海洋放线菌的培养鉴定与分离方法

海洋放线菌的培养鉴定与分离方法

一、放线菌的分布

放线菌常以孢子或菌丝状态极其广泛地存在于自然界。不论数量和种类，以土壤中最多。据测定，每克土壤可含数万乃至数百万个孢子，但受土壤性质、季节、作物种类等条件的影响。一般情况下，肥土较瘦土多，农田土比森林土多，中性或偏碱性土壤中也较多。土壤环境因子如有机质、水分、温度、通气状况等也影响其数量。它适宜在含水量较低的土壤内生长。而厩肥和堆肥中仅限于高温放线菌活动。放线菌所产生的代谢产物往往使土壤具有特殊的泥腥味。

河流和湖泊中，放线菌数量不多，大多为小单孢菌、游动放线菌和孢囊链霉菌，还有少数链霉菌。海洋中的放线菌多半来自土壤或生存在漂浮海面的藻体上。海水中还存在耐盐放线菌。大气中也存在着大量的放线菌菌丝和孢子，它们并非原生的微生物区系，而是由于土壤、动植物、食品甚至衣物等表面均有大量的放线菌存在，由于它们耐干燥，常随尘埃、水滴，借助风力飞入大气所致。

食品上常常生长放线菌，尤其在比较干燥、温暖的条件下易于大量繁殖，使食品发出刺鼻的霉味。

健康动物，特别是反刍动物的肠道内有着大量的放线菌，它们可有是肠道内定居的微生物，堆肥中的高温放线菌可能来源于此。在动物和植物体表有大量的腐生性放线菌，偶尔也有寄生性放线菌存在。

了解放线菌的分布，对于进一步开发放线菌资源，发现和筛选新的抗生素，无疑是很重要的。

二、放线菌的形态与结构

放线菌菌体为单细胞，大多由分枝发达的菌丝组成，最简单的为杆状或具原始菌丝。菌丝直径与杆状细菌差不多，大约1微米。细胞壁化学组成中亦含原核生物所特有的胞壁酸和二氨基庚二酸，不含几丁质或纤维素。革兰氏染色阳性反应，极少阴性。有许多放线菌对抗酸性染色亦吴阳性反应，像诺卡氏放线菌。它与结核杆菌相比，如果脱色时间太长也可成为阴性，这是诺卡氏菌与结核杆菌的区别之一。

放线菌菌丝细胞的结构与细菌基本相同。根据菌丝形态和功能可分为营养菌丝、气生丝和孢子丝三种。

(一)营养菌丝又叫初级丝体或一级菌丝体，匍匐生长于培养基内，主要生理功能是吸收营养物，故亦称基内菌丝。营养菌丝一般无隔膜，即使有也非常少；直径0.2-0.8微米，但长度差别很大，短的小于100微米，长的可达600微米以上；有的无色素，有的产生黄、橙、红、紫、蓝、绿、褐、黑等不同色素，若是水溶性的色素，还可透入培养基内，将培养基染上相应的颜色，如果是非水溶性(或脂溶性)色素，则使菌落吨呈现相应的颜色。因此，色素是鉴定菌种的重要依据。

(二)气生菌丝又称二级菌丝体。营养菌丝体发育到一定时期，长出培养基外并伸向空间的菌丝为气生菌丝。它叠生于营养菌丝上，以至可覆盖整个菌落表面。在光学显微镜下，颜色较深，直径比营养菌丝粗，约1-1.4微米，其长度则更悬殊。直形或弯曲而分枝，有的产生色素。

(三)孢子丝当气生菌丝体发育到一定程度，其上分化出可形成孢子的菌丝即孢子丝，又名产孢丝或繁殖菌丝。孢子丝的形状和在气生菌丝上的排列方式，随菌种而异。

孢子丝的形状有直形、波曲和螺旋形之分。螺旋状孢子丝的螺旋结构与长度均很稳定，螺旋数目、疏密程度、旋转方向等都是种的特征。螺旋数目通常为5-10转，也有少至1个多至20个的；旋转方向多为逆时针，少数种是顺时针的。孢子丝的排列方式，有的交替着生，有的丛生或轮生。孢子丝从一点分出3个以上的孢子枝者，叫做轮生枝。它有一级轮生和二

级轮生。上述特征，皆可作为菌种鉴定的依据。

孢子丝生长到一定阶段可形成孢子。在光学显微镜下，孢子呈球形、椭圆形、杆状、瓜子状等；在电子显微镜下还可看到孢子的表面结构，有的光滑、有的带小疣、有的生刺(不同种的孢子，刺的粗细长短不同)或有毛发状物(图2-63)。孢子表面结构也是放线菌种鉴定的重要依据。孢子的表面结构与孢子丝的形状、颜色也有一定关系，一般直形或波曲状的孢子丝形成的孢子表面光滑；而螺旋状孢子丝的形状、颜色也有一定关系，一般直形或波曲状的孢子丝形成的孢子表面光滑；而螺旋状孢子丝形成的孢子，有的光滑，有的带刺或毛；白色、黄色、淡绿、灰黄、淡紫色的孢子表面一般都是光滑型的，粉红色孢子只有极少数带刺，黑色孢子绝大部分都带刺和毛发。

由于孢子含有不同色素，成熟的孢子堆也表现出特定的颜色，而且在一定条件下比较稳定，故也是鉴定菌种的依据之一。应指出的是，孢子的形态和大小不能笼统地作为分类鉴定的重要依据。因为，即使从一个孢子子丝分化出来的孢子，形状和大小可能也有差异。

放线菌的发育周期是一个连续的过程。现以链霉菌为例，将放线菌生活史概括如下：孢子在适宜条件下萌发，长出1-3个芽管；芽管伸长，长出分枝，分枝越来越多形成营养菌丝体；营养菌丝体发育到一定阶段，向培养基外部空间生长成为气生菌丝体；气生菌丝体发育到一定程度，在它的上面形成孢子丝；孢子丝以一定方式形成孢子。如此周而复始，得以生存发展。

三、放线菌和菌落特征

放线菌的菌落由菌丝体组成。一般圆形、光平或有许多皱褶，光学显微镜下观察，菌落周围具辐射状菌丝。总的特征介于霉菌与细菌之间，因种类不同可分为两类：

一类是由产生大量分枝和气生菌丝和菌种所形成的菌落。链霉菌的菌落是一类型的代表。链霉菌菌丝较细，生长缓慢，分枝多而且相互缠绕，故形成的菌落质地致密、表面呈较紧密的绒状或坚实、干燥、多皱，菌落较小而不蔓延；营养菌丝长在培养基内，所以菌落与培养基结合较紧，不易挑起或挑起后不易破碎：当气生菌丝尚未分化成孢子丝以前，幼龄菌落与细菌的菌落很相似，光滑或如发状缠结。有时气生菌丝呈同心环状，当孢子丝产生大量孢子并布满整个菌落表面后，才形成絮状、粉状或颗粒状的典型的放线菌菌落；有些种类的孢子含有色素，使菌落有面或背面呈现不同颜色。

另一类菌落由不产生大量菌丝体的种类形成，如诺卡氏放线菌的菌落，粘着力差，结构呈粉质状，用针挑起则粉碎。

若将放线菌接种于液体培养基内静置培养，能在瓶壁液面处形成斑状或膜状菌落，或沉降于瓶底而不使培养基混浊；如以震荡培养，常形成由短的菌丝体所构成的球状颗粒。

四、放线菌的繁殖方式

放线菌主要通过形成无性孢子的方式进行繁殖，也可借菌体为裂片段繁殖。

放线菌长到一定阶段，一部分气生菌丝形成孢子丝，孢子丝成熟便分化形成许多孢子，称为分生孢子。孢子的产生有以下几种方式。

凝聚分裂形成凝聚孢子。其过程是孢子丝孢壁内的原生质围绕核物质，从顶端向基部逐渐凝聚成一串体积相等或大小相似的小段，然后小段收缩，并在每段外面产生新的孢子壁而成为圆形或椭圆形的孢子。孢子成熟后，孢子丝壁破裂释放出孢子(图2-65)。多数放线菌按此方式形成孢子，如链霉菌孢子的形成多属此类型。对些种方式现已提出了异议。

