LightShift化学发光法EMSA试剂盒
试剂盒组成
化学发光法EMSA优化和质控试剂盒(20148×)
10×Binding Buffer,1ml,保存于-20°C
Biotin-EBNA Control DNA,50μl,保存于-20°C
Unlabeled EBNA DNA,50μl,保存于-20°C
Epstein-Barr Nuclear Antigen(EBNA) Extract,125μl,保存于-20°C
Poly(dI.dC),125μl,保存于-20°C
50%Glycerol,500μl,保存于-20°C
1%NP-40,500μl,保存于-20°C
1M KCl,1ml,保存于-20°C
100mM Mgcl2,500μl,保存于-20°C
200mM EDTA,500μl,保存于-20°C
5×Loading Buffer,1ml,保存于-20°C
化学发光核酸检测模块(89880)
Stabilized Streptavidin-Horseradish Peroxidase Conjugate,1.5ml,保存于4°C Chemiluminescent Substrate,4°C可保存1年
Luminol/Enhancer Solution,80ml
Stable Peroxide Solution,80ml
Blocking Buffer,500ml,保存于4°C
4×Wash Buffer,500ml,保存于4°C
Substrate Equilibration Buffer,500ml,保存于4°C
EMSA步骤
A 配胶和预电泳
1 用0.5×TBE配制非变性聚丙烯酰胺凝胶,大多数采用0.5×TBE配制4-6%的非变性聚丙烯酰胺凝胶
2 用0.5×TBE灌注电泳槽,直至刚好没过加样孔底部。
3 冲洗加样孔,100V预电泳30-60min
B 进行结合反应
1 融化所有结合反应成分,EBNA相关成分和待检测样品放在冰上,避免DNA探针过热。EBNA 提取物加入前再融化。
2结合反应,根据Table 1,2,3准备20μl结合反应体系
3 室温孵育20min
4 加入5μl 5×Loding Buffer,轻柔上下吹匀,不可剧烈混匀。
C 电泳
1 关闭电源
2 冲洗加样孔,每孔加样20μl
3 打开电源,100V电泳,溴酚蓝迁移至胶底部2/3或3/4处停止电泳
D 转膜
1 将尼龙膜浸于0.5×TBE,至少10min。
2 用冷却至10°C的0.5×TBE和干净的海绵,镊子,手套进行转膜
3 100V,380mA转膜30-60min,
4 转膜结束后,将膜(带有溴酚蓝的一面)放在干纸巾上1min,使膜表面的缓冲液吸进膜内。不能使膜变干。立即进行步骤E
E 交联
用手持UV灯离膜0.5cm处254nm照膜5-10min,将DNA与膜交联。
F 化学发光法检测生物素标记的DNA
1 37-50°C缓慢加温Blocking Buffer和4×Wash Buffer,直至颗粒完全溶解。Substrate Equilibration Buffer在4°C和室温条件下使用。
2 用20ml Blocking Buffer封闭膜,轻柔摇床孵育15min
3 将66.7μl Stabilized Streptavidin-Horseradish Peroxidase Conjugate加至20ml Blocking Buffer 中,配制Conjugate/ Blocking Buffer。
4 轻轻倒掉Blocking Buffer,换成Conjugate/ Blocking Buffer,轻柔摇床孵育15min
5 将40ml 4×Wash Buffer加至120ml纯水中,配制1×Wash Buffer
6 将膜移入新容器内,用20ml 1×Wash Buffer短暂洗一次
7 用20ml 1×Wash Buffer轻柔摇床多次洗膜,每次5min
8 将膜移入新容器内,加入30ml Substrate Equilibration Buffer,轻柔摇床孵育5min
9 将6ml Luminol/Enhancer Solution加至6ml Stable Peroxide Solution中,配制Substrate Working Buffer,需避光。
10 将膜从Substrate Equilibration Buffer提起,用纸巾轻轻接触膜的边缘,吸掉残余的Buffer。将膜移入新容器内。
11 用Substrate Working Buffer覆盖膜的全部表面,不要摇动,孵育5min
12将膜从Substrate Working Buffer提起,用纸巾轻轻接触膜的边缘,吸掉残余的Buffer,但不要使膜变干。
13 用塑料包包住湿膜,避免气泡和起皱。
14 显影并拍照