001-经口急性毒性试验方法-改良寇氏法

急 性 毒 性 试 验 方 法

――改良寇氏法

K?rber 法由K?rber 于1931提出，后经Finney 改进，顾汉颐作过改进，1963年孙瑞元教授对该法进一步改进，改进后的计算方法称为点斜法或孙氏法，增加了不含0%和100%死亡率的校正式，所得LD 50及全部有关参数与正规概率单位法相近。

改良寇氏法（K?ber）试验设计的原则是：各组剂量按等比级数；各组动物数相等：大致有一半组数的动物死亡率在10%～50%之间，另一半在50%～100%之间，最好出现0 %和100 %的剂量组。

一、剂量选择及分组

1、剂量选择

剂量设计是否合理是急性毒性试验能否成功的关键。

探求外源化学物的急性毒性，测定其LD 50或LC 50时，应首先广泛查阅文献资料，了解该化学物的化学结构和理化性质，如结构式、分子量、溶解度、挥发度、纯度及杂质含量等，其次确定测定LD 50的计算方法，然后设计剂量。

2、预试验：

总的原则是先用少量动物，以较大的剂量间距染毒，求出粗略的致死剂量范围，即确定受试动物全部致死的最小剂量（b ）和全部不致死的最大剂量（a ），即求出待测化学物0 %~100 %的大致致死剂量范围，然后在这个剂量范围内按几何级数的间距设计5~7个剂量组，组间剂量呈等比级数（r ），其比值为1.2~1.5。进行正式实验。

用于急性毒性试验时，动物的体重为：大鼠180~200g ，小鼠18~22g ，豚鼠200~250ｇ，家兔2~2.5kg ，犬10~12 kg 。用于实验的同一批动物体重变异范围不得超过所用动物平均体重的20%。仍然遵守雌雄各半或雌雄兼取的原则。当预试中发现化学物的毒性有明显的性别差异时，则需要选用雌、雄两种性别的动物分别进行试验，求出各自的LD 50。

通过预试，找出受试化学物引起动物死亡的大致剂量范围，以此为依据设计正式试验的剂量和分组。 按下式设计剂量组：

1

n a

b

r -= 式中：r —相邻两组剂量的比值，一般为1.2～1.5，

b —最低全致死剂量量， a —最高不致死剂量， n —设计的组数。

分组恰当与否也是确保实验结果准确的条件之一。因为组数过多，需要消耗较多的动物，还可能出现较大剂量组动物死亡率低于较小剂量组；组数过少，不能较精确求出LD 50。 3、根据公比(r)计算各组剂量

各组剂量分别为： 第一组：a 第二组：a r 第三组：a r 2

第五组：a r 4 第六组：a r 5

二、受试物溶液配制

1、溶剂的选择

毒理学试验中，常用的剂型有液体剂型、固体剂型。液体剂型中有溶液剂、混悬剂、乳化剂等。选择溶剂的原则是不与受试物发生化学反应，不改变化学物的毒性，故应根据受试物的理化性质，选择适当的溶剂。

一般而言，水溶性化学物可选择蒸馏水或生理盐水，以水为溶剂，既经济、方便、易吸收，又无毒副作用。脂溶性化学物多选用植物油，如花生油、橄榄油。不溶于水而溶于油的化学物常用吐温-80或吐温-60配制成乳化剂。既不溶于水又不溶于油脂的化学物可选择淀粉液、明胶液、羧甲基纤维素钠液（0.5-1% CMC ）等助悬剂配制成混悬液。如用有机溶剂，实验动物应设溶剂对照组，有机溶剂所用比例不宜超过10%，溶解后，再用水稀释，必要时可加入增溶剂，如吐温-80、聚乙二醇等，以提高溶液剂的浓度。

2、配制方法

将受试物配制成一种浓度，不同剂量组实验动物单位体重所给受试物的体积不同，剂量越高，所用的体积越大；剂量越低，所用的体积越小。比如某受试物的试验剂量分别为100、200、400和800mg/kg ，受试物配制成10 mg/ml ，每组动物每10g 体重分别给与0.1、0.2、0.4和0.8 ml 。

将受试物配制成不同浓度，不同剂量组实验动物单位体重所给受试物的体积相同，剂量越大，受试化学物配制的浓度越高。上例中，若实验动物按0.2ml/10g b.w 容量灌胃,则应配制成4个不同浓度,即5mg/ml 、10mg/ml 、20mg/ml 和40mg/ml 。

灌胃体积依所选用的实验动物而定，一次灌胃的体积为：小鼠0.1～0.4ml/10g b.w ，每只不超过1ml ；大鼠0.5～1ml/100g ，每只不超过4ml;家兔在5ml/kg 之内;犬不超过50ml/kg ；

为避免操作误差，等容量稀释的传统方法常采用1∶K 系列稀释法。该法操作简便、浓度精确、节约受试化学物。

a 、 确定各剂量组所需受试液浓度

如已知最高剂量组剂量为2000mg/kg b.w.，小鼠按等容量方法给予受试药液，即0.2ml/10g b.w.，相

当于20ml/1000g b.w.，故最高剂量组所需受试液的浓度（母液浓度）为2000 mg/20ml ，即10.0%（C 1）。

b 、 确定每组所需受试液的量（m ml ）

按每只鼠体重25g 计算（将损耗也计算在内），给药量为0.2ml/10g b.w.，则每组10只动物所需受

试液的量为5ml ；

c 、 确定母液总量

配制时，根据实验设计要求确定最高剂量组所需受试化学物的浓度和总体积，配制母液。设母液浓度为C 1，各组所需要的量为m ml ，母液应配制的总量M 用下述公式计算：