横隔分裂形成横隔孢子。其过程是单细胞孢子丝长到一定阶段，首先在其中产生横隔膜，然后，在横隔膜处断裂形成孢子，称横隔孢子，也中节孢子或粉孢子(图2-66)。一般呈圆柱形或杆状，体积基本相等，大小相似，约0.7-0.8×1-2.5微米。诺卡氏菌属按此方式形成孢子。有些放线菌首先在菌丝上形成孢子囊(sporangium)，在孢子囊内形成孢子，孢子囊成熟后，破裂，释放出大量的孢囊孢子。孢子囊可在气生菌丝上形成，也可在营养菌丝上形成，或二

者均可生成。游动放线菌属和链孢菌囊菌属待均民些方式形成孢子。孢子囊可由孢子丝盘绕形成，有的由孢子囊柄顶端膨大形成。孢囊孢子形成过程见图2-67。

小单孢菌科中多数种的孢子形成是在营养菌线上作单轴分枝，基上再生出直而短(5-10微米)的特殊分枝，分枝还可再分枝杈，每个枝杈顶端形成一个球形、椭圆形或长圆形孢了，它们聚集在一起，很象一串葡萄(图2-68)，这些孢子亦称分生孢子。

某些放线菌偶尔也产生厚壁孢子。

放线菌孢子具有较是的耐干燥能力，但不耐高温，60-65℃处理10-15分种即失去生活能力。放线菌也可借菌丝断裂的片断形成亲的菌体，这种繁殖方式常见于液体培养基中。工业化发酵生产抗生素时，放线菌就以此方式大量繁殖。如果静置培养，培养物表面往往形成菌膜，膜上也可产生出孢子。

五、放线菌的生理

除少数自养型菌种如自养链霉菌外，绝大多数为异差型。异差型。异差菌的营养要求差别很大，有的能利用简单化合物，有的却需要复杂的有机化合物。它们能利用不同的碳水化合物。它们能利用不同的碳水化合物，包括糖、淀、粉有机酸、纤维素、半纤维素等作为能源。最好的碳源是葡萄糖、在麦芽糖、糊精、淀粉和甘油，而蔗糖、木糖、棉子糖、醇和有机酸次之。有机酸中以醋酸、乳酸、柠檬酸、琥珀酸和苹果酸易于利用，而草酸、酒石酸和马尿酸较难利用。某些放线菌还可利用几丁质，碳氢化合物、丹宁以至橡胶。

氮素营养方面，以蛋白质、蛋白有胨以及某些氨基酸最适，硝酸盐 铵盐和素次之。除诺卡氏菌外，绝大多数放线菌都能利用酷蛋白，并能液化明胶。

和其他生物一样，放线菌的生长一般都需要K、Mg、Fe、Cu和Ca其中Mg和K对于菌丝生长和抗生素的产生有显著作用。各种抗生素的产生所需的矿质营养并不完全相同，如弗氏链霉菌产生新霉素时必需Zn元素，而Mg、Fe、Cu、Al和Mn和等不起作用。Co是放线菌产生维生素B12的必需元素，当培养基中含1或2ppm的Co时，可提高灰色链霉菌的维生素产量三倍，如果培养基中Co含量高至20-50ppm时则产生毒害作用。另外，Co还有促进孢子形成的功能。

大多数放线菌是好气的，只有某些种是微量好气菌和厌气菌。因此，工业化发酵生产抗生素过程中必须保证足够的通气量；温度对放线菌生长亦有影响，大多数放线菌的最适生长温度为23-37℃，高温放线菌的生长温度范围在50-65℃，也有许多菌种在20-23℃以下仍生长良好；放线菌菌丝体比细菌营养体抗干燥能力强，很多菌种有盛在CaCl2 和H2SO4的干燥器内能存活一年半左右。

放线菌的生理特性相当复杂，这里只能概要地介绍。了解上述特性，对于进一步发挥其经济效益，寻找和开发放线菌资源无疑是很重要的。

六、放线菌的代表属

(一)链霉菌属(Streptomyces)共约1，000多种，其中包括和很多不同的种别和变种。它们具有发育良好的菌丝体，菌丝体分枝，无隔膜，直径约0.4-1微米，长短不一，多核。菌丝体有营养菌丝、气生菌丝和孢子丝之分，孢子丝再形成分生孢子。孢子丝和孢子的形态因种而异，这是链霉菌属分种的主要识别性状之一。

虽然一些链霉菌可见于淡水和海洋，但它主要生长在含水量较低、通气较好的土壤中。由于许多链霉菌产生抗生素的巨大经济价值和医学意义，对这类放线菌已做了大量研究工作。研究表明，抗生素主要由放线菌产生，而其中90%又由链霉菌产生，著名的、常用的抗生素如链霉素、土霉素，抗肿瘤的博莱霉素、丝裂霉素，抗真菌的制霉菌素，抗结核的卡那霉素，能有效防治水稻纹枯的井冈霉素等，都是链霉菌的次生代谢产物。有的链霉菌能产生一种以上的抗生素，有化学上，它们常常互不相关；可是，从全世界许多不同地区发现的不同种别，却可能产生同抗生素；改变链霉菌的营养，可能导致抗生素性质的改变。这些菌一般能抵抗

自身所产生的抗生互不，而对其他链霉菌产生的抗生素可能敏感。尽管过去对产生抗生素的链霉菌的链霉菌研究很广，但对这些生物的生态学相互关系了解甚少，这是今后应加强的。另外，许多传染病用现有的抗生素得不到适当抑制或者产生了抗药株，因此，必须继续寻找和筛选新的抗生素。

链霉菌不仅种类繁多，而且其中50%以上的都能产生抗生素。中国科学院北京微生物所根据气候菌丝的颜色(孢子堆的颜色)；基内菌丝的颜色、可溶性色素、孢子丝的形状、孢子的形状和表面结构等特征，将链霉菌分为14个种组，每个种组又包括许多不同的种。

(二)诺卡氏菌属(Nocardia)它又名原放线菌属，在培养基上形成典型的菌丝体，剧烈弯曲如树根或不弯曲，具有长菌丝。这个属的特点是在培养15小时至4天内，菌丝体产生横隔膜，分枝的菌丝体突然全部断裂成长短近于一致的杆状或球状体或带杈的杆状体(图2-69)。每个杆状体内至少有一个核，因些可以复制并形成新的多核的菌丝体。此属中多数种无气生菌丝，只有营养菌丝，以横隔分裂方式形成孢子。少数种在营养菌丝表面覆极薄的一层气生菌丝枝—子实体或孢子丝。孢子丝直形、个别种呈钩状或螺旋，具横隔膜。以横隔分裂形成孢子，孢子杆状、柱形两端截平或椭圆形等。

菌落外貌与结构多样，一般比链霉菌菌落小，表面崎岖多皱，致密干燥，一触即碎，或者为面团；有的种菌落平滑或凸起，无光或发亮呈水浸状。

此属多为好气性腐生菌，少数为厌气性寄生菌。能同化各种碳水化合物，有的能利用碳氢化合物、纤维素等。

诺卡氏菌主要分布于土壤。现已报导100余种，能产生30多种抗生素。如对结核分枝杆菌和麻疯分枝菌有特效的利福霉素，对引起植物白叶枯病的细菌，以及原虫、病毒有作用的间型霉素，对革兰氏阳性细菌有作用的瑞斯托菌素等。另外，有此诺卡氏菌用于石油脱蜡、烃类发酵以及污水处理中分解腈类化合物。

