一种新的天然SENP1抑制剂-地肤子皂苷
目录
第一部分 (1)
一种新的天然SENP1抑制剂-地肤子皂苷I C，抑制前列腺癌细胞增殖 (1)
第一章绪论 (1)
1.引言 (1)
1.1前列腺癌 (1)
1.2 SUMO特异性蛋白酶1（SUMO/Sentri-Specific Proteases1，SENP1） (2)
1.3地肤子皂苷I c (3)
1.4本文主要研究内容 (4)
第二章MC是SENP1的天然抑制剂 (4)
1.引言 (4)
2.实验材料及方法 (5)
2.1主要仪器与试剂 (5)
2.1.1主要仪器 (5)
2.1.2主要试剂 (5)
2.1.3抗体 (6)
2.1.4地肤子皂苷I c溶液的配制 (6)
2.2细胞培养和稳定表达PBabe-3flag-SUMO1/2/3/SENP1的PC3细胞株的建立 (6)
2.2.1原理 (6)
2.2.2细胞培养 (6)
2.2.3包装病毒 (6)
2.2.4感染PC3细胞 (7)
2.3质粒小抽 (7)
2.4细胞总蛋白提取 (8)
2.5总蛋白定量（Bradford法） (8)
2.5.1原理 (8)
2.5.2配制Bradford工作液 (8)
2.5.3制作标准曲线 (9)
2.5.4蛋白定量 (9)
2.6 western blot (9)
2.6.1试剂配制 (9)
2.6.2操作步骤 (9)
2.7体外de-SUMOylation实验 (10)
2.8纯化蛋白SENP1C (11)
2.8.1转化 (11)
2.8.2诱导表达 (11)
2.8.3纯化 (11)
2.9细胞热转移实验（Celluar thermal shift assay, CETSA） (12)
2.9.1原理 (12)
2.9.2热溶解曲线 (12)
2.9.3等温剂量反应曲线 (12)
2.9.4用纯化的蛋白SENP1C进行CETSA实验 (12)
2.10药物靶标亲和反应稳定技术(Drug affinity responsive targetstability, DARTS) (13)
2.10.1原理 (13)
2.10.2试剂配制 (13)
2.10.3最适蛋白酶浓度的摸索 (13)
2.10.4 DARTS实验 (13)
3.实验结果 (13)
3.1 SENP1C蛋白的原核表达、纯化及功能验证 (13)
3.2地肤子皂苷 c可抑制外源性SENP1活性 (14)
3.3 Mc可抑制内源性SENP1活性，导致细胞内SUMO修饰的底物累积 (16)
3.4 Mc与SENP1可直接结合 (17)
4.本章小结 (19)
第三章MC对前列腺癌细胞生物学功能的影响 (19)
1.引言 (19)
2.实验材料及方法 (20)
2.1主要仪器与试剂 (20)
2.1.1主要仪器 (20)
2.1.2主要试剂 (20)
2.1.3抗体 (20)
2.2细胞的复苏传代和冻存 (21)
2.2.1细胞来源 (21)
2.2.2细胞的复苏及培养 (21)
2.2.3细胞传代 (21)
2.2.4细胞冻存 (22)
2.2.5细胞计数 (22)
2.3细胞增殖活力检测（CCK8检测） (22)
2.3.1原理 (22)
2.3.2操作步骤 (23)
2.4 Western blot (23)
2.5实时定量PCR 测定前列腺癌细胞中SENP1 表达量的变化 (23)
2.5.1总RNA提取 (23)
2.5.2 cDNA链合成 (24)
2.5.3实时荧光定量PCR (25)
2.6流式细胞术检测细胞周期 (25)
2.6.1原理 (25)
2.6.2细胞样品准备 (25)
2.6.3细胞固定 (26)
2.6.4染色 (26)
2.6.5流式检测及分析 (26)
2.7流式细胞术检测细胞凋亡 (26)
2.7.1原理 (26)
2.7.2准备细胞样品 (27)
2.7.3染色 (27)
2.7.4流式检测及分析 (27)
3.实验结果 (27)
3.1 Mc对前列腺癌细胞活力的影响 (27)
3.2 Mc对PC3细胞周期的影响 (28)
3.3 Mc对PC3细胞凋亡的影响 (29)
3.4 Mc可下调前列腺癌细胞中SENP1的表达 (30)
4.本章小结 (31)
第四章SENP1可部分抵消MC处理引起的前列腺癌细胞生物学效应 (31)
1.引言 (31)
2.实验材料及方法 (32)
2.1主要仪器与试剂 (32)
2.1.1主要仪器 (32)
2.1.2主要试剂 (32)
2.1.3抗体 (32)
2.2细胞培养及稳定表达pBabe-3flag-SENP1的PC3细胞的建立 (32)
2.3 CCK8试验 (32)
2.4细胞周期 (32)
2.5 western blot (33)
2.6.细胞培养及稳定敲除SENP1的PC3细胞系建立 (33)
2.6.1原理 (33)
2.6.2 细胞培养 (33)
2.6.3包装病毒 (33)
2.6.4感染PC3细胞 (34)
3.实验结果 (34)
4.本章小结 (37)
第五章MC抑制前列腺癌的体内实验 (37)
1.前言 (37)
2.实验材料及方法 (38)
2.1主要仪器与试剂 (38)
2.1.1主要仪器 (38)
2.1.2主要试剂 (38)
2.1.3抗体 (38)
2.2材料 (38)
2.2.1受试药物 (38)
2.2.2动物 (38)
2.2.3细胞系 (38)
2.3.试验方法 (39)
2.3.1细胞培养 (39)
2.3.2裸鼠移植瘤模型的建立 (39)
2.3.3分组、给药方式及观察指标 (39)
2.3.4裸鼠处置 (39)
2.3.5石蜡组织切片的制备 (40)
2.3.6 HE染色 (40)
2.3.7免疫组织化学染色 (41)
2.3.8 TUNEL染色 (42)
2.3.9统计学分析 (43)
3.实验结果 (43)
3.1裸鼠一般情况 (43)
3.2肿瘤生长情况 (43)
3.3肿瘤体积 (43)
3.4移植瘤免疫组化 (44)
4.本章小结 (45)
第六章讨论 (46)
全文小结 (50)
参考文献 (51)
第二部分 (55)
口腔黏膜病外周血淋巴细胞亚群的观察及分析 (55)
第一章绪论 (57)
第二章材料与方法 (57)
1.病例选择 (57)
2.仪器试剂 (57)
3.方法 (57)
4.统计学方法 (58)
第三章结果 (58)
第四章讨论 (59)
参考文献 (63)
致谢 (65)
附录1 (67)
附录2 (68)