猪血抗菌肽的分离与生物学特性分析
分类号：单位代码：10019
密级：学号：S0*******
硕士学位论文
猪血抗菌肽的分离纯化及部分
生物学活性研究
Studies on Isolation, Purification and Biological Activity of
Antibacterial Peptides From Swine Blood
研究生：张艳梅
指导教师：佘锐萍教授
合作指导教师：
申请学位类别：农学硕士
专业领域名称：基础兽医学
研究方向：动物黏膜免疫细胞及分子病理学
所在学院：动物医学院
2008年5月
本研究由国家自然科学基金
(项目编号：30471301) 和高等学校博士学科点专项科研基金（项目编号：
20070019035）提供资助
独 创 性 声 明
本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得中国农业大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。
研究生签名：时间：年月日
关于论文使用授权的说明
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(保密的学位论文在解密后应遵守此协议)
研究生签名：时间：年月日
导师签名：时间：年月日
摘 要
利用酶解技术从新鲜猪血中分离提取具有抗菌活性的物质，即为猪血抗菌肽的粗提物。将该粗提物进行Sephadex G-100凝胶柱过滤层析，并检测层析组分的活性。收集具有抗菌活性的组分，再经Tricine-SDS-PAGE分析纯化，出现一条分子量为7KDa左右的蛋白带，并对其生物学活性进行了如下研究。
1.采用琼脂糖弥散法检测猪血抗菌肽对鸡多杀性巴氏杆菌、金黄色葡萄球菌ACTT25923株、铜绿假单胞菌ACTT27853株、鸡大肠杆菌O88、鸡沙门氏菌自然分离株等5种细菌的作用；同时，采用扫描电镜观察猪血抗菌肽对上述金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌形态结构的影响。试验结果表明，猪血抗菌肽对以上各种细菌均有不同程度的抑杀作用；而且可以使细菌的形态结构发生明显的改损伤，表现为细菌干瘪、皱缩、菌体畸形、表面粗糙不平。
2.按0.1mg/mL猪血抗菌肽给1d雏鸡饮水，连续试验28d，进行动态观察，结果如下：
（1）实验组雏鸡的体重、十二指肠绒毛长度以及肠黏膜上皮AKP活性均比对照组高，且14d-21d时差异显著（P＜0.05或P＜0.01）。同时扫描电镜观察发现，14d时实验组雏鸡十二指肠黏膜上皮微绒毛比对照组的排列整齐、致密、且长。这说明猪血抗菌肽可以促进雏鸡肠道黏膜上皮细胞微绒毛的生长发育，改善雏鸡肠道黏膜结构，在一定程度上增强肠黏膜上皮的消化吸收功能。
（2）14d-21d时实验组雏鸡十二指肠黏膜上皮内淋巴细胞（IEL）、杯状细胞（GC）数量以及肠黏膜上皮sIgA阳性表达量显著高于对照组（P＜0.05）。这说明猪血抗菌肽在一定程度上可以提高雏鸡肠道黏膜免疫水平。
（3）流式细胞仪检测结果发现，28d实验组雏鸡外周血中CD4+、CD4+/CD8+值均高于对照组，但差异不显著。14d-21d实验组雏鸡的脾脏指数、法氏囊指数，以及脾脏中CD68、IL-2阳性表达量均显著高于对照组（P＜0.05）。这说明猪血抗菌肽在一定程度上可以提高雏鸡机体免疫功能。
3.用鸡胚成纤维细胞进行细胞毒性试验，结果表明，低浓度猪血抗菌肽对鸡胚成纤维细胞低或无毒性作用。用家兔进行热源检测和刺激性试验，结果表明，0.1mg/mL猪血抗菌肽中不含致热源物质、低或无刺激性。
综上所述，本研究首次采用酶解技术从新鲜猪血中分离出了抗菌肽，并证明了此肽分子量小、具有热稳定性，在0.1mg/mL浓度下无细胞毒性、无热源性、无刺激性。本研究还揭示了猪血抗菌肽具有改善雏鸡肠道黏膜结构、提高肠道黏膜免疫等免疫功能的生物学活性。这些研究结果为猪血抗菌肽的开发利用奠定了一定的理论基础。
关键词：猪血抗菌肽；纯化；抗菌作用；黏膜免疫
ABSTRACT
After the fresh swine blood were treated by enzymolysis, by Sephadex G-100 gel filtration chromatography, antibacterial peptides (ABPs) was isolated from fresh swine blood. The fractions obtained were tested against Pasteurella using agarose diffusion assay. The molecular weight of the antibacterial peptides was estimated by using Tricine-SDS-PAGE. The results showed that an electrophoresis-grade antibacterial peptides was purified from swine blood, and its molecular weight was estimated to be about 7kilodaltons.
The swine blood ABPs′ antibacterial activity against 5 bacteria strains (chicken Pasteurella multocida , Staphylococcus aureus ACTT25923, Pseudomonas aeruginosa ACTT 27853, chicken Escherichia coli O88 , chicken Salmonella typhisuis isolated) was revealed. The results showed that the ABPs was strongly active against all the bacteria strains above. Scanning electron microscopy observation of Staphylococcus aureus ACTT25923, Pseudomonas aeruginosa ACTT 27853 treated with the ABPs showed that they became rough , malformed.
One-day’s chicken drinking water with the swine blood ABPs in 28 days, had been taken dynamic observation every 7 days. The results were as follows: The weight, height of villus, and activity of AKP of duodenum mucous in the experimental group turned out to be remarkably stronger than the control group at 14d-21d（P＜0.05）. According to the scanning electron microscopy results, the length and density of the microvilli were better in the experimental group. This suggested that the ABPs could improve the structure of chicken intestine mucosa , increase the absorbed ability to nutrients. Moreover, compared to the control groups, the numbers of IEL, GC and sIgA+ cells in the duodenums of the 14d-21d ABPs′ groups were significantly increased. Besides, CD4+, CD8+ cells in the peripheral blood of 28d chickens were detected using flow cytometry, and expression of CD68, IL-2 in spleens with immunohistochemistry. The above results showed that these indexes in the ABPs′groups were higher. This exposed that to some extent, the swine blood peptides could improve chickens’ non-specific immunity levels.
Using rabbits and CEF to research biotical safety of ABPs, by means of heat source detection, stimulus, and cytotoxicity test. The results were showed that 0.1mg/mL swine blood ABPs could not induce to fervescence , irritative response, and nontoxic effect .
In summary, the antibacterial peptides isolated and purified from the swine blood was strongly active against bacteria, and had significant effect on the mucosal and non-specific immunity function of chickens. Undergone further research, the swine blood antibacterial peptides could be able to develop as a novel therapeutic agent against microorganisms and immunity-enhancing agent or immunomodulator.
