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NK细胞研究的几个热点问题

NK细胞研究的几个热点问题
NK细胞研究的几个热点问题

#述评#

NK细胞研究的几个热点问题

田志刚(山东省医学科学院基础医学所山东肿瘤生物治疗研究中心,济南

250062)

田志刚,男,42岁,研究员,博

士,博士生导师,山东省医学

科学院基础医学研究所所长,

山东肿瘤生物治疗中心主任,

中国免疫学会理事,5中国免

疫学杂志6编委,主要从事免

疫学及分子生物学研究。

1NK细胞研究的沿革

70年代初NCI的研究人员在研究T细胞对靶细胞的特异杀伤时发现正常对照小鼠的脾细胞可以象免疫小鼠的脾细胞一样杀伤某些肿瘤细胞,继而发现正常人外周血淋巴细胞也可以天然杀伤某些癌细胞。这些细胞的杀伤功能不需要预先免疫或致敏,故取名为天然杀伤细胞(NK Cells)。NK 细胞的发现引起了世界轰动,学者们进而提出了机体的In-nate Immunity的主要承担者为NK细胞,并发现了NK细胞不仅对癌细胞,对病毒,胞内寄生菌和老化变异细胞都具有极强的清除能力。

70年代和80年代初期是免疫识别的收获季节。这期间Ig重排的起源和T细胞受体的多样性均逐渐显露端倪,使人类基本认清了机体主要免疫细胞清除无数抗原的奥秘所在。NK细胞发现以来的20年中免疫学家从未放弃研究NK细胞的识别机制,试图揭开NK细胞广谱识别/自我0与/非我0的机制,希望能象描述TCR或BCR一样描述NKCR。T细胞和B细胞主要司职/Acquired Immunity0,但这些功能以Innate Im-munity为基础,NK细胞的功能和机制的彻底阐明不仅对揭开Innate Immunity之谜至关重要,也会对/Acquired Im munity0有全新的补充,从而得以从更高层次上解读免疫系统。

伴随着80年代中期细胞因子基因工程产品的问世和CD抗原家族及相应单抗商品化,细胞免疫治疗的基础与临床研究掀起新高潮,其中LAK细胞,ATL细胞,CIK细胞, CD3-AK细胞等各种经生物因子活化并扩增的效应细胞走上学术舞台。NK细胞的研究者们不但从中获得了更多的技术上的储备(NK细胞纯化,扩增,鉴定),而且对这些广谱的杀伤细胞的功能有了新的见解。认为这些效应细胞是以NK 为主体的/杀伤现象0,并非为一类新的细胞群。这些广泛的研究为NK细胞的深入探索积蓄了大量的资料。

自80年代中后期以来,NK细胞的研究开始蓬勃发展,尤其从90年代开始几乎令所有免疫学家应接不暇。学者们已经开始从NK细胞的形态特征,起源,识别杀伤机制,调节功能等诸方面全线出击,其中伴随着NK细胞的起源和识别两个主题的进展,NK细胞的传统观念发生了质的变化。

2NK细胞研究的几个热点问题

2.1NK细胞的发育生物学

2.1.1NK和T、B细胞的共同前体细胞的发现1994年Geogopoulos等发现,小鼠编码锌指纹蛋白(IKAROS)的基因发生突变或Knockou t后,HSC向淋巴类细胞的分化被终止,其它造血细胞的分化不受影响,推测IKAROS基因的表达涉及HSC向淋巴类细胞的分化,即同时决定了NK、T和B细胞的发育。尽管SCID鼠无T和B细胞,但NK正常,SCID鼠在适当环境可以生存。IKAROS缺陷鼠则由于T、T和NK的缺陷而在出生早期死于各类感染,提示了NK作为机体免疫系统第一道防线的重要意义。

2.1.2NK细胞与T细胞分化发育的关系大量资料表明人类NK和T细胞在早期发育中可能存在共同前体细胞,与B细胞相比,NK细胞与T细胞在个体发生上更为接近。首先发现人类胚胎未成熟NK可表达CD3的所有4条链的基因,成熟NK受IL-2激活后仍可再表达CD3分子,提示NK细胞在个体发生更接近T细胞。未成熟NK表达CD3的能力强于成熟NK,提示NK早期发育中更接近于T。由于NK细胞所承担的细胞毒效应与CD8+的C TL有相近之处,且均与MHC有关,以及NK细胞分泌细胞因子的种类及数量又与CD4+Th细胞相近,故学者们倾向认为NK细胞和T细胞为个体发育上关系十分接近的两类细胞。

2.1.3胚胎肝脏或胸腺存在NK与T细胞的共同前体细胞胚胎肝脏是造血前体细胞的发源地,其中应包含淋巴类细胞的共同祖细胞。首先发现胎肝细胞悬液在PHA+IL-2存在下可分化为CD3+P TCR+的T细胞;但如果在同种异体受照细胞系H9+IL-2存在时则分化为CD3-CD16+CD56+的成熟NK细胞,还发现胚胎肝脏中可分别分化为T细胞或NK 细胞的共同前体细胞的特有标志为白细胞共同抗原(CD45)。Rodewald等观察到胚胎期CD16+CD4-CD8-的细胞如进入胸腺则发育分化为T细胞。如果脱离胸腺后移入合适的其它体内环境或体外环境则可分化为NK细胞。诱导NK或T细胞的体外环境与胚肝细胞分化为NK和T细胞的条件相一致,此时CD16抗原成为胚胎胸腺中NK P T细胞共同前体细胞的特有标志。继而M inger等发现新生儿胸腺中CD7+CD3-

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#中国免疫学杂志1999年第15卷

CD8-CD4-细胞可在PHA+IL-2作用下分化为成熟的T细胞(CD3+P TCR+),或者在H9+IL-2作用下分化为成熟NK细胞(CD3-CD16+CD56+)。如果CD56-分化为T细胞,而CD56+将分化为NK细胞。

2.1.4骨髓为NK细胞分化发育的场所骨髓CD34+CD7+ DR+的前体细胞经长期培养后可分化为NK细胞,其CD34抗原在分化为NK细胞时,CD34抗原消失,代之而来则为CD2、CD16和CD56的标志。HSC分化为NK细胞时必须有IL-2存在,但与IL-7和干细胞因子(SC F)共存时,NK细胞的发育分化与扩增将大幅度增加。由于IL-2缺陷小鼠中NK 仍可正常发育,以及骨髓基质细胞并无IL-2分泌,人们开始寻找NK分化所必需的调节因子。近期人们发现骨髓基质细胞可表达IL-15mRNA,长期培养的骨髓基质细胞上清中含IL-15。CD34+的HSC细胞体外培养中单独IL-15则可以促发其向NK细胞分化。

2.2NKCR及其识别功能

2.2.1NK细胞识别靶细胞的几种可能模式NK细胞与T 细胞和B细胞不同,它区分自我与非我的方式可能至少有3种方式:1针对通称为NK敏感靶细胞(如K562细胞)的杀伤效应,该杀伤功能不受靶细胞是否表达MHC的影响;oNK细胞受IL-2激活后可展现更为宽广的杀瘤谱,可杀伤大部分肿瘤细胞及某些正常细胞;?近期阐明的称为/丢失的自我(Missingsel f)0的识别方式,主要识别缺乏MHC I类抗原或突变的MHC I类抗原的靶细胞,从而弥补了CTL细胞必须识别的MHC I类抗原阳性的靶细胞而无法杀伤MHC I类阴性的细胞缺陷。

2.2.2NK杀伤功能与靶细胞MHC-I类分子已经证明某些低水平表达MHC-I类分子的淋巴类细胞较易为NK所识别而杀伤。采用基因转染技术将NK敏感的靶细胞经转基因处理为高表达MHC-I类基因,可使该靶细胞变为NK抗性细胞。Storkus等将HLA-A3或HLA-B7基因转入HLA阴性、EB病毒转化的B淋巴母细胞系,可使该细胞由NK敏感型转化为NK抗性细胞。采用遗传杂交分析技术可将该功能的遗传定位为HLA的A1P A2区域。进一步发现HLA分子的某一个特定氨基酸的替代(如HLA-A2的His或HLA-A3的Asp)与这种保护效应有关,即靶细胞表面的HLA分子细微变化可足以导致靶细胞本身对NK杀伤的敏感性的变化。通过分子突变技术进一步发现HLA分子的微小变化主要发生在第74位残基上,该部件正是HLA与多肽抗原形成复合物的空间结构的核心部位。

