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线粒体提取方法

线粒体提取试剂盒

产品组成：

产品组成 BB-3601-1 BB-3601-2

规格 50T 100T

线粒体提取液A 20ml 40ml

线粒体提取液B 20ml 40ml

线粒体保存液 20ml 40ml

产品简介：

本试剂盒可用于各种动物细胞和实体软、硬组织样本的线粒体提取。不能用于冷冻样品

的线粒体提取。

细胞线粒体提取：

1.取1-2×107个细胞，在4℃，500×g条件下离心2-3分钟，小心吸取培养基，

尽可能吸干，收集细胞；

2.用冷PBS洗涤两次，每次洗涤后尽可能吸干上清。

3.加入400μl冷的试剂A，置冰上10分钟。

4.用Dounce匀浆器匀浆30-40下，然后在4℃，500×g条件下离心5分钟。

5.快速将上清吸入另一预冷的干净离心管。

6.在4℃，11000×g以上条件下离心20分钟。

7.在沉淀中加入400μl冷的试剂B，混匀。

8.在4℃，11000×g以上条件下离心20分钟。

9.弃上清，沉淀用线粒体保存液重悬。

10.即得到线粒体样品，置冰箱备用或直接用于下游实验。

组织线粒体提取：

a)取50-100mg新鲜动物组织样本，用PBS洗涤干净。

b)用剪刀尽可能剪碎，用冷PBS洗涤两次。

c)加入400μl冷的试剂A，置冰上10分钟。

d)用Dounce匀浆器匀浆30-40下，然后在4℃，500×g条件下离心5分钟。

e)快速将上清吸入另一预冷的干净离心管。

f)在4℃，11000×g以上条件下离心20分钟。

g)在沉淀中加入400μl冷的试剂B，混匀。

h)在4℃，11000×g以上条件下离心20分钟。

i)弃上清，沉淀用线粒体保存液重悬。

j)即得到线粒体样品，置冰箱备用或直接用于下游实验。

线粒体的分离

————————————————————————————————作者：————————————————————————————————日期：

实验三线粒体的分离、超活染色与观察一、实验目的 1、学习差速离心法分离动、植物线粒体技术。 2、观察动、植物活细胞内线粒体的形态、数量与分布。 3、学习细胞器的超活染色技术。二、实验原理利用沉降系数不同的颗粒，在一定介质中沉降速度的差异，采取分级差速离心的方法，将线粒体从细胞悬液中逐级分离出来。离心用的悬浮介质通常用缓冲的蔗糖溶液，它比较接近细胞质的分散相，在一定程度上能保持细胞器的结构和酶的活性，在pH7.2的条件下，亚细胞组分不容易重新聚集，有利于分离。整个操作过程应注意使样品保持4℃，避免酶失活。活体染色是指对生活有机体的细胞或组织能着色但又无毒害的一种染色方法。它的目的是显示生活细胞内的某些结构，而不影响细胞的生命活动和产生任何物理、化学变化以致引起细胞的死亡，可用来研究生活状态下的细胞形态、结构和生理、病理状态。体外活体染色又称超活染色，它是由活的动、植物分离出部分细胞或组织小块，以活体染料溶液浸染，染料被选择固定在活细胞的某种结构上而显色。詹纳斯绿B（Janus green B）和中性红（neutral red）两种碱性染料是活体染色剂中最重要的染料，对于线粒体的染色各有专一性。线粒体的鉴定用詹纳斯绿活染法。詹纳斯绿B（Janus green B）是对线粒体专一的活细胞染料，毒性很小，属于碱性染料，解离后带正电，由电性吸引堆积在线粒体膜上。线粒体的细胞色素氧化酶使该染料保持在氧化状态呈现蓝绿色从而使线粒体显色，而胞质中的染料被还原成无色。三、实验材料与方法 1、材料：人口腔上皮细胞、大鼠肝脏、玉米黄化幼苗（水稻、高粱等幼苗均可）、洋葱鳞茎内表皮细胞。 2、主要试剂和仪器：Ringer 溶液，10%、1/3000中性红溶液，1%、1/5000詹纳斯绿B 溶液；分离介质：0.25mol/L蔗糖、50mmol/L的Tris-盐酸缓冲液（pH7.4），3mmol/L EDTA，0.75mg/ml牛血清白蛋白（BSA），50mmol/L的Tris-HCl缓冲液(pH7.4)，0.3mol/L 甘露醇（pH7.4）、20%次氯酸钠（NaClO）溶液、1%詹纳斯绿B染液，生理盐水，0.25mol/L蔗糖＋0.01mol/L Tris-盐酸缓冲液(pH7.4)，0.34mol/L蔗糖＋0.01mol/L Tris-盐酸缓冲液(pH7.4)，固定液，姬姆萨染液，1/15mol/L磷酸盐缓冲液（pH6.8）。温箱，冰箱，冷冻控温高速离心机（或普通高速离心机），高速离心机，显微镜，恒温水浴锅，解剖盘，玻璃匀浆器，剪刀、镊子，双面刀片，载玻片，凹面载玻片，盖玻片，漏斗，小烧杯，表面皿，吸管，牙签，吸水纸，纱布，瓷研钵，尼龙织物。四、实验方法（一）大鼠肝线粒体的分离 1、制备大鼠肝细胞匀浆。实验前大鼠空腹12h，击头处死，剖腹取肝，迅速用生理盐水洗净血水，用滤纸吸干。称取肝组织2g，剪碎，用预冷到0－4℃的0.25mol/L缓冲蔗糖溶液洗涤数次。然后在0－4℃条件下，按每克肝加9ml冷的0.25mol/L缓冲蔗糖溶液将肝组