(三)放线菌属(Actinomyces) 放线菌属多为致病菌，只有营养菌丝，直径小于1微米，有横隔，可断裂成"V"形或"Y"形体。无气生菌丝，也不形成孢。一般为厌气菌或兼性厌气菌。引起牛颚肿病的牛型放线菌是此属的典型代表。另一类是衣氏放线菌，它寄生于人体，可引起后颚骨肿瘤和肺部感染。它们的生长需要较丰富的营养，通常在培养基中加放血清或心、脑浸汁等。

(四)小单孢菌属(Micromonospora) 菌丝体纤细，直径0.3-06微米，无横隔膜、不断裂、菌丝体侵入培养基内，不形成气生菌丝。只在菌丝上长出很多分枝小梗，顶端着生一个孢子。菌落比链霉菌小得多，一般2-3毫米，通常橙黄色，也有深褐、黑色、蓝色者；菌落表面覆盖着一薄层孢子堆。此属菌一般为好气性腐生，能利用各种氮化物的碳水化合物。大多分布在土壤或湖底泥土中，堆肥的厩肥中也有不少。此属约30多种，也是产抗生素较多的一个属。例如庆大霉素即由绛红小单孢菌和棘孢小单孢菌产生，有的能产生利福霉素、卤霉素等共30余种抗生素。现在认为，此属菌产生抗生素的潜力较大，而且有的种还积累维生素B12，应予重视。

(五)链孢囊菌属(Streptosporangium)主要特点是能形成孢囊和孢囊孢子。其形成过程参见图2-67。有时还可形成螺旋孢子丝，成熟后分裂为分生孢子。此属菌的营养菌体分枝很多，横隔稀少，直径0.5-1.2微米，气生菌丝体成丛、散生或同心环排列。此属菌约15种以上，其中因不少种可产生广谱抗生素而受到重视。粉红链孢囊菌产生的多霉素(polymycin)，可抑制革兰氏阳性细菌、革兰氏阴性细菌、病毒等，对肿瘤也有抑制作用。绿灰链孢囊菌产生的绿菌素，对细菌、霉、酵母菌均有作用。由西伯利亚链孢囊菌产生的两性西伯利亚霉素，对肿瘤有一定疗效。

(六)游动放线菌属(Actinoplanes)通常在沉没水中的叶片上生长。气生菌丝体一般有或极少；营养菌丝分枝或多或少，隔膜或有或无，直径约0.2-2.6微米；以孢囊孢子繁殖，孢囊形成