2.2.3人类NK受体(NKR)的发现1P58分子的发现, Moretta等首先建立了一系列NK细胞克隆系,发现可溶性抗P58单抗可阻断HLA-C类分子与P58的结合,使HLA-C类分子与NKR(P58)之间传递的/阴性信号0被阻断,导致了NK 对靶细胞的杀伤,P58cDNA已被克隆,发现与存在于小鼠的类似分子Ly49分子或C类凝集素基因家族无同源性;oKp43(CD94)和NKB1(P70)与识别HLA-C类分子受体P58一样,NK细胞亦存在识别HLA-B类分子的受体。已发现有针对HLA-B7P BW6的KP43(CD94)和针对HLA-B58P B W4的NKB1(P70)。CD94和NKB1为结构及分子量均不同的两个分子,与P58亦无相同之处。引人注目的是CD94可表达于所有NK表面,P58仅在部分NK表达。高表达CD94(CD94 bright)的NK细胞与HLA-B7(BW6)之间可传递/阴性信号0。

2.2.4小鼠NK受体(NKR)的发现)))Ly49家族Ly49分子是类似于人类存在的P58分子或者NKB1分子,其研究的广度与深度均强于人类NKR的研究。根据所发现的时间顺序,Ly49分子家族已发现了Ly49A、Ly49B、Ly49C、Ly49D、Ly49E、Ly49F和Ly49G等分子。Ly49A最初发现于小鼠胸腺瘤细胞(EL4),分子量44kD的二聚体,cDNA克隆研究表明其基因相连于NK1.1抗原的基因区。Ly49A极少表达于T 细胞,在IL-2作用后可持续表达于CD3-NK1.1+脾细胞。Ly49A与NK1.1(又称NKR-P1)的结构相似,二基因相连以及共表达于NK细胞等特性,提示Ly49A对NK细胞的功能有重要作用。将NK细胞分为Ly49A+和Ly49A-两大群体,发现这两大群体细胞除存在NK共有功能(YAC-1杀伤、ADCC、凝集素强化杀伤和抗体再定位杀伤等)和标志(CD3-CD4-CD8-Sig-NK1.1+)外,二者对一系列小鼠靶细胞的杀伤存在差异。这种差异与靶细胞的MHC的单倍型有关,不同之处在于NKR与MHC-I类分子A1P A2区结合,而CD8+TCR与MHC-I类分子的A3区结合。

2.2.5介导NK细胞活化的受体NK细胞表面的IgG类FC 受体(FcrRIII,亦称CD16)可通过ADCC效应启动NK的杀伤功能。NK亦可为CD2或CD69所活化而呈现杀伤效应。但是CD2、CD16和CD69均不是启动NK杀伤所必需,NK细胞的杀伤功能多数情况下是自发启动的。现已发现一类重要的NKR分子,其具备了Ly49家族的类似功能与特性,称为NKR-P1(亦称NK1.1)。NKR-P1为30kD的二聚体组成,与Ly49分子家族无同源性,但二者均为C类凝集素超家族中一员,二者基因亦均位于6号染色体上NK基因复合体(NKC)内。抗NKP-P1单抗启动NK杀伤的过程称为/再导向杀伤(Redireted lysis)0。据此学者们认为NKR-P1为一介导NK活化的特异受体。人类KP43可能为活化NKR,为43kD 的二聚体,在介导NK杀伤中起活化作用。另外还发现称为NKG2的分子家族,至少已发现了5个多态性分子,互相间有极大同源性,其功能特性尚在探索之中。

3NK细胞的免疫学调节功能

3.1NK细胞是机体天然免疫的主要承担者T细胞对特定抗原的反应仅是T细胞库中极少比例的T细胞的反应,需要相当长的过程方可达到峰值(10天以上)。NK细胞不需特异抗原的刺激,反应十分迅速,可在数小时或一天内达到高峰。NK细胞被触发的第一个反应是迅速分泌大量的细胞因子(IFN C,TNF A,GM-CSF,IL-3,M-CSF等),其中IFN C在体内的免疫反应至关重要。NK细胞所产生的细胞因子的主要意义在于调节吞噬细胞的功能。采用T细胞和B细胞均缺陷的SCID鼠为实验模型,发现该鼠含有正常的NK和M5功

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田志刚NK细胞研究的几个热点问题第3期

能。采用抗IFN C 单抗或抗NK 抗体以阻断SCID 鼠体内IFN 的功能或直接去除NK 细胞,该鼠均出现M 5的数量及功能的大幅度下降,同时变为极易被肿瘤、细菌或病毒所攻击致死。NK 细胞体内产生IFN C 的能力主要受IL -12的调节,体内IL -12的来源主要由吞噬细胞(单核细胞、巨噬细胞、中性粒细胞、树突状细胞、郎格罕细胞等)所提供,从而形成了一个互相调节的天然免疫防线。

3.2 NK 细胞是获得性细胞免疫的核心调节细胞 正常BALB P c 鼠为利氏曼菌易感鼠,可导致100%死亡。IL -12在感染早期注入后,不但可大幅度减少死亡率,还可使小鼠产生针对再次攻击的免疫力。如果将该小鼠NK 去除,IL -12治疗不可能产生上述治疗效果,亦不出现Th1类细胞因子占主导的细胞免疫反应。正常CH3鼠为利氏曼菌不敏感鼠,体内呈现Th1类细胞因子状态。当去除NK 细胞后,体内呈现Th2类细胞因子状态,同时开始变为利氏曼菌敏感而致死。上述试验直接证明IL -12对机体Th1类细胞因子的主导作用完全依赖于NK 细胞的存在,其中NK 细胞产生IFN C 至关重要。

SCID 鼠和裸鼠体内均无T 细胞反应。当病毒感染时NK 细胞大幅度提高且可持续远比正常BALB P c 鼠长的NK 高峰反应期(可达14天),正常鼠仅持续3天左右。NK 细胞活性在正常鼠体内受C TL 调控,其CD8+CTL 细胞可通过产生IL -4和TGF B (又称为CD8Th2类细胞因子)抑制NK 活性。NK 和CTL 均可受IL -2的正向调节,二者受IL -2调节的状况有极大区别;NK 细胞可持续表达低亲合力IL -2R,从而在任何时间可针对较高浓度IL -2而出现反应;C TL 细胞仅在活化后表达低亲合力IL -2R,从而只有活化的有限的T 细胞克隆可出现针对IL -2的反应,但IL -2仅需较低浓度即可触发反应。

近年发现NK 缺陷病人承受着危及生命的多种病毒的感染。该病人体内CD3-CD16+CD56+NK 细胞缺乏,同时CD8+CD45RO +T 细胞(记忆T 细胞)和CD8+CD57+(效应T 细胞)的数量大幅度下降。正常鼠NK 被去除后,机体对多种病原体的侵袭和肿瘤的产生的抵抗力大幅度下降,尤其是再次免疫反应较难产生。这主要因为NK 缺乏而导致CD8+的C TL 的功能丧失有关。采用混合淋巴细胞试验(MLC)观察NK 对C TL 的调节作用。发现在反应体系中去除CD16+CD56+

的NK 细胞后,CTL 细胞可针对同种异体抗原产生增

殖反应而无法分化为成熟的具有杀伤功能的效应细胞。CTL 前体细胞分化为成熟CTL 必须直接与NK 细胞接触,NK 细胞分泌的可溶性分子无此效应。NK 细胞与C TL 接触的分子为CD56。采用抗NK 单抗(NK1.1)去除小鼠体内NK 后,该小鼠无法产生针对所荷黑色素瘤(B16)的特异性CD8+CTL 细胞,而且对再次攻击无记忆反应。尤为引人注目的发现是,不仅原始T 细胞(Naive T )(初步免疫反应的主体细胞)需要NK 的辅助方可启动免疫反应,休止的记忆T 细胞(2次免疫反应的主体细胞)也需要NK 的辅助方可分化为效应细胞而最终行使免疫学功能。