K

1m

M -=

式中， K 为各组剂量的比值，K=1/r 。

选择适当的溶剂配制浓度为C 1的受试液，取M ml 作为母液，从母液中取出m ml 供最高剂量组染毒用；然后取m ml 溶剂加入剩余的母液中，混匀，稀释后的母液浓度为C 2（C 1 ：C 2=1：k= r ），即次高剂量组所要求的浓度，从中取出m ml 供次高剂量组染毒用（第2组），然后再加入m ml 溶剂，其稀释后的浓度为C 3（C 2 ：C 3=1.2），取出m ml 供第3组动物染毒用。依此类推，可配制成按1∶K 递减的各剂量组不同浓度的试液。

三、染毒

各组小鼠分别按等容量方法给予相应浓度的受试药液，即0.2ml/10g b.w.。

四、观察指标与试验期限

急性中毒症状及出现时间，死亡数量、时间。大体剖检变化。 试验期限为7-14天

五、结果及LD50的计算

采用寇氏法计算LD 50及其95%可信限 1、试验结果列表

表 试验结果

2 计算LD 50

当急性毒性试验的最大剂量死亡率为100%，最小剂量的死亡率为0%；各组动物数相等；各剂量组的组距等比或剂量对数等差时，用下述基本公式计算LD 50：

)]5.0p (

i X [log LD m 150∑--=-

当不含0%和100%死亡率时，用下式计算LD 50：

)]4

P P 3p (

i X [log LD n

m m 150∑---

-=- n

pq i

S 50

x ∑= 以上各式中：i —组距，即相邻两组剂量对数剂量之差

X m —最大剂量对数

P —各剂量组死亡率(死亡率均用小数表示) P m —最高死亡率

q —各组剂量存活率，q=1-p

P n —最低死亡率

∑p —各剂量组死亡率之和 n —各组动物数 S x50—logLD 50的标准误

LD 50 的95 %可信限=log -1(log LD 50±1.96×S x50)

改进K?rber 法的优点是计算简便、结果精确，实用性大。我国《新兽药一般毒性试验技术要求》规定用此法计算新兽药的LD 50。

举例：给小鼠口服某药进行急性毒性试验，测定LD 50。

选择体重18~24g 健康小鼠（雌雄各半），按随机方法将动物分为5个组，每组10只。经预试找出死亡率在0~100%的剂量范围大约为300~600mg/kg b.w. 。

（1) 预试

（略） （2） 计算公比

1

n a

b

r -=

（3） 根据公比(r)计算各组剂量

因而各组剂量分别为：

第一组：a=300mg/kg b.w.

第二组：a r =300?1.2 = 360mg/kg b.w. 第三组：a r 2 =300?1.2 2 = 432mg/kg b.w. 第四组：a r 3 =300?1.2 3 = 518mg/kg b.w. 第五组：a r 4 =300?1.2 4 = 622mg/kg b.w.

（4） 受试液配制

采用1：K 系列稀释法配制不同浓度的受试液。（K ＝1/r ）

a 、 确定各剂量组所需受试液浓度：

已知最高剂量组剂量为622mg/kg b.w.，小鼠按等容量方法给予受试药液，即0.2ml/10g b.w.，相

当于20ml/1000g b.w.，故最高剂量组所需受试液的浓度（母液浓度）为622 mg/20ml ，即3.11%（C 1）； b 、 确定每组所需受试液的量

按每只鼠体重25g 计算（将损耗也计算在内），给药量为0.2ml/10g b.w.，则每组10只动物所需受

试液的量为5ml ；

c 、 确定母液总量

各组动物需用本组浓度受试液的用量为5 ml （m ）；各剂量组之比为0.833（k=1/ r ），则母液应配制的总量为（ml ）：

d 、 配制母液

选择适当的溶剂配制浓度为3.11%（C 1）的受试液，取30 ml 作为母液，从母液中取出5ml 供第五组（最高剂量组）接毒用，然后取5 ml 溶剂加入25ml 母液中混匀，稀释后的母液浓度为2.59%（C 2）（C 1 ：C 2=1：k=1.2），即第四组（次高剂量组）所要求的浓度，从中取出5 ml 供第四组接毒用，然后再加入5 ml （ν ml ）溶剂，其稀释后的浓度为2.16%（C 3）（C 2 ：C 3=1.2），即第三组所需的浓度。依此类推，可配制第二组、第一组所需浓度的受试液，分别为1.80%、1.50%

（5） 接毒

各组小鼠分别按等容量方法给予相应浓度的受试药液，即0.2ml/10g b.w.。 （6） 观察指标

（7） 结果及LD50的计算

采用寇氏法计算LD 50及其95%可信限 a 、将试验结果列入下表，按改良寇氏法进行计算；

表 试验结果

b 、按下列公式计算：

)]5.0p (

i X [log LD m 150∑--=-

即：logLD 50=Xm -d （∑p -0.5）

Xm=log622=2.7938 i=log 1.2=0.0792 p=0+0.2+0.5+0.7+1.0=2.4

代入公式：logLD 50= 2.7938-0.0792（2.4-0.5）=2.6433 c 查反对数求出LD 50=439.87 mg/kg b.w.。

d 计算LD 50的标准误（S ）：

n

pq i

S 50x ∑=

=0.0792×0.249=0.0197

e 计算LD 50的95%可信限：

LD 50的95%可信限= log -1（logLD 50±1.96×S logLD 50）= log -1（2.6433±1.96×0.0197） = log -1（2.6433±0.0386）= log -1（2.6047~2.6819）=402.44~480.73 mg/kg b.w.