植物抗病性基因的研究
植物抗病性基因的研究
摘要：植物对病原物的反应有抗病和感病两大类。从寄主一病原物相互作用角度，抗病反应又叫非亲和性反应，这一系统以寄主抗病和病原物无毒性为特征，寄主植物对病原物有抑制、排斥或减毒作用，病害不发生或受到限制;感病反应又叫亲和性反应，其特征是寄主感病和病原物毒性，结果严重发病。与脊椎动物不同，植物尚未进化到以一种基本机制就能有效地抗衡多种病菌的程度，而是以多种结构和生化防卫机制与一种病原物抗衡才勉强奏效。
关键词：无毒基因；抗病性；克隆
引言：植物遗传型和病原物遗传型决定的，从而逐渐形成遗传学的一个新分支，即寄主一病原物相互作用的遗传学。关于寄主抗病和感病，病原物毒性和无毒性的生化机制从60年代起就进行了大虽研究，但是自80年代起由于分子生物学理论和方法与植物病理学交叉、渗透后取得了明显进展，从而形成了分子植物病理学新分支。分子植物病理学的主要任是研究植物的抗(或感)病性基因和病原物的无毒(或毒)性基因的特证、表达、调控和相互作用。
1.植物抗病表型
可以从不同角度对植物抗病表型进行归类，60年代范德普朗克从群体遗传角度，根据寄主植物变异与病原物变异的相关性把抗病性分为垂直抗性和水平抗性两类。抗病性遗传分析表明垂直抗性往往是单基因的作用，针对一个小种，所以又称单基因抗性或小种专化性抗性;水平抗性则是多基因抗性，由于可针对不同小种，所以又称广谱抗性。在病原物与非寄主植物的关系中，植物对非自身病原物的抗性称为非寄主抗性。从寄主植物对病原物侵染的反应来看，寄主植物的抗病性还可以分为具有过敏反应(HR)的抗病性和无过敏反应的抗病性两类。过敏反应是植物受病原物侵染后，细胞、组织快速死亡的现象。尽管对过敏反应与植物抗病的因果关系尚有争议，但多数研究者仍，把HR看成是植物抗病性的重要标志。寄主植物对病原物的非亲和小种或非自身病原物都可以产生HR。无过敏反应的抗病性发生在一些对所有植物都不产生HR的病原物如土壤杆菌棒杆菌以及一些产生寄主专化性毒素和其他坏死因子的病原菌如菜豆腔、马铃薯晚疫病菌、菜豆单胞锈菌峨等·在这些病害中，植物的防卫反应或者是由无HR的激发
子所激发，或者是在病菌抱子萌发时产生抑制寄主防卫反应的物质。
2.植物抗病因子
植物抗病因子一般分为结构因子和生化因子两类:
2.1结构性抗病因子
主要指植物表面角质层和细胞壁的厚度和组成其功能是限制和敞碍病菌侵入。由病菌诱导合成的凝胶、侵填体和栓质可以使植物体的大部分免受其害;脐眠质、富含经脯氨酸的蛋白质和木质素的沉积有减慢病菌繁殖速度的作用;病菌侵染点局部组织坏死对病菌转移和植物中营养成分的提供有阻碍作用。
2.2生化因子
主要包括抑制病菌对寄主结构物质的代谢能力和直接起杀伤作用的两类。前者主要指病原物降解酶的抑制剂，后者则包括植保素、酚类化合物和降解病原物细胞壁的酶(如几丁酶和葡聚糖酶)。另外，许多植物还能产生含量很高的其他结构性杀菌物质如氧厉酸(DIMBOA)、氰氢酸，皂角普和单宁等。通常情况下，这些物质对寄主植物本身的病原菌并无影响，但有些品系一旦缺失这些物质后，不仅对原有病原物更加敏感，而且对一些非病原物也变得感病，说明这些物质作为真正抗病因子的作用。
3.植物抗病性遗传
根据生产上应用，植物抗病性有单基因抗性和多基因抗性两类
3.1单基因抗性
有显性、部分显性和隐性等类型，单基因显性抗性由于能提供明显的抗、感病界限，便于对后代进行选择，所以最容易进入育种程序。迄今已发现儿百个单基因分别对真菌、细菌、病毒、线虫和其他昆虫提供抗性，包括从免疫到部分抗性不同类型。应用于抗病育种的已有200多例。这些抗病基因多数仅对一种病菌或一个小种起作用，但也发现一些与病毒侵染有关的抗病基因，对其他病原物也有效。应该承认用显性单基因进行抗性育种，对生产上许多病害的防治起到积极作用，但主要问题是这些单基因可能由于病原菌新小种的出现而被克服，抗性不
稳定，所以当前用数量遗传育种更为育种学家所重视。尽管如此，有些单基因杭性已维持了30年以上，如燕麦对维多利亚根腐病菌的抗性和玉米对圆斑病菌的抗性。
3.2数量抗性
是多个单基因微效反应的指示性状，对单个遗传组分的数量和性质尚未完全了解，但近年来应用RFLP技术剖析复杂性状如产量时指出仅有2一6个片一段决定其主要变化，因此，对于一种病害的数童抗性最终也可能归咎于少量主效基因。这些主效基因可能涉及植物的代谢和抗菌活力，结构和生化特征以及识别病菌的能力。目前对那些在遗传和分子上不明显的位点尚无法进行基因克隆。
4.寄主一病原物相互作用的遗传特征和分子机制
植物抗病性遗传是遗传学的一个特殊领域，其特点是它所研究的不是一种生物的特征，而是寄主一病原物遗传组合的特征，植物抗病性是针对某(些)种病原物或病原物的某(些)小种而言的。据寄主一病原物相互作用，植物抗病可划分为两种显然不同的遗传学概念框架。
4.1与病原物亲和性因子有关的抗病性
亲和性因子指寄主一病原物亲和性互作中，寄主植物表现敏感的病原物致病因子如毒素、胞壁降解酶等阻山亲和性因子作用的抗病性表现，如对毒素的减毒作用或胞外酶抑制作用，在遗传上是稳定的，要克服它需要获得一种新的亲和性因子。说明植物对亲和因子抗性机制的最好例子是玉米圆斑病，该病菌小种I 产生的Hc一毒素是一种环状多肤被视为亲和性因子，它只对小种I敏感的玉米基因型起作用。病原真菌产生Hc一毒素的能力与ToxZ共分离，ToxZ编码毒素合成需要的酶。玉米对小种兀抗性受两个核基因调控，HMI在}号染色体上，HMZ 在2号染色体上〕HMI提供在全生育期及全株抗性，HMZ则为半显性，幼苗是感病的，随植物成熟度增加而增强表达。分子克隆及基因表达研究证明，HMI编码Hc一毒素还原酶(HcTR)，钝化毒素分子中的碳基。另外，Anzoi实验室从烟草丁香假单胞菌分离了一种乙酞转移酶基因，由于这种酶的作用使细菌本身对烟草野
火毒素具有抗性。上述两种毒素都已经过转基因杭物的验证，获得的转基因玉米和烟草，分别对上述两种病原菌具有抗性。
对其他类型病原物亲和因子如胞壁降解酶的研究尚未导致有关酶抑制剂的分子克隆，原因之一可能是胞壁降解酶的作用多数情况涉及几种酶的协同作用，抑制一种常常不表现明显减症效果。或者寄主对某种胞壁降解酶的抗性是表现在酶与基质的不亲和性上，需从酶与基质的关系来阐明。对病原物亲和因子的抗性也可以由寄主植物的隐性抗病因子提供。这类抗性被解释为显性等基因编码亲和因子的受体，而隐性等位基因缺乏这种受体，因而亲和性互作不发生。目前这种抗性正在用燕麦Vb基因研究，Vb位点提供燕麦对根腐病菌的敏感性。wolPert 和Maeko发现标记的维多利亚毒素(Victorin)吸附到1OOKDa的感病蛋白质上，而不吸附抗性蛋白质.但是另外一些人发现Victorin的抗体处理抗病和感病植物后，所吸附的蛋白质是一样的，因此，带有隐性等位基因的植物是由于受体丧失还是受体被修饰尚需进一步明确。
4.2与病原物不亲和性因子有关的抗性