Keywords:Swine Blood Peptides; Purification; Antibacterial Activity; Mucosal Immunity
目 录
摘要............................................................I ABSTRACT.........................................................II 目录..........................................................III 英文缩略表........................................................V 插图和图版说明...................................................VI 第一章文献综述.. (1)
1抗菌肽研究进展 (1)
2黏膜免疫研究进展 (7)
3本研究目的意义 (12)
第二章猪血抗菌肽的分离纯化及抗菌作用研究 (13)
1材料与方法 (13)
2试验结果 (17)
3讨论与小结 (21)
第三章猪血抗菌肽对雏鸡肠道和脾脏等器官功能的影响 (23)
实验一猪血抗菌肽对雏鸡十二指肠黏膜结构相关指标的影响 (23)
1材料与方法 (23)
2试验结果 (25)
3讨论与小结 (27)
实验二猪血抗菌肽对雏鸡十二指肠黏膜免疫相关指标的影响 (29)
1材料与方法 (29)
2试验结果 (32)
3讨论与小结 (34)
实验三猪血抗菌肽对雏鸡外周血和脾脏中免疫相关指标的影响 (36)
1材料与方法 (36)
2实验结果 (38)
3讨论与小结 (39)
第四章猪血抗菌肽安全性的初步检测 (41)
1材料与方法 (41)
2实验结果 (42)
3讨论与小结 (43)
第五章结论 (44)
参考文献 (45)
图版与说明 (53)
致谢 (58)
个人简历 (59)
英文缩略表
ABPs antibacterial peptides 抗菌肽
phosphatase 碱性磷酸酶
AKP alkaline
AP ammonium persulfate过硫酸铵
℃ centigrade 摄氏度
tissue 眼结膜相关淋巴样组织CALT conjunctiva-associated
lymphoid
CFU clone forming unit 菌落形成单位
DAB diaminobenzidine 二氨基联苯胺
g gram 克
GALT gut-associated lymphoid tissue 肠相关淋巴样组织
H＆E haematoxylin-eosin 苏木素－伊红
IEL intraepithelial lymphocyte 上皮内淋巴细胞
KDa kilodalton 千道尔顿
L liter 升
LPL lamina propria lymphocyte 固有层淋巴细胞
MALT mucosa-associated lymphoid tissue 黏膜相关淋巴样组织
lode 肠系膜淋巴结
lymph
MLD mesenteric
mg microgram 毫克
min minute 分钟
mL microliter 毫升
mm micrometer 毫米
mol/L mole/Litre 摩尔/升
density 光密度
OD optical
PAS periodic acid-Schiff reaction 高碘酸－希夫氏反应
mobility 相对迁移率
R f relative
SDS sodium dodecyl sulfate 十二烷基磺酸钠
SDS-PAGE SDS-polyarylamide gel electrophoresis SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳
immunoglobin
A 分泌型免疫球蛋白A sIgA secretory
TEMED N,N,N’,N’-tetramathylethylenediamine N,N,N’,N’-四甲基乙二胺Tricine Tris（hydroxymethyl）methylglycine 三(羟甲基)甲基甘氨酸Tris Tris-hydroxymethyl-aminomethane 三羟甲基氨基甲烷
value 绒毛长度/隐窝深度比值V/C villus/crypt
插图和图版说明
图1-1 毯式和穿桶式结构模式图 (6)
图1-2 黏膜免疫应答过程示意图 (11)
图2-1 猪血抗菌肽G-100层析曲线 (18)
图2-2 猪血ABPs对鸡多杀性巴氏杆菌抑菌作用 (18)
图2-3 Ticine-SDS-PAGE鉴定抗菌肽分子量 (18)
图2-4 猪血抗菌肽分子量的测定 (18)
图2-5 牛血清白蛋白蛋白浓度标准曲线 (19)
图2-6 温度对猪血抗菌肽抗菌活性的影响 (19)
图2-7 pH值对猪血抗菌肽抗菌活性的影响 (20)
图3-1-1 不同日龄实验组和对照组雏鸡肠十二指肠黏膜结构相关指标的比较图 (26)
图3-1-2 各组雏鸡不同日龄十二指肠黏膜上皮AKP表达量变化图 (27)
图3-2-1 各组不同日龄雏鸡十二指肠黏膜上皮IEL数量比较图 (33)
图3-2-2 各组不同日龄雏鸡十二指肠上皮GC数量比较图 (33)
图3-2-3 各组不同日龄雏鸡十二指肠上皮sIgA+面积系数比较图 (34)
图3-3-1 各组不同日龄雏鸡体重和各免疫器官指数变化的比较图 (39)
图3-3-2 各组不同日龄雏鸡脾脏中CD68、IL-2阳性面积系数比较图 (39)
图3-3-3 各组不同日龄雏鸡脾脏中CD68、IL-2阳性面积系数比较图 (39)
图版1 对照组铜绿假单胞菌表面光滑、平直, 外观饱满，常见分裂现象 (53)
图版10 各组14d雏鸡十二指肠黏膜上皮肠绒毛结构图 (54)
图版11 各组14d雏鸡十二指肠黏膜上皮AKP活性分布图 (55)