于营养菌丝体上或孢囊梗上，孢囊梗直形或分枝，每分枝顶端形成一至数个孢囊，孢囊孢子通常略有棱角，并有一至数个发亮小体或几根端生鞭毛，能运动，是此属菌最特殊之处。

第三节 奈瑟菌属

第三节奈瑟菌属(Neisseria) 致病菌脑膜炎奈瑟菌(N. meningitides) 淋病奈瑟菌(N. gonorrhoeae) 一、脑膜炎奈瑟菌(N. meningitides) （一）生物学性状形态与染色肾形，G-双球菌，有荚膜，菌毛培养特性专性需氧，培养基：巧克力培养基，5%CO2 菌落：光滑，透明，不溶血 1．抵抗力对干燥，热力，消毒剂均敏感 （二）致病性致病物质荚膜：菌毛：内毒素：主要致病物质 1．所致疾病流脑，人是其唯一易感宿主三种临床类型：普通型，爆发型，慢性败血病型 （三）免疫性：以体液免疫为主 （四）微生物学检查法标本采集涂片染色镜检分离培养与鉴定快速诊断法 （五）防治原则流脑荚膜多糖疫苗，治疗首选青霉素G ：1云南大学药学院(昆明650091)；2云南沃森生物技术有限公司(昆明6501l8 为制备四价脑膜炎球菌疫苗的需要2005 A群脑膜炎球菌多糖结合物的免疫原性研究上海生物制品研究所朱为2002 脑膜炎奈瑟菌（Neisseria meningitides）感染是细菌性脑膜炎的常见病因，按荚膜多糖可将其分成12个血清群，其中A、B 和C 群感染占所有感染者的90%。全球由脑膜炎球菌引起的脑膜炎发病率在30-50万，病死率约10%，有相当一部分儿童因脑膜炎球菌严重感染而发生致聋等永久后遗症。在我国，A群脑膜炎球菌是主要致病菌群，95%的病例由A群引起。80 年代以来，我国进行了A群脑膜炎球菌荚膜多糖疫苗的大面积接种，有效地控制了发病率。该荚膜多糖是N-乙酰-3-O-乙酰甘露糖胺磷酸盐的线形共聚物，属T细胞非依赖性（TI）抗原，具有中等免疫原性和年龄相关的保护力，不能诱导免疫记忆。现已证实它对2岁以上儿童和成人在短期内有效，但随时间延续保护力下降，尤其在幼龄儿童中。因此有必要改进现有疫苗，提高其对各年龄组（包括婴儿）的免疫效果。近期的研究集中在开发多糖结合疫苗，即将多糖共价结合到蛋白质上，使其转化为T细胞依赖性（TD）抗原，以增强免疫原性和诱导免疫记忆。本文报道将! 群脑膜炎球菌多糖共价结合到精制破伤风类毒素(TT)上制备结合物，观察其在小鼠中的免疫原性。 A+C群脑膜炎球菌多糖一DT结合疫苗与多糖疫苗诱导的抗多糖抗体间的功能活性差异[英]2004 多糖蛋白结合疫苗对预防由一些有荚膜细菌(包括b型流感杆菌、肺炎球菌和C群脑膜炎球菌)引起的侵袭性疾病高度有效。与未结合多糖疫苗相比，多糖一蛋白结合疫苗能在婴幼儿体内诱导更高浓度的血清抗荚膜抗体。而且，结合疫苗诱导的抗体亲和力更高，补体介导的杀菌活性更强。 。在限定剂量时，多糖疫苗诱导的血清抗荚膜抗体预防C群脑膜炎球菌感染婴鼠发生菌血症的效力弱于结合疫苗。结合疫苗组的抗C群抗体的亲和力指数高于多糖疫苗组。两种疫苗在成人中诱导的抗荚膜抗体的功能活性差异，意味着各自激活了不同的B细胞群。 (兰州生物制品研究所崔萱林2001 流行性脑脊髓膜炎是由脑膜炎球菌(Meningococcus)引起的细菌性脑膜炎(简称流脑)，发病急，病死率高，且在各年龄组中都可发生，15岁以下儿童发病占75％以上。脑膜炎球菌根据荚膜多糖的结构可分为12个血清群，其中A、B、c群引发的流脑占90％以上。流脑的流行具有菌群漂移特点，如美国在1945年以前为A群流行，1960年以后以B群为主，1967年以后转为C群流行。我国以A群菌流行为主，B群和C群菌有少量病例，约占lO％左右。因此预防流脑的重点应是A、B、C群流脑球菌引起的疾病。由于流脑菌群的漂移现象，国外多采用多价多糖疫苗用于预防流行性脑脊髓膜炎，目前所使用的主要为A+C群二价疫苗(B群多糖对人体无效，主要研制外膜蛋白为基础的疫苗)，其次为A、C、Y及WI35四价疫苗，其它相关菌群引起的流脑病例已少见。国内目前主要使用A群流脑多糖疫苗，自80年代初使用至今效果很好；对于其它菌群的预防．目前尚未有疫苗出现，因此我们研制了A+C群流脑多糖疫苗，即在现有的A群流脑多糖疫苗中加入C群流脑多糖抗原，形成二价疫苗以预防A、C群流脑球菌引起的脑脊髓膜炎。 A+C群脑膜炎球菌多糖疫苗的制造和检定均按照WHO(生物制品规程》的要求进行，C群流脑多糖原液的主要制造过程借鉴A群流脑多糖原液的生产工艺，在多糖纯化步骤另采用澄清过滤、苯酚抽提控制多糖浓度等措施，使得C群多糖原液的蛋白质和核酸含量符合要求。A群流脑多糖原液为选用的本所常规生产的原液制品。由于多糖原液在制备过程中未进行专门的除类毒素工艺，因而在原液检定中采用鲎试剂法对类毒素含量进行测定，以确保疫苗的安全性。 2岁以下年龄组儿童在接种A+C群脑膜炎球菌多糖疫苗一个月后，虽然同组儿童的免前及免后的血清杀菌抗体滴度有显著差．但血清4倍阳转率较大年龄组儿童低，而且免后血清中的杀菌抗体滴度的整体水平也相对较低。提示低年龄组儿童对多糖疫苗的免疫应答水平较高年龄组儿童低，有关该疫苗人体接种后的安全性和免疫持久性的结果将另文报告。 A群脑膜炎球菌多糖疫苗自80年代在我国研制成功并广泛接种以来效果明显。我国A群带菌率和发病率大幅度下降，预防效果达90％以上。至今在我国引起流脑的脑膜炎球菌仍以A群为主，同时B群和C群的病例也开始出现。欧美国家主要流行菌群由A群转为B群和c群的事实。提示我们在A群脑膜炎被控制之后要防止B群和C群变迁。 1994年法国由法国巴斯德梅里厄血清疫苗研究所(PasteurMerreux)提供生产的A+C群脑膜炎球菌多糖疫苗，申请在我国注册，中国药品生物制品检定所与河南省卫生防疫站协作，在河南省新县进行了人群安全性与免疫原性的现场考核，现将结果报告如下该疫苗较安全，免疫原性较强，且更具免疫持久性。2000 A群脑膜炎球菌多糖结合疫苗的研制2000杨丽华 (长春生物制品研究所，长春130062)李风祥(中国药品生物制品检定所， 本试验制备的A群脑膜炎球菌多糖结合疫苗的理化特性及免疫特性与国内外文献报道结果一致。制备的结合疫苗可诱导出高水平的保护性A群脑膜炎球菌多糖抗体和TT抗体。结合疫苗具有很好的免疫原性和安全性。制备工艺稳定，重复性好，可批量生产。本试验为进一步临床评价结合疫苗的人群免疫效果提供了实验基础。本试验选用Tr作为载体蛋白，因为这种蛋白目前已经标准化，作为载体蛋白的同时兼有预防伤风感染的作用，而用TT蛋白对于已经建立起的免疫程序和“自然”免疫并不产生干扰 A群脑膜炎球菌多糖结合疫苗的制备熊慧玲成都生物制品研究所 预防A群脑膜炎球菌引起的脑脊髓膜炎，我国目前采用A群脑膜炎球菌多糖疫苗，而疫苗接种后，小于1岁的婴儿，即使加强接种产生的抗体只能维持1年，1～1．5岁半的婴幼儿，加强后只能维持2年，1．5～2岁的幼儿，接种1针维持不到1年_l1 。wHO指出，按目前的免疫程序，婴儿在出生后5年内至少需要免疫接种4次才可提供中度抗体水平一。说明A群脑膜炎球菌多糖疫苗在婴幼儿中，尤其在2岁以下，免疫原性低，即使产生抗体，抗体水平也不能长久保持。因而提高疫苗免疫原性，使它能对各年龄组，尤其2岁以下婴幼儿提供高水平的长期保护作用，有特别重要的意义。b型流感嗜血杆菌结合疫苗的成功研制和应用给我们以深刻的启示。和流感嗜血杆菌荚膜多糖一样，A群脑膜炎球菌多糖为半抗原，为非T细胞依赖性抗原，当与蛋白结合后，可转化为T细胞依赖性抗原，可刺激机体产生高水平的保护抗体，重复接种有记忆抗体产生因此，我们进行了A群脑膜球菌多糖结合疫苗的研制，并对经中国药品生物制品检定所检定合格的连续3批 2003 流行性脑脊髓膜炎(流脑)被发现并确认已有l00多年．尽管对此病已有有效的预防和治疗措施，但它仍是一种急性传染病．而且病死率高、继续威胁着人类，尤其是儿童的身体健康。我国目前使用的预防制品是A群脑膜炎球菌多糖疫苗，该疫苗对4岁以上儿童有很好免疫效果，对幼儿免疫效果较差，保护时问较短。而脑膜炎球菌多糖与一种蛋白载体连接构成结合疫苗．可增强其对幼儿的免疫回忆反应，提高预防效果?。卫生部成都生物制品研究所已研制成功“A群脑膜炎球菌多糖结合疫苗”，并由中国药品生物制品检定所、卫生部成都生物制品研究所、江苏省疾病预防控制中心联合于2002年l0月～2003年1月在江苏省射阳县进行的“A群脑膜炎球菌多糖结合疫苗临床研究”已圆满结束。现将婴幼儿接种A群脑膜炎球菌多糖结合疫苗的安全性报告如下本次临床试验表明，3～4月婴幼儿接种A群脑膜炎球菌多糖结合疫苗具有良好的安全性，但由于该疫苗首次应用于人群，在大规模推广接种前，仍需对其安全性进一步进行观察 C群脑膜炎球菌结合疫苗的质量控制与生产的科学挑战2004 世界卫生组织(WHO)生物制品标准化专家委员会于1976年通过了脑膜炎球菌多糖疫苗的建议，并于1978年和1981年进行了修订。在临床研究中，疫苗的有效率至少达9O% ，证明其在疫苗接种计划中高度有效。然而，不能在幼婴中诱生保护性应答或免疫记忆制约了其在英国婴儿免疫接种计划中的应用。随着b型流感杆菌(Hib)结合疫苗的成功引入，C群脑膜炎球菌(MenC)荚膜多糖结合疫苗的研究取得了显著的进展。临床对照试验已证实它们在所有年龄组中均可诱生针对MenC多糖的保护性水平的抗体，并且作为T细胞依赖性抗原，能诱导免疫记忆和抗荚膜抗体的亲和力成熟。英国引入MenC结合疫苗后，证实该疫苗可提供保护性免疫。WHO已经制定了有关这些新疫苗生产和检定的建议。 脑膜炎球菌是细菌性脑膜炎和败血病的重要病原。根据荚膜多糖在化学和血清学上的不同，脑膜炎球菌可分为若干群，其中A、B、C、Y、Wl35群对人致病。A群在