实验四线粒体的分离与观察

实验八线粒体的分离与观察实验目的用差速离心法分离动、植物细胞线粒体。实验原理线粒体(mitochondria)是真核细胞特有的，使能量转换的重要细胞器。细胞中的能源物质——脂肪、糖、部分氨基酸在此进行最终的氧化，并通过耦联磷酸化生成ATP，供给细胞生理活动之需。对线粒体结构与功能的研究通常是在离体的线粒体上进行的。制备线粒体采用组织匀浆在悬浮介质中进行差速离心的方法。在一给定的离心场中(对于所使用的离心机，就是选用一定的转速)，球形颗粒的沉降速度取决于它的密度、半径和悬浮介质的粘度。在一均匀悬浮介质中离心一定时间内，组织匀浆中的各种细胞器及其它内含物由于沉降速度不同将停留在高低不同的位置。依次增加离心力和离心时间，就能够使这些颗粒按其大小、轻重分批沉降在离心管底部，从而分批收集。细胞器中最先沉淀的是细胞核，其次是线粒体，其它更轻的细胞器和大分子可依次再分离。悬浮介质通常用缓冲的蔗糖溶液，它比较接近细胞质的分散相，在一定程度上能保持细胞器的结构和酶的活性，在pH7.2的条件下，亚细胞组分不容易重新聚集，有利于分离。整个操作过程应注意使样品保持4℃，避免酶失活。线粒体的鉴定用詹纳斯绿活染法。詹纳斯绿B(Janus green B)是对线粒体专一的活细胞染料，毒性很小，属于碱性染料，解离后带正电，由电性吸引堆积在线粒体膜上。线粒体的细胞色素氧化酶使该染料保持在氧化状态呈现蓝绿色从而使线粒体显色，而胞质中的染料被还原成无色。 I．鸡肝线粒体的分离实验用品一、材料鸡肝脏二、试剂 1. 生理盐水 2．1％詹纳斯绿B染液，用生理盐水配制。 3. 0. 25 mol／L蔗糖+0.01mol／L Tris-盐酸缓冲液（ph7.4）：

核与线粒体分离提取方案

线虫细胞核和线粒体提取 N2同步化后，转移至培养皿，每皿大约4000条，2 day后到了mid-late L4，day5，day10，day15收集线虫（也有文献选择1、6、12、17day）。初步计划收集10个皿线虫。 1.细胞核分离细胞核蛋白提取查阅的文献上都没提及是用哪个厂家的试剂盒，只简单说了自己采用的方法，也不是很具体。查到一份Protocol采用蔗糖分离法提取细胞核，此方法开始是用于肝组织(Widnell and Tata 1964)，后来被用于动物软组织(Rickwood et al. 1997)，后来成功用于肌细胞和培养的细胞。方法如下： 1.在10cm细胞培养皿中培养的细胞系，直到它们达到90％汇合 2.分离当天，吸出培养基，然后用冰冷的PBS清洗细胞。吸出PBS。 3.将培养皿放在冰上，用1 mL PBS将细胞从板上刮掉。转移将细胞加入到冰上的1.5mL离心管中。 4.以10000rpm短暂离心5-10秒。 5.吸掉上清液，并将沉淀物重悬在9个填充细胞体积均质培养基中 6.用Potter-Elvehjem匀浆器将悬浮液均质化，冰上匀6次 7.用棉布过滤匀浆 8.在4℃下以600g离心滤液10分钟。丢弃上清液。用步骤5中一半体积的均匀培养基重悬沉淀。4℃ 600g 离心10分钟。丢弃上清液。 10.将9体积的高渗蔗糖缓冲液加入沉淀。在Potter-Elvehjem匀浆器（5或6冲程）或Dounce均化器在冰上。 11.在4℃下以60,000g-80,000g离心匀浆80分钟。 12.翻转管子去除蔗糖。从管壁擦去剩余的蔗糖，注意不要擦掉细胞核。核在这个阶段保留其膜。要卸下膜，请执行步骤13。 13.为了除去核膜，将来自步骤12的沉淀重悬含有0.5％Triton X-100的匀浆介质。在4℃下以600g离心10分钟。重复该过程。最后，如果需要，用均质介质洗涤沉淀以除去剩余的TritonX-100。 14.将沉淀物重悬在选择的介质中用于随后的分析。分离的细胞核可以尝试裂蛋白，再用BCA法检测蛋白浓度。 2.线粒体提取查阅了文献，线粒体蛋白提取采用的是Qproteome Mitochondria Isolation Kit (Qiagen 37612)，流程如下： 1.将新鲜切除的组织放在冰上，取出适当的大小样品。用1ml 0.9％（w / v）氯化钠溶液洗涤样品。 2.将样品切成约2毫米3片，放入2毫升反应液中管，并加入500μl含蛋白酶抑制剂的裂解液。 3.使用TissueRuptor转子定子使样品均质化，均质器设最低速度转10s。 4.吸取1.5ml含有蛋白酶抑制剂的裂解缓冲液加入管中并孵育在4℃摇床上10分钟。 5.在4℃下以1000xg离心匀浆10分钟。 6.小心地清除上清液 7.将细胞沉淀重悬于1.5ml冰冷的破碎缓冲液中使用1毫升枪头吹打。细胞使用钝头针头和注射器进行破

组织线粒体分离试剂盒

组织线粒体分离试剂盒简介：线粒体是细胞呼吸的主要场所，细胞活动所需的能量主要由在线粒体内进行的氧化所产生的能量来供应。制备线粒体的关键是保持线粒体的完整性和纯度，可通过分级分离法获得，即先低俗出去细胞核以及细胞碎片，再进行高速梯度离心分离线粒体。 Leagene 组织线粒体分离试剂盒(Tissue Mitochondria Isolation Kit)是快速便捷分离动物组织中的线粒体的试剂盒，分离线粒体的同时可以获得去除线粒体的细胞浆蛋白，可用于分析细胞色素C 等线粒体蛋白向胞浆的释放，大部分获得的线粒体都含有完整的内膜和外膜，并具有线粒体的生理功能(如检测线粒体膜电位)，获得的蛋白可用于SDS-PAGE 、Western 、双向电泳等蛋白分析。该试剂盒可用于从动物软组织(如脑、肝脏)和硬组织(心肌、骨骼肌)中提取线粒体，对于采用该试剂盒提取硬组织线粒体效果不佳者，建议采用Leagene 硬组织线粒体分离试剂盒。该试剂盒仅用于科研领域，不宜用于临床诊断或其他用途。组成：自备材料： 1、低温离心机、匀浆器 2、 PBS 操作步骤(仅供参考)： 1、清洗：取新鲜组织(不宜采用冻存的组织)，迅速称重，用预冷的PBS 清洗1次，冰上剪成3mm 2大小的组织碎片。 2、匀浆裂解：加入Mitochondria Lysis buffer(如需获得细胞浆蛋白，应提前加入PMSF ，至PMSF 浓度为1×)，置于冰浴上Dounce 匀浆器中，匀浆10～20次。不同组织或不同匀浆器所需的匀浆次数有所不同，需自行优化。 3、离心以去除细胞核、未破碎的细胞和大的膜碎片。注：如需获得纯度更高的线粒体，可编号名称 CS0010 50T Storage 试剂(A): Mitochondria Lysis buffer 100ml -20℃ 试剂(B): Mitochondria Stock buffer 10ml -20℃ 试剂(C): Protein Stock buffer (5×) 10ml RT 试剂(D): PMSF(100×) 1.5ml -20℃ 使用说明书 1份