图版12 各组14d雏鸡十二指肠黏膜上皮IEL分布图 (55)
图版13 各组14d雏鸡十二指肠黏膜上皮间GC分布图 (55)
图版14 各组14d雏鸡十二指肠黏膜上皮sIgA+细胞分布图 (56)
图版15 各组28d雏鸡外周血中CD4+、CD8+细胞流式图 (56)
图版16 各组14d雏鸡脾脏中CD68阳性细胞分布图 (56)
图版17 各组14d雏鸡脾脏中IL-2阳性细胞分布图 (57)
图版18 培养的CEF细胞的形态结构 (57)
图版2 实验组铜绿假单胞菌表面粗糙,菌体畸形扭曲，一端膨大 (53)
图版3 实验组铜绿假单胞菌菌体干瘪皱缩，胞浆内容物外溢 (53)
图版4 实验组铜绿假单胞菌菌体一端突起，一端凹陷，形似火柴棒 (53)
图版5 对照组金黄色葡萄球菌呈球形, 外观饱满，分裂增殖活跃 (53)
图版6 实验组金黄色葡萄球菌表面可见许多小棘突，明显凹陷 (53)
图版7 实验组菌肽组金黄色葡萄球菌干瘪固缩，表面粗糙不平 (54)
图版8 实验组金黄色葡萄球菌菌体变的大小不一，形似短杆菌 (54)
图版9 扫描电镜观察各组14d雏鸡十二指肠黏膜微绒毛的形态结构 (54)
第一章 文献综述
1 抗菌肽研究进展
1.1抗菌肽的来源
1972年，瑞典科学家Boman以惜古比天蚕的蛹为实验材料，向其注射蜡状芽孢杆菌时，发现了抗菌肽cecropin。后来又经众多科学家的不懈努力，发现抗菌肽的主要合成部位为脂肪体。1980年，Boman等人从注射大肠杆菌的美国天蚕蛹的脂肪体中分离到了专一性抗菌肽mRNA，并将其导入鼠肝的无细胞体系中，成功的翻译成具有杀菌能力的天蚕素，分别命名为cecropin A 和cecropin B，并完成了这两种抗菌肽的氨基酸的序列测定（Boman H.G.，1989）。从此，也就揭开了抗菌肽的研究序幕。
抗菌肽（Antibacterial Peptides，ABPs）, 也称肽类抗生素或天然抗生素，是一类具有广谱抗微生物活性的小分子短肽，广泛存在于生物界中，包括细菌、两栖类动物、鸟类、动植物和人类，是宿主先天性非特异性防御系统的重要组分。抗菌肽主要由免疫系统的许多细胞产生，如多形核嗜中性白细胞(PMNs)、巨噬细胞、T淋巴细胞和自然杀伤细胞等，主要储存在胞浆的嗜苯胺蓝体颗粒内（Lehrer R I等，1999）。一旦细胞激活并脱颗粒时，这些与颗粒有关的多肽便被释放到胞内包涵病原的囊泡中或者分泌到细胞外，通过非氧化杀伤机制起作用（Elsbach P，1992）。此外，机体的上皮细胞也可以产生抗菌肽（Andreu D，1999）。Boman称抗菌肽是机体理想的第一道防线，因为抗菌肽的合成速度非常快，与以恒定的肽键合成速度相比较，抗菌肽的产生比IgM快100多倍（Boman H.G.，1989）。而且，小肽的扩散比大蛋白质和免疫细胞更加迅速，作用更显灵活。
抗菌肽一般具有抗菌作用（Hancock REW等，1995；Jacopo Vizioli等，2002；Andreas R 等，2003），有些抗菌肽还具有抗原虫（Gwadz R.W.等，1989；韩献萍等，1994）、抗真菌（Iijima R等，1993；刘影等，1999）、抗病毒（Esser AF等，1979；Marcos JF等，1995；Sergey Chernysh，2002）和抑制或杀伤肿瘤细胞（贾红武等，1996；许玉澄等，1998；王芳等，1999）等作用。它具有分子量小(12～100个氨基酸残基)、水溶性好、耐热、无免疫原性等特点，极有可能成为一种高效、低毒并且无残留危害的抗菌、抗病毒和抗癌新药，甚至可以通过基因工程方法将抗菌肽基因导入植物、动物或微生物体内，用于大批量生产或进行动植物的抗病育种。
由于其应用前景广阔，现已成为生命科学领域的研究热点之一，其研究主要集中在抗菌肽的分离与纯化、氨基酸序列分折、蛋白质构型与功能的关系、抗菌肽的作用机理、基因工程克隆与表达抗菌肽基因、改造合成抗菌肽基因及动植物的转抗菌肽基因工程。人们期望通过研究，一方面在分子水平上弄清抗菌肽在动物免疫防御系统中精细的合成过程及其调控机制；另一方面是探讨抗菌肽的药用开发价值，努力使之成为继青霉素等传统抗生素之后又一类重要的新型抗菌、抗病毒、抗肿瘤药物。
1.2 抗菌肽的分类
最早对抗菌肽分类的主要依据是抗菌肽的来源，如在什么生物体分离鉴定即命名为某某抗菌
肽，比如哺乳动物抗菌肽、昆虫抗菌肽、植物抗菌肽、细菌抗菌肽、病毒抗菌肽等。后来随着越来越多的抗菌肽被发现，人们又根据抗菌肽的化学组成、二级或三级空间结构以及功能进行分类，又如含有－S－S－的抗菌肽、富含Pro的抗菌肽以及抗细菌肽、抗真菌肽、抗肿瘤肽等。然而，抗菌肽分子如此之多，能被大家普遍接受的分类方式并不多。目前，根据抗菌肽主要组成成分和三级结构，将抗菌肽分为四大类（Robert，1997； Andreu D等，1998）。
（1）含有α-螺旋结构的线性抗菌肽。从天蚕免疫血淋巴中分离到的Cecropins 家族抗菌肽即属于此类，此后在许多昆虫中也鉴定出cecropins或其类似分子（Hultmark D等，1980；Qu XM等，1982）。Lee等在猪肠道中也分离到类似cecropin抗菌肽（Jong-Youn Lee等，1989），这暗示cecropins 可能在生物界中广泛存在。
（2）含有2～3个二硫键的β-折叠抗菌肽。这类抗菌肽很多，主要有防御素、protegrins和tachyplesins家族抗菌肽。
①防御素（defensins）家族具有以下三项特征（傅荣昭等，1996）：①由29～35个氨基
酸组成，包括6个保守的半胱氨酸；②通过半胱氨酸分子间三对二硫键使肽环合形成稳定的反
向平行的β-片状结构；③抗微生物谱比较广泛，包括革兰氏阴性与阳性细菌、分枝杆菌、螺旋体、许多真菌和一些被膜病毒。此外，还对广泛的恶性细胞具有非特异性的毒杀作用。
② protegrins家族是从猪白细胞中分离到的，仅含16～18个氨基酸，分子量为2kDa，含2