双歧杆菌与乳酸菌筛选培养基

BBL培养基 双歧杆菌选择性培养基成份 蛋白胨15.0g 酵母粉2.0g 葡萄糖20.0g 可溶性淀粉0.5g 氯化钠5.0g 5%半胱氨酸10.0mL 西红柿浸出液400.0mL 吐温80 1.0mL 肝提取液80.0mL 琼脂20.0g 蒸馏水520.0mL pH7.0 MRS培养基 乳酸细菌培养基（MRS） 蛋白胨10.0 g 牛肉膏10.0 g 酵母膏 5.0 g 柠檬酸氢二铵[（NH4）2HC6H5O7] 2.0 g 葡萄糖(C6H12O6·H2O) 20.0 g 吐温80 1.0 mL 乙酸钠（CH3COONa·3H2O） 5.0 g 磷酸氢二钾（K2HPO4·3H2O） 2.0 g 硫酸镁（MgSO4·7H2O）0.58 g 硫酸锰（MnSO4·H2O）0.25 g 琼脂18.0 g 蒸馏水 1 000 mL pH 6.2~6.6 当乳酸菌生长代谢出乳酸后，会使pH下降而使颜色由绿变为黄绿，也由于pH 值降低再加上抗生素及厌氧培养的作用，所以一般的微生物不容易在此培养基上生长，因此十分容易鉴别乳酸菌。 2005-03-10 08:08 消息引用收藏分享 奉上一篇实验，以供参考！ 厌氧菌的分离和培养 目前培养厌氧微生物的简便而又有效的技术包括有：厌氧箱培养技术；厌氧罐培养技术；厌氧袋培养技术；亨盖特厌氧滚管技术。这里介绍的是亨盖特厌氧滚管技术。

亨盖特厌氧滚管技术是美国微生物学家亨盖特（Hungate）于1950年首次提出并应用于瘤胃厌氧微生物研究的一种厌氧培养技术。以后这项技术又经历了几十年的不断改进，从而使亨盖特厌氧技术日趣完善，并逐渐发展成为研究厌氧微生物的一整套完整技术。而且多年来的实践已经证明它是研究严格、专性厌氧菌的一种极为有效的技术。 亨盖特厌样滚管培养技术不仅可用于有益厌氧菌如双歧杆菌等的分离、与活菌培养计数，还可以用于有害***菌（如酪酸菌）或病原菌（如肉毒梭状芽孢杆菌）的分离与鉴定。 1材料 1.1 样品 双歧酸奶（液体）、双歧杆菌制剂（固体）。 1.2 培养基 改良MRS培养基，PTYG培养基。 1.3 仪器和器具 亨盖特厌氧滚管装置一套，厌氧管，厌氧瓶，滚管机，定量加样器。 2 流程 铜柱除氧→预还原培养基→稀释用液制备→稀释样品→滚管→培养→计数 3方法 3.1铜柱系统除氧 铜柱是一个内部装有铜丝或铜屑的硬质玻璃管。此管的大小为40—400mm，两段被加工成漏斗装，外壁绕有加热带，并与变压器相连来控制电压和稳定铜柱的温度。铜柱两端连接胶管，一端连接气钢瓶，一端连接出气管口。由于从气钢瓶出来的气体如N2、CO2和H2等通常都含有O2，故当这些气体通过温度约360℃的铜柱时，铜和气体中的微量O2化合生成CuO，铜柱则由明亮的黄色变为黑色。当向氧化状的铜柱通入H2时，H2与CuO中的氧就结合形成H2O，而CuO又被还原成了铜，铜柱则又呈现明亮的黄色。此铜柱可以反复使用，并不断起到除氧的目的。当然H2源也可以由氢气发生器产生。 3.2 预还原培养基及稀释液的制备

产淀粉酶海洋放线菌的酶活性测定及发酵条件研究【开题报告】

开题报告 生物科学 产淀粉酶海洋放线菌的酶活性测定及发酵条件研究 一、综述本课题国内外研究动态，说明选题的依据和意义 舟山地处长江口南侧，地理位置介于东经121°30′～123°25′，北纬29°32′～31°04′之间，地理环境优越，生物资源丰富。特别是舟山海域潮间带，所谓潮间带，即是指大潮期的最高潮位和大潮期的最低潮位间的海岸，也就是海水涨至最高时所淹没的地方开始至潮水退到最低时露出水面的范围。由于潮间带的特殊性质使得潮间带微生物环境中生长的放线菌就会具有非常独特的生理生化性质，可能在它们身上发现一些具有特殊作用的代谢产物。 海洋微生物包括海洋细菌、海洋真菌和海洋放线菌等，是一个正在开发的重要生物资源。海洋环境独特，具有高压、高盐、低营养、低温的特点。在这种环境中海洋微生物种类约为陆生微生物的20倍以上，代谢途径不同于陆地微生物，因此，可以产生多种新的物质。目前各国已经从海洋细菌、放线菌、真菌等微生物中分离到多种活性物质，这些活性物质可大致分为：1、抗生素：研究表明海洋微生物及其代谢产物是寻找新抗生素的重要来源。其中海洋放线菌始终是研究和开发的前沿。头孢菌素C、P、N，硫酸小诺霉素就是由海洋放线菌分泌产生并已得到临床应用的抗生素[1]。2、抗肿瘤活性物质：海洋微生物蕴含丰富的结构新颖的抗肿瘤代谢产物，国内外已经从海洋细菌、放线菌、真菌等微生物体内分离到多种抗肿瘤活性物质[2]。3、毒素：海洋生物毒素一直是海洋活性物质研究的焦点之一。目前发现，许多海洋生物毒素的真正来源是海洋中游离的或附生在海洋生物上的海洋微生物所产生。其中研究较多的是河豚毒素(TXX)。4、酶制剂：由海洋微生物生产的酶制剂，在生物技术和工业应用中已担任了重要的角色。其中包括蛋白酶，淀粉酶，热稳定酶等等。 淀粉酶(amylase) 是能够催化淀粉水解转化成葡萄糖、麦芽糖及其它低聚糖的一群酶的总称。它广泛存在于动植物和微生物中。淀粉酶包括α-淀粉酶和β-淀粉酶。α-淀粉酶（EC3.2.1.1）从淀粉糖链内部水解1,4-α-D-葡萄糖苷键，广泛应用于燃料乙醇、淀粉糖浆、传统酿造、食品加工、纺织退浆等行业，是最早实现工业化生产，迄今为止用途最广、产量最大的酶制剂品种之一. 随着社会需求的发展，淀粉酶不仅需要活力

薄层色谱自显影法分离检测海洋放线菌T-2-3中抑菌成分

薄层色谱自显影法分离检测海洋放线菌T-2-3中抑菌成分 目的采用薄层色谱生物自显影方法对北极海洋放线菌T-2-3提取物的抑菌成分进行研究。方法采用大孔树脂对该放线菌活性成分进行富集，并针对活性成分进行薄层生物自显影检测。结果经检测，Rf 0.40的点为活性化合物。结论薄层色谱生物自显影法是一种快速分离检测抑菌成分的实验手段。 Abstract：ObjectiveTo investigate the antimicrobial components in extracts of Arctic Marine actinomycetes T-2-3 by TLC bioautography. MethodsThe active fraction was extracted by macroporous resin, and detected by TLC bioautography. ResultsThe compoud of Rf 0.40 behave antimicrobial activity. ConclusionTLC bioautography is a fast method to isolate and detect antimicrobial activity components. Key words：TLC bioautography; Marine actinomycetes; Antimicrobial activity 海洋微生物由于其特殊的生存環境，表现出特异的代谢方式，同时可以产生结构新颖且具有特殊生物活性的化合物，是海洋生物活性物质的重要来源[1]。目前为止，已知有22000多种微生物次级代谢产物中70%由放线菌产生，而10000多种抗生素由链霉菌属产生[2]。链霉菌属在放线菌中占有重要的地位，是生物活性物质的重要来源。 薄层色谱生物自显影法（TLC-Bioautography）是近年来应用的一种集分离、生物活性和鉴定于一体的”化合物+生物活性”的测定方法[3-4]。本实验室前期从北极海底海泥沉积物中分离得到一株海洋放线菌T-2-3，经初步鉴定为链霉菌属。本实验利用TLC-生物自显影法对T-2-3的提取物中的抗菌活性成分进行检测，为进一步分离纯化活性成分提供了依据。 1资料与方法 1.1一般资料噻唑蓝(MTT)购自Sigma公司；替加环素、氨苄西林购自美国Amresco公司。所用试剂均为市售分析纯。 1.2方法 1.2.1 T-2-3菌株粗提物样品制备将生长良好的T-2-3斜面培养物接种至种子培养基中，180 r/min摇床，28 ℃培养3 d；然后转接于发酵培养基中，180 r/min 摇床，28℃下持续发酵5 d，收取发酵液，并用D-101大孔树脂富集，依次用水，100%乙醇梯度洗脱，洗脱部位减压浓缩得浸膏，将乙醇梯度的浸膏用甲醇溶解，制备成20 mg/mL供试样品。 1.2.2供试菌及其培养供试细菌：①革兰氏阳性菌：金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、藤黄八叠球菌；②革兰氏阴性菌：大肠杆菌、肺炎克雷伯杆菌、鲍曼不动杆菌；③临床耐药菌：耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）3株、耐甲氧