主要表现在基因一基因互作中。根据Flor的基因一基因理论，病原物无毒基因与寄主抗病基因显性互作，导致寄主植物特定的品种对病原物特定的小种产生抗性。此类互作中涉及到病原物无毒基因产物或次生代谢产物一激发子与寄主抗病基因产物受体的特异性结合，从而导致寄主防卫反应基因的表达在这里病菌无毒基因产物被认为是寄主抗病基因产物所识别的抗原决定簇。这种抗原决定簇模式已被大量无毒基因的分子克隆所肯定屯隆无毒基因的理论依据是转化毒性小种后使其成为无毒小种的能力。无毒基因对病菌的生存是不利的.它之所以被病菌保留是由于相应抗病基因出现的频率低和在不带抗病基因的品种土占优势细菌的无毒基因可以是染色体携带的，也可以是质粒携带的。已经克隆到的染色体上的无毒基因有
大豆斑点病菌的avrA、avrB，菜豆晕斑病菌的avrAsPil.豌豆叶斑病菌的avrAsphl.棉角斑病菌avrB6、avrBN、avrB.n以及辣椒斑点病菌的avrRxv、avrB、上述病菌中的有些无毒基因也发生在质粒上，如大豆斑点病菌的avrC和辣椒斑点病菌的avrBs、avrBs3。迄今研究清楚的真菌无毒基因是番茄叶霉病菌的
avrg。avrg的产物只在与含cfg基因的抗病品种番茄互作时才被诱导表达。无毒基因avrg的产物是含63个氨基酸的多肤。纯化的多肤能直接诱导带cfg的番茄品种产生过敏反应。Southern杂交分析avrg基因与侵染带cfg番茄品种的其他小种无同源性。研究得比较好的还有葛首霜霉病菌和水稻稻瘟病菌葛食霜霉病菌属卵菌，专性寄生，遗传分析表明有13个显性无毒基因与寄主中冷个抗病显性位点相匹配。其中avrs已证明是上位显性，编码一种抑制子。
与无毒基因连锁的限制性片段长度多态吐标记已经建立，以此为起点的染色体巡查正在进行，并以用RFLP探针(G538)鉴定出6 Morgan)16OKb的无毒基因avr6的连锁片段。主要问题是，卵菌与子囊菌和担子菌不同，表达载体需要构建，DNA向无性抱子和芽管的转化技术需要解决，转化子的选择必需在植物上进行等稻瘟病菌的分子遗传学研究倍受重视，近年来由于利用水稻菌系和画眉草菌系杂交和回交获得对水稻致病的育性后代作为相互亲本，已经鉴定出好几个与不同水稻鉴别品种互补的无毒基因如avrCO39，avrMZOlh和av:IYM等。稻瘟病菌的基因转化要比葛苞霜霉病菌容易，所以RFLP与无毒基因的连锁标记也较容易进行，但相比之下，水稻植物的遗传转化要比葛首困难。因此最终克隆无毒基因和根据相互作用克隆植物抗病基因还有许多工作哥做。病原物无毒基因的产物由于能与寄主抗病基因产物互作，并进而激发寄主防卫反应，所以又称子。激发子可以是无毒基因的直接产物，或间接产物.在后一种情况下，可能包含对植物正常组分的转化。普通激发子是指一种病原菌所有成员产生的，能激发一种植物所有基因型产生防卫反应。小种专化性激发子是指表达一定无毒基因的病菌小种产生的，仅能激发那些表达互补抗病基因
5.植物抗病基因
植物抗病基因的分子克隆已进行了10多年。分子遗传学家没计了许多可行的策略，坦州年的基因屈指可数。随着分子克隆技术的发展，近年内会有较多的植物抗病基因克隆的报道尽竹如此，克隆抗病基因的工作仍然是难度较大的，无捷径可行。
第一个被克隆的抗病基因是豌豆抗花叶病毒基因。
第二个被克隆的抗病基因是玉米抗圆斑病的基因这个基因。
第三个被克隆的抗病基因是番茄抗叶斑病菌的基因。
6.机制研究的应用前景
了解植物伉病机制的最终目的是为了寻求和制订防治植物病害的新策略和新措施。传统植物病理学对病害侵染循环的研究，为我们针对各种不同病害制订一系列攻克病害发生与流行中薄弱环节的有效措施提供了依据。植物抗病分子机制是研究寄主一病原微生物相互作用遗传学的重要组成部分，其中既有微生物的遗传改良问题，也有农作物的遗传改良问题。从应用前景考虑则具有当前、近期和中期的实践意义，对预测植物病害的灾变过程，制订防病新策略和开发防病新技术、新产品具有指导意义。
植物抗病基因在进化中形成了几种共有的进化形式
植物抗病基因在进化中形成了几种共有的进化形式。植物祖先抗病基因的复制创造了新基因座。基因间和基因内重组导致了变异，也导致了新特异性抗病基因的产生。另外，与特异性识别相关的富含亮氨酸重复区顺应于适应性选择。同样，类转座元件在抗病基因座中的插入加速了抗病基因的进化。随着抗病基因的进化，抗病反应也呈现出多样化，代表着植物与病原物动态进化的不同阶段。 几种抗病基因进化模式得到提出。重复拷贝对创造新的抗病基因起着重要的作用。抗病基因的复制与随后序列的差异性能创造或扩大基因家族中另一基因簇。不对等重组与基因转化（基因内）创造了基因数量上的多样性。基因外重组与基因转化能创造新的特异性抗病基因。而有的这些重组事件发生在高保守区域上。LRR区域的多态性为识别、配位及防卫大量病原物提供了进化优势。转座元件插入到某些抗病基因座中造成基因断裂或染色体重排，加速了抗病基因的进化。基因座内的过多重组将导致抗病基因特异性丧失，而寄主植物与病原物不断相互作用——双方相互施加压力并不断适应与反适应于选择压力，进行着协同进化，那么抗病基因就必须维持着序列的特异性。实际上，抗病基因的进化是基因变异与基因序列保守性之间的平衡。在抗病基因不断进化的推动下，抗病基因控制下的抗病反应表现出多样化（如过敏性反应、非过敏性反应、系统过敏性反应以及极度抗病等），不同类型的抗病反应代表着植物与病原物动态进化的不同阶段。有关与抗病基因的进化研究还存在一定困难，涂礼莉等人借助其他物种已获得的信息，利用生物信息学的方法来研究海岛棉抗病基因的抗病机制及抗病基因进化。这种研究方法可能也适用于其他农作物，可以说对抗病机制的研究、抗病基因的转育及抗病基因进化的研究具有重要的意义。 近年来抗性基因研究的突破性进展、抗性基因的克隆和序列分析所揭示的其编码蛋白的组 成、拓扑学和亚细胞定位等特征,为揭开抗性基因的作用特点提供了线索。一般来讲,基因克 隆的策略可分为两种:正向遗传学途径和反向遗传学途径。前者以欲克隆的基因所表现的功 能为基础,通过鉴定其产物或某种表型的突变进行,如功能克隆( Functional Cloning) 和表 型克隆( Phenotype Cloning) ;后者则着眼于基因本身特定序列或者在基因组中的特定位 置进行,如定位克隆( Positional Cloning) 和序列克隆( Sequence Cloning) 。
植物基因工程实验技术
植物基因工程实验技术
编者: 赵 燕
主审: 张学文
湖南农业大学植物科学实验教学中心
2007 年 4 月
前
言
基因工程是现代生物技术的核心, 也是现代分子生物学研究的重 要手段. 掌握基因工程技术对于生物技术专业及其它生物学相关专业 学生都很重要. 基因工程本身是由一系列分子生物学操作技术组成的系统性技 术体系,本实验指导侧重于 DNA 重组操作,将基因工程操作的常用 和核心技术组织起来, 以为我校生物技术本科生及有关专业研究生基 因工程实验提供简单而明确的指导. 为适应基因工程的飞速发展,一些生物技术公司匠心独运,开发 出专门的试剂盒,使一些复杂的实验操作简单化了.这对于实验者来 说自然是好事,但也使实验者动手胜于用脑.对于实验人员来说,一 定应知其然并知其所以然, 才会在实验中运用自己的知识予以创新性 的发展.期望本实验指导不成为实验中的教条.