个分子内二硫键，被认为是defensins超家族成员，具有抗真菌、G+菌、G-菌和HIV活性。
③ Tachyplesins家族是从马蹄蟹（horseshoe crab）血细胞中分离到的。马蹄蟹的tachyplesin
和猪的protegrin是已经发现的抗菌肽中空间结构、同源性最高的一族，但二者的前体却没有同
源性（Miyasaki KT等，1997）。
(3) 富含1～2种氨基酸的抗菌肽。最早发现的该类抗菌肽是蜜蜂中的apidaecin，富含脯氨酸（Pro）和精氨酸（Arg），随后在牛嗜中性粒细胞、猪小肠上皮细胞、人嗜中性粒细胞以及果蝇中相继发现了富含脯氨酸和精氨酸、富含色氨酸、富含甘氨酸的抗菌肽。Agerberth B等（1991）从猪的小肠中分离到了一种抗菌肽，含有7种氨基酸，共39个，属于富含Pro-Arg的肽家族，因此被命名为 PR—39。
(4) 具有袢状结构的抗菌肽。这类抗菌肽主要有从牛嗜中性粒细胞中分离到的环状十二肽Bactenecin和在蛙类Rana中发现了的brevinins、esculentin和ranalexin（Barra D等，1998）。
抗菌肽的种类多样，无论其分类不同，还是其空间结构不同，都可产生相应的抗菌作用。
但目前还没有发现完全毒杀细菌的抗菌肽分子（Martin E，1995），这可能是生物在漫长的进化
过程中，抗菌肽分子与机体内的细菌等微生物相互适应的结果。而从另一方面看，抗菌肽类分
子在经过了几千年、几万年的进化仍然保持了其强大的抗菌活性，说明其在动物的先天性免疫
中起到重要的作用。
1.3 抗菌肽的生物学活性
抗菌肽是作为一种非特异性免疫分子，同时也是体液免疫防御系统中的重要成员，在抵御外来病原体致病过程中起重要作用。特别是两栖类，由于缺乏细胞免疫，抗菌肽对于免疫防御就显
得尤为重要。
(1) 抗菌肽的抗菌功能
抗菌肽既可杀灭或抑制革兰氏阳性（G+）菌，又可杀灭或抑制革兰氏阴性（G-）菌，其广谱抗菌特性是传统抗生素所无法比拟的。不同结构抗菌肽的抗菌活性有很大的差异。通常富含脯氨酸和精氨酸的抗菌肽对G-菌比对G+菌的杀灭或抑制更有效（Harwig SSL等，1995；Agerberth B等，1995），而富含色氨酸和半胱氨酸的抗菌肽抗G+菌的效果更好（Falla T等，1996）。具有α-螺旋结构的抗菌肽都表现出广谱抗菌活性，包括对一些临床上耐抗生素的菌株，如金黄色葡萄球菌（Skerlavaj B等，1996；Turner J等，1998）和多抗铜绿假单孢菌（Turner J等，1998）。与传统抗生素相比，抗菌肽除了抗菌谱广外，另一重要特点是杀菌迅速。研究表明，在4倍MIC条件下，抗菌肽比庆大霉素杀灭E.coli UB1005的速度要快得多（Steinberg DA等，1997；Zhang L等，2000）。
(2) 抗菌肽的抗病毒功能
大量研究表明，有些抗菌肽如defensins、indolicidin、polyphemusin、melittin和alloferon
等都有抗病毒活性（Tissot C 等，1995；Wachinger M 等，1998；Sergey Chernysh等，2002；
徐进署等，2002）。兔NP-1、NP-2，人HNP-1、2、3，鼠RatNP-1以及豚鼠GPNP-1都能在组
织培养物中中和单纯疱疹病毒，使之失去感染性（Lehrer RI等，1985）。抗菌肽中和病毒的程
度与其浓度以及分子内二硫键的完整性有关，另外还受接种时间、pH值、温度以及培养液成分
的影响（Daher KA等，1988）。
(3) 抗菌肽的抗真菌功能
戴祝英等（1999）进行了抗菌肽抗小麦赤霉病的实验，结果表明适当浓度的抗菌肽对赤霉
病菌的抑制率达到30%左右。也有研究表明，豚鼠抗菌肽对白色念珠菌以及新生隐球菌有作用（Zeya HI等，1966；Lehrer等，1975；Lehrer等，1977），兔抗菌肽和人防御素对白色假丝酵
母有作用（Selsted等，1985；Lehrer等，1988）。
(4) 抗菌肽的抗原虫作用
天蚕素和其合成类似物对病原原生动物包括引起虐疾和锥虫病的寄生虫都有作用。
(5) 抗菌肽的细胞毒性作用
随着抗菌肽的深入研究，人们发现一些新型抗菌肽不仅作用于某些细菌、病毒、真菌和原虫，而且还作用于某些肿瘤细胞（Lichtenstein A，1986；胡云龙等，1987；贾红武等，1996）。研究表明，与传统抗肿瘤药物不同的是，抗菌肽一般不会对造血系统及消化系统造成损害，从而避免了类似传统抗肿瘤药物对机体免疫系统的损害（Zanetti M等，1995）
(6) 抗菌肽在天然免疫中的作用
当宿主感染病原菌时,体内抗菌肽的表达量会相应增加。如牛感染副结核分支杆菌时，肠道
β-defensins表达量增加（Stolzenberg ED等，1997）；猪感染沙门氏菌时，循环系统中cathelicidin
表达量增加3倍（Zhang G等，1997）；在小鼠气管内注入铜绿假单胞菌，可导致其气管上皮和
肠道内mBD-3（mouse β-defensins -3）表达增加（Bals R等，1999）。在肠炎患者的肠道上皮中hBD-2（human β-defensins -2）表达量升高（O'Neil DA等，1999）；齿龈炎患者口腔上皮内hBD-2
的表达也升高（Mathews M等，1999）。在果蝇，调节基因或信号基因发生变异，可以影响许多肽类的表达，从而导致对细菌和真菌易感性的增加（Meister M等，2000）。Wilson等（1999）从小鼠体内分离到一种酶matrilysin，可将肠道defensins前体转化为有活性的defensins；剔除该酶基因可以阻断肠道defensins前体转化为有活性的defensins，导致小鼠对微生物的易感性提高10倍。Cole等（2001）在猪皮肤伤口上应用特异性protegrin加工酶抑制剂，结果导致伤口protegrin活性降低，对细菌抵抗力下降。当然，相似的试验不可能在人体内进行，但是从患者的生理反应中可以看到类似的结果，如患有特异性颗粒缺乏综合征的病人缺乏α-defensins，会经常发生严重细菌感染（Hancock REW等，1998）；感染HIV的病人由于唾液中histatin含量下降，因此发生口腔念珠菌病（candidiasis）和真菌感染的几率增加（Andreu D等，1998）。这些研究从各方面都进一步证实了抗菌肽在宿主抗感染防御过程中的重要作用。