中国部分地区人体粪便中双歧杆菌的分离鉴定及具潜在益生特性菌株的筛选

中国部分地区人体粪便中双歧杆菌的分离鉴定及具潜在益生特 性菌株的筛选 本研究采用选择性培养基对河南、四川、西藏、云南、内蒙古和新疆等地区的18份人体粪便样品中的双歧杆菌进行了分离纯化,并采用16S rRNA基因序列分析法对分离到的29株双歧杆菌进行了鉴定。以B.animalis subsp.Iactis V9为参照,通过耐酸性、人工消化液和胆盐耐受试验,筛选出胃肠道转运过程中耐受性较好的4株双歧杆菌。 并对筛选出的双歧杆菌进行了脱脂乳发酵特性和贮藏特性的研究。试验结果表明,从18位中国部分地区健康人体粪便中分离得到29株双歧杆菌,经16S rRNA 基因序列分析法将IMAUFB064、IMAUFB065和IMAUFB091等9株菌鉴定为B. longum,其中河南6株、四川2株和新疆1株；将IMAUFB071、IMAUFB073、IMAUFB084、IMAUFB090和IMAUFB092等20株菌鉴定为B.pseudocatenulatum,其中四川9株、西藏7株、云南3株和内蒙古1株。 29株双歧杆菌中有24株在pH3.0、3.5和4.0的改良MRS培养液中生长良好,初筛出的24株双歧杆菌分别经pH3.0、2.5、2.0人工胃液消化3h后,存活率高于V9(84.97%)的菌株有2株,分别为IMAUFB084(85.98%)和MAUFB073(85.66%),占总菌数的6.90%,各菌株在不同pH值人工胃液中耐受性有显著差异 (P<0.05),随着pH值的降低,供试菌株对模拟人工胃液的耐受性也随之降低。4株复筛出的双歧杆菌在人工肠液消化8h后,其中MAUFB090的存活率为101.8%,高于V9(97.84%),MAUFB073(97.19%)、IMAUFB084(94.38%)和IMAUFB064(89.93%)都低于V9的存活率。 4株双歧杆菌均能耐受2.0%胆盐浓度,但各菌株的延迟时间差异显著

海洋放线菌XS904分类鉴定及其发酵液抑菌活性的研究

第39卷 第5期 海 洋 与 湖 沼 Vol.39, No.5 2008年 9月 OCEANOLOGIA ET LIMNOLOGIA SINICA Sep., 2008 * 浙江省自然科学基金资助项目，402038号。杨文鸽，博士，教授，E-mail ：yangwenge@https://www.wendangku.net/doc/9617696541.html, 收稿日期: 2007-08-17, 收修改稿日期: 2007-10-25 海洋放线菌XS904分类鉴定及其发酵液 抑菌活性的研究* 杨文鸽1 楼乔明2 徐大伦1 孙爱飞1 潘云娣3 (1. 应用海洋生物技术教育部重点实验室 宁波大学生命科学与生物工程学院 宁波 315211; 2. 中国海洋大学食品科学与工 程学院 青岛 266003; 3. 宁波出入境检验检疫局 宁波 315012) 提要 采用形态观察、培养特征、生理生化鉴定以及16S rDNA 序列分析方法, 对从宁波海域滩涂泥样中筛选到的一株放线菌XS904进行分类鉴定, 同时对XS904菌株发酵液的抑菌活性和抑菌物质的理化性质进行了研究。结果表明, XS904菌株为链霉菌属灰浅红链霉菌(Streptomyces griseorubens )的变种; 经液体培养, XS904菌株发酵液对革兰氏阳性细菌有显著的抑菌活性, 对金黄色葡萄球菌的最小抑制浓度为0.78%; pH 纸色谱和捷克八溶剂系统纸层析结果显示发酵液中的抑菌活性物质为一类中等极性的碱性抗生素, 易溶于三氯甲烷, 对温度较敏感, 在酸性和中性条件下稳定。 关键词 海洋放线菌, XS904, 分类鉴定, 发酵液, 抑菌活性 中图分类号 Q93 放线菌是抗生素等制药工业最重要的微生物资源之一。自Waksman(1943)从灰色链霉菌提取出链霉素以来, 在放线菌中已发现和分离到4000多种抗生素, 如链霉素、土霉素、卡那霉素、井冈霉素等已广泛应用于临床治疗和农业生产。当前开发研究陆栖放线菌已相当深入, 从陆栖放线菌发现新的活性物质的几率正逐渐下降, 因此从海洋微生物资源中寻找新型微生物药物成为研究的必然趋势(Adinarayana et al , 2007; Janos, 2005; Maskey et al , 2004)。据不完全统计, 自20世纪70年代东京微生物化学研究所从海洋放线菌Chainia sp.分离到抗生素SS-228Y 以来, 从海洋放线菌中发现结构新颖具有强生理活性的物质已达100多个, 其中90%以上产生于放线菌中的链霉菌属(林永成等, 2003)。源于链霉菌的新生理活性物质不断被发现, 新链霉菌的分离、鉴定和活性物质的筛选已成为微生物来源新药筛选工作的重要课题(Muramatsu et al , 2004; 徐平等, 2005)。 本实验室从宁波海域滩涂泥样中筛选到一株海洋放线菌XS904, 经多次传代培养证实该菌株具有稳定的生理特性。本文作者在形态观察、生理生化特征 试验以及16S rDNA 序列相似性比较的基础上对XS904菌株进行分类鉴定, 同时对该菌株发酵液的抑菌活性进行研究, 旨为海洋放线菌的开发利用提供理论依据。 1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 菌株XS904 分离自宁波象山港海域滩涂海泥中。 1.1.2 供试菌 青霉(Penicillium sp.), 根霉(Rhizopus sp.), 曲霉(Aspergillus niger ), 啤酒酵母(Saccharomyces carlsbergensis ), 金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus ), 枯草杆菌(Bacillus subtilis ), 大肠杆菌(Escherichia coli )。以上供试菌均由本院微生物实验室提供。 1.1.3 培养基 ① 改良高氏一号培养基：可溶性淀粉20g, KNO 3 1g, NaCl 0.5g, K 2HPO 4 0.5g, MgSO 4 0.5g, FeSO 4 0.01g, 琼脂15—20g, 海水晶30g, 蒸馏水1000ml, pH7.2—7.4, 121℃灭菌20min 。② 黄豆粉培养基：可溶性淀粉20g, 黄豆粉15g, 葡萄糖5g, 酵

