SDS-PAGE电泳SOP

SDS-PAGE电泳标准操作规程

1.目的：

制定本规程以规范还原性SDS-PAGE和非还原性SDS-PAGE电泳方法分离蛋白的操作过程。

2.范围：

抗原或是抗体的定性鉴定、纯度鉴定和相对定量比较。

3.责任：

质量分析人员熟悉并遵守该标准操作规程。

4.定义：

N/A

5.设备、材料和试剂：

5.1设备、材料

设备名生产商型号/货号设备编号备注

电泳仪伯乐PowerpacHC TM HV JS026

垂直电泳槽伯乐Miniprotean JS025

干式恒温浴K30 JS045

离心机eppendorf F-45-12-11 JS020

单道移液器（10ul,100ul）Eppendorf Research plus JH07931,

GH15898

冰箱TCL BCD-211KD3 N/A

摇床QILIM BEIER N/A

PH仪梅特勒

5.2试剂

试剂名称生产商货号批号

APS国药集团化学试剂F20111213甲醇国药集团化学试剂20130407 冰醋酸国药集团化学试剂130420

考马斯亮蓝R-250 国药集团化学试剂20130322 Tris-HCl 国药集团化学试剂201300422 甘油国药集团化学试剂

溴酚蓝国药集团化学试剂20120929 无水乙醇国药集团化学试剂

甘氨酸国药集团化学试剂

SDS

DTT

Protein Marker

盐酸国药集团化学试剂

2×PAGE 7.5%凝胶制备试剂盒Promoton PG111 分离胶缓

分离胶溶液

4%浓缩胶浓缩胶预混液

6.溶液配制

6.1分离胶

以1mm板，配两块为例：

取7.5%的分离胶缓冲液和分离胶各5ml混匀，再向其加入10%的APS溶液100μl混匀。

6.2 浓缩胶

以1mm板，配两块为例：

取浓缩胶的预混液4ml，向其加入10%的APS溶液40μl混匀。

6.3 上样缓冲液（loading buffer）：

6.4 10%过硫酸铵

称取1g APS，加入10ml纯水搅拌溶解（现配现用）也可储存4~8℃冰箱中保存，保存期为1-2周。

6.5电极缓冲液

6.6染色液

6.7脱色液（1000）

考马斯亮蓝R-250脱色液：

量取甲醇或者乙醇50ml ，醋酸100ml，加入纯水混匀至定容1000ml

考马斯亮蓝G-250脱色液：

量取适量的自来水。

7.操作步骤

7.1凝胶板的制备

先把1mm凝胶玻璃板板固定到支架上，把配制好的分离胶溶液，混匀后用移液枪将凝胶液加至长、短玻璃板之间的缝隙内加入到适当位置（举短玻璃板顶部2cm），用装有75%的酒精喷壶喷其胶面，以进行封面压平。10min后，凝胶与水封层间出现折射率不同的界线，则表示凝胶完全聚合，倾去封层的酒精，再用滤纸条吸去多余水分。

将配置好的浓缩胶混匀后，用移液管将浓缩胶加到已聚合的分离胶上方至满，轻轻将样品槽模板插入浓缩胶内，约10min后凝胶聚合。将电极缓冲液倒入上、下储槽中，应没过长玻璃板，小心拔去样品槽模板，即可准备加样。

7.2样品的处理与加样

取20ul两份样品分别加入20ul loading buffer和DTT还原剂1:1混匀，溶解后在100摄氏度干式恒温浴温3min，取出10000rpm离心30-60S。

加样体积要根据样品浓度决定 (通常为 2 ug蛋白)；在凝胶中央加入protein marker 3-5 ul。

7.3电泳

盖上电泳槽连接电泳仪，正负极对应插好，调电泳电压在60-70V之间，电流在30-40mA左右；待样品前沿距硅胶框底边1cm时，停止电泳，关闭电源。

7.4凝胶板的剥离

电泳结束后，用工具打开玻璃板，取下凝胶，电极缓冲液倒入相应的储液瓶中。

7.5染色与脱色

染色加入20 ml至25 ml快速染色液（按盛胶容器的大小而定，以浸没胶面为准），加热至沸腾后保持沸腾状态30-60秒（微波炉最小火，加热10-60秒，到约80度或沸腾为止），停止加热后继续在脱色摇床上摇动5-10分钟，弃去染色液（此时蛋白条带应已可见）。染色液可重复使用多次。

脱色加入约50 ml水，加热至沸腾后保持沸腾状态30-60秒，停止加热后继续在脱色摇床上摇动5-10分钟，倒掉脱色液即可完成脱色，观察结果，如背景深。可重复此步骤。

8拍照分析

将脱色后的胶置于透明文件夹中，或放到扫描仪上，拍照

根据protein marker，来为蛋白的鉴定提供分子量信息

9.参考资料

N/A

10.相关文件

N/A

11.附录

N/A