研究发现，抗菌肽参与急性炎症有关的宿主天然防御的各个方面（表1-1），如：溶解入侵的细菌，使其释放炎症介质；使肥大细胞脱颗粒，释放组织胺，导致血管扩张；增强嗜中性白细胞和辅助性T细胞的趋化功能，使白细胞向感染部位聚集；促进吞噬细胞的非调理素吞噬功能；抑制组织纤维蛋白溶解，防止感染扩散；促进成纤维细胞的趋化和成熟以修复组织创伤；抑制某些蛋白溶解酶以防组织损伤。如果急性炎症过程不足以清除细菌，那么宿主就会启动慢性炎症反应和适应性免疫应答。抗菌肽在慢性炎症过程中的作用包括趋化单核细胞；通过趋化作用使T细胞向炎症部位聚集；促进辅助性T细胞趋化因子的产生及辅助性T细胞的增殖，提高体内IgG水平；促进巨噬细胞凋亡，激活淋巴细胞，以清除已感染的细胞。
表1-1 抗菌肽在宿主天然免疫过程的作用
抗菌肽在天然免疫中可能发挥的作用资料来源LL-37;CP-28* 调节吞噬细胞的活性 Hancock等,2000
CAP11;Magainin2 促进肥大细胞释放组织胺，使血管通透性增强 Andreu等,1998; GH等,1999α-defensins 诱导呼吸道上皮细胞产生IL-8 Van等,1997
PR-39 对嗜中性细胞有趋化作用，增强其吞噬功能 Gallo等,1994; GH等,1999 LL-37;HNP-2;HNP-3 促进创伤愈合 Andreu等,1998; GH等,1999 Guinea-pig defensins 增强CD11b、CD11c和ICAM-1的表达，增加嗜中
性白细胞的吸附能力
GH等,1999 Rabbit defensins NP-1,2 促进巨噬细胞非调理素吞噬功能,清除细菌 Hancock等,2000 CA(1-8)M(1-18)* 诱导巨噬细胞信号旁路和iNOS合成，激活巨噬细
胞，清除细菌
Velasco等,1997 Defensin ,
ⅠⅡ抑制组织纤维蛋白溶解，防止感染扩散 Andreu等,1998
Defensin;SB-37;Shiva*,
Vishnu* 刺激成纤维细胞和上皮细胞的有丝分裂，促进成纤
维细胞的生长，促进创伤愈合
Reed等,1992
PR-39 诱导基质表面蛋白多糖分泌，促进创伤愈合 Gallo等,1994 Histatin 3;pro Bac 7 抑制组织蛋白溶解酶，防止炎症过程中的组织损伤Basak等,1997
BMAP-27;MBAP-28; CA(1-8)M(1-18)*; 在体外可激活人淋巴细胞，可清除感染病毒和细菌
的细胞以及癌细胞
Risso 等,1998; Lillard
等,1999; GH等,1999
Lactoferricin
Defensins 减少类固醇类物质的生成，减弱感染应激过程中皮
质类免疫抑制剂的释放Ganz T等,1995; Hancock
等,2000
CAP11 增加嗜中性白细胞黏附能力，调节其功能 GH等,1999 ProBac7;defensins 对单核细胞有趋化作用 Risso
A等,1998 CAP18(106-137);LL-37;
CP-28*
中和LPS，抗败血症，反馈性地抑制内毒素反应 Sawa等,1998; GH等,1999 Many ABPs 中和LTA，抗败血症 Hancock等,2000
LL-37;CP-28 中和CpG，抗败血症 Stein
T等,1996 LL-37;CP-28 选择性抑制诱导LPS基因的表达，减少细胞因子的
表达，抗败血症
Hancock等,2000 HNP-1,-2; LL-37 对T细胞有趋化作用，启动细胞免疫应答 CH＆Ertov O等,1996 Nisin* 诱导鼠CD4和CD8细胞的产生，增强细胞免疫功
能和T细胞的辅助功能
Andreu等,1998 Defensins;HNP-1,-2,-3 提高IFN-γ、IL5等活性，提高体内IgG水平，改
善全身获得性免疫应答
Lillard 等,1999 注：标有*者为人工合成抗菌肽，其余均为天然抗菌肽。
1.4 抗菌肽的作用机理
目前，国内外对抗菌肽的抗菌机制仍有不同的看法，但大家都认可的是抗菌肽是直接作用于
细菌或肿瘤细胞的质膜结构，引起胞内水溶性物质大量渗出，从而导致细菌或肿瘤细胞死亡，这
种机制在最近的研究中也得到了证实。而抗菌肽的结构特征是保证这种机制发挥作用的重要基
础。这种胞膜攻击作用的机理是：通过其两亲性α-螺旋上正电荷与细菌细胞质膜磷脂分子上负电
荷之间的静电吸引而结合聚集在质膜上，随后抗菌肽分子中的疏水段C端(酰胺基) α-螺旋插入到
疏水的细菌细胞膜中央，使抗菌肽在质膜表面聚集，形成‘穿桶式”结构或“毯式”结构，从而打乱
了质膜上蛋白质和脂质原有的排列秩序，使得膜外正电荷增多，超过阈值时导致膜去极化，造成
膜损伤。
“穿桶式”结构是多个抗菌肽分子形成横跨细胞膜的离子通道。离子通道一旦形成，外界的水
分即可渗入细胞内部，细胞质也可渗透到外部。严重时细胞膜会崩解而导致细胞死亡。该模型中
起主要作用的是疏水作用，阳离子抗菌肽有稳定的结构，如：两亲α-螺旋、疏水α-螺旋、β-折叠，
或同时存在α-螺旋和β-折叠。而对于“毯式”结构则是在疏水作用和分子张力作用下改变细胞膜的
流动性和厚度，从而在细胞膜上出现瞬时孔洞，导致细胞质外渗或抗菌肽渗透到细胞质中，严重
时同样会引起细胞膜崩解，导致细胞死亡（Shai and Oren，2001）。该模型起关键作用的是电荷
间的作用力，抗菌肽无需α-螺旋、β-折叠等稳定的二级结构，也不需要在细胞膜表面形成多聚体。
阳离子抗菌肽引起细胞膜破坏可以发生在整个细胞膜上，也可仅在其中的某些部位（如图1-1）。