海洋放线菌研究的新进展

海洋放线菌研究的新进展 3 刘妍　李志勇 33 (上海交通大学生命科学技术学院海洋生物技术实验室,上海　200240) 摘　要:　海洋放线菌由于其独特的代谢途径和合成新颖抗生素的能力,已经广泛引起人们的关注。本文就海洋放线菌在海洋环境中的分布、医药领域的应用及其相关研究方法进行了综述。 关键词:　海洋放线菌　分布　抗生素　研究方法 N ew R esearch Progress of Marine Actinomycetes 3 Liu Yan Li Zhiyong 33 (M arine B iotechnology L aboratory ,S chool of L i f e S cience and B iotechnolog y , S hanghai J iao Tong Universit y ,S hanghai 200240) Abstract :　Great attentions have been paid to marine actinomycetes for their particular metabolic pathway and the ability to synthesize new antibiotics.This review summarized new development on the distribution ,pharmaceuti 2cal application and research approach of marine actinomycetes. K ey words :　Marine actinomycetes Distribution Antibiotics Research approach 放线菌(acti nom ycetes )是一类高(G +C )%的 革兰氏阳性细菌。自1875年Cohn 从人泪腺感染病灶中分离到一株链丝菌(st reptot hri x )以来,放线菌由于其拥有独特的合成多种结构复杂的次生代谢产物的能力引起了人们的广泛关注。许多放线菌的次生代谢产物具有医药和植物保护方面的用途,已广泛用作抗细菌、抗真菌和抗肿瘤药物。现在已发现的数万种微生物来源的生物活性物质中,约有70%是由放线菌所合成的[1]。 目前分离得到的绝大多数放线菌都来源于土壤,陆生放线菌产生的抗生素占天然来源抗生素的三分之二以上。然而,随着病原微生物对抗生素抗性的日益提高,寻找具有新型作用机制的抗生素已迫在眉睫。近20年来,从陆生放线菌中分离得到的先导化合物的数量锐减,于是人们把目光投向了更为广阔的生境———海洋[2]。海洋占地球面积的70%,海洋微生物无论从数量还是多样性方面来说都是巨大的。 海洋放线菌的生活环境十分特殊,如:高盐度、高压、低营养、低温及与不同生物之间的关系等[3]。在这些所谓生命的极限环境中,海洋放线菌已发展出独特的代谢方式[4],这不仅确保其在极端环境中生存,也提供了产生新颖抗生素的潜力[5]。因此,海洋环境将成为放线菌和放线菌代谢产物的重要新来源。下面分别从海洋放线菌的分布、生物活性物质、研究方法等角度对于海洋放线菌的最新研究进展予以介绍。 1　海洋放线菌的分布 虽然人们普遍认为海洋放线菌的祖先来源于陆地,但越来越多研究表明:深海中有许多罕见的放线菌,这些放线菌与陆生样品中典型的放线菌有很大的不同[2,6,7]。 海洋放线菌主要包括链霉菌属(S t reptom yce 2tes )、小单孢菌属(M icromonos pora )以及红球菌(R hodococcus )、诺卡氏菌(N ocar di a )、游动放线菌(A cti nopl anetes )等稀有属种[8]。海洋放线菌主要 收稿日期:2005206221 　3基金项目:国家高新技术发展计划(863)资助(2002AA628080,2004AA628060)及上海市青年科技启明星计划资助(04QMX1411)和上海 高校优秀青年教师后备人才计划资助 作者简介:刘妍(19812),女,硕士研究生。研究方向:海洋微生物33通讯作者:李志勇,Tel :021*********,E 2Mail :zyli @https://www.wendangku.net/doc/9617696541.html, 　生物技术通报 ?综述与专论? B IOTEC HNOLOGY BULL ETI N 2005年第6期

实验方案(双歧杆菌的分离)

1 双歧杆菌的分离 1.1 样品 取出生后20天母乳喂养健康婴儿粪便。 1.2 培养基 根据目前的双歧杆菌选择性培养基，以及X-Gal在这方面的应用。选择使用NPNL培养基，在其基础上添加X-Gal。 1.2.1 缓冲蛋白胨水溶液（BP） 成份：蛋白胨10g 磷酸氢二钠2g 葡萄糖5g 磷酸二氢钾2g 氯化钠5g 蒸馏水1000ml 制法：精确称取各种试剂，加人到1000ml的蒸馏水中，加热溶化后分装于250ml的三角瓶中，每瓶90ml，121℃，杀菌15min后置4℃的冰箱中备用。 1.2.2 选择性改良NPNL培养基（苏世彦） 成份：酵母膏5g 淀粉0.5g 蛋白胨10g L-半胱氨酸0.5g 胰蛋白胨5g 溶液A 10ml 大豆蛋白胨5g 溶液B 5ml 葡萄糖10g 溶液C 50ml 乳糖3g 琼脂 15g 吐温80 1g pH 7.2 牛肝提取液150ml 制法：将各成分准确量取后，分别加热溶化，混合摇匀后分装，121℃杀菌10min，备用。 溶液A：K2HPO4 10g、KH2PO4 10g溶于蒸馏水100ml。 溶液B：FeSO4·7H2O 0.2g、MgSO4·7H2O 4g、MnSO4·4H2O 0.135g、NaCl 0.2g溶于蒸馏水100ml。 溶液C：丙酸钠30g、硫酸巴龙霉素400mg、硫酸新霉素200mg、NaCl 6g溶于蒸馏水1000ml。 1.2.3 NPNL培养基(孙雪) 培养基成分及用量：牛肉浸汁粉(oxoid)3g，蛋白胨10g，胰蛋白酶5g，

植胨3g，酵母浸出汁5g，肝浸出汁150ml，葡萄糖10g，可溶性淀粉0.5g，溶液A 10ml，溶液B 5ml，吐温80 1g，盐酸半胱氨酸0.5g，琼脂15g，蒸馏水815ml，X-Gal(5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D- 半乳糖苷)60mg。pH 7.2，121℃，15min 高压灭菌。 溶液A：K2HPO425g，KH2PO425g，蒸馏水250ml。 溶液B：MgSO4·7H2O 0.5g，FeSO4·7H2O 0.5g，NaCl 0.5g，MnSO40.337g，蒸馏水250ml，硫酸新霉素100μg/ml，硫酸巴龙霉素200μg/ml，萘啶酮酸15μg/ml，氯化锂3mg/ml。 1.3 分离方法 取成年人的粪便1g，放人含有9ml缓冲蛋白胨水溶液中，用液枪充分混匀，制成1:10的稀释液，摇匀后取1ml注人含有9ml缓冲蛋白胨溶液中制成1:100的稀释液，在此基础上作10-3~10-9与的稀释，由于肠道中双歧杆菌的菌数一般在109左右，所以取10-4~10-9稀释液用倾注法倒平板，每个稀释液都各取1ml分别注人到两只无菌平皿中，每个稀释度重复3个平板。待培养基凝固后倒置，将温度调至37℃进行厌氧培养48h。用缓冲蛋白胨水溶液做稀释液可以有效地保护双歧杆菌的存活，避免受外界环境因素的影响。 1.4 分离培养 在加人样品稀释液的平皿中，分别注人适量冷却至50℃左右的选择性改良NPNL培养基，然后放人37℃的恒温培养箱中厌氧培养1.4.1 培养特性与镜检特性 双歧杆菌在改良NPNL培养基上，经过厌氧培养以后，菌落直径1-2cm，圆形、凸起，表面光滑，边缘整齐，乳白色，粘稠湿润。经革兰氏染色后镜检，双歧杆菌为革兰氏阳性无芽抱杆菌，呈多形性、典型的双歧杆菌为V字型或Y型；也有直、弯、棒状、匙形等多种形态，排列成单、双、短链、X、Y、V 或栅状；其大小为2-8×0.4-0.6μm，不具英膜和鞭毛，无运动性。 培养48h 后，平板上菌落呈现深蓝色、白色、浅蓝色三种颜色。