线粒体的提取与纯化

mt DNA的分离及纯化按戴建华等报道的方法，就具体情况稍加改进，步骤如下（除特别说明，均在4℃下完成）：1.1 取新鲜肝组织，放在缓冲液A（0.25M 蔗糖，0.01M Tris·Hcl，0.001M Na2-EDTA，pH8.0）中漂洗2~3次，尽可能去除表面血污、结缔组织及脂肪组织后剪碎。按组织重﹕缓冲液A=1﹕5~10加入缓冲液A，用玻璃匀浆器冰浴匀浆。 1.2 1000 g?min-1离心15min；取上清液；15000 g?min-1离心20min，弃上清，沉淀用缓冲液B （0.25M 蔗糖，0.05M Tris·Hcl，0.007M Mg Cl2，p H7.5）洗涤，按0.5m L?g-1肝的比例加入缓冲液B 悬浮沉淀后加入DNase I 至终浓度为100 μg?m L-1，30℃下作用30min。 1.3 冰浴冷却，加入2倍体积的DNase I反应终止液（0.25M蔗糖，0.1M Na2-EDTA，pH8.0）。15000g?min-1离心20min。沉淀用DNaseI反应终止液洗涤一次，重复离心。 1.4 按0.5 m L?g-1肝加入缓冲液C（0.1M Nacl，0.05M Tris·Hcl，0.01M Na2-EDTA，p H8.5）悬浮沉淀，加入SDS至终浓度为1%~1.5%，吸打混匀后37℃保温15min。 1.5 用等体积的苯酚，苯酚/氯仿（1:1），氯仿/异戊醇（24:1）各抽提一次。取水相，加0.2 倍体积1M Na Ac和2倍体积的预冷无水乙醇，混匀后放在4℃冰箱中过夜。 1.6 15000g?min-1离心30min后去上清；沉淀用70%乙醇洗涤2次，干燥，TE（0.01M Tris·Hcl， 0.001M Na2-EDTA，pH8.0）溶解。 1.7 加入预处理的RNase I 至终浓度为50μg?m L-1，37℃保温1h。4℃保存待用。

线粒体蛋白质组学的研究进展(一)

线粒体蛋白质组学的研究进展(一) 【摘要】线粒体是真核细胞重要的细胞器，随着蛋白质组技术的发展和完善，一些新方法也被应用于线粒体蛋白质的研究，线粒体蛋白质组研究虽然已取得了一些成果，但线粒体蛋白质组数据库中的数据仍较匮乏，并且还有一些问题亟待解决和改善。【关键词】线粒体；蛋白质组学人类体细胞中除了红细胞，其他所有细胞均含有线粒体。线粒体是真核细胞重要的细胞器，它不仅是机体的能量代谢中心，而且还参与多种重要的细胞病理过程。线粒体拥有自己的DNA（mtDNA），可以进行转录、翻译蛋白质合成。线粒体含有500～2000种蛋白质，约占整个细胞蛋白质种类的5%~10%。线粒体的蛋白质参与机体许多生理、病理过程，如参与电子传递和ATP合成、三羧酸循环、脂肪酸氧化、氨基酸降解等过程。线粒体蛋白质结构与功能的改变与人类许多疾病相关，如退行性疾病、心脏病、衰老和癌症。运用蛋白质组研究技术，从整体上研究这些蛋白质在生理及病理状态下的变化趋势及相互关系，可以为线粒体作用机制的探索提供新的有力的支持。 1线粒体的超微结构和功能线粒体是机体细胞中重要的亚细胞器，它具有独特的超微结构和多种重要的生物学功能。线粒体由两层膜包被，外膜平滑，内膜向内折叠形成嵴，两层膜之间有腔，线粒体中央是基质。基质内含有与三羧酸循环所需的全部酶类，内膜上具有呼吸链酶系及ATP酶复合体。线粒体是细胞内氧化磷酸化和形成ATP的主要场所，有细胞“动力工厂”之称。线粒体合成的ATP供给几乎所有的细胞生理过程：从骨骼肌和心肌的收缩，到细胞膜跨膜离子梯度的维持、甚至激素和神经递质的分泌等。另外，线粒体有自身的DNA和遗传体系，但线粒体基因组的基因数量有限，因此，线粒体只是一种半自主性的细胞器。线粒体的主要化学成分是蛋白质和脂类，其中蛋白质占线粒体干重的65%~70%，脂类占25%~30%。在肝细胞线粒体中外膜、内膜、膜间隙和基质四个功能区，各蛋白质的含量依次为：基质67%，内膜21%，外膜8%，膜间隙4%。内膜含有三类功能性蛋白：（1）呼吸链中进行氧化反应的酶。（2）ATP合成酶复合物。（3）一些特殊的运输蛋白，调节基质中代谢物的输出和输入。细胞线粒体的功能，不仅限于生物学功能。它们在氨基酸和血脂新陈代谢、血红素和铁硫群生物合成、细胞信号与细胞凋亡发挥关键作用。 2线粒体蛋白质组学概述 2.1蛋白质组学的概念蛋白质组学（proteome）一词，源于蛋白质（protein）与基因组（genome）两个词的杂合，意指“一种基因组所表达的全套蛋白质”，即包括一种细胞乃至一种生物所表达的全部蛋白质。蛋白质组本质上指的是在大规模水平上研究蛋白质的特征，包括蛋白质的表达水平、翻译后的修饰、蛋白与蛋白相互作用等，由此获得蛋白质水平上的关于疾病发生、细胞代谢等过程的整体而全面的认识。 2.2蛋白质组学的研究内容蛋白质组学的研究内容主要有两个方面：即结构蛋白质组学和功能蛋白质组学。结构蛋白质组学主要是蛋白质表达模式的研究，包括蛋白质氨基酸序列分析及空间结构的解析、种类分析及数量确定。功能蛋白质组学主要是蛋白质功能模式的研究，包括蛋白质的功能及蛋白质间的相互作用。蛋白质组的研究不仅能为生命活动规律提供物质基础，也能为多种疾病机制的阐明及攻克，提供理论根据和解决途径。 2.3线粒体蛋白质组的分析对蛋白质组组成的分析鉴定是蛋白质组学中与基因组学相对应的主要内容。目前线粒体蛋白质组的分析工作主要有:（1）通过双向电泳等技术得到正常生理条件下的蛋白质的图谱，建立相应的数据库。（2）比较病理组织细胞蛋白质组发生的变化，如蛋白质表达量的变化,翻译后修饰的类型和程度,或者可能的条件下分析蛋白质在亚细胞水平上定位的改变等。 2.4线粒体蛋白质组研究技术线粒体蛋白质组研究常用的技术有：（1）用于蛋白质相互作用