图1-1 毯式和穿桶式结构模式图（引自Shai Y，and Oren Z，2001）
左图：“毯式”学说膜崩解；
作用方式：（1）诱导细胞调亡具有热稳定性、水溶性好、广谱杀菌、甚至有统抗生素，不仅产生了诸多耐药菌株，使抗生素的有效剂量不断加大，导致养殖业用：A 阳离子氨基酸末端亲水区结合到细胞膜表面，B 出现孔洞，C 右图：“穿桶式”学说：A’聚集在细胞膜表面，B’插入脂质层出现孔洞
随着研究的深入，人们发现抗菌肽还具有其他的具有抗菌效果的；（2）攻击线粒体、抑制呼吸；（3）抑制细胞壁的合成；（4）抑制细胞外膜蛋白的形成；
（5）直接作用于肿瘤细胞核染色质；（6）断裂细胞骨架。以上各种机制，在一定意义上说，还需要进一步的证明与完善，还处于一种假说状态。但有一点是可以肯定的，抗菌肽的杀菌作用与细菌细胞膜的通透性增加有关。当然，具体到某一种抗菌肽，其杀菌方式各有差异，可能其杀菌效果的发挥是通过各种因素的协同作用。
1.5 抗菌肽在畜牧生产上的应用
抗菌肽是哺乳动物防御系统的一个重要组成部分，的能杀真菌、原虫等优点，而且许多抗菌肽在100℃加热30 min 条件下仍能保持一定活力，且对较大的离子强度和较低或较高的pH 都有较强的抗性，而对真核细胞几乎无作用，仅作用于原核细胞和发生病变的真核细胞，并且与抗生素通过阻断大分子生物合成的作用机制完全不同，病原菌不易对其产生耐药性，由此显示了它具有独特的研究和应用价值。从哺乳动物抗菌肽特有的性质，显示了在畜牧生产上它具有以下几个方面的应用前景。
（1）药用前景
广泛使用传药成本急剧上升，更为重要的是，剂量的不断加大导致动物食品抗生素残留日益增加，严重
威胁到了人类的健康甚至生命安全。而用抗菌肽代替传统抗生素，则不会产生耐药菌，无毒无残留，在畜禽疾病治疗与预防中具有广阔的应用前景。温刘发等人研究表明，蚕抗菌肽AD 能抑制多种畜禽病原菌，如猪水肿病菌、猪肠炎沙门氏菌、鸡大肠杆菌(具毒素株)、鸭大肠杆菌和流产杆菌等。另有报道，柞蚕抗菌肽应用于预防及治疗鸡白痢效果明显。随着对抗菌肽结构与活性的关系、抗菌肽作用机制及其基因表达调控机制认识的不断深入，设计一种高效的、有利于人类健康的抗菌肽作为抗生素替代品是完全可行的。
（2）抗菌肽添加剂研究
随着抗生素的大量使用和人们对食品质量和环境质量的要求越来越高，人们对其副作用的认识日于各种动物界中，是动物先天免疫系统的重要组分，因此，寻找各种饲养动炎及各种病毒性疾病如猪瘟、鸡新城疫等一直是棘手的疾病，不利于畜牧业2 黏膜免疫研究进展
黏膜免疫系统（Mucosal immune system ，MIS ）是指广泛分布于呼吸道、胃肠道、泌尿生殖道层（弥散淋巴组织益加深，抗生素在饲料中的应用已面临被淘汰或禁用的局面。世界各国对饲料中抗生素使用的控制日益加强，一些国家甚至已限制或禁止使用多种抗生素作饲料添加剂。近年来对抗生素替代品的研究及对饲料安全的关注是畜牧业研究与生产的热点问题，抗菌肽由于自身的优点显示了在饲料中广泛的应用前景。如抗菌肽能耐受饲料制粒时的高温；规模化发酵生产抗菌肽时经高温浓缩工序，可充分杀灭酵母菌体而不导致抗菌肽失活，产品在推广应用后不会出现工程菌的扩散而导致环境生态问题。以工程菌工业化发酵生产抗菌肽，可大规模生产，生产周期短，生产成本低且不受季节和气候变化等外在环境的影响。据美国学者报道，抗菌肽可以作为饲料防霉剂。应用含抗菌肽的柞蚕免疫血淋巴粉添加于断奶仔猪料，饲喂试验结果表明，蚕抗菌肽可减轻断奶仔猪的腹泻。研究表明，转抗菌肽CAD 基因酵母用作鸡、猪及虾的饲料添加剂，可完全代替现行禁用的抗生素，用于预防及治疗大肠杆菌、沙门氏菌引起的腹泻等消化道炎症，且无毒副作用、无药物残留及环境污染。
由于抗菌肽广泛存在物的内源性抗菌肽，用现代生物技术工业化生产在病原上具有动物“种”专一性的饲料添加剂，无疑将是“后抗生素时代“的一条出路和发展方向。
（3）转基因研究及应用
仔猪腹泻、奶牛乳房的发展。借鉴已成功的昆虫抗菌肽转基因工程，如转基因蚊子等，把特异的抗菌肽基因转入畜禽特定细胞让其表达，从而产生抗病新品种，不失为一条发展畜牧生产的新思路，前景深远。 黏膜下及一些外分泌腺体处的淋巴组织，是执行局部特异性免疫功能的主要场所。黏膜免疫系统在结构和功能上均有别于传统的免疫系统，主要表现在以下几个方面：
（1）MIS 是大量免疫细胞和免疫分子弥散分布在黏膜上皮内或黏膜下固有），或由单个或多个淋巴滤泡聚集成的黏膜相关淋巴样组织（mucosal-associated lymphoid tissue ，MALT ），包括肠相关淋巴样组织（gut-associated lymphoid tissue ， GALT ）、支气管相关淋巴样组织（bronchus-associated lymphoid tissue ， BALT ）、鼻相关淋巴样组织（nasal-associated
lymphoid tissue ， NALT ）和眼结膜相关淋巴样组织（conjunctiva-associate lymphoid tissue ，CALT ）等。机体50％以上的淋巴组织和80％以上的免疫细胞集中于黏膜免疫系统。
（2）MIS 分泌的是一类黏膜相关的免疫球蛋白，即分泌型IgA （secretory immunoglobin A ，sIgA 一类能下调全身免疫应答的效应性T 细胞。
。前者主要指MALT ，后者
主要敏的免能是对黏膜表面吸入或食入的大量种类繁多的抗原进行识别并作出反应。T 淋巴细胞、B 淋巴细胞、质进入消化道，并穿过黏膜表面的上皮屏障，与黏）和sIgM 。
（3）MIS 内有（4）MIS 按功能不同可分为两个部位：诱导部位和效应部位包括固有层、上皮内淋巴细胞和一些相关的外分泌腺（如泪腺、唾液腺和乳腺等）
。 （5）在诱导部位和效应部位间，主要通过淋巴细胞归巢发生联系。即在一个诱导部位致疫细胞，经胸导管进入血循环，逐步分化成熟，在特异性归巢受体的介导下，多数免疫细胞（约80％）归巢到抗原致敏部位（即诱导部位的黏膜固有层或上皮内）发挥效应功能，由此使黏膜免疫相对独立于系统免疫，表现为局部性。另外，约20％的免疫细胞进入其它的黏膜部位，发挥效应功能，使不同黏膜部位的免疫反应相关联（Brandtzaeg P 等，1999）。因此，有人把从黏膜诱导部位归巢到效应部位这一功能上相关联的系统统称为共同黏膜免疫系统（Mestecky J ，1987）。