海洋放线菌_药物开发的新兴资源_蔡超靖

海洋放线菌—药物开发的新兴资源 蔡超靖， 丁彦博， 单越琦， 穆云龙 （华北制药集团新药研究开发有限责任公司 微生物药物国家工程研究中心 河北省工业微生物代谢工程技术研究中心, 石家庄 050015） 摘 要：近些年，海洋放线菌成为新药研发的重要来源，引起人们的关注，本文综述了海洋放线菌在分离方面取得的成绩，并介绍了通过传统筛选方法分离得到的生物活性代谢物，以及在与新化合物相关的基因挖掘和生物合成基因簇的异源表达方面取得的进展。 关键词：海洋放线菌； 活性代谢产物； 基因组学； 异源表达 中图分类号：R978.1 文献标识码：A 文章编号：1001-8751(2012)01-0022-08 Marine Actinomycetes －an Emerging Resource for the Drug Discovery Cai Chao-Jing ， Ding Yan-Bo ， Shan Yue-Qi ， Mu Yun-Long （New Drug Research & Development Center of North China Pharmaceutical Group Corporation, National Microbial Medicine Engineering & Research Center, Hebei Industrial Microbial Metabolic Engineering Research Center, Shijiazhuang 050015） Abstract: As an important resource of the new drugs, more and more attentions were paid on marine actinomycetes recently. This review highlights achievements in the isolation of marine actinomycetes, some examples of bioactive metabolites identi ?ed by traditional screening, and presents new progress in the ?eld of genome mining leading to the discovery of novel compounds and heterologous expression of biosynthetic gene clusters. Key words ：marine actinomycetes ； bioactive secondary metabolites ； genomics ；heterologous expression 收稿日期：2011-11-15 作者简介：蔡超靖，工程师， 研究方向：微生物来源的新药筛选。 放线菌是革兰阳性细菌，能产多种活性化合物，从20世纪50年代，人们开始研究和筛选陆生放线菌，得到许多重要的抗菌药物（两性霉素B ，红霉素，万古霉素），抗癌药物（柔红霉素，博莱霉素，丝裂霉素）和免疫抑制剂（雷帕霉素）。但近几年由于分离和筛选方法的限制，导致发现的化合物重复性高，人们转而开始研究极端生境微生物[1]，以期发现新属种与新化合物。目前已经从海洋放线菌中分离到了许多结构新颖并具有多种生物活性的化合物，因此开发海洋放线菌资源，寻找新型活性先导化合物成为 当前的研究热点[2]。1 海洋放线菌及其分离技术 海洋放线菌的分离早在1969年[3]就开始，但由于与陆生放线菌的分离方法没有太大区别，因此未得到新的属种。随着采样和分离、培养方法的改进，许多海洋固有放线菌实现分离培养，海洋环境成为新的放线菌和新天然产物的来源。Fenica 和Jensen [4]从热带太平洋海域发现了包括嗜盐产孢菌属Salinispora (MAR1类群)和海孢菌属Marinispora (MAR2类群)在内的至少13个海洋放线菌

微生物学实验报告——双歧杆菌分离

微生物学实验报告 乳酸菌分离纯化——双歧杆菌的分离纯化 2012/6/5 实验目的：从酸奶等富含乳酸菌的物质中分离到具有活性的双歧杆菌并进行初步鉴定。 实验原理：双歧杆菌是动物体肠道内的正常优势生理细菌，革兰氏阳性，无芽孢，没有运动能力，最适生长温度37℃~41℃，专性厌氧。双歧杆菌的细胞呈现多样形态，有短杆较规则形、纤细杆状具有尖细末端形、球形、长杆弯曲形、分枝或分叉形、棍棒状或匙形。单个或链状、V形、栅栏状排列，或聚集成星状。双歧杆菌的菌落光滑、凸圆、边缘完整、乳脂至白色、闪光并具有柔软的质地(7)。 因为双歧杆菌是严格厌氧细菌，所以双歧杆菌的培养条件必须无氧，且培养基要具有低氧化还原电势。培养双歧杆菌最常用的方法是亨盖特厌氧滚管法(1, 5, 7)，此外还有厌氧箱法，厌氧袋法和厌氧罐法等。亨盖特厌氧滚管法是亨盖特（Hungate）于1950年发展起来的一套严格厌氧微生物的培养技术，主要原理是利用铜柱氧化除氧的滚管分离纯化法。亨盖特厌氧滚管法的优点是可以实时检查培养物，无氧效果好且花费不高，但需要专门的仪器和技术性很强的操作。本实验采用的简易厌氧罐法是一种操作简单且成本很低的方法，主要原理是利用焦性没食子酸除去厌氧罐内的氧气。该方法的缺点是焦性没食子酸与NaOH反应过程中会产生一定量的NO，可能不利于细菌的生长；此外，过量的NaOH 会将厌氧罐中的CO2一起除掉，而CO2对多数厌氧菌的生长有促进作用。另外，在同一个培养皿上接种好氧细菌（如大肠杆菌和枯草杆菌）能加强除氧的效果。 本实验所用的培养基参考了NPNL培养基(6)和BS培养基的配方，其中鱼粉、牛肉膏、酵母浸粉、胰蛋白胨的作用是提供氮源、维生素和生长因子，葡萄糖和乳糖为乳酸菌发酵提供糖类底物，磷酸氢二钾和磷酸二氢钾为酸碱缓冲剂，硫酸亚铁、硫酸锰为乳酸菌提供生长因子，氯化钠维持均衡的渗透压。如果在培养基中加入一定浓度的抗生素，比如硫酸卡那霉素（75μg/ml）、硫酸新霉素（30-200μg/ml）、硫酸巴龙霉素（20-200μg/ml）、萘啶酮酸（15或80μg/ml）、氧化锂（3mg/ml）、丙酸钠（10或15g/L）、山梨酸（0.4g/L）等，培养基就成为双歧杆菌的选择性培养基(7)。实验材料：蒙牛冠益乳（含bb-12双歧杆菌），伊利酸牛奶（ABLS益生菌），佳宝、光明原味酸牛奶，双歧杆菌乳酸菌三联活菌片（含长型双歧杆菌Bifidobacterium longum），枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis） 实验方法： 1.培养基 双歧杆菌琼脂培养基【蛋白胨（鱼粉）10.0g，牛肝浸粉5.0g，牛肉膏3.0g，酵母浸粉5.0g，胰蛋白胨8.0g，可溶性淀粉0.5g，磷酸氢二钾1.0g，磷酸二氢钾 1.0g，葡萄糖10.0g，乳糖3.0g，L-半胱氨酸0.5g，琼脂15g，吐温80 1g，溶液A （FeSO4·7H2O 0.2g，MgSO4·7H2O 4.0g，MnSO4·4H2O 0.135g，NaCl 0.2g 于100ml蒸馏水定容）10ml，蒸馏水定容至1L】 枯草芽孢杆菌LB琼脂培养基【胰蛋白胨10g/L，酵母浸粉5g/L，Nacl10g/L，琼脂粉15g/L】 2.简易厌氧罐法 将双歧杆菌琼脂培养基倒入培养皿中，待培养基冷却后，先用接种环取LB琼脂培养基上生长的枯草芽孢杆菌菌落接种在培养皿一侧，再于另一侧划线接种酸奶或三联活菌片的稀释液，按照每L容积1.0g 焦性没食子酸、10%NaOH溶液10ml加入厌氧罐后，立即以凡士林和胶带密封，置于37℃恒温培养2-3天。 图1. 实验中使用的