组织线粒体提取

从动物组织中粗提线粒体一、实验目的：从动物组织中分离线粒体，以便线粒体功能分析实验。二、实验准备 Lysis buffer、匀浆器、离心管、解剖器具三、实验步骤： 1．实验前一天小鼠禁食过夜。线粒体提取前所有溶液要冰上预冷。 2．解剖小鼠（~30g），快速取出肝脏，去除胆囊，放入50ml预冷的IBc烧杯中； 3．预冷的IBc洗去多余的血液。洗4-5次至IBc澄清。 4．冰上将肝脏剪碎 5．倒掉清洗的IBc，加入新的5mlIBc，将上清转移至玻璃匀浆器 6．以1,600 rpm冰上匀浆3-4次，组织与缓冲液比例1：5-1：10间 7．匀浆液转移至50ml离心管，600g，离心10min 4 ℃ 8．小心将上清转移至新的离心管600g，离心10min 4 ℃ 9．小心将上清转移至新的离心管7000g，离心10min 4 ℃ 10．倒掉上清，加入5ml预冷的IBc，洗一次，不要用枪头重悬 11．7000g，离心10min 4 ℃ 12．去除上清，重悬底部的含有线粒体的颗粒。用玻璃棒搅松底部的沉淀，不加IBc，用弃去上清的少量缓冲液重悬。用1ml移液管重悬避免出现气泡。 13．转移至14ml离心管，置于冰上。线粒体在1-3小时内用于实验，得到比较好的活性。 14．Bradford法测定线粒体浓度。四、试剂配方 Buffer for cell and mouse liver mitochondria isolation (IBc)：100 ml 10 ml 0.1M Tris–MOPS 1 ml 0.1M EGTA/Tris 20 ml 1M sucrose 100 ml ddH2O，pH 7.4 储液： 1 M sucrose： 342.3 g sucrose 1L ddH2O Mix, 20 ml分装-20 C保存. 0.1MTris/MOPS： 12.1 g Tris； 500ml ddH2O，MOPS 调pH 7.4，ddH2O 体积至1L保存于4 C. 0.1 M EGTA/Tris： 38.1 g EGTA； 500 ml ddH2O，Tris调pH 7.4 总体积至1L ，保存于4 C. 五、注意事项 1. 开始前将离心管预冷5min，所有步骤包括匀浆在4度冰上进行，降低磷脂酶和蛋白酶活性； 2．最后重悬时，用玻璃棒搅松底部的沉淀。不加IBc，用弃去上清的少量缓冲液重悬，线

细胞线粒体分离试剂盒

细胞线粒体分离试剂盒简介：线粒体是细胞呼吸的主要场所，细胞活动所需的能量主要由在线粒体内进行的氧化所产生的能量来供应。制备线粒体的关键是保持线粒体的完整性和纯度，可通过分级分离法获得，即先低俗出去细胞核以及细胞碎片，再进行高速梯度离心分离线粒体。 Leagene 细胞线粒体分离试剂盒(Cell Mitochondria Isolation Kit)是快速便捷分离培养细胞中的线粒体的试剂盒，分离线粒体的同时可以获得去除线粒体的细胞浆蛋白，可用于分析细胞色素C 等线粒体蛋白向胞浆的释放，大部分获得的线粒体都含有完整的内膜和外膜，并具有线粒体的生理功能(如检测线粒体膜电位)，获得的蛋白可用于SDS-PAGE 、Western 、双向电泳等蛋白分析。本试剂盒提供台盼蓝染色液和PMSF ，可以分别判断线粒体质量和提取细胞浆蛋白。该试剂盒仅用于科研领域，不宜用于临床诊断或其他用途。组成：自备材料： 1、胰蛋白酶 2、低温离心机、匀浆器 3、 PBS 操作步骤(仅供参考)： 1、清洗：用预冷的PBS 清洗细胞，离心，其上清。 2、裂解：沉淀用预冷的Mitochondria Lysis buffer 重悬细胞，冰浴放置，可用相差显微镜检测膨胀的程度。 3、匀浆：把细胞悬液转移至Dounce 匀浆器中，匀浆。不同细胞或不同匀浆器所需的匀浆次数有所不同，需自行优化。编号名称 CS0201 50T Storage 试剂(A): Mitochondria Lysis buffer 100ml -20℃ 试剂(B): Trypan Blue Stain 10ml 4℃ 避光试剂(C): Wash buffer 100ml -20℃ 试剂(D): Mitochondria Stock buffer 10ml -20℃ 试剂(E): Protein Stock buffer(5×) 20ml RT 试剂(F): PMSF(100×) 1.5ml -20℃ 使用说明书 1份