（6）MIS 的主要功既可对大量无害抗原下调免疫反应或产生耐受，也可对有害抗原或病原体产生高效体液和细胞免疫，进行有效免疫排斥或清除。
2.1 肠相关淋巴样组织简介
肠相关淋巴样组织(GALT) 包括组织性淋巴样组织和散在于肠壁中浆细胞、巨噬细胞和各种白细胞以及肠上皮内淋巴细胞等弥散性黏膜淋巴样细胞（佘锐萍等，2002；殷彦君等，2002）。它们参与构成机体免疫防御的第一道防线，当消化道的黏膜受到抗原的作用后，其黏膜内的淋巴组织随即产生免疫应答并向消化道内分泌免疫球蛋白，以抵御消化道内细菌、病毒及其有害抗原物质的侵入。
当细菌、病毒、原虫等颗粒物质或可溶性蛋白膜淋巴组织的M 细胞接触，M 细胞可吞噬这些抗原物质并以小囊泡形式转运给上皮内淋巴细胞。上皮内淋巴细胞接受刺激后可能迁出上皮进入固有层，并可将抗原信息传递给固有层中的淋巴细胞，使B 细胞和T 细胞致敏。被抗原致敏的B 细胞和T 细胞通过淋巴导管系统迁移至肠外淋巴组织发育成熟后重新分布于消化道和呼吸道等处的黏膜固有层和上皮内（Hanson L 等，1998）。黏膜固有层是一个重要的黏膜效应部位，B 细胞在固有层定居下来，并在抗原、T 细胞和细胞因子的刺激下增殖变为成熟的IgA 浆细胞。IgA 在浆细胞内产生，由J 链（含胱氨酸较多的酸性蛋白）连接成双聚体分泌出来。当IgA 通过黏膜上皮细胞向外分泌时，与吸收细胞产生的糖蛋白分泌片连接成完整的分泌性免疫球蛋白（sIgA ）。吸收细胞又将sIgA 吞入胞质后再释入肠腔。sIgA 附着于上皮表面的细胞衣上，可与相应的抗原结合，并将其中和、分解和破坏；或者sIgA 阻止抗原黏附于黏膜上皮细胞表面，或对抗原物质封闭，使抗原不能进入机体而被排出，从而对机体起到了一种有效的屏障作用（成令忠等，1994；沈霞芬等，2001）。
2.2 几种常见的黏膜免疫细胞
黏膜要保护机体免受病原体的侵袭，同时又不能对食物等无害抗原产生反应，这两方面同样地重要，所以需要复杂而精确的调节机制才能维持平衡，黏膜系统的特殊结构、特殊免疫细胞在其中扮演了重要角色。黏膜免疫细胞分为黏膜诱导部位的免疫细胞和黏膜效应部位的淋巴细胞两大类，黏膜诱导部位包括集合淋巴结和腹腔淋巴结。派伊尔氏结（PP 结）具有典型的二级淋巴器官结构，有确定的T 和B 细胞依赖区，位于黏膜下，有单层柱状上皮将之与肠腔隔开。上皮层内包括许多肠上皮细胞，各种淋巴细胞及M 细胞。而在黏膜效应部位主要包括位于固有层的淋巴细胞和位于上皮内基底膜之上的上皮内淋巴细胞（intraepithelial lymphocyte, IEL ）（王华，2000）。下面就与本试验有关的黏膜免疫细胞进行简单的介绍。如吸收细胞、杯状细胞）是黏膜诱导部位的细胞，在宿主黏膜表面天然和获得性免疫中有重要的调节作用。吸收细胞(absorptive cell) 是小肠黏膜上皮的最主要功能细胞，数量最多，约占小肠上皮细胞的90%。吸收细胞呈高柱状，胞核呈圆形或椭圆形，位于细胞基部，胞浆丰富。在细胞临近肠腔的游离面有明显的纹状缘，后者在电镜下是由密集排列的微绒毛构成。每个吸收细胞约有1000～3000根微绒毛，有利于消化吸收功能。微绒毛表面有一层由吸收细胞产生的糖蛋白构成较厚的细胞衣（cell coat ）。这种糖蛋白本身可与细胞质膜的蛋白质和脂质结合牢固，对细胞具有保护作用。同时，糖链可广泛吸附胰蛋白酶、胰淀粉酶等消化酶，故吸收细胞的微绒毛与细胞衣既是消化的关键场所，又是物质吸收的门户，对肠黏膜有保护作用。杯状细胞（goblet cell ）散在于吸收细胞之间，呈高脚杯状，因而得此名。其顶部胞质为大量糖原颗粒拥塞而膨隆，底部纤细，有小而深染的不规则核与少量嗜碱性胞质。杯状细胞能分泌粘液，有润滑上皮和清除废物的作用，杯状细胞还可合成三叶状蛋白，通过聚合粘性糖蛋白来保护上皮细胞免受外部损害，从而加强宿主防御。
，其在黏膜表面调节宿主天然免疫和获得性免疫中的重要作用主要表现在以下几个方面：①上皮细胞表面有各种防御分子如粘蛋白、防御素、sIgA 、sIgM 、细胞因子、趋化因子、酶类等，在肠黏膜的免疫防御功能中起着重要的作用。②参与黏膜免疫球蛋白分泌的调节。sIgA 是黏膜表面的重要免疫球蛋白，上皮细胞合成的分泌片作为特异受体成为sIgA 分泌和转运的重要机制。③上皮细胞通过分泌细胞因子与黏膜部位的免疫细胞（IEL 、LPL ④上皮细胞分泌的细胞因子可以改变自身或者其他黏膜免疫细胞的表型。⑤上皮细胞可以通过多种细胞因子的自分泌和旁分泌的形式来发挥对自身的调节作用。⑥上皮细胞可上调一系列致炎性细胞因子、抗炎性细胞因子以及趋化因子的表达和产生，如IL-1受体拮抗剂（Bocker U 等，1998）、IL-7、IL-8（Daig R 等，2000）、GM-CSF （Panja A 等，5）等参与不同炎症反应的细胞因子来下调机体对于口服抗原的反应。⑧上皮细胞具有消化抗原的作用，并对抗原有递呈作用（Gonella PA 等，1993）。此外，上皮细胞还能表达MHC Ⅱ类分子（Kaiserlian D 等，1990）。
2.2.1 上皮细胞
上皮细胞（上皮细胞除具有消化吸收营养物质的功能之外）进行信息传递，对它们的发生、分化、增殖及功能起重要的调节作用。199调节。⑦针对食物抗原的黏膜免疫反应会导致有害的超敏反应，而肠上皮细胞可通过它分泌的2.2.2 上皮内淋巴细胞