3.3 NK 细胞是造血的主要调控成分 鉴于是否存在NK 功能亚群或者类似于Th1P Th2的分泌不同类细胞因子的亚群尚不明确,同时不同活化状态的NK 细胞本质的资料亦不充足,导致NK 对造血的调控作用仍众说纷纭。目前主要有三大方面的研究。1对自身造血的影响:主要有两大学派:/NK 抑制造血说0和/NK 促进造血说0。这两派学说所采用的NK 的活化状态不同(例如IL -2刺激与否)、NK 的亚群鉴定方法不同和NK 可分泌的细胞因子种类不同(TNF A ,IFN C ,TGF -B 抑制造血;IL -3,IL -6,GM -CSF,M -CSF,IL -7等促进造血),从而得出了各自假说。这些假说的最终定论均有待于NK 细胞最终本质的揭秘。o对异体骨髓的影响:NK 细胞对于异体实体器官的排斥功能并不十分明显,但针对异体骨髓植入的排斥却远快于T 细胞体系。纯系小鼠F1代的NK 细胞甚至可针对母代的骨髓产生排斥反应,从而出现了不符合器官免疫排斥规律的/杂交抵抗(Hybrid resistance)现象0。?体外对造血干细胞的影响:为使NK 细胞对造血的调控更为具体直观,同时已发现NK 细胞的体内定位迁移与造血干细胞(CD34+)基本一致(一起发源于胎肝、骨髓等),各国学者开始采用/纯化0的NK 和CD34+干细胞进行体外培养以观察二者的直接相互作用。相信该领域的研究将为形成新的骨髓移植P 过继细胞免疫治疗(B MT P ACI)联合治疗方案奠定基础。

4 参考文献(略)

1收稿1999-01-182(编辑 徐 杰)

#会讯#

非洲免疫学联盟第三次国际会议

第一轮通知

时 间:2000年2月14日~17日地 点:喀麦隆、雅温得

主要内容:1.寄生虫感染;2.感染疾病;3.MHC 抗原处理及呈递;4.诊断;5.免疫抑制及艾滋病;6.疫苗发展;7.自身免疫;8.免疫调节;9.生物技术及应用;10.最新趋向。

联系地址:FAI S Conference Secretariat Biotechnology Centre University of Yaounde B.P.3851,messa -Yaounde Fax:+237237429P 237234451 E -mail:rose.Leke @camnet.cm

#144#中国免疫学杂志1999年第15卷

细胞培养基本方法.docx

1?操作台基本要求: S ii. ??*SΛl-≤手的工作A通冈禹基也布局α *!!崗左芋£丄fTAβ^WLJt禺整丄fl-??' 上豹品矿播班苗 2?随着传代次数的增加,连续培养细胞系遗传物质不稳定,不得将细胞存放于-20C 或-80C冰柜中,因为细胞存在次低温条件下活力迅速降低。 3.细胞污染: (1)细菌污染 A S 佛3相差&Λ凰示旳螯主长的丄S ??tfΛ?t i li??- 1EfeS??T可见Iii垦壬庭司的区14存査■ ??S?????^ffi?1但是?

(2)酵母污染 阴站.M栢差圉煙昱示J?壁增齐的23」迄無蛍醉母污果?陌集的H*??ffl胞呈髓兀电貶也??!???生屮转Ke e JH* I (3)霉困污染 初期PH值维持稳定,污染严重后PH值迅速升高,导致培养基浑浊。 (4)病毒污染 一般不会对与其宿主物种不同的细胞培养物造成不良影响,通过电子显微镜检查、一组抗体的免疫染色,ELISA实验或者采用适当病毒引物的PCR技术可以检测出细胞为病毒污染。 (5)支原体污染 唯一检测支原体污染的方法是采用荧光染色、ELISE PCR免疫染色、放射自显 影 4.抗生素只能作为对付污染的最后手段而且只能短期使用,并应尽快撤出 5 ?适合贴壁的细胞和悬浮的细胞

6.基础培无血清培养基 7.PH值:大多数正常哺乳动物细胞系PH为7.4; 成纤维细胞系适合轻度偏碱 (pH747?7) Sf9和sf21等昆虫细胞系最适合在PH值为6.2的环境中生长 8.温度:大多数人和哺乳动物细胞系在36C至37C最佳 昆虫细胞在27C为最佳禽类细胞在38.5C最佳冷血动物(15C -26C) 9.动物细胞形态划分: 成纤维细胞,贴附生长上皮样细胞呈多角形,贴附淋巴母细胞样细胞呈球形,不贴附特殊形态: I型有长突触 U型没有轴突 10.细胞增长模式

中国经济热点问题答案

八次危机——中国的真实经验(一)已完成1 下列不属于工业领域内部特点的是: ?A、资本增密 ?B、劳动增密 ?C、技术增密 ?D、排斥劳动 我的答案:B 2 中国历朝历代新政权都要做的一件事情是()。 ?A、大赦天下 ?B、发动战争 ?C、均田免赋 ?D、施行仁政 我的答案:C 3 新中国成立以后,中国共有多少次成规模的外资进入?()?A、1.0 ?B、2.0

?C、3.0 ?D、4.0 我的答案:D 4 新中国成立以来,由引进外资而引起的经济危机中,后两次为内生性危机。我的答案:× 5 在小资产阶级人口占绝对比例的国家建立社会主义制度的先例并不存在。()我的答案:√ 八次危机—中国的真实经验(二)已完成 1 新中国成立到社会主义改造完成这一时期,中国社会的性质是()。 ?A、资本主义 ?B、社会主义 ?C、新民主主义 ?D、旧民主主义 我的答案:C 2 中共中央提出调动“两个积极性”是在()。

?A、1953年 ?B、1957年 ?C、1958年 ?D、1949年 我的答案:C 3 中苏关系破裂之前,苏联远东舰队在中国唯一的不冻港出口是在()。?A、营口 ?B、旅顺 ?C、阜新 ?D、大连 我的答案:B 4 1957年,中国已经可以独立生产并出口双口座的轻型飞机了。()我的答案:× 5 江泽民时期,农村土地承包经营权30年不变。() 我的答案:√ 1

四个现代化中最早提出的是()。?A、农业现代化 ?B、城镇现代化 ?C、工业现代化 ?D、信息化 我的答案:C 2 以下行业属于世界三大市场的是:?A、能源 ?B、材料 ?C、粮食 ?D、以上都有 我的答案:D 3 斯大林模式的实质是()。 ?A、社会主义 ?B、私人资本主义 ?C、国家资本主义 ?D、官僚资本主义

中国经济热点问题研究网络考试作业

八次危机——中国的真实经验(一) 1.从上世纪50年代开始每次外资进入中国导致的财政赤字会引起几次危机? A、四次 B、三次 C、两次 D、一次 正确答案:C 2.二战之后形成的大部分 经济发展中遇到的共同问题是工业化急需发展,但资本稀缺,从而导致外债。正确答案:√ 3.中国从上世纪50年代开始经历的8次危机中前六次是什么危机? A、输入性危机 B、内生性危机 C、外生性危机 D、挤兑性危机 正确答案:B 4.工业领域的内在特点不包括: A、资本增密 B、人力资本 C、技术增密 D、排斥劳动 正确答案:B 5.小土地所有者可以归类为: A、小资 B、农民 C、资产阶级 D、无产阶级 正确答案:A 八次危机—中国的真实经验(二) 1.中国从50年代开始工业化发展是因为苏联的战略资源。 正确答案:√ 2.中国第一次向苏联提出不同意见的政治事件是什么? A、海湾战争 B、萨拉热窝事件 C、古巴导弹危机 D、匈牙利事件 正确答案:D 3.从什么时候开始苏联不再向中国提供资本技术援助,中苏关系开始交恶? A、1954年 B、1957年 C、1958年 D、1960年 正确答案:B 4.大多数发展中国家进入不了工业化的原因是:

A、缺乏人力资本 B、无法引进和开展机器生产 C、无法跟分散的资源所有者做交易 D、本身农业条件的限制 正确答案:C 5.20世纪50年代,中国和苏联的矛盾最激化的事件不包括: A、匈牙利事件 B、中国收回旅顺口 C、收回大连特区 D、收回中长铁路 正确答案:A 八次危机——中国的真实经验(三) 1.中国知识分子的上山下乡本质上是因为什么? A、促进农村文化提高 B、提高中国文化水平 C、城市工业危机导致大量失业 D、促进农业技术发展 正确答案:C 2.中国的危机主要发生在热战时期,美国的危机主要发生在冷战时期。 正确答案:× 3.三次大规模的插队都是三次危机的结果。 正确答案:√ 4.中美客观经验的相同点: A、两国在人均收入8000美元以前都处于实体经济阶段 B、都没有遭遇过剩危机 C、都没有对外殖民战争 D、中美平均增长速度相同 正确答案:A 5.美国的危机主要发生在: A、冷战时期 B、热战时期 C、改革时期 D、动乱时期 正确答案:B 八次危机——中国的真实经验(四) 1.产业资本主义时代的资本主义地缘战略现在变成了金融资本时代的什么战略? A、技术战略 B、人才战略 C、币缘战略 D、联盟战略 正确答案:C 2.朱镕基总理是从什么时候开始实习国债手段的? A、1998年 B、1999年

影响细胞呼吸的因素

影响细胞呼吸的因素 影响呼吸作用的因素有温度、氧气浓度、二氧化碳浓度、含水量等,其中主要是温度。现在简单谈谈这些因素的影响及其在生产实践中的应用。 1. 温度 呼吸作用在最适温度(25℃~35℃)时最强;超过最适温度,呼吸酶活性降低甚至变性失活,呼吸作用受抑制;低于最适温度,酶活性下降,呼吸作用受抑制。 生产上常利用这一原理在低温下储存蔬菜、水果。在大棚蔬菜的栽培过程中夜间适当降温,抑制呼吸作用,减少有机物的消耗,可达到提高产量的目的。 2. 氧气浓度 在氧气浓度为零时,只进行无氧呼吸;氧气浓度为10%以下时,既进行有氧呼吸,又进行无氧呼吸;氧气浓度为10%以上时,只进行有氧呼吸。 生活中常利用降低氧气浓度能抑制呼吸作用,减少有机物消耗这一原理来延长蔬菜水果的保鲜时间。但是,在完全无氧的情况下,无氧呼吸强,分解的有机物也较多,一样不利于蔬菜水果的保质、保鲜,所以一般采用低氧(5%)保存,此时有氧呼吸较弱,而无氧呼吸又受到抑制。 无土栽培通入空气,农耕松土等都是为了增加氧气的含量,加强根部的有氧呼吸,保证能量供应,促进矿质元素的吸收。 3. 二氧化碳浓度 CO 2是呼吸作用产生的,从化学平衡角度分析,CO 2 浓度增加,呼吸速率下降。 在密闭的地窖中,氧气浓度低,CO 2 浓度较高,抑制细胞的呼吸作用,使整个器官的代谢水平降低,有利于保存蔬菜水果。 4. 含水量 呼吸作用的各种化学反应都是在水中进行的,自由水含量增加,代谢加强。 粮油种子的贮藏,必须降低含水量,使种子处于风干状态,从而使呼吸作用降至最低,以减少有机物消耗。如果种子含水量过高,呼吸作用加强,使贮藏的种子堆中温度上升,反过来又进一步促进种子的呼吸作用,使种子的品质变坏。四、细胞呼吸类型的判断 原理:仅以葡萄糖为呼吸底物,二氧化碳的释放量和氧气的吸收量是判断呼吸底物的重要依据。 1、无CO2的释放——_____________________________ 2、不消耗O2,放CO2——_________________________________

当前我国农业经济的热点问题及研究进展

当前我国农业经济的热点问题及研究进展 2011/6/30 9:22:56 不详佚名【字体:大中小】我要评论(0) 农业在我国产业结构中是最具有“中国特色”的产业。由于其固有的弱质性,在面向市场化、现代化和国际化的进程中,农业面临着多种机遇和挑战。 1、农业现代化和可持续发展 农业现代化的内容是随着实践和认识的提高而逐步发展的。我国最初提出农业的出路在于机械化,后来发展为“四化”,即机械化、电气化、水利化和化学化。显然,当时认识农业现代化是一个生产力或科学技术的概念。1979年后又提出用科学化、集约化和社会化代替原来的“四化”;90年代以来发展为用现代科技(主要是生物技术)、现代装备和现代管理来概括农业现代化,认为可持续农业才是真正意义上的现代农业,并区别于以前的“石油农业”(卢良恕,1998a;胡福明等,1996;顾焕章等,1998;高旺盛,1997;钱志林等,1998;蒋伏心,1995;Zilberman等, 1997)。 在总结国内外研究成果基础上,卢良恕(1998b)结合中国国情提出,现代农业应该是以增加大量外部投入为特征,用现代工业装备、物质投入和科学管理武装起来的高度集约化经营的发达产业;是以资源综合利用和节约为特点的土地生产率和劳动生产率大幅度提高的高效产业;是以提高农民收入和增加农产品有效供给为目标,经济效益、社会效益和生态效益并重的社会化产业;是通过劳动积累向资本积累到技术积累为过程的知识密集型产业。发展现代农业要更新十大观念,即农业增长方式由传统粗放型向现代集约型转变;农业经济结构由传统的种植业向种养加综合经营转变;食物生产由传统的粮食观念向优化食物结构、广辟食物资源的现代食物观念转变;种植业生产结构由传统的粮经二元结构向粮饲经三元结构转变;农业资源开发利用由传统的仅靠耕地向整个国土资源转变;农产品加工由传统的简单加工向现代食品制造业转变;农业产业发展由传统的分散经营向现代贸工农一体化转变;农业投入方式由单一注重物质投入的资源型向物质投入和智力投入并重的知识型转变;资源配置方式由部门分割、行业垄断的封闭低效型向国家宏观调控、市场资源配置资源的开放高效型转变;农村经济结构由工农分离、城乡脱节的二元结构向工农协调、城乡结合的一体化经济转变。 在探讨农业跨世纪发展战略与途径时,顾焕章(1997)强调要处理好我国农业现代化进程中的十大关系,即土地生产率与劳动生产率、有机农业与无机农业、经济效益与生态效益、物质投入与科技投入、生产手段现代化与制度现代化、农业产业化与农民组织化、土地规模经营与社会化服务体系、农村城市化与城乡一体化、政府主导与农民主体、总结自己经

2020高中生物 专题 影响细胞呼吸的因素每日一题 新人教版必修1

影响细胞呼吸的因素 高考频度:★★★☆☆难易程度:★★☆☆☆ 现有一瓶混有酵母菌和葡萄糖的培养液,通入不同浓度的氧气时,产生酒精和二氧化碳的量如图所示,请据图回答问题。 (1)曲线A表示___________的量;曲线B表示___________的量。判断依据是____________________。 (2)酵母菌呼吸作用产生酒精的场所是___________,酒精可用_________________________________鉴定。(3)氧气浓度为a时,酵母菌无氧呼吸消耗的葡萄糖量占葡萄糖总消耗量的_____________________。 【参考答案】(1)二氧化碳酒精随氧气浓度升高,酵母菌无氧呼吸减弱,有氧呼吸增强,所以酒精产生量减少,二氧化碳产生量增加 (2)细胞质基质(酸性)重铬酸钾溶液 (3)2/3 1.研究发现,冬小麦在秋冬受低温袭击时,呼吸速率先升高后降低;持续的冷害使根生长迟缓,吸收能力下降,但细胞内可溶性糖的含量明显的提高。下列推断合理的是 A.冷害初期呼吸作用增强,不利于抵御寒冷 B.低温持续使线粒体内氧化酶活性减弱,影响可溶性糖合成淀粉