线粒体提取

线粒体提取缓冲液A（100 mM Tricine-KOH (pH 7.4), 300 mM sucrose, 10 mM KCl, 1 mM MgCl2, 1 mM potassium-EDTA, 0.1% BSA, 5 mM DTT and protease inhibitors: 1 mM PMSF, 10 g/ml pepstatin A）。缓冲液B（pH 7.4, 无DTT ，余下同分离缓冲液A）。 1、将拟南芥叶片10g,置于研钵中，剪碎。 2、加25ml分离缓冲液A，冰上充分研磨。 3、匀浆液经4层纱布过滤。滤液取20ul用于细胞色素c活性测定，记为（1）。 4、于2,600g 离心15 min（Beckman J2-HS），弃沉淀。上清取20ul用于细胞色素c活性测定，记为（2）。 5、上清液进一步在12,000g 离心15 min，此时得到线粒体粗提样。 6、弃上清，将沉淀轻柔地悬浮于2 ml分离缓冲液B中。从中取20ul用于细胞色素c活性测定，记为（3）。 7、铺制蔗糖密度梯度于38ml超离管中，介质由上到下依次包括6 ml / 0.6 M sucrose, 6 ml / 0.9 M sucrose, 8 ml/ 1.2 M sucrose, 8 ml /1.45 M sucrose 和8 ml/ 1.8 M sucrose。介质均用缓冲液B配制。 8、然后将2 ml悬浮液铺于蔗糖密度梯度介质上。 9、然后以24000rpm离心90 min（SW28 Beckman rotor）。 10、超离结束后，收集1.45M/1.2M层组分于50ml离心管中，缓冲液B稀释5倍。 11、12000g离心15min，沉淀即为纯化的线粒体。 13、将沉淀重悬于500ul缓冲液B中，从中取20ul用于细胞色素c活性测定，记为（4）。 14、纯化的线粒体液氮速冻，存于-80℃。

线粒体分离及功能测定

组织和线粒体裂解液（Tissue and Mitochondrial lysis buffer）： Components Final concentration Tris-HCl 50mM pH7.4 NaCl 150mM EDTA 2mM EGTA 2mM Triton X-100 0.2% NP-40 0.3% PMSF 100uM NaVO3 1mM NaF 250mM Leupeptin 10ug/ml Aprotinin 2ug/ml DTT 1mM 组织线粒体的分离 1) 小鼠脱臼处死，迅速取出组织，放入用冰预冷的线粒体提取缓冲液中， 2) 充分洗去血水，尽量去除非组织成分， 3) 在小烧杯中加入新鲜的提取缓冲液，用小剪刀将组织剪碎， 4) 4℃，电动匀浆机，600rpm 上下3 次， 5) 1000g 4℃离心10min，将上清小心倒入新离心管中， 6) 重复上面步骤一次， 7) 10,00Og 4℃离心10min,沉淀即为线粒体， 8) 倒掉上清，加入新鲜的提取缓冲液重悬沉淀，10,000g 洗一次， 9) 最后用适量的提取缓冲液小心悬起沉淀，冰上保存备用（不要超过6hours）， 10) 定量线粒体蛋白浓度，用于后续分析。分离或培养细胞线粒体的提取(Dounce 匀浆法) 低渗线粒体缓冲液（Hypotonic mitochondrial buffer）:100 ml Components Final concentration Hepes(KOH) 20mM pH7.2 Sucrose 210mM Mannitol 70mM EDTA 1mM EGTA 1mM

分离线粒体蛋白和胞质蛋白

线粒体分离试剂盒说明 PMSF一定要在线粒体分离试剂或线粒体裂解液加入到样品中前2-3分钟内加入，以免PMSF 在水溶液中很快失效。分离线粒体的所有步骤均需在冰上或4℃进行，所用溶液需冰浴或4℃预冷。 1 准备溶液：室温融解试剂盒中的各种溶液，溶解后立即置于冰上并混匀。第一次使用时，把1.5ml PMSF(溶剂)加入到PMSF(晶体)中，溶解并混匀，即得到1.5ml 100mM PMSF。配制好的100mM PMSF溶液-20℃保存。如果最终目的是制备线粒体蛋白样品，根据样品数量，取适量线粒体分离试剂备用，在线粒体分离试剂加入到细胞样品中前数分钟内加入PMSF，使PMSF的最终浓度为1mM。取适量线粒体裂解液备用，在线粒体裂解液加入到线粒体样品中前数分钟内加入PMSF，使PMSF的最终浓度为1mM。 2 对于贴壁细胞：用PBS洗一遍，用胰酶细胞消化液(Trypsin-EDTA Solution)消化细胞，离心收集细胞。 3 洗涤细胞：用冰浴预冷的PBS轻轻重悬细胞沉淀，取少量细胞用于计数，剩余细胞600g，4℃离心5分钟沉淀细胞。弃上清。 4 预处理：加入1-2.5ml临用前添加了PMSF的线粒体分离试剂至2000-5000万细胞中，轻轻悬浮细胞，冰浴放置10-15分钟。 5.匀浆：把细胞悬液转移到一适当大小的玻璃匀浆器中，匀浆10-30下左右。 6 匀浆效果的鉴定：不同细胞不同匀浆器所需的匀浆次数有所不同，需自行优化。通常可以在匀浆10次后取约2微升细胞匀浆，加入30-50 微升台盼蓝染色液，混匀后显微镜下观察台盼蓝染色阳性( 蓝色) 细胞的比例。如果阳性细胞比例不足50%，增加5次匀浆。随后再同前取样进行台盼蓝染色鉴定。当阳性比例超过50%时即可停止匀浆进入下一步。请勿过度匀浆，过度匀浆会导致线粒体的机械损伤。同时记录对于该细胞的匀浆次数，通常在后续实验时不必再摸索匀浆次数。 7.把细胞匀浆在600g，4℃离心10分钟。 8.小心把上清转移到另一离心管中，在11,000g，4℃离心10分钟。 9 沉淀即为分离得到的细胞线粒体。收集上清时注意勿触及沉淀，随后把收集的上清12000g，4℃离心10分钟。取上清即为去除线粒体的细胞浆蛋白。 10 如果用于线粒体的蛋白分析，分离得到的线粒体样品中可以加入150-200微升临用前添加了PMSF的线粒体裂解液裂解线粒体。裂解后的线粒体可以用于PAGE、Western、IP以及线粒体中的一些酶活性的测定等。