编
者
2007 年 4 月
1
目
实验一 实验二 实验三 实验四 实验五 实验六 实验七 实验八 实验九 实验十 附录:
录
大肠杆菌的对照培养,单菌落的分离及菌种保存 ...............3 强碱法小量制备质粒 DNA.....................................................5 琼脂糖凝胶电泳......................................................................7 植物总 DNA 的提取,纯化和检测 ........................................9 DNA 的 PCR 扩增................................................................. 11 植物总 RNA 的分离 .............................................................15 RT-PCR..................................................................................17 体外重组分子的构建,筛选及检测.....................................21 植物表达载体的构建,筛选及检测.....................................22 植物遗传转化技术 ................................................................23 实验中常用的仪器与器皿 .....................................................24
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植物与病原菌互作和抗病性的分子机制
中国农业科学 1999,32(增刊):94～102 Scientia A gricultrua Sinica 植物与病原菌互作和抗病性的分子机制3 刘胜毅1 许泽永1 何礼远2 (1中国农业科学院油料作物研究所,武汉 430062;2中国农业科学院植物保护研究所) 提要 概述了近几年在寄主植物抗病基因与防卫反应基因、病原菌毒性基因、寄主抗病性机制和抗病基因工程策略等方面取得的主要进展,重点分析了抗病反应的一般过程、毒性基因 产物胞外水解酶和毒素的作用与关系、作物抗毒素基因工程策略。 关键词 植物;抗病基因;防卫基因;毒性基因;基因工程策略 早在40年代末50年代初,F lo r(1947;1955)在对亚麻和亚麻锈菌互作的遗传规律研究中,提出了基因对基因假说(gene2fo r2gene hypo thesis)〔4,5〕,这标志着对植物与病原菌互作的认识深入到了基因水平,从而为应用分子生物学手段研究植物抗病性奠定了基础。本文概要地综述近几年在寄主植物抗病基因、病原菌致病基因、寄主抗病机制等方面取得的主要进展,并试图侧重分析概括抗病反应的一般过程及毒素的作用与基因工程策略。 1 抗病相关基因 根据基因的作用性质,可把抗病反应过程中起作用的基因分为两类:抗病基因和防卫反应基因。抗病基因是决定寄主植物对病原菌的专化性识别,并激发抗病反应的基因。即按F lo r的基因对基因理论,它与病原菌的无毒基因互补;按Keen(1990)提出的用来解释基因对基因理论分子机制的配体2受体模型〔6〕,它的产物是抗病反应信号传导链的起始组分,即信息链的前端,当它与病原菌的无毒基因直接或间接编码产物互补结合后,启动信号传导激发植物的抗病反应。防卫反应基因是一类在抗病机制中最终起作用的基因,它们的编码产物直接或间接地作用于病原。除此之外,抗病基因和防卫反应基因的区别还有:(1)抗病基因编码产物具有特异性,而防卫反应基因编码产物具有普遍性,即不同的寄主植物中有一套类似的防卫反应基因,如植保素合成链中的酶基因、病程相关(PR)蛋白基因、植物细胞壁成分合成酶基因等。(2)抗病基因产物是植物防卫反应基因表达的直接或间接调节因子。防卫反应基因一般是受病原菌诱导表达的,编码产物比较容易分离的一类基因,而抗病基因是组成型表达的,编码产物不容易分离的一类基因。因此在基因克隆、基因编码产物的结构和功能分析等方面的研究工作中,防卫反应基因均早于抗病基因。所以植物防卫基因既有普遍性,又有特殊性。除有一部分是相似的外,还有一部分是不同的,如对真菌、细菌毒素的解毒基因,因毒素不同而不同。而人工赋予植物的解毒基因则可能更加不同,有动物源的,也有微生物源的。 1.1 抗病基因 接收病原菌信号,启动植物抗病反应信号转导的是植物抗病基因的编码产物,这是分子植物病理学研究寄主植物的重点和难点。自1992年应用转座子标签法分离出第一个抗病基 收稿日期 1999207215
转基因作物对生物多样性的影响
转基因作物对生物多样性的影响 张永强，赵志模 （西南大学植保学院， 重庆 400716） 摘要：转基因作物是为了提高农作物的产量和品质或者是为了抵抗病虫害。目前转基因技术得到广泛应用，并获得极大成功。然而经过基因饰变的作物对非目标生物也有一定的影响。许多人在认可转基因作物的同时，也认为，目的基因在自然环境中的存在和发展可能会改变生态环境中的物种组成，加快许多濒危物种的灭绝速度，对生物多样性构成潜在威胁和影响。本文例举了一些最近发表的有关转基因作物对生物多样性影响的研究结果。从中可以看出，对转基因作物的研究仍是热点课题之一，但是对转基因作物对生物多样性的影响说法不一。笔者更倾向于认为转基因作物对生物多样性的影响是利大于弊。 关键词：转基因作物；生物多样性 转基因作物(transgenic crops)是指利用生物转基因技术，将从动物、微生物、人类、远缘植物中提取的或人工合成的目的基因导入作物细胞或组织，并使其表达而产生理想性状的作物。其目的为了提高农作物的产量和品质或者是为了抵抗病虫害。将抗病虫害基因引入作物中，提高作物的抗病性；通过基因修饰可以提高作物吸收养分的能力；可以增强作物在逆境中的生态适应性。目前，转基因技术得到广泛应用，并获得极大成功。 然而经过基因饰变的作物对非目标生物也有一定的影响。如种子休眠期的改变、种子萌发率的提高、对有害生物和逆境的耐受性以及作物具有的生长优势，都有可能提高转基因作物的生存和繁殖力，使其可能成为入侵性杂草，它能够在引入的持续存在并能入侵及改变其他栖息地，从而增加转基因作物的入侵性，破坏自然种群平衡，影响生物多样性，对经济和生态系统将造成严重后果。