C.低温使细胞内结合水含量降低,自由水含量增加,以适应低温环境 D.低温使根细胞呼吸减弱,使根细胞吸收矿质元素能力下降 2.如图是外界条件对植物细胞呼吸速率的影响曲线图,以下分析不正确的是 A.从甲图中可知,细胞呼吸最旺盛时的温度是B点。AB段可说明在一定的温度范围内,随着温度升高,细胞呼吸加快 B.乙图中曲线Ⅰ表示无氧呼吸,曲线Ⅱ表示有氧呼吸 C.如果乙图中曲线Ⅰ描述的是水稻根细胞的呼吸,那么在DE段根细胞内积累的物质是乳酸 D.曲线Ⅱ表示的生理过程所利用的有机物主要是葡萄糖 3.为探究氧浓度对假丝酵母菌呼吸熵的影响(呼吸熵=放出的CO2量/吸收的O2量),以葡萄糖为呼吸底物进行实验。当氧浓度为0~5%时,呼吸熵都大于1;当氧浓度≥7%时,呼吸熵都等于1。回答下列问题: (1)当氧浓度为0%时,葡萄糖分解的场所是假丝酵母菌细胞中的_____________________;分解形成的产物中,用重铬酸钾的浓硫酸溶液可检测出______________。 (2)实验中呼吸熵大于1的原因是__________________________________;呼吸熵等于1的原因是_____________________。 (3)当氧浓度≥7%时,将呼吸底物改换为花生油,呼吸熵小于1。从化学元素组成的角度分析,因为花生油脂质分子中氧的含量_____________________葡萄糖中氧的含量,氢的含量_____________________葡萄糖中氢的含量,所以脂质分子在氧化分解过程中耗氧量___________________。 1.【答案】D 【解析】冷害初期呼吸作用增强,释放能量增加,利于抵御寒冷,A错误;持续低温使线粒体内氧化酶活性减弱,使细胞呼吸减弱,而氧化酶与可溶性糖合成淀粉无关,B错误;低温使细胞内结合水含量增加,自由水含量降低,细胞液浓度上升,有利于适应低温环境,C错误;低温使根细胞呼吸减弱,提供能量减少,导致细胞吸收矿质营养能力下降,D正确。

中国经济热点问题研究(2016课后习题以与答案正确率在99.9以上)

八次危机——中国的真实经验(一)已完成 1 下列不属于工业领域部特点的是: ?A、资本增密 ?B、劳动增密 ?C、技术增密 ?D、排斥劳动 我的答案:B 2 中国历朝历代新政权都要做的一件事情是()。 ?A、大赦天下 ?B、发动战争 ?C、均田免赋 ?D、施行仁政 我的答案:C 3 新中国成立以后,中国共有多少次成规模的外资进入?() ?A、1.0 ?B、2.0 ?C、3.0 ?D、4.0 我的答案:D 4 新中国成立以来,由引进外资而引起的经济危机中,后两次为生性危机。 我的答案:× 5 在小资产阶级人口占绝对比例的国家建立社会主义制度的先例并不存在。()我的答案:√

八次危机—中国的真实经验(二)已完成 1 新中国成立到社会主义改造完成这一时期,中国社会的性质是()。?A、资本主义 ?B、社会主义 ?C、新民主主义 ?D、旧民主主义 我的答案:C 2 中共中央提出调动“两个积极性”是在()。 ?A、1953年 ?B、1957年 ?C、1958年 ?D、1949年 我的答案:C 3 中苏关系破裂之前,苏联远东舰队在中国唯一的不冻港出口是在()。?A、 ?B、旅顺 ?C、 ?D、 我的答案:B 4 1957年,中国已经可以独立生产并出口双口座的轻型飞机了。() 我的答案:× 5 时期,农村土地承包经营权30年不变。() 我的答案:√

八次危机——中国的真实经验(三)已完成 1 四个现代化中最早提出的是()。 ?A、农业现代化 ?B、城镇现代化 ?C、工业现代化 ?D、信息化 我的答案:A 2 以下行业属于世界三大市场的是: ?A、能源 ?B、材料 ?C、粮食 ?D、以上都有 我的答案:D 3 斯大林模式的实质是()。 ?A、社会主义 ?B、私人资本主义 ?C、国家资本主义 ?D、官僚资本主义 我的答案:C 4 没有任何一个政治现代化的发达国家是用自己本国的财政来承担本国庞大的上层建筑支出的。() 我的答案:√ 5 美国的危机多发生在热战时期,中国的危机多发生在冷战时期。

NK细胞的研究现状及应用前景

自然杀伤( NK) 细胞是先天性免疫系统的重要组成部分,是机体抗御感染和防止细胞恶性转化的重要免疫调节细胞。与T 淋巴细胞不同, NK 细胞无需肿瘤特异性抗原识别便可以直接杀伤肿瘤细胞, 是肿瘤免疫治疗的重要效应细胞[1]。人类NK细胞约占全血淋巴细胞的10 %~15 %。目前研究认为NK 细胞特异性表达CD56, 而缺乏T 细胞抗原CD3。NK 细胞具有以下功能:( 1) 对病毒感染细胞、白血病细胞及其他肿瘤细胞产生直接细胞毒活性;( 2) 分泌多种免疫调节细胞因子 ( 如:IFN- γ, TNF- α, GM- CSF) ;( 3) 通过细胞膜FcγRⅢ( CD16)与抗体Fc 段结合从而介导抗体依赖的细胞毒( ADCC) 作用 NK 细胞临床应用进展 2.1 体内扩增、激活NK 细胞 目前NK 细胞的免疫治疗主要是利用细胞因子体内扩增、 激活NK 细胞和体外产生LAK、CIK 细胞杀伤自体肿瘤细胞。 从早期的大剂量IL- 2 治疗的严重毒副作用到随后的长期小剂 量联合间断中剂量IL- 2 治疗证实在HIV 感染及恶性肿瘤患者 中可以较好耐受。但这种治疗方法只是增强骨髓祖细胞向NK 细胞分化及依赖IL- 2 延迟NK 细胞的凋亡, 而并非外周血成 熟NK 细胞的增生[14, 15]。因此联合应用IL- 2 和其他细胞因子 ( 如IL- 12, IL- 15, KL, FL) 可能达到更好的体内和体外扩增 NK 细胞的效果[16, 17]。但是由自体肿瘤细胞上表达的MHC- Ⅰ类 分子所介导的抑制性信号仍然是成功治疗的最大限制。 2.2 体内阻滞抑制性受体 在自体和HLA 相合的干细胞移植中, 白血病细胞表达 MHC- Ⅰ类分子与NK 细胞的抑制性受体结合从而抑制NK 细

常规细胞培养方法

常规细胞培养方法(原代培养和传代培养)初代培养 原理 将动物机体的各种组织从机体中取出,经各种酶(常用胰蛋白酶)、螯合剂(常用EDTA)或机械方法处理,分散成单细胞,置合适的培养基中培养,使细胞得以生存、生长和繁殖,这一过程称原代培养。 仪器、材料及试剂 仪器:培养箱(调整至37℃),培养瓶、青霉素瓶、小玻璃漏斗、平皿、吸管、移液管、纱布、手术器械、血球计数板、离心机、水浴箱(37℃) 材料:动物组织块 试剂:1640培养基(含20%小牛血清),0.25%胰酶,Hank′s 液,碘酒 初代消化培养法

1.准备:取各种已消毒的培养用品置于净化台面,紫外线消毒20分钟。开始工作前先洗手、75%酒精擦拭手至肘部。 2.布局:点燃酒精灯,安装吸管帽。 3.处理组织:把组织块置于烧杯中,用Hanks液漂洗2~3次,去除血污;如怀疑组织可能污染,可先置于含有青链霉素的混合液中3 0~60分钟。 4.剪切:用眼科剪把组织切成2~3毫米大小的块,以便于消化。加入比组织块总量多30~50倍的胰蛋白酶液,然后一并倒入三角烧瓶中,结扎瓶口或塞以胶塞。 5.消化:或用恒温水浴,或置于37℃温箱消化均可,消化中每隔20分钟应摇动一次,如用电磁恒温搅拌器消化更好。消化时间依组织块的大小和组织的硬度而定。 6.分离:在消化过程中见消化液发混浊时,可用吸管吸出少许消化液在镜下观察,如组织已分散成细胞团或单个细胞,立即终止消化,随即通过适宜不锈钢筛,滤掉尚未充分消化开的组织块。低速(500 ~1000转/分)离心消化液5分钟,吸出上清,加入适量含有血清的培养液。