细胞器线粒体的分离与观察

细胞器线粒体的分离与观察高熹1120152430（李安一）（北京理工大学生命学院16121501班）摘要：差速离心法是交替使用低速和高速离心，用不同强度的离心力使具有不同质量的物质分级分离的方法。此法适用于混合样品中各沉降系数差别较大组分的分离。离心分离出细胞核与线粒体，进行染色，对细胞核和线粒体的形态进行观察并记录。关键词：差速离心法；细胞核；线粒体；实验。 1 引言差速离心主要是采取逐渐提高离心速度的方法分离不同大小的细胞器。起始的离心速度较低，让较大的颗粒沉降到管底，小的颗粒仍然悬浮在上清液中。收集沉淀，改用较高的离心速度离心悬浮液，将较小的颗粒沉降，以此类推，达到分离不同大小颗粒的目的。线粒体是真核细胞特有的，司能量转换的重要细胞器。细胞种的能源物质——糖、脂肪、部分氨基酸在此进行最终的氧化，并通过偶联磷酸华生成ATP，供给细胞生理活动之需。对线粒体的结构和功能的研究通常是在离体线粒体上进行的。制备线粒体用组织匀浆在悬浮介质中进行差速离心的方法。在一给定的离心场中（对于所使用的离心机，就是选用一定的转速），球形颗粒的沉降速度取决于它的密度、半径和悬浮介质的粘度。在一均匀悬浮介质中离心某一时间内，组织匀降中的各种细胞器及其它内含物由于沉降速度不同而停留在高低不同的位置。依次增加离心力和离心时间，就能使这些颗粒按其大小、轻重分批沉降在离心管底部，从而分批收集。细胞器中最先沉降的是细胞核，其次是线粒体，其他更轻的细胞器和大分子可依次再分离。悬浮介质通常用缓冲的蔗糖溶液，它比较接近细胞质的分散相，在一定程度上能保持细胞器的结构和酶的活性，在pH7.2的条件下，亚细胞组分不容易重新聚集，有利于分离。整个操作过程应注意样品保持4，避免酶失活。线粒体的鉴定用詹纳斯绿活染法。詹纳斯绿B（janus green B）是对线粒体专一的活细胞染料，毒性很小，属于碱性染料，解离后带正电，由电性吸引而堆积在线粒体膜上。线粒体的细胞色素氧化酶使该染料保持在氧化状态呈现蓝绿色从而使线粒体显色，而胞质中的染料被还原成无色。 Giemsa染液为天青色素、伊红、次甲蓝的混合物，本染色液最适于血液涂抹标本、血球、疟原虫、立克次体以及骨髓细胞、脊髓细胞等的染色。染前用蛋白酶等进行处理，然后再用姬姆萨染液染色，在染色体上，可以出现不同浓淡的横纹样着色。姬姆萨染液可将细胞核染成紫红色或蓝紫色，胞浆染成粉红色，在光镜下呈现出清晰的细胞及染色体图像。 2 实验器材及材料 2.1 实验材料大鼠肝脏。

动物线粒体DNA提取的原理和方法

动物线粒体D NA 提取的原理和方法 *X 夏玉玲刘彦群鲁成X X (西南农业大学蚕学与生物技术学院农业部蚕桑学重点实验室重庆 400716) 摘要从动物线粒体的特征、线粒体的鉴定方法、提取线粒体D NA 各步骤等原理出发,比较了目前常用的几种提取线粒体D N A 的方法,提出动物线粒体D N A 提取的几点关键步骤,并提出一套优化的操作流程。关键词线粒体线粒体D N A 提取方法线粒体是存在于绝大多数真核细胞内的一种基本的重要的细胞器。它是细胞进行氧化磷酸化的场所。线粒体基因组不仅是研究D N A 结构与复制转录的良好模型,也是研究真核细胞核酸与蛋白质合成非常合适的模型系统。线粒体基因组与核基因组的同源基因结构对比也被广泛应用于核基因和核外基因的进化研究中。由于线粒体基因在真核生物具有高保守性,所以它已成为了研究物种进化的一种常用的标记,并为线粒体起源提供有价值的线索[1]。动物线粒体D NA 具有分子量小、结构简单、母性遗传和进化速度快等特点,已广泛应用于动物群体遗传学和进化生物学等领域的研究[2]。进行动物线粒体D NA 方面意义重大,现将线粒体D N A 的提取的原理和方法介绍如下: 1 提取动物线粒体D N A 的原理 1.1 线粒体的特征线粒体是由内外两层膜组成,外膜光滑,内膜向内回旋折叠,形成许多横隔。线粒体中含有多种氧化酶,在此进行TCA 循环、呼吸连电子传递和氧化磷酸化等产能作用,并传递和储存所产生的能量,是细胞的动力工厂和生物氧化的主要场所。线粒体的形状、大小、数目和组成,在不同生物、不同组织以及生活于不同条件下的细胞中变化很大。线粒体的外型呈多样化,绝大多数类型细胞呈圆形、卵原形,也有呈杆状的。其体积大小不等,一般直径比较一致,为0.5~1.0L m,长度为1~5L m,最长可达到7L m 。线粒体的数目与生物种类、组织、细胞类型和细胞生理功能变化有关。锥虫和有的真菌只有一个线粒体,大多数动物的肝脏细胞含有上千个线粒体,生殖细胞如卵母细胞可达到30万个线粒体,家蚕的每个后部丝腺细胞只有2~4个线粒体[13],而有的细胞根本没有线粒体;在细胞生命活动旺盛时,它的数量多,在衰老时,数量少,有时可能消失;新生细胞比衰老细胞或病变细胞的线粒体多。线粒体的主要成分是蛋白质(占干重60~65%)和脂类(占干重35~40%)。此外还有少量的核酸(主要为D NA 和RNA)、金属离子、阴离子和维生素等。其中线粒体膜主要成分是蛋白质、脂类和一些酶,基质由各种酶、D N A 、RNA 、金属离子、阴离子和维生素等组成。mtD N A 不24蚕学通讯 Ne wsletter of Sericultural Science 第22卷第3期 2002年 9月 X X X 通讯作者国家自然科学基金项目资助(项目编号:30170719)

