使用。 2、0.05 ml/L的NaOH（需标定）。 3、标准酪蛋白溶液准确称取0.5 g酪蛋白（干酪素）溶于0.05 ml/L的NaOH 溶液中，并定容于100ml，即为5mg/L的标准溶液。 4、未知蛋白质溶液浓度应在1—10mg/L范围内。可根据条件选用小麦粉或家畜血清，后者需用水稀释10倍，置于冰箱保存备用。

蛋白质定量的五种方法

蛋白质定量得五种方法 方法一双缩脲法测定蛋白质浓度 [目得］掌握双缩脲法测定蛋白质浓度得原理与标准曲线得绘制。 [原理] 双缩脲（NH 2CＯNHCOＮH 2 )在碱性溶液中与硫酸铜反应生成紫红色化合物, 称为双缩脲反应，蛋白质分子中含有许多肽键（—ＣＯＮH—)在碱性溶液中也能与Cu２＋反应产生紫红色化合物。在一定范围内,其颜色得深浅与蛋白质浓度成正比。因此,可以利用比色法测定蛋白质浓度。 双缩脲法就是测定蛋白质浓度得常用方法之一.操作简便、迅速、受蛋白质种类性质得影响较小,但灵敏度较差，而且特异性不高.除—CONH—有此反应 外，—CＯNＨ 2、—CＨ 2 ＮＨ 2 、-CS－NＨ 2 等基团也有此反应。 [操作］ 取中试管7支，按下表操作． 各管混匀、放置37℃水浴中保温20分钟.用5４0nｍ比色,以空白管调零点,读取各管光密度值。 [计算］ （一）在座标纸上以光密度为纵座标,以蛋白质浓度为横座标绘制标准曲线。 (二)从标准曲线中查出待测血清样本得蛋白质浓度(ｇ／L),并求出人血清样本得蛋白质 浓度. （三）再从标准管中选择一管与测定管光密度相接近者，求出人血清样本得蛋白质浓度(ｇ／L)。 [器材] 中试管7支,l毫升刻度吸管3支,10毫升刻度吸管１支，水浴箱，７21型分光光度计、坐标纸。 [试剂］

(—)6Ｎ NaOH:称取240ｇ氢氧化钠溶于1000mｌ水中。 (二）双缩脲试剂:称取CuS0 4·5H ２ O 3。0克,酒石酸钾9.0 克与碘化钾５. ０克,分别溶解后混匀,加6ＮNaＯH l00mｌ，最后加水至1000mｌ,贮于棕色瓶中，避光，可长期保存.如有暗红色沉淀出现,即不能使用. （三)０、９%NａCl． (四）蛋白质标准液(１0ｍg／ｍ1),称取干燥得牛血清蛋白100、０mｇ，以少量生理盐水溶解后倒入ｌ0ml容量瓶中，淋洗称量瓶数次,一并倒入容量瓶中，最后加生理盐水至刻度线,或用凯氏定氮法测定血清蛋白质含量,然后稀释成ｌ0mg/ｍ1作为蛋白质标准液。 （五)待测血清样本:将人血清或动物血清用生理盐水稀释１0倍后再测定。 方案二 Foliｎ-酚试剂法(Lowry法)测定蛋白质浓度[目得］掌握Loｗry法测定蛋白质浓度得原理. [原理] 蛋白质在碱性溶液中其肽键与Cｕ2+螯合,形成蛋白质一铜复合物,此复合 物使酚试剂得磷钼酸还原,产生蓝色化合物,在一定条件下，利用蓝色深浅与蛋白质浓度得线性关系作标准曲线并测定样品中蛋白质得浓度. [操作] 取试管7支、编号、按下表操作: 生理盐水 生理盐水 立即混匀，在20℃～25℃水浴保温30分钟.用６6０ｎm比色,测定光密度值. 操作注意事项： 1.按顺序添加试剂 ２.试剂乙在酸性条件下稳定，碱性条件下(试剂甲)易被破坏,因此加试剂乙后要立即混匀，加一管混匀一管，使试剂乙(磷目酸）在破坏前即被还原。 ［计算］ （一)绘制标准曲线。以浓度为横坐标，光密度值为纵坐标绘制标准曲线。