7.计数:用计数板计数,如细胞悬液细胞密度过大,再补加培养液调整后,分装入培养瓶中。对大多数细胞来说,pH要求在7.2~7. 4范围,培养液呈微红色,如颜色偏黄,说明液体变酸,可用NaHC O3调整。 8.培养:置于36.5℃温箱培养,如用CO2温箱培养,瓶口需用纱布棉塞或螺旋帽堵塞,纱布塞易生霉菌,每次换液时需要换新塞。 初代组织块培养法 1.剪切:把组织小块置于小烧杯或青霉素小瓶中,用Hanks液漂洗二三次以去掉表面血污,吸静Hanks液,用眼科剪反复剪切1mm 3块为止。 2.摆布:用弯头吸管吸取若干小块,置于培养瓶中,用吸管弯头把组织小块摆布在培养瓶底部,小块相互距离以0.5cm为宜,每一2 5ml培养瓶底可摆布20~30块。 3.轻轻翻转培养瓶,另瓶底向上,注意翻瓶时勿另组织小块流动,塞好瓶塞,置36.5℃温箱培养2小时左右(勿超过4小时),使小块微干涸。 4.培养:从微箱中取出培养瓶,开塞,46度斜持培养瓶,箱瓶底脚部轻轻注入培养液少许,然后缓缓再把培养瓶翻转过来,让培养液

中国经济热点问题研究

中国经济热点问题研究 作业标题:八次危机——中国的真实经验(一) 1 下列不属于工业领域内部特点的是:(B) A、资本增密 B、劳动增密 C、技术增密 D、排斥劳动 2 中国历朝历代新政权都要做的一件事情是(C)。 A、大赦天下 B、发动战争 C、均田免赋 D、施行仁政 3 新中国成立以后,中国共有多少次成规模的外资进入?(D) A、1.0 B、2.0 C、3.0 D、4.0 4新中国成立以来,由引进外资而引起的经济危机中,后两次为内生性危机。

正确答案:× 5在小资产阶级人口占绝对比例的国家建立社会主义制度的先例并不存在。() 正确答案:√ 作业标题:八次危机—中国的真实经验(二) 1 新中国成立到社会主义改造完成这一时期,中国社会的性质是(C)。 A、资本主义 B、社会主义 C、新民主主义 D、旧民主主义 2、1957年,中国已经可以独立生产并出口双口座的轻型飞机了。()正确答案:× 3 中共中央提出调动“两个积极性”是在(C)。 A、1953年 B、1957年 C、1958年 D、1949年 4江泽民时期,农村土地承包经营权30年不变。() 正确答案:√ 5

中苏关系破裂之前,苏联远东舰队在中国唯一的不冻港出口是在(B)。 A、营口 B、旅顺 C、阜新 D、大连 作业标题:八次危机——中国的真实经验(三) 1没有任何一个政治现代化的发达国家是用自己本国的财政来承担本国庞大的上层建筑支出的。() 正确答案:√ 2 四个现代化中最早提出的是(A)。 A、农业现代化 B、城镇现代化 C、工业现代化 D、信息化 3 以下行业属于世界三大市场的是:(D) A、能源 B、材料 C、粮食 D、以上都有 4美国的危机多发生在热战时期,中国的危机多发生在冷战时期。

关于NK细胞的研究

关于NK细胞的研究 【摘要】:自然杀伤细胞是机体重要的免疫细胞,不仅与抗肿瘤、抗病毒感染和免疫调节有关,而且在某些情况下参与超敏反应和自身免疫性疾病的发生。1【In humans, NK cells comprise about 30%–50% of intrahepatic lymphocytes, whereas peripheral blood lymphocytes contain about 5%–20% NK cells. Accumulating evidence suggests that NK cells play an important role not only in host defense against invading microorganisms and tumor transformation in the liver but also in liver injury and repair.】 一,NK细胞的来源: NK细胞确切的来源还不十分清楚,一般认为直接从骨髓中衍生,其发育成熟依赖于骨髓的微环境。实验表明,胸腺细胞在体外IL-2等细胞因子存在条件下培养也可诱导出NK细胞。二,NK细胞的功能: (一)自然杀伤活性 由于NK细胞的杀伤活性无MHC限制,不依赖抗体,因此称为自然杀伤活性。NK细胞作用于靶细胞后杀伤作用出现早,在体外1小时、体内4小时即可见到杀伤效应。NK细胞的靶细胞主要有某些肿瘤细胞、病毒感染细胞、某些自身组织细胞(如血细胞)、寄生虫等,因此NK细胞是机体抗肿瘤、抗感染的重要免疫因素,也参与第Ⅱ型超敏反应和移植物抗宿主反应。 1. 识别靶细胞NK细胞识别靶细胞是非特异性的,这与CTL识别靶细胞机理不同,但确切的机理尚未明了。 2. 杀伤介质主要有穿孔素、NK细胞毒因子和TNF等。 (二)ADCC (antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity) NK细胞表面具有FcγRⅢA,主要结合人IgG1和IgG3的Fc段(Cγ2、Cγ3功能区),在针对靶细胞特异性IgG抗体的介导下可杀伤相应靶细胞。IL-2和IFN-γ明显增强NK细胞介导的ADCC作用。 (三)分泌细胞因子 活化的NK细胞可合成和分泌多种细胞因子,发挥调节免疫和造血作用以及直接杀伤靶细胞的作用。 此外,NK细胞可抑制PWM体外诱导B细胞的分化及抗体应答,其机理可能通过直接抑制B 细胞或抑制辅佐细胞的抗原提呈作用。 (1)NK细胞在体外还可杀伤某些细菌、真菌、原虫等,可能与NK细胞释放某些杀伤介质有关。(2)NK细胞在免疫监视、杀伤突变的肿瘤细胞可能比T细胞具有更重要的作用。(3)参与骨髓移植后移植物抗白血病效应骨髓移植后数周内,来自供体的NK细胞在PBL中占相当高的比例。有报道称2【CD8~+Tr、双阴性T(DNT)细胞和NK T 细胞在移植耐受的不同模型中亦发挥重要作用。】此外,在体内NK细胞还可杀伤某些不成熟细胞如骨髓干细胞、胸腺细胞亚群等。 它还和杀死肿瘤细胞有关,可利用分泌穿孔素及肿瘤坏死因子,摧毁目标细胞。并且3【可以通过细胞因子、单抗及多功能抗体介导NK细胞活化,调节抑制性信号和活化性信号传递加强NK细胞活性,免疫药物刺激及基因修饰提高NK细胞功能等多种途径增强NK细胞的肿瘤杀伤作用。】 4【A comparison of IL-15 stimulation and IL-2 stimulation showed slightly higher efficiency of IL-15 for expansion of CD4 + CD25 + cells, and for FoxP3 expression, IL-15 also showed significantly higher efficacy for inhibition of MLC.】

影响细胞呼吸的因素及应用

1.温度对细胞呼吸的影响 (1)温度通过影响酶的活性影响细胞呼吸速率。 (2)根据曲线模型分析: ①最适温度时,细胞呼吸最强。 ②超过最适温度时,呼吸酶活性降低,甚至变性失活,细胞呼吸受到抑制。 ③低于最适温度呼吸酶活性下降,细胞呼吸受到抑制。 (3)应用:①低温下贮存蔬菜水果。 ②温室栽培中增大昼夜温差(降低夜间温度),以减少夜间呼吸消耗有机物。 2.氧气浓度对细胞呼吸的影响 (1)机理:O2是有氧呼吸所必需的,且O2对无氧呼吸过程有抑制作用。 (2)根据曲线模型分析: ①O2浓度=0时,只进行无氧呼吸。 ②0

A.与t1相比,t2时呼吸速率高峰出现时间推迟且峰值低,不利于叶片贮藏 B.与t2相比,t1时乙烯产生量高峰出现时间提前且峰值高,有利于叶片贮藏 C.t1、t2条件下呼吸速率的变化趋势相似,t1>t2,t1时不利于叶片贮藏 D.t1、t2条件下乙烯产生量的变化趋势相似,t1