细胞生物学

10.以动物细胞摄入LDL为例，概述受体介导胞吞的组成结构、运行过程及生理意义。组成结构：衔接蛋白、网格蛋白、发动蛋白、受体、膜过程：低密度脂蛋白LDL，先与细胞表面的互补性受体相结合，形成受体-配体复合物并引起细胞膜的局部内化作用，先是质膜在网格蛋白的参与作用下内陷形成有被小窝，然后是深陷的小窝脱离质膜形成有被小泡。即完成胞吞过程（后又脱包被，胞内体作用等）。生理意义：作为一种选择性浓缩机制，既保证了细胞大量的摄入特定的大分子，同时又避免了吸入胞外大量的液体。 11.比较两种胞吐途径的特点及功能。类型特点功能组成型合成就外排补充膜成分；信号介导完成其他生命活动；可形成外周蛋白、基质等调节型合成先储存，等信号刺激短时间内大量释放，维持机体平衡 12. 甾类激素是如何通过胞内受体介导的信号通路去调节基因表达？甾类激素与受体结合时，导致抑制性蛋白脱离，暴露出受体上DNA结合位点而被激活。受体结合的DNA序列是转录增强子，可增加某些相邻基因的转录水平。甾类激素诱导的基因活化分两个阶段: 1）初级反应阶段：直接活化少数特殊基因，发生迅速 2）延迟的次级反应：由初级反应的基因产物，再活化其他基因，对初级反应起放大作用。NO是自由基性质的气体，具脂溶性，可快速扩散透过细胞膜，对邻近靶细胞起作用。血管内皮细胞和神经细胞中有一氧化氮合酶（NOS），能催化合成NO，当血管神经末释放乙酰胆碱作用于血管内皮，使其合成释放NO，所以才快速缓解心绞痛。 13. 以突触处神经递质作用为例，说明离子通道偶联受体介导的信号通路特点。离子通道偶联受体本身具信号结合点，又是离子通道，其跨膜信号转导无需中间步骤。神经递质（胞外化学信号）与受体结合而引起通道蛋白变构，导致离子通道开启，使突触后细胞膜出现过膜离子流（如Na＋和Ca2＋），从而将胞外化学信号转换成胞内电信号，导致突触出后细胞的兴奋。当胆碱脂酶将神经递质水解后，离子通道关闭，信号传递中断。 14. 概述G蛋白偶联受体介导的信号通路的组成、特点及主要功能。组成：细胞外配体、细胞表面受体、G蛋白（分子开关）、第二信使、靶蛋白 G蛋白偶联受体介导的信号通路整体的传递过程：细胞外配体—→细胞表面受体—→G蛋白（分子开关）—→第二信使—→靶蛋白（酶或离子通道）—→细胞应答根据第二信使的不同，信号通路可以分为两类：（1）cAMP信号通路信号通路信号通路信号通路cAMP的产生有腺苷酸环化酶催化完成，而该酶的活性由激活性激素（肾上腺素、胰高血糖素）或抑制性激素（前列腺素、腺苷）调控。激素－→G蛋白偶联受体－→G蛋白－→腺苷酸环化酶－（激素作用）→cAMP－→cAMP依赖的蛋白激酶A（PKA）产生PKA后，他可以激活下游的靶酶以及开启基因表达：（前者是快速反应，后者是慢速反应）a. 活化的PKA—>靶酶蛋白磷酸化—>细胞代谢核细胞行为（如肾上腺素刺激骨骼肌细胞导致糖原分解） b. 活化的PKA—>基因调控蛋白—>基因转录（2）磷脂酰肌醇信号通路磷脂酰肌醇信号通路磷脂酰肌醇信号通路磷脂酰肌

实验二细胞核与线粒体的分离与观察

实验二细胞核与线粒体的分离与观察一、实验目的 1．了解差速离心法分离细胞核与线粒体的原理。 2．掌握差速离心法分离动物与植物细胞的细胞核与线粒体的方法。二、实验原理细胞核（nucleus）是细胞中重要的细胞器，细胞的控制中心，在细胞的代谢、生长、分化中起着重要作用，是遗传物质的主要存在部位。线粒体（mitochondria）是真核细胞特有的能量转换的重要细胞器，是细胞进行有氧呼吸的主要场所。细胞中的能源物质—脂肪、糖、部分氨基酸在此进行最终的氧化，并通过偶联磷酸化生成ATP，供给细胞生理活动需要。对细胞核和线粒体结构与功能的研究通常是在离体进行的，因而分离细胞核和线粒体是必须的。差速离心主要是采取逐渐提高离心速度的方法分离不同大小的细胞器。采用组织匀浆在悬浮介质中进行差速离心分离细胞核和线粒体。在确定的离心场中，球形颗粒的沉降速度取决于它的密度、半径和悬浮介质的黏度。在一均匀悬浮介质中离心一定时间内，组织匀浆中的各种细胞器及其它内含物由于沉降速度不同将停留在高低不同的位置。依次增加离心力和离心时间，就能够使这些颗粒按其大小、轻重分批沉降在离心管底部，从而分批收集。细胞器中最先沉淀的是细胞核，其次是线粒体，其它更轻的细胞器和大分子可依次再分离。缓冲的蔗糖溶液是常用的悬浮介质，它属于等渗溶液，比较接近细胞质的分散相，在一定程度上能保持细胞器的结构和酶的活性，在pH7.2的条件下，亚细胞组分不容易重新聚集，有利于分离。整个操作过程应注意使样品保持4℃，避免酶失活。线粒体的鉴定用詹纳斯绿B（Janus green B）活染法，对线粒体专一的活细胞染料，毒性很小，线粒体的细胞色素氧化酶使该染料保持在氧化状态呈现蓝绿色从而使线粒体显色，而胞质中染料被还原成无色。从植物细胞分离线粒体除了作线粒体功能测定外，在植物细胞遗传工程中，常用于分离核外基因——线粒体DNA等目的。分离线粒体的方法仍采用均匀介质中的差速离心。介质中0.25mol/L蔗糖也可以用0.3mol/L甘露醇代替。EDTA螯合二价阳离子，Ca2+除去后细胞间粘着解体，促使组织分散成单个细胞。牛血清白蛋白（BSA）能包在细胞外面，并作为