许多人在认可转基因作物的同时，也认为，目的基因在自然环境中的存在和发展可能会改变生态环境中的物种组成，加快许多濒危物种的灭绝速度，对生物多样性构成潜在威胁和影响。 1 目前获得的转基因作物类型 据报道，目前全世界已分离植物目的基因近百个，获得转基因作物近200种，进行商业化生产的作物有50多个，主要有以下类型： 1.1 抗除草剂转基因作物 这是种植面积最大的转基因作物类型，目前涉及的除草剂主要有草甘膦、草铵膦、磺酰脲类、咪唑啉酮类、溴苯腈、2，4-D等，已进行商业化生产的作物有烟草、大豆、玉米、棉花、油菜、向日葵、甜菜、小麦、亚麻、水稻等。其中以抗除草剂大豆、玉米、棉花种植面积最大。 1.2 抗虫转基因作物 一类是最早被利用的杀虫基因——苏云金芽孢杆菌Bt晶体毒素蛋白基因，对鳞翅目昆虫有毒，相继在棉花、玉米、水稻、烟草、番茄、马铃薯等作物中转基因成功；另一类是胶蛋白酶抑制剂基因，可抑制蛋白酶活性，干扰害虫消化作用而导致其死亡。现已从菜豆中分离出丝氨
农杆菌介导的植物转基因技术实验指导
农杆菌介导的植物转基因技术 一、实验目的 1 了解低温离心机、恒温振荡培养箱、超净工作台等仪器的使用。 2 学习真核生物的转基因技术及农杆菌介导的转化原理；掌握农杆菌介导转化植物的实验方法，了解转基因技术的操作流程。 二、实验原理 农杆菌是普遍存在于土壤中的一种革兰氏阴性细菌，它能在自然条件下趋化性地感染大多数双子叶植物的受伤部位，并诱导产生冠瘿瘤。农杆菌通过侵染植物伤口进入细胞后，可将 T-DNA插入到植物基因组中。因此，农杆菌是一种天然的植物遗传转化体系。人们将目的基因插入到经过改造的T-DNA区，借助农杆菌的感染实现外源基因向植物细胞的转移与整合，然后通过细胞和组织培养技术，再生出转基因植株。 实验一培养基配制 一、仪器和试剂 1、仪器：高压灭菌锅，超净工作台 2、药品：Beef extract （牛肉浸膏） 5g/L ，Yeast extract （酵母提取物） 1g/L ，Peptone （蛋白胨） 5g/L ，Sucrose （蔗糖） 5g/L ，MgSO4.7H2O 0.4g/100ml ，Agar （琼脂）1.5g/100ml，MS粉，有机溶液，肌醇，Fe盐，NAA（萘乙酸），6-BA （6-苄氨基腺嘌呤），卡那霉素（kan），利福平（rif ），链霉素（str ）。 二、实验方法 第一组配制YEB固体培养基 1、配制250mlYEB固体培养基：先称取1.25g Beef extract （牛肉浸膏）； 1.25g Peptone （蛋白胨）；0.25g Yeast extract （酵母提取物）；1.25g Sucrose
（蔗糖）;1g MgS04.7H2O琼脂粉3.75g ;将上述药品置于250ml三角瓶中，用量筒称取 200ml蒸馏水将其溶解混匀，然后再定容至250ml,用NaOH调pH=7.4。 2、灭菌：将盛有250ml 培养基的三角瓶封口，在三角瓶表面写清培养基名称，用高压灭菌锅进行灭菌。 3、抗生素的加入：高压灭菌后，待培养基温度降到50-60 C时（手可触摸）加入已经过滤好的抗生素（100用/ml kan+50⑷/ml Str+ 50旧/ml rif ）,以免温度过高导致抗生素失效。 4 、倒板：将抗生素与培养基混匀，每个平皿倒15ml 培养基，可以倒16个平皿，倒完后打开平皿盖，在紫外灯下照10min,等待培养基凝固，盖上平皿盖，封口备用。 第二组配制YEB液体培养基 1、配制500mlYEB液体培养基：先称取2.5g Beef extract （牛肉浸膏）;2.5g Peptone （蛋白胨）; 0.5g Yeast extract （酵母提取物）; 2.5g Sucrose （蔗糖）; 2g MgSO4.7H2O将上述药品置于500ml三角瓶中，用量筒称取450ml蒸馏水将其溶解混匀，然后再定容至500ml，用NaOH调pH=7.4。 2、灭菌：将盛有500ml 培养基的三角瓶封口，在三角瓶表面写清培养基名称，用高压灭菌锅进行灭菌。 3、抗生素的加入：高压灭菌后，待培养基温度降到50-60 C时（手可触摸）加入已经过滤好的抗生素（100用/ml kan+50⑷/ml Str+ 50旧/ml rif ），以免温度过高导致抗生素失效。 4 、分装：将培养基分别分装到试管和三角瓶中，每个试管中分装5ml，分 装12个试管。每个三角瓶中倒入35ml，共12个三角瓶。 5、分装好后，封口备用。 第三组配制MS液体培养基 1、配制500mlMS液体培养基：先在500ml三角瓶中加入400ml蒸馏水，称取2.15gMS 粉置于蒸馏水中，搅拌均匀；再向其中加入5ml 100倍Fe盐浓缩液；5ml100倍肌醇浓缩液；5ml有机溶液的混合液，然后混匀定容至500ml,用NaOH 调pH=5.8。
植物抗病基因研究进展
植物抗病基因研究进展 摘要:植物抗病基因的研究是目前植物病理学科的热点及难点之一。近年来，通过基因工程技术培育抗病毒植物已经成为抵抗植物病毒的有效手段。本文简要讨论了近年来植物抗病毒基因工程的方法策略, 并对植物抗病基因工程的研究取得的成绩、存在的问题及展望进行了简介。 关键词植物病毒、抗病基因、基因工程、前景 一、植物抗病基因工程原理 植物抗病基因工程指的是用基因工程（遗传转化）的手段提高植物的抗病能力，以此获得转基因植物的方法。植物抗病基因工程主要包括：抗病及其他相关基因的分离和克隆、与合适的载体及标记基因构成适于转化的重组质粒、用不同的转化方法向受体植物导入重组质粒、筛选转化因子并鉴定转基因植株。此外，还有一种可以获得抗病转基因植物的方法即把具有抗病能力的植物或微生物的DNA 直接导入受体植物，从后代中筛选具有抗病能力的个体，经过稳定转化得到转基因抗病植株。 植物病毒每年给世界各地的农作物生产造成严重损失，每年全世界的农作物因病毒侵害的损失数百亿美元，传统的防治方法已远远无法满足现代农业的生产要求。病毒侵染之所以复杂，在于一方面病毒的高突变率所致的植物抗病品种抗性丧失速度远高于常规植物抗病育种速度；另一方面病毒在隐症野生植物中的储存；第三，无亲缘关系的病毒复合侵染以及病毒侵染的持久性，特别是以线虫和真菌传播的植物病毒能在土壤中存活许多年。因此，在适宜病毒介体生长的温度条件下，大面积连作缺乏抗病基因的植物，造成的经济损失会更高。Hamilton[1]于 20 世纪 80 年代初首先提出了基因工程保护的设想，在转基因植物中表达病毒基因组序列可能是防御病毒侵染的途径之一。近 20 多年来，基因工程的发展，为防治病毒病开辟了新途径。 二、利用非病毒来源的基因策略 1.植物自身基因介导的病毒抗性 一些植物在病毒侵染的时会启动主动防御机制，最普遍最常见的主动防御机制就是通常所说的过敏反应，也就是那些最初被病原侵染点周围的细胞发生程序性死亡最终在病原最初侵染点周围形成坏死斑。如番茄中的 Tm-1 或 Tm-2 和Tm-22基因，马铃薯的 Rx，Ry，烟草中的 N 基因等等[2]。这类基因通常称为 R 基因。根据其抗性水平的不同还分为：真实免疫指病毒复制完全不能发生、阈下侵染指病毒的复制仅局限于受侵染的细胞。不管 R 基因是在模式植物还是在