分子克隆及细胞培养基本实验方法

分子克隆及细胞培养基本实验方法 1.载体构建实用操作技术 1.1菌种的保存—20%甘油菌 2体积菌液与1体积70%的甘油混合后,储存于-20℃或-70℃备用。(甘油菌中甘油的浓度为20-30%均可) 1.2甘油菌复苏、培养 方法一、挑取甘油菌一环,接种在含100ug/ml Amp的LB固体培养基上(活化菌种),37℃培养过夜(约16小时);挑取一个菌落转接在含100ug/ml Amp 的LB液体培养基中,37℃振荡过夜(约12~16小时)。 方法二、直接吸取10~20ul甘油菌,接种在含100ug/ml Amp的LB液体培养基中,37℃振荡过夜(约12~16小时)。 1.3小规模制备质粒DNA(QIA miniprep kit ) 适于从1~5ml 菌液中制备20ug高拷贝质粒 ⑴收集菌液,离心1000rpm,1分,弃上清 ⑵以250ul P1重悬细菌(P1中已加RNase) ⑶加入250ul P2,颠倒4~6次轻混,约2~3分(轻混以免剪切基因组DNA,并免 长时间消化) ⑷加入350ul N3,迅速颠倒4~6次轻混;离心10分,13 000rpm ⑸上清入QIAprep柱,离心30~60秒,滤液弃之 ⑹加入0.5ml PB洗,离心30~60秒 ⑺加入0.75ml PE洗,离心30~60秒,弃滤液,再离心1分 ⑻换新管,加入50ul EB,静置1分(EB 37℃预热),离心1分。 1.4酶切反应 ⑴体系构成(反应体系尽可能小!) pGEM3ZF-huCTLA4-Ig(ul)pAdTrack-CMV(ul)

①dd.H2O 17 17 ②10×NEbuff 2 3 3 ③10×BSA 3 3 ④底物DNA 5 5 ⑤内切酶HindⅢ 1 1 XbaⅠ 1 1 Total : 30 ul 30ul ⑵37℃水浴1~2小时,必要时延长酶切时间至12小时 ⑶酶切2小时后,取5-10ul 电泳观察酶解是否完全 ⑷65℃灭活内切酶 ⑸-20℃保存备用 1.5回收目的片段(QIAquick Gel extraction Protocol) ⑴胶,尽可能去除多余的胶,称重; ⑵加入适量buff QG(300ul QG /100mg胶);>2%的胶,应加大QG用量(600ul QG /100mg); ⑶水浴50℃,10min,每2-3min混匀一次,使胶完全溶解!必要时延长水浴时间, 胶完全溶解后混合物颜色应为黄色,与buff QG 相似; ⑷当DNA片段在<500bp或>4kb时,应加入异戊醇100ul/100mg胶,以提高产物 量。此步不离心。DNA片段在500bp~4kb时,加入异戊醇并不能提高产量; ⑸结合:将混合物转入QIAquick柱,离心13000rpm,1min;(柱容量800ul/次); ⑹洗:0.75ml buff PE,离心13000rpm,1min;(DNA用于盐敏感操作时,如平 端连接、直接测序,加入PE后静置2-5min);弃离心液,再离心13000rpm, 1min,以去除剩余的乙醇; ⑺将QIAquick柱置于一清洁的1.5ml Ep管,加入30~50ul buff EB或H2O (滴 于QIAquick 膜上!),静置1min,离心15000rpm,1min; ⑻-20℃保存备用。 1.6连接反应

MDCK细胞培养基本技术方法 -2011本

MDCK细胞培养 一、目的MDCK细胞培养是分离流感病毒及相关研究实验的基本技术。 二、适用范围适用于疾控中心所有技术人员。 三、程序 (一)生物安全要求实验室生物安全级别:BSL-1所有操作必须在BSL-1实验室的生物安全柜里进行。 (二)材料 1.生长成片的MDCK细胞 2.无菌的T25细胞培养瓶 3.D-MEM培养液(含有L-谷氨酰胺) 4.青、链霉素母液(10000U/mL青霉素G;10000μg/mL硫酸链霉素),分装后保存于-20℃ 5.HEPES缓冲液,1M母液 6.胎牛血清 7.EDTA-胰酶(0.05%胰酶,0.53mMEDTA-4Na),分装后保存于-20℃8.7.5%牛血清白蛋白组分V9.1mL、10mL无菌移液管10.70%~75%的酒精注意事项:经常检查试剂使用的有效期。 (三)实验步骤这里以T75细胞瓶的单层细胞培养为例,叙述MDCK细胞的培养程序。如果细胞瓶的规格有变,MDCK细胞悬液的量必须做相应的调整。 1.D-MEM培养液的准备 500mLD-MEM液中加入:青、链霉素母液5mL(终浓度达:100U/mL青霉素;100μg/mL链霉素),HEPES缓冲液12.5mL(终浓度:25mM)。7.5%牛血清白蛋白组分Ⅴ12.5mL 2.细胞生长液的准备 胎牛血清10mL加到90mL的上述(1)的液体中,使胎牛血清的终浓度为10%。 3.首先将细胞培养瓶中的培养液弃去,加入5mL在37℃水浴中预热的EDTA-胰酶。 4.温和地摇动细胞瓶1min,使EDTA-胰酶均匀分布在整个细胞薄层。然后用移液管吸去EDTA胰酶。

5.重新加入5mL在37℃水浴中预热的EDTA-胰酶重复上述步骤。 6.加入1mLEDTA-胰酶使其均匀分布在整个细胞薄层,37℃孵育细胞瓶直至细胞从塑料细胞瓶的表面分离(约5~10min)。必要时可以摇动或吹打来分离细胞。然后加入1mL胎牛血清灭活残余的胰酶。 7.加9mL已经配置好的含有L-谷氨酸的D-MEM培养液,轻轻用移动移液管来吹散细胞团。 8.取10mL混合物加到90mL细胞生长液(细胞悬液的浓度大约为每毫升含105细胞) 9.每个T25细胞培养瓶加入6mL(6×105/mL)细胞悬液,剩余的细胞悬液可以加到T75细胞瓶用于细胞传代。通常6mL细胞悬液2~3日可生长成片(80%~90%)的单层细胞。 10.于37℃,5%CO2培养箱里培养细胞,每天观察细胞状态,以供进一步实验用。

2019年中国经济研究热点分析

2010年中国经济研究热点分析 2011-01-2715:29 中国经济研究热点排名 根据教育部中国社会科学研究评价中心提供的2010—2011年中文社 会科学引文索引(CSSCI)来源期刊排名,确定了17份统计样本期刊。通过对2010年在这17份期刊上发表的全部学术论文按专题进行分类统计,得出了2010年中国经济研究的热点问题。排在前10位的问题分别是:经济增长与发展、资本市场、“三农”、产业结构与产业政策、收入分配与收入差距、货币政策、对外贸易与贸易政策、自主创新、低碳经济、区域经济发展。 经济研究热点的新变化 国际金融危机对我国经济的冲击表面上是对经济增长速度的冲击,实质上是对经济发展方式的冲击。巩固和扩大应对国际金融危机冲击的成果,需要加快转变经济发展方式。2010年,我国已成为世界第二大经济体。加快从经济大国迈向经济强国,同样需要加快转变经济发展方式。这就决定了2010年中国经济研究热点排名变化带有转变经济发展方式的突出特征。具体表现在以下几个方面: 自主创新更受重视。加快转变经济发展方式,须加强自主创新,坚持把科技进步和创新作为重要支撑。只有如此,才能促使经济增长由主要依靠增加物质资源消耗向主要依靠科技进步、劳动者素质提高、管理创新转变,突破资源瓶颈,实现经济长期平稳较快发展;才能建设资源节约型、环境友好型社会,实现人与自然和谐相处。在加快转变经济发展方式的新框架中,自主创新的研究内容从以往侧重技术创新向全面创新提升。有学者提出了构建创新型经济的新战略,即从跟随战略向引领战略转变、从比较优势向竞争优势转变。