细胞线粒体提取试剂盒

Leagene 。com 北京雷根生物技术有限公司细胞线粒体提取试剂盒简介：细胞线粒体提取试剂盒(Cell Mitochondria Isolation Kit)是快速便捷提取培养细胞中的线粒体的试剂盒，提取线粒体的同时可以获得去除线粒体的细胞浆蛋白，可用于分析细胞色素C 等线粒体蛋白向胞浆的释放，大部分获得的线粒体都含有完整的内膜和外膜，并具有线粒体的生理功能(如检测线粒体膜电位)，获得的蛋白可用于SDS-PAGE 、Western 、双向电泳等蛋白分析。组成：操作步骤(仅供参考)： 1、匀浆：把细胞悬液转移至Dounce 匀浆器中匀浆。不同细胞或不同匀浆器所需的匀浆次数有所不同，需自行优化。 2、立即取匀浆液，加入Wash buffer ，轻轻颠倒混匀数次。 3、4℃，离心以去除细胞核、未破碎的细胞和大的膜碎片。 4、上清液转移至一干净离心管，4℃离心，重复2次。 5、上清液转移至一干净离心管，4℃ 离心，重复1次。 6、弃上清，沉淀为线粒体，如果希望获得去除线粒体的细胞浆蛋白，应在本步骤中收集上清，并且在收集上清时注意勿触及沉淀。随后把收集的上清12000g ，4℃离心10min ，上清即为去除线粒体的细胞浆蛋白。注意事项： 1、提取线粒体的所有步骤均需在冰上或4℃进行，所用溶液需冰浴或4℃预冷，全部操作时间尽量控制在1h 以内。编号名称 CS0201 50T Storage 试剂(A): Mitochondria Lysis buffer 100ml -20℃ 试剂(B): Trypan Blue Stain 10ml 4℃ 避光试剂(C): Wash buffer 100ml -20℃ 试剂(D): Mitochondria Stock buffer 10ml -20℃ 试剂(E): Protein Stock buffer(5×) 20ml RT 试剂(F): PMSF(100×) 1.5ml -20℃ 使用说明书 1份

线粒体提取方法

线粒体提取试剂盒产品组成：产品组成 BB-3601-1 BB-3601-2 规格 50T 100T 线粒体提取液A 20ml 40ml 线粒体提取液B 20ml 40ml 线粒体保存液 20ml 40ml 产品简介：本试剂盒可用于各种动物细胞和实体软、硬组织样本的线粒体提取。不能用于冷冻样品的线粒体提取。细胞线粒体提取： 1.取1-2×107个细胞，在4℃，500×g条件下离心2-3分钟，小心吸取培养基，尽可能吸干，收集细胞； 2.用冷PBS洗涤两次，每次洗涤后尽可能吸干上清。 3.加入400μl冷的试剂A，置冰上10分钟。 4.用Dounce匀浆器匀浆30-40下，然后在4℃，500×g条件下离心5分钟。 5.快速将上清吸入另一预冷的干净离心管。 6.在4℃，11000×g以上条件下离心20分钟。 7.在沉淀中加入400μl冷的试剂B，混匀。 8.在4℃，11000×g以上条件下离心20分钟。 9.弃上清，沉淀用线粒体保存液重悬。 10.即得到线粒体样品，置冰箱备用或直接用于下游实验。组织线粒体提取： a)取50-100mg新鲜动物组织样本，用PBS洗涤干净。 b)用剪刀尽可能剪碎，用冷PBS洗涤两次。 c)加入400μl冷的试剂A，置冰上10分钟。 d)用Dounce匀浆器匀浆30-40下，然后在4℃，500×g条件下离心5分钟。 e)快速将上清吸入另一预冷的干净离心管。 f)在4℃，11000×g以上条件下离心20分钟。 g)在沉淀中加入400μl冷的试剂B，混匀。 h)在4℃，11000×g以上条件下离心20分钟。 i)弃上清，沉淀用线粒体保存液重悬。 j)即得到线粒体样品，置冰箱备用或直接用于下游实验。相关产品：产品产品号产品产品号总蛋白提取试剂盒BB-3101 磷酸化蛋白富集试剂盒 BB-3108 核蛋白提取试剂盒 BB-3102 膜蛋白提取试剂盒 BB-3103 - 1 -

线粒体蛋白提取

线粒体蛋白提取 1.线粒体蛋白抽取液配方(pH7.4)：250mM蔗糖，20mM HEPES，10mM KCl,1.5mM MgCl2,1mM EDTA,1mM EGTA,1mM DTT, 17ug/mL PMSF, 8ug/mL aprotinin, 2ug/mL leupeptin；-20℃保存。 2.步骤：（1）收集5X10E7细胞，并用PBS洗细胞；（2）往细胞沉淀加入2mL上述抽取液，并混匀，可以采用超声或匀浆器方法破膜，程度至苔盼兰染色约90%的细胞为蓝色。（3）750g，4℃离心5分钟，收集上清，此时沉淀即为细胞膜成分。（4）13000rpm,4℃离心30分钟, 弃上清，此时沉淀即为线粒体成分。（5）用100uL列解液重悬沉淀，-80℃保存备用. 培养悬浮细胞全蛋白裂解的方法 1.细胞裂解液（pH8.0）的配方：20mM Tris-Cl，1% NP-40, 137mM NaCl, 20mM DTT, 2mM Sodium Vanadate，1ug/mL Aprotinin, 1ug/mL leupetin, 1mM PMSF；配好后分装-20℃保存，其中PMSF和蛋白酶抑制剂量使用时现加。 2.裂解方法：按1X106细胞/100uL的比例加细胞裂解液,混匀后冰浴30分钟, 12,000r pm, 4℃,离心10min, 实验时取25uL的上清加5uL 6X上样缓冲液煮沸5分钟使蛋白变性后，12000rpm离心5分钟，取上清和预染Marker加样电泳。或-80℃保存备用。细胞核蛋白质的提取2009-04-28 21:28 一、试剂准备缓冲液A 缓冲液B 10mmol/L HEPES-KOH pH7.9 20mmol/L HEPES-KOH pH7.9 1.5mmol/L MgCL2 1.5mmol/L MgCL2 10mmol/L KCL 420mmol/L NaCL 0.5mmol/L DTT 0.2mmol/L EDTA 0.2mmol/L PMSF 25% Glycerol 0.5mmol/L DTT 0.2mmol/L PMSF 二、操作步骤

线粒体提取方法

线粒体的分离

实验四 线粒体的分离与观察

核与线粒体分离提取方案

组织线粒体分离试剂盒

线粒体的提取与纯化

线粒体蛋白质组学的研究进展(一)

组织线粒体提取

细胞线粒体分离试剂盒

线粒体提取

线粒体分离及功能测定

分离线粒体蛋白和胞质蛋白

细胞器线粒体的分离与观察

动物线粒体DNA提取的原理和方法

细胞生物学

实验二 细胞核与线粒体的分离与观察

细胞线粒体提取试剂盒

线粒体提取方法

线粒体蛋白提取

实验四线粒体的分离与观察

实验二细胞核与线粒体的分离与观察