植物抗病、抗虫及抗除草剂基因与基因工程
植物抗病、抗虫及抗除草剂基因与基因工程 张永强 （西南大学植物保护学院， 重庆 400716） 摘 要：病虫草害历来是植物保护工作的重中之重，农药为病虫草害防治立下了汗马功劳。近来由于大量使用、滥用农药给环境带来了巨大的负面影响。20世纪70年代兴起的基因工程为这一问题的解决带来了新的途径。本文就植物抗病基因分类、最新报道的相关基因；抗虫基因的来源、最新报道的抗虫基因及试验结果；抗除草剂基因以及基因工程技术在现代农业中的应用予以综述。 关键词：植物抗病；植物抗虫；抗除草剂；基因工程 农药伴随人类改造自然，征服自然已经有100多年的历史，在促进农业发展和对人类发展做出卓越贡献的同时，也不可避免的带来许多负面影响，如：对非靶标生物的毒害、对环境的污染、对生态系统的破坏以及病虫草抗药性的产生等。特别是化学农药对动物和人类健康的影响，已经成为全人类普遍关心和急需解决的全球性问题。诞生在20世纪70年代的基因工程技术为这些问题的解决提供了一条新的途径。进入20世纪90年代具有实用价值的转基因生物品种因其诸多的优势，逐渐被人们所接受，而迅速走向商品化和产业化。 1 植物抗病基因与基因工程 植物受病原菌侵染时，会诱导相关的基因产生一系列参与植物防御反应的拮抗物质，阻止病害的传播和病原菌的进一步侵入。将这些参与植物防御反应的相关基因导入植物，使其在植物体内表达，可以提高植物的抗病能力。植物抗病基因在进化中形成了几种共有的进化形式。植物祖先抗病基因的复制创造了新基因座。基因间和基因内重组导致了变异，也导致了新特异性抗病基因的产生；另外，与特异性识别相关的富含亮氨酸重复区顺应于适应性选择；同样，类转座元件在抗病基因座中的插入加速了抗病基因的进化（庄军等，2004）。 1.1 植物抗病基因的分类 植物中许多抗病基因已被克隆，根据抗病蛋白（R蛋白）将抗病基因（R基因）分为以下几类。第一类，玉米抗圆斑病的基因Hml，其编码的解毒酶能钝化病原真菌所产生的HC 毒素，代表着抗病基因中与病原物亲和性因子作用的一类基因。 第二类，番茄抗细菌叶斑病的基因pto，其编码蛋白Pto是一种丝氨酸/苏氨酸激酶。AvrPto 蛋白是病原菌假单胞杆菌Pseudomonas进入植物细胞中通过Ⅲ型分泌系统分泌的，现已证实Pto激酶噜噗结构域中204位苏氨酸决定着Pto对AvrPto的特异性识别。具有自动磷酸化能力的Pto激酶与AvrPto相互作用从而产生了过敏性反应。 第三类抗病基因所编码的蛋白显示出与细胞间信号转导蛋白具有结构相似性。这些蛋白所共有的基元是富含亮氨酸重复序列（Leucine-rich repeat，LRR），一般由24个氨基酸残基组成，其共同蛋白序列是LXXLXXLXXLXLXXNXLSGXIPXX（氨基酸的单字符号，X代表任何一种氨基酸）。这一类型基因的共同结构是LRR-TM，它们编码的蛋白包括胞外N端LRR 重复区、膜锚定蛋白和胞质内C末端部分（如图1所示）。 第四类是水稻抗白叶枯病Xanthomonas oryzae pv．oryzae，Xoo的基因xa27。这一基因所编码的Xa21蛋白具有3个受体激酶特征的主要结构域：胞外LRRs结构、跨膜结构域及胞内激
浅议转基因植物的利弊
浅议转基因植物的利弊 摘要：20世纪后期，生物工程迅速发展，给人类生活带来了巨大的变化。有人说，生物工程给人类带来了更大的希望，也有人说，它也会给人类带来灾难。其中，植物转基因工程更是如此。植物基因工程又称植物转基因技术，是通过各种物理的、化学的和生物的方法将从动物、植物及微生物中分离的目的基因整合到植物基因组中，使之正确表达和稳定遗传，并且赋予受体植物预期形状的一种生物技术。 关键词：转基因植物安全性 1、转基因植物的利用 1.1抗除草剂的转基因植物 化学除草剂在现代农业中起着十分重要的作用，理想的除草剂必须具有高效、广谱的杀草能力，二队作物及人畜无害。但这样的除草剂陈本越来越高，通过转基因技术，在作物中导入抗除草剂基因，获得抗除草剂作物，就能有效地解决这些问题，提高经济效益，使除草剂的应用更加方便。据报道，现已成功地获得了转aroA基因的番茄、油菜、大豆、杨树等，在田间试验中表现出对除草剂的良好抗性。 1.2抗虫的转基因植物 虫害对农业生产的危害非常严重，如能在植物体内转入抗虫基因，使植物获得抗虫性，增加对虫害的抵抗力，将对农业生产具有重要意义。基于这个目的，人们现已成功地将苏云金芽孢杆菌的B.t毒蛋白基因转入了烟草、番茄、马铃薯、甘蓝、棉花、杨树等植物，使这些植物获得了抗虫性。 1.3抗病的转基因植物 据报道，讲烟草花叶病毒（TMV）、黄瓜花叶病毒（CMV）、马铃薯X和Y病毒（PVX 和PVY）、大豆花叶病毒（SMV）、苜蓿花叶病毒（AIMV）等病毒的外壳蛋白基因导入不同的植物体后，这些植物均获得了对相应病毒的抗性，这有望应用于农业生产。 1.4抗逆的转基因植物 小分子化合物（如脯氨酸。甜菜碱、葡萄糖等）与植物忍受环境渗透胁迫的能力有关。人们若能将与脯氨酸或甜菜碱等合成有关的酶的基因克隆后转入植物，有望提高植物对干旱和盐碱等逆境的抗性。有报道说，人们现已成功地将相关基因转入了烟草、苜蓿、马铃薯等植物，使它们获得了对不同逆境的抗性。 1.5植物生物反应器产生药物蛋白 生物反应器是指利用生物系统大规模生产有重要商业价值的外源蛋白质，用于医疗保健和科学研究。将不同的基因转入植物，可使转基因植物产生植物抗体、口服疫苗、植物药物和人类蛋白质等。据报道，到目前为止，人们已经成功地获得了4种具有潜在医疗价值的植物抗体。 2、转基因植物存在的风险 2.1转基因植物对生态环境的潜在风险 在耕地上栽种的那些实验室里培育出来的转基因植物可能会对生态环境造成许多负面影响，转基因植物对非目标生物可能造成危害，转基因植物通过基因漂变对其他物种也可能产生有害影响。 2.2对人类健康的潜在危害 转基因食品里的新基因可能对消费者造成健康威胁，因为转基因植物是在传统植物接受了动物、植物、微生物的基因的基础上形成的，所以很可能对人类健康产生影响。人们正在关注这样一些问题：毒性问题、过敏反应问题、对抗生素的抵抗作用问题、营养问题等。
转基因植物的安全性评价.