低碳经济首次进入前10位。加快转变经济发展方式,须坚持把建设资源节约型、环境友好型社会作为重要着力点。随着全球气候变暖和极端天气频频出现,节能减排、保护生态环境成为各国经济发展的硬约束。作为负责任的发展中大国,我国强调大力发展低碳经济,努力降低单位国内生产总值能耗和二氧化碳排放。2010年,我国确立了首批发展低碳产业、建设低碳城市、倡导低碳生活的试点城市。在这种形势下,低碳经济研究成为经济学者面对的重要任务。在研究内容上,一是从不同产业、生产和消费、城镇化、能源效率、低碳技术、碳排放交易市场等视角探讨影响碳排放的主要因素,寻求降低碳排放的途径与机制;二是深化碳税、环境税、碳关税等的研究,以进一步完善环境规制、促进节能减排;三是将低碳经济置于我国经济发展大局中来研究,丰富了经济发展理论。 区域经济发展重回前10位。加快转变经济发展方式,须坚持把经济结构战略性调整作为主攻方向。其中,包括缩小区域差距,实现区域经济协调发展。2009年以来,我国多个区域经济发展战略上升为国家战略,区域经济发展新格局初步形成,为区域经济研究开辟了新领域。在研究内容上,一是从产业分布、自主创新、城镇化、区域要素丰裕度、区域全要素生产率、外商直接投资、制度等视角探讨我国区域发展差距的形成原因以及协调发展的对策;二是从区域经济融合、区域创新体系、区域市场效应、区域空间效率、环境约束、区域政策等方面深化区域经济发展战略研究;三是把低碳经济、生态环境等因素纳入区域经济发展理论体系。 对收入分配与收入差距的关注度再创新高。加快转变经济发展方式,须坚持把保障和改善民生作为根本出发点和落脚点。这就要求深化收入分配制度改革,调整收入分配格局,抑制收入差距扩大趋势,为增强消费对经济发展的拉动作用、为全体人民共享经济发展成果提供分配制度基础。有关研究主要围绕以下几方面展开:继续探讨收入分配不公的根源和解决途径;从国民收入结构失衡、技术进步、市场力量、出口贸易、地方政府行为等视角探讨劳动收入份额变动及其提升的途径;分析增加居民财产性收入的主要影响因素及措施;关注城市低收入群体和城市贫困问题;将幸

影响呼吸作用的因素

影响植物的呼吸作用的因素有温度、湿度、环境气体、机械损伤及植物激素。(1)温度:呼吸作用和温度的关系十分密切。一般地说,在一定的温度范围内,每升高10℃呼吸强度就增加1倍,如果降低温度,呼吸强度就大大减弱。果蔬呼吸强度越小,物质消耗也就越慢,贮藏寿命便延长。因此,贮藏果蔬的普遍措施,就是尽可能维持较低的温度,将果蔬的呼吸作用抑制到最低限度。 (2)湿度:一般来说,轻微的干燥较湿润更可抑制呼吸作用。 干燥种子呼吸作用在粮油种子贮藏中的应用。粮食贮藏中首要的问题是控制种子的含水量不得超过安全含水量, (3)环境:适当降低贮藏环境中的氧浓度和适当提高二氧化碳浓度,可以抑制果蔬的呼吸作用,从而延缓果蔬的后熟、衰老过程。另外,较低温度和低氧、高二氧化碳也会抑制果蔬乙烯的合成并抑制已有乙烯对果蔬的影响。 (4)机械损伤:在这种情况下,果蔬的呼吸强度增强,因而会大大缩短贮藏寿命,加速果蔬的后熟和衰老。受机械损伤的果蔬,还容易受病菌侵染而引起腐烂。因此,在采收、分级、包装、运输和贮藏过程中要避免果蔬受到机械损伤。这是长期贮藏果蔬的重要前提。(5)化学调节物质主要是指植物激素类物质植物激素、生长素和激动素对果蔬总的作用是抑制呼吸、延缓后熟。乙烯和脱落酸总的作用是促进呼吸、加速后熟。当然,由于浓度的不同和种类不同,各种植物激素的反应也是十分多样的。

呼吸作用知识在生产实践中应用: 1.干燥种子呼吸作用在粮油种子贮藏中的应用。粮食贮藏中首要的问题是控制种子的含水量不得超过安全含水量,一般油料种子的含水量在8~9%,淀粉种子含水量在11~12%时才能安全贮藏,此时种子里所含水都是束缚水。此外,还要经常通风换气,适当提高CO2浓度,降低O2浓度或将粮食中空气抽出,充入N2,抑制其呼吸作用实现安全贮藏的目的。 2.萌发种子和幼苗的呼吸作用的应用。种子吸水膨胀后,呼吸作用增强,播种后必须保证水分的充足供应并有相应适宜的温度和空气,保证有氧呼吸,抑制无氧呼吸。如果播种后长期淹水造成缺氧,对幼苗器官的形成和转化不利,特别是根的生长和分化受到明显抑制,中生植物则首先要中耕松土来保证根部的有氧呼吸,抑制无氧呼吸。 3.果实呼吸作用与贮藏。呼吸跃变型果实在呼吸跃变后果实品质下降失去食用价值,因此,推迟跃变型果实的呼吸高峰的来临,在果实的贮藏保鲜上具有重要意义,生产上常采用的措施是:①在呼吸跃变期出现前采收,同时避免伤呼吸的产生;②降低温度,大多数果实的贮藏温度为0~1℃左右,而香蕉要在11~14.5℃左右;③增加CO2的浓度,降低O2浓度,降低乙烯的浓度。 二、呼吸跃变 呼吸跃变现象:指果实在成熟过程中,呼吸速率首先降低,然后

影响呼吸作用的因素及应用

影响呼吸作用的因素及应用 导入:回顾上节课内容: 细胞呼吸的两个反应式: 一、分析影响呼吸作用的内部因素 1、不同植物种类呼吸速率不同 (1)低等植物>高等植物 (2)生长快的植物>生长慢的植物 (3)草本植物>木本植物 2、不同器官、组织呼吸速率不同 (1)幼嫩器官>年老器官 (2) 生殖器官>营养器官 二、外部因素对呼吸速率的影响 1. 温度:呼吸作用在分解有机物过程中,需要一系列酶的催化,温度通过影响酶的活性来影响呼吸作用。如下图所示:在最适温度B 以下,呼吸强度随着温度升高而增强。超过最适温度,呼吸强度随着温度升高而减弱,当温度过高时,由于酶 遭到不可逆破坏而完全失去活性,呼吸作用 就停止 应用:生产上,常利用降温的方法来延长蔬 果的贮存时间。大棚栽培时,则可适当降低 夜间温度,以减少有机物的消耗。农民冬种 红薯和马铃薯时,常常运用培土起畦的方法, 以便白天土壤能吸收更多太阳能,提高土温, 促进吸收更多的矿质元素,夜晚又能快速降温,以减弱呼吸作用,减少有机物的消耗,从而达到增产 的目的。 例1. 图1表示在不同温度条件 下,测到的植物光合作用同化二 氧化碳量和呼吸作用释放二氧化 碳量的变化曲线。据图回答:(1) 在该实验条件下,使植物体中有 机物增加最快的温度是

_______________。 (2)在该实验条件下,植物体中有机物开始减少的温度是_________________。 (3)要使该植物有机物增加,除改变温度条件外,还可以改变实验中的______________________两个条件。 2. 氧气和二氧化碳 氧气不足会直接影响到呼吸速率和呼吸性质。绿色植物在缺氧时进行无氧呼吸,大多数植物无氧呼吸产生酒精毒害细胞,而且无氧呼吸释放的能量少,不能满足正常生命活动的需要。所以陆生植物不能长时间忍受无氧呼吸。氧气对无氧呼吸有抑制作用,当氧气浓度逐渐升高时,无氧呼吸逐渐减弱,最后消失,而有氧呼吸则逐渐增强。两者关系可以用图2曲线说明。图中曲线OAF 是有氧呼吸释放CO2的变化量,曲线 CAB是无氧呼吸释放二氧化碳变化 量,曲线CDF是CO2释放的总量变化 曲线。 其中的E点和B点都是无氧呼吸消 失点,A点和D点是呼吸作用最弱 点,F点是氧气饱和点,氧浓度 超过此点,再提高氧浓度,呼吸 作用也不再增强了。 应用: 在贮存蔬果时,常常运用降低氧浓度(如充氮气或充二氧化碳)的方法来达到保鲜目的,一般把氧浓度降到无氧呼吸消失点。如果氧浓度太低,植物组织进行无氧呼吸产生酒精,酒精对细胞有毒害作用,影响保鲜。给植物松土或无土栽培时充入氧气,以增强根细胞的呼吸作用,促进吸收更多的矿质营养。在酿酒时,先通入氧气,促进有氧呼吸,加快酵母繁殖,然后创造一个无氧环境,加速酒精发酵。

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