上皮内淋巴细胞（Intraepithelial lymphocyte ，IEL ）是小肠淋巴细胞中一群独特的细胞，位于肠等淋巴因子。新鲜分crophage ，M Φ)是一类重要的免疫细胞。一方面它吞噬外来异物，经消化处理后将物质或可溶性蛋白质进入消化道，并穿过黏膜表面的上皮屏障，与黏绒毛上皮细胞之间，邻近基膜。对IEL 的来源问题进行了广泛而深入的研究，对其发育的途径归纳为：①依赖胸腺的途径，即IEL 的前体细胞在胸腺中发育、成熟经选择再进入小肠；②IEL 的前体细胞不进入胸腺，但需胸腺衍生因子的作用，使之在小肠中完成分化、成熟和选择的过程；③IEL 前体虽进入胸腺，但未发育成熟，在出胸腺后受到胸腺因子的影响才获得成熟；④IEL 前体细胞在小肠中发育成熟，不受胸腺因子的影响，是一条独立的胸腺外途径（Lefrancois L 等，1995）。近年来，Maric 等（1996） 用小鼠小肠上皮细胞株MDE-K ，在体外与BM 中的T 细胞前体细胞一起培养，可诱导出IEL 细胞，这说明小肠的上皮环境可诱导IEL 的前体细胞发育成熟。现已发现小肠上皮细胞可表达IL-7和SCF ，可促进IEL 的生长、发育和增殖。有人报道IL-7受体缺损的小鼠伴随着γδIELs 的缺损。由于γδIEL 具有调节IgA 的免疫应答，故这类小鼠小肠黏膜IgA 的浆细胞明显减少，血清IgA 的浓度和IgA 对抗原刺激的应答亦相应下降（Kagnoff ME 等，1996）。
上皮内淋巴细胞有以下几种主要功能：①分泌IFN-γ，IL-5，TFN-α和IL-2离的CD4 IEL 可表达TH 2细胞因子IL-4、IL-5、IL-6和IFN-γ的mRNA 。②抗原特异性辅助功能。CD4 IEL 分泌的TH 2细胞因子与B 细胞分化成IgA 和IgG 分泌浆细胞密切相关。因此，iIEL 可作为体液免疫中TH2辅助细胞，参加辅助B 细胞分化的作用。③具有NK 细胞的活性。许多研究报道鸡的IEL 具有NK 细胞的活动性（Lefrancois L 等，1989），故可抵抗肠道微生物感染。此外，有实验表明iIEL 与肠上皮细胞之间存在明显的相互影响，Kiyono H 报道上皮细胞产生的IL-7可刺激γδTCR IEL 的形成。上皮细胞产生干细胞生长因子(SCF),而IEL 则可表达SCF 受体。IEL 在IL-7、IL-2和SCF 刺激下，可上调IL-7受体。实验还证明γδTCR IEL 具有调节黏膜IgA 免疫反应的作用,γδ-knock out 小鼠肠黏膜中IgA 浆细胞数目显著下降（Martin F 等，1996）。④刺激上皮细胞更新。⑤对食物抗原耐受。
2.2.3 巨噬细胞
巨噬细胞(ma 抗原递呈免疫细胞，参与特异性免疫应答；另一方面它吞噬异物，非特异性杀灭病原体，故在机体非特异性免疫中也起重要作用（肖贞良等，2001）。但在一些情况下, M Φ吞噬一些外来细菌或寄生虫后，只吞而不杀，使这些细菌和寄生虫在M Φ内增殖繁衍，导致疾病发生，这类细菌称为胞内菌，如分枝杆菌、沙门氏菌、布氏杆菌等。寄生虫如利什曼原虫也能在M Φ内生存繁殖。近来研究发现，胞内菌能否在M Φ内存活，除了自身必备的特殊生理特性和相关基因外，也受到宿主M Φ的一些基因的控制，其中目前认为最为重要，研究最为活跃的是一种M Φ蛋白——天然抵抗力相关巨噬细胞蛋白。巨噬细胞为循环中单核细胞迁入组织分化而来，也可由B 细胞在成纤维细胞等刺激下转化而来，后者主要递呈细菌与细胞膜成分。
2.3 肠黏膜免疫应答过程
当细菌、病毒、原虫等颗粒膜淋巴组织的M 细胞接触，M 细胞可吞噬这些抗原物质并以小囊泡形式转运给上皮内淋巴细胞。上皮内淋巴细胞接受刺激后可能迁出上皮进入固有层，并可将抗原信息传递给固有层
中的淋巴细胞，使B 细胞和T 细胞致敏。被抗原致敏的B 细胞和T 细胞通过淋巴导管系统迁移至肠外淋巴组织发育成熟后重新分布于消化道和呼吸道等处的黏膜固有层和上皮内（Richard A 等，2002）。黏膜固有层是一个重要的黏膜效应部位，B 细胞在固有层定居下来，并在抗原、T 细胞和细胞因子的刺激下增殖变为成熟的IgA 浆细胞。IgA 在浆细胞内产生，由J 链(含胱氨酸较多的酸性蛋白)连接成双聚体分泌出来。当IgA 通过黏膜上皮细胞向外分泌时，与吸收细胞产生的糖蛋白分泌片连接成完整的分泌性免疫球蛋白(sIgA)。吸收细胞又将sIgA 吞入胞质后再释入肠腔。当sIgA 通过黏膜上皮细胞向外分泌时，与上皮细胞产生的分泌片连接成完整的sIgA ，释放到分泌液中，与上皮细胞紧密结合在一起，分布在黏膜表面发挥免疫作用。其基本过程的示意图（如图1-2）。
黏膜免疫应答应因子。sIgA 分子图1-2 黏膜免疫应答过程示意图（引自Richard A. Goldsby 等，2002）
过程产生的分泌型免疫球蛋白A(sIgA)分子是黏膜免疫的主要效由2个多聚Ig 受体单位和2个外加的多聚多肽链，J 链和分泌片段（SC ）（多聚Ig 受体）组成。sIgA 的轻链、重链和J 链由浆细胞合成，而与sIgA 结合的SC 由黏膜上皮细胞和外分泌腺产生。sIgA 具有多种生物学功能。sIgA 除了为黏膜表面提供一个免疫屏障防止微生物的粘附和能结合黏膜固有层中的抗原避免局部形成免疫复合物外，目前发现sIgA 还具有抗炎症调节和调理作用。免疫反应常常导致炎性反应。sIgA 的免疫排斥机制可消除IgE 和IgG 的炎性抗体介导的过敏反应（
Jarvis GA 等，1991）。黏膜局部较多的sIgA 可有效地抵抗入侵的病原体，sIgA 能参加IgE 和IgG 混合免疫复合物的形成，因此sIgA 可看成是内环境稳定的调节者，确保炎症反应对机体产生较小的损伤。sIgA 除了与黏膜上皮膜上的多聚Ig 受体结合外，还可与嗜酸性粒细胞、单核细胞、巨噬细胞和中性粒细胞膜上的Fc α受体结合。嗜酸性粒细胞表面的受体与sIgA 结合可引起脱颗粒现象。黏膜组织中经常存在嗜酸性粒细胞以抵抗寄生虫的感染可能与sIgA 的作用有关。sIgA 与单核细胞相互作用可下调炎性因子如IL-1、TNF-α和IL- 6的释放（Wolf HM 等，1996）。sIgA 通过主动和被动免疫在黏膜免疫中发挥着重要的作用。sIgA 能粘附在M 细胞的表面，促进少量抗体的吸收。实验证明sIgA 本身可作为黏膜免疫疫苗的携带者；SC 与sIgA 结合可将弗氏志贺氏菌侵袭素B 的保护性外源抗原决定部位传递给肠淋巴组织