1转基因植物安全评价的意义 转基因植物育种,是利用遗传工程的手段,有目的地将外源基因或DNA构建导 入植物基因组,通过外源基因的直接表达,或通过对内源基因表达的调控,甚至通过直接调控植物相关生物如病毒的表达使植物获得新的性状的一种品种改良技术,可最大限度地满足人类的需要[1]。 与此同时,转基因技术使物种的进化速度远远超过生物自然变异与选择的速度,对于这种急剧的生物物种变化,自然界能否容纳和承受?自然界的其他组成部分是否会因此受到伤害或破坏?转基因植物及其产品被人们食用时,是否会向人体肠道微生物发生基因转移?是否会出现由于某种新物质的形成对人体健康产生危害或潜在影响?要消除这些疑虑就要进行转基因植物的安全性评价。要经过合理的实验设计和严密科学的实验程序,积累足够的数据,根据这些数据判断转基因植物的大田释放和大规模商业化生产是否安全,对实验证明安全的转基因植物正式用于农业生产,对存在安全隐患的加以限制,避免危及人类生存及破坏生态环境[2]。因此,制定科学完善的安全性评价的原则与方法,对确保人类健康和环境安全及转基因技术的健康发展具有十分重要的意义。 2转基因农产品安全评价的内容 2.1转基因植物的环境安全性 转基因植物的环境安全性评价要解决的核心问题是转基因植物释放到田间后是否会将基因转移到野生植物中;是否会破坏自然生态环境,打破原有生物种群的动态平衡[2]。 转基因植物演变为农田杂草的可能性:转基因植物可通过传粉进行基因转移,可能将一些抗虫、抗病、抗除草剂或对环境胁迫具有耐性的基因转移给近缘种或杂草,如果杂草获得了这些抗性,就会变成超级杂草,使农田杂草难以控制。 基因漂移到近缘野生种的可能性:在自然生态条件下,有些栽培植物会和周围生长的近缘野生种发生天然杂交,从而将栽培植物中的基因转入野生种中。在进行转
植物抗病基因研究进展
植物抗病基因研究进展 摘要：植物抗病基因在植物抗病过程中起重要作用。综述了植物抗病基因的克隆方法，结构特点，作用机制以及未来的发展前景。 关键词：R-基因；克隆方法；结构特点；作用机制 Advance on Plant Resistance Gene Research Abstract：R gene played an important role in defending the disease. This paper reviewed the gene cloning，structure characteristic，function mechanism and the foreground of R gene. Key words：R gene，gene cloning，structure characteristic，function mechanism R基因在植物的病害防御过程中起着非常重要的作用。植物时刻受到周围各种潜在病原菌的侵染。一旦病原菌侵入植物表皮，将遇到R基因和avr基因的互作，即植物的非寄主抗病性[1]。随之所产生的现象包括局部细胞坏死(过敏性细胞死亡)，木质素和胼胝质形成，以及所有与抑制病原菌生长和病害发生相关的抗菌物质产生。病原菌还有可能通过不同的途径赋予植物长期的系统抗性诱导系统免疫，使植物能抵抗其他相似病原菌的侵染[2]。随着分子生物学的发展，更多的植物抗病基因克隆方法及作用机制逐渐为人们所发现，也有更多的植物抗病基因的功能得到了证实。 1 R基因的克隆方法 1) 表型基因克隆法：利用表现型差异或组织器官特异表达产生的差异来克隆植物基因就是表型克隆。表型克隆在策略上试图将表型基因与结构基因表达的特征联系起来，从而分离特定的与表型相关的基因，力求不必事先知道基因的生化功能或图谱定位，根据基因的表达效应就能直接分离该基因。 2) 转座子标签技术：转座子标签技术是比较经典的方法，是将转座子或T-DNA插入到欲分离基因的内部，基因发生突变而被标识，然后利用插入2个和小麦(Triticum aestivum)1 个(表1)[5]。 尽管R基因之间的序列同源性很低，但是这些R基因编码的蛋白也具有一些相似的结构特征，根据这些结构特征，已经克隆的R基因可以分为5个大类：
五种常用的植物转基因技术
五种常用的植物转基因技术 杂粮作物2010 . 30(3):186～189RainFedCrops''…… 文章编号:1003—4803(2010)03—0186—04 五种常用的植物转基因技术 汪由,吴禹,王岩,李兆渡,王光霞 (1.辽宁省农业科学院创新中心,辽宁沈阳110161;2.沈阳市东陵区白塔街道办事处,辽宁沈阳110167) 摘要:从原理,基本步骤和优缺点等几个方面对农杆茵介导法,基因枪法,超声波介导法,子房注射法和花粉管 通道法等5种常用的植物转基因技术进行了简要介绍. 关键词:农杆菌介导法;基因枪法;超声波介导法;子房注射法;花粉管通道法;原理;基本步骤;优缺点 中图分类号:$336文献标识码:B 植物转基因技术是通过各种物理的,化学的和生物的 方法将从动物,植物及微生物中分离的目的基因整合到植 物基因组中,使之正确表达和稳定遗传并且赋予受体植物 预期性状的一种生物技术方法.1983年,首例抗病毒转 基因烟草的成功培育标志着人类开始尝试利用转基因技 术改良农作物.目前,植物转基因技术已在作物改良和育 种领域发挥了重要作用.通过植物转基因技术,一些来自 于动物,植物及微生物的有益基因如抗病/虫基因,抗非生 物胁迫性状基因及特殊蛋白基因已被转化到农作物中以 改良现有的农作物和培育新的农作物品种.以DNA重组 技术为基础的植物转基因技术极大地扩展了基因信息的 来源,打破了远缘物种间自身保持遗传稳定性的屏障.植
物转基因技术已应用到玉米,水稻,小麦,大豆和棉花等许多农作物.同时,该技术也正在被尝试用于茄子和草莓等其它的作物中"J.目前,根据转基因植物的受体类型, 植物转基因方法可以分为3大类:以外植体为受体的基因转化方法,如农杆菌介导法,基因枪法和超声波介导法;以原生质体为受体的基因转化方法,如聚乙二醇法,电击法, 脂质体法及磷酸钙?DNA共沉淀法;以种质系统为受体的基因转化方法,如子房注射法和花粉管通道法j.由于以 原生质体为受体的基因转化方法有原生质体培养难度大, 培养过程繁杂,培养工作量大且培养技术不易掌握;原生质体再生植株的遗传稳定性差,再生频率低并且再生周期长;相关的转化方法的转化率低,效果不理想等缺点,所以该类基因转化方法未被作为植物转基因的常规方法广泛使用.本文将对农杆菌介导法,基因枪法,超声波介导 法,子房注射法和花粉管通道法的原理,基本步骤和优缺点作以简要介绍. 1以外植体为受体的基因转化方法 1.1农杆菌介导法 农杆菌介导法是最早应用,最实用有效并且具有最多 成功实例的一种植物转基因方法J.农杆菌是一类普遍 存在于土壤中的革兰氏阴性细菌.目前,用于植物转基 因介导的农杆菌是根癌农杆菌和发根农杆菌.某些根癌 农杆菌和发根农杆菌分别含有大小为200—800bp的结构和功能相似的质粒和Ri质粒J.Ti质粒和Ri质粒含 有3个功能区:参与农杆菌侵染植物过程的vir区,参与农杆菌基因整合到宿主植物基因组过程的T-DNA区,在农杆菌中启动质粒复制的orj区.在vir区上的vir操纵子群作用下,rrj质粒和Ri质粒能将自身的T-DNA转入宿主植物细胞内,而后将T—DNA整合到植物基因组中J.T-
