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EMSA实验步骤

EMSA实验步骤
EMSA实验步骤

LightShift化学发光法EMSA试剂盒

试剂盒组成

化学发光法EMSA优化和质控试剂盒(20148×)

10×Binding Buffer,1ml,保存于-20°C

Biotin-EBNA Control DNA,50μl,保存于-20°C

Unlabeled EBNA DNA,50μl,保存于-20°C

Epstein-Barr Nuclear Antigen(EBNA) Extract,125μl,保存于-20°C

Poly(dI.dC),125μl,保存于-20°C

50%Glycerol,500μl,保存于-20°C

1%NP-40,500μl,保存于-20°C

1M KCl,1ml,保存于-20°C

100mM Mgcl2,500μl,保存于-20°C

200mM EDTA,500μl,保存于-20°C

5×Loading Buffer,1ml,保存于-20°C

化学发光核酸检测模块(89880)

Stabilized Streptavidin-Horseradish Peroxidase Conjugate,1.5ml,保存于4°C Chemiluminescent Substrate,4°C可保存1年

Luminol/Enhancer Solution,80ml

Stable Peroxide Solution,80ml

Blocking Buffer,500ml,保存于4°C

4×Wash Buffer,500ml,保存于4°C

Substrate Equilibration Buffer,500ml,保存于4°C

EMSA步骤

A 配胶和预电泳

1 用0.5×TBE配制非变性聚丙烯酰胺凝胶,大多数采用0.5×TBE配制4-6%的非变性聚丙烯酰胺凝胶

2 用0.5×TBE灌注电泳槽,直至刚好没过加样孔底部。

3 冲洗加样孔,100V预电泳30-60min

B 进行结合反应

1 融化所有结合反应成分,EBNA相关成分和待检测样品放在冰上,避免DNA探针过热。EBNA 提取物加入前再融化。

2结合反应,根据Table 1,2,3准备20μl结合反应体系

3 室温孵育20min

4 加入5μl 5×Loding Buffer,轻柔上下吹匀,不可剧烈混匀。

C 电泳

1 关闭电源

2 冲洗加样孔,每孔加样20μl

3 打开电源,100V电泳,溴酚蓝迁移至胶底部2/3或3/4处停止电泳

D 转膜

1 将尼龙膜浸于0.5×TBE,至少10min。

2 用冷却至10°C的0.5×TBE和干净的海绵,镊子,手套进行转膜

3 100V,380mA转膜30-60min,

4 转膜结束后,将膜(带有溴酚蓝的一面)放在干纸巾上1min,使膜表面的缓冲液吸进膜内。不能使膜变干。立即进行步骤E

E 交联

用手持UV灯离膜0.5cm处254nm照膜5-10min,将DNA与膜交联。

F 化学发光法检测生物素标记的DNA

1 37-50°C缓慢加温Blocking Buffer和4×Wash Buffer,直至颗粒完全溶解。Substrate Equilibration Buffer在4°C和室温条件下使用。

2 用20ml Blocking Buffer封闭膜,轻柔摇床孵育15min

3 将66.7μl Stabilized Streptavidin-Horseradish Peroxidase Conjugate加至20ml Blocking Buffer 中,配制Conjugate/ Blocking Buffer。

4 轻轻倒掉Blocking Buffer,换成Conjugate/ Blocking Buffer,轻柔摇床孵育15min

5 将40ml 4×Wash Buffer加至120ml纯水中,配制1×Wash Buffer

6 将膜移入新容器内,用20ml 1×Wash Buffer短暂洗一次

7 用20ml 1×Wash Buffer轻柔摇床多次洗膜,每次5min

8 将膜移入新容器内,加入30ml Substrate Equilibration Buffer,轻柔摇床孵育5min

9 将6ml Luminol/Enhancer Solution加至6ml Stable Peroxide Solution中,配制Substrate Working Buffer,需避光。

10 将膜从Substrate Equilibration Buffer提起,用纸巾轻轻接触膜的边缘,吸掉残余的Buffer。将膜移入新容器内。

11 用Substrate Working Buffer覆盖膜的全部表面,不要摇动,孵育5min

12将膜从Substrate Working Buffer提起,用纸巾轻轻接触膜的边缘,吸掉残余的Buffer,但不要使膜变干。

13 用塑料包包住湿膜,避免气泡和起皱。

14 显影并拍照

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