植物基因工程
一从现代农业到基因工程 (一)粮食安全现状 1、食物总量供给已成为全球的焦点之一： 从2000年开始，全球出现了当年粮食生产量比消费量低的情况，2003年全世界粮食的消费量超过生产量0.93亿吨，世界粮食储备也降低到30年来的最低水平。 1999年以来，我国粮食连续四年减产。1999-2002年，我国粮食总产量累计减少800亿公斤左右。自2000年以来，我国粮食年消费需求大致在4.8-4.9亿吨之间，产需缺口约400亿公斤。 (二)农业发展的一个主要矛盾——科技支撑能力不强 农业生产的规模化、专业化和多样化对科技提出了更高的要求，大幅度提高农业劳动生产率需要通过先进适用技术的广泛应用，而目前我国科技进步贡献率只有45%左右，与发达国家的70-80%有很大的差距。 一个农业劳动力养活的人口数： 美国：70人； 日本：约25人； 中国：4-5人。 农业发展的根本出路是现代农业，而其核心支撑条件是现代农业科技的进步。 (三)现代农业的内涵 现代农业是以现代工业和科学技术为基础，重视加强农业基础设施建设，充分汲取中国传统农业的精华，根据国内外市场需要和WTO规则，建立起采用现代科学技术、运用现代工业装备、推行现代管理理念和方法的农业综合体系(引自卢良恕院士)。 (四)建设农业科技创新体系是现代农业的一个根本任务 国家级农业科研工作应具有较强的关键性、全局性、基础性、战略性和前瞻性的特点，为加快现代农业建设提供科技支撑。省级有关农业的科研机构应逐步实行联合，重点开展应用研究和开发研究(也可根据需要适当开展应用基础研究)，重视科技成果转化，更好地为发展生产服务(引自卢良恕院士)。 到2030年，我国人口的持续增长将要达到高峰期，预计达到16亿人口，解决这个庞大人口的口粮是一个新的挑战。 随着人民生活水平的提高，肉蛋奶和水产品的消费不断增加，粮食作为饲料的比重将越来越大，人均粮食占有量的标准应有所提高。 2、食品安全性也成为全球的焦点之一： 农业综合措施、现代农业技术尤其是转基因技术的应用，使老百姓对当前食品尤其是转基因食品安全性问题十分关心。 (五)农业科技创新的一个核心内容：良种创新 农业科技创新的核心：良种+良法。良种对增产的作用所占的比重越来越大，良种是一个先进技术的集合体。 良种创新：植物良种创新、动物良种创新。植物食品占总食品的93%，动物食品占7%，但也间接来自植物食品，所以良种创新的首要任务是植物良种创新。 (六)传统育种面临的挑战 以杂交育种为核心的传统育种技术取得了丰硕的成果，目前仍然是主要作物的主要育种手段。目前传统育种技术在改良作物性状方面遇到了一些挑战，如缺乏特别性状的种质资源，育种周期长，难以克服不良性状的连锁或负相关，易受杂交不亲和及杂种不育的限制，远缘物种间不能进行遗物物质交流和性状转移。 (七)基因工程带来的机遇与竞争 20世纪50年代以来，DNA双螺旋模型和基因操纵子学说的提出，以及DNA限制性内切酶的发现，导致了DNA体外重组技术?a?a基因工程技术的发展，推动了分子生物学和基因工程本身在广度和深度方面以空前的速度蓬勃发展，生物技术相关产业和生命科学已经出现划时代的
常用的植物转基因技术
五种常用的植物转基因技术 植物转基因技术是通过各种物理的、化学的和生物的方法将从动物、植物及微生物中分离的目的基因整合到植物基因组中，使之正确表达和稳定遗传并且赋予受体植物预期性状的一种生物技术方法。1983年，首例抗病毒转基因烟草的成功培育标志着人类开始尝试利用转基因技术改良农作物。目前，植物转基因技术已在作物改良和育种领域发挥了重要作用。通过植物转基因技术，一些来自于动物、植物及微生物的有益基因如抗病／虫基因、抗非生物胁迫性状基因及特殊蛋白基因已被转化到农作物中以改良现有的农作物和培育新的农作物品种。以DNA重组技术为基础的植物转基因技术极大地扩展了基因信息的来源，打破了远缘物种间自身保持遗传稳定性的屏障。植物转基因技术已应用到玉米、水稻、小麦、大豆和棉花等许多农作物。同时，该技术也正在被尝试用于茄子和草莓等其它的作物中‘1’纠。目前，根据转基因植物的受体类型，植物转基因方法可以分为3大类：以外植体为受体的基因转化方法，如农杆菌介导法、基因枪法和超声波介导法；以原生质体为受体的基因转化方法，如聚乙二醇法、电击法、脂质体法及磷酸钙-DNA共沉淀法；以种质系统为受体的基因转化方法，如子房注射法和花粉管通道法。由于以原生质体为受体的基因转化方法有原生质体培养难度大，培养过程繁杂，培养工作量大且培养技术不易掌握；原生质体再生植株的遗传稳定性差、再生频率低并且再生周期长；相关的转化方法的转化率低、效果不理想等缺点，所以该类基因转化方法未被作为植物转基因的常规方法广泛使用。本文将对农杆菌介导法、基因枪法、超声波介导法、子房注射法和花粉管通道法的原理、基本步骤和优缺点作以简要介绍。 1以外植体为受体的基因转化方法 1.1农杆菌介导法 农杆菌介导法是最早应用、最实用有效并且具有最多成功实例的一种植物转基因方法。农杆菌是一类普遍存在于土壤中的革兰氏阴性细菌。目前，用于植物转基因介导的农杆菌是根癌农杆菌和发根农杆菌。某些根癌农杆菌和发根农杆菌分别含有大小为200 -800bp的结构和功能相似的Ti质粒和Ri质粒。Ti质粒和Ri质粒含有3个功能区：参与农杆菌侵染植物过程的vir区、参与农杆菌基因整合到宿主植物基因组过程的T-DNA区、在农杆菌中启动质粒复制的ori区。在vir区上的vir操纵子群作用下，Ti 质粒和Ri质粒能将自身的T-DNA转入宿主植物细胞内，而后将T-DNA整合到植物基因组中。T— DNA 是质粒上一段10—30kb的序列，它的两端各有一段高度保守的25bp的同向重叠序列。由于T-DNA 转化无序列特异性，因此可用任何基因片段代替原来的T-DNA基因片段进行。 农杆菌介导法的原理是：在农杆菌基因ehvA，chvB， pscA，and att家族所编码的蛋白和植物伤口产生的酚类物质和糖类物质的共同作用下，农杆菌识别并附着在宿主细胞壁上。virD4和virB基因编码蛋白组成的type IV分泌系统将单链VirD2-T-DNA复合体运送到宿主细胞内。此外，VirE3、VirE2和VirF蛋白也通过该系统进入宿主细胞质中。在宿主细胞质中，VirE2蛋白与VirD2-T-DNA复合体结合。在VirD2核定位信号、某些农杆菌蛋白和宿主细胞蛋白的共同作用下，VirD2-T-DNA复合体进入细胞核。在VirD2、VirE2、某些宿主细胞核蛋白如AtKu80和DNA连接酶的作用下，T-DNA被整合到宿主基因组中，但具体过程不详。 农杆菌介导法的基本步骤是：(1)诱导目标植物外植体；(2)构建含有目的基因的质粒；(3)质粒导人合适的农杆菌菌株中及该菌株的活化过程；(4)植物愈伤组织的微伤口处理及农杆菌侵染；(5)共培养及脱菌处理；(6)愈伤组织筛选、分化与植株再生；(7)再生植株及其后代的外源基因及其表达产物的分子检测；(7)转基因T1代的目标性状鉴定。 农杆菌介导法具有操作简单、转化效率较高、重复性好、单拷贝整合、基因沉默现象少、转育周期
植物转基因原理与技术
植物转基因原理与技术 植物转基因原理与技术 转基因是指通过基因工程技术将外源基因导入到受体细胞中的过程。微生物和动物细胞转基因开展较早，技术也比较成熟，相对动物和微生物转基因来说，植物转基因开展较晚。自1984年获得第一株转基因烟草以来，近二十年的时间里在数百种植物中获得成功。下面就植物转基因的原理和常见技术做一简单介绍。 原理 根据植物细胞能再生成植株的全能性，利用生物媒介或其他物理化学的方法和技术将外源基因导入受体细胞并且整合到基因组中，通过组织培养获得完整植株。在培养过程中为了筛选阳性转基因植物往往采用植物敏感的抗生素进行筛选，最后经过分子生物学和生理方面的检测来鉴定抗性生根的植株是否是真正的转基因植物。以技术为媒介，一个植物转基因系统必然涉及到外源基因和受体细胞。外源基因可以是克隆到质粒等载体中的或是未经克隆的裸露基因。受体细胞根据转基因技术和植物的类型的不同，可以选择外植体，愈伤组织，原生质体等。一个好的转基因受体细胞应该是具有高效稳定的再生能力，并且能接受外源基因的整合，并对选择抗生素敏感的无性繁殖系。植物转基因流程图如下所示。 外植体） 愈伤组织瞬时表达 外源基因植物受体细胞 原生质体 生殖细胞稳定表达 获得抗性生根转基因苗转基因植物的检测和鉴定（PCR, Southern blot ,Northern blot,生理指标鉴定等） 技术 就植物转基因技术而言可以根据转化系统的原理分为三大系统：载体转化技术，直接转化技术和种质转化技术。下面分别叙述。 一载体转化技术 载体转化技术是指通过农杆菌的Ti 或Ri质粒，植物病毒的DNA或RNA等生物载体介导基因进入并整合到植物基因组上的方法。其中土壤农杆菌转化系统是目前研究最为清楚而且转化最成功的方法。病毒载体转化系统的研究也取得一些成就。 土壤农杆菌是一类浸染受伤植物并且形成冠瘿瘤的革兰氏阴性菌。它的致瘤能力来源于存在于细胞内的Ti（tumour-induced）质粒。它利用Ti质粒控制植物细胞来生产自己独特的“食品”- 冠瘿碱，从而将植物细胞转变成特定营养的安全避难所和工厂。Ti质粒长200-250kb，上面分布着四个区：T-DNA(transferred DNA) ,Vir(virulence gene) ,控制结合转移的区域和与冠瘿碱利用有关的基因区。毒力基因即Vir基因控制着转移DNA 即T-DNA向植物细胞转移，T-DNA是唯一整合进植物基因组的区域，它编码植物激素和冠瘿碱合成酶。T-DNA转化植物的过程如下：植物受伤后释放酚类化合物信号分子被位于细胞膜的VirA蛋白感受，VirA蛋白是受配基刺激自身磷酸化的受体，并将磷酸基团转移给Vir区基因调控蛋白因子VirG。VirG 调控着下游基因的表达来完成T-DNA的切割，包装和转移。 天然的Ti质粒因为太大，酶切位点多又诱导产生肿瘤，所以不适合作为载体。经过改造后可以作为基因工程载体，主要是通过破坏或缺失癌基因成为安全载体，太大不适合操作可以通过同源重互换或功能互补来解决。T-DNA整合进植物基因组与其边界序列相关，而与内部序列无关，因此可以将内部控制植物激
转基因植物及其安全性综述
转基因植物及其安全性综述 一，摘要 介绍目前转基因植物概念、常用的植物转基因方法，就转基因植物的生态安全性进行讨论。 二，正文 转基因植物概念：将人工分离和修饰过的基因导人到生物体基因组中，由于导人基因的表达，引起生物体性状的可遗传的修饰，这一技术称之为转基因技术。转基因植物：通过基因转移技术获得的整合有外源基因的植物个体。在过去十多年来，植物学家们已成功地把具有各种新性状的基因转移到了50多种不同的植物上，为农作物育种创造了一个又一个的新品种。 ?每一个植物都有很多基因。基因的本质，就是我们常说的DNA(去氧核糖核酸)。一个基因，在DNA双螺旋结构中占据着一个限定长度的片段。所以要想从供体植物上获得某个决定遗传性状的基囡，只要我们能从供体植物的DNA结构中取出这个基因片段可以了。这个决定遗传性状的基因也称目的基因，将它转化或转移到受体植物上，使它整合到受体植物的染色体上重新组合并使其(目的基因)在再生植株中表达出来，这样就完成了目的基因的传导操作，达到了转基因植物的合成及改造植物性状的目的。 1983年，植物学家首次完成了将一个容易鉴别的抗卡那霉
素基因转移到烟草上的试验，其后代也具有抗卡那霉素的特征。这一开创性的研究成果，为开拓转基因植物的研究与应用展示了广阔的前景。 自此以后，在水稻，玉米，大豆、番茄，马铃薯，烟草，油菜等很多重要的农作物上又得到了转基因植物。如美国孟山都等公司把杀蠋菌的苏云金杆菌的毒素蛋白基因引入到棉花、烟草、番茄和马铃薯等植物上，产生了杀死吃这些作物的蠋幼虫的毒蛋白，培育出了抗虫的棉花，烟草新品种。将毒壳蛋白基因转入苜蓿、黄瓜，烟草等作物，它们可对致命的病毒产生抗性，从而获得了抗花叶病毒感染的抗病植株。 植物转基因方法大致分成两大类，第一类需要通过组织培养再生植株，常用方法有农杆菌介导转化法、基因枪法；另一类方法不需要通过组织培养，目前技术比较成熟的主要有花粉管通道法。 1.农杆茵介导转化法 农杆菌是普遍存在于土壤中的一种革兰氏阴性细菌，分根瘤农杆菌和发根农杆菌两种，其细胞中分别含有Ti质粒和Ri 质粒，其上有一段T-DNA，通过侵染植物伤口进入细胞后，可将T-DNA插入到植物基因组中。因此，农杆菌是一种天然的植物遗传转化体系。农杆菌介导法起初只被用于双子叶植物中，但近年来，农杆菌介导转化在一些单子叶植物(尤其是日益作为模式植物的水稻中也已经得到了广泛应用和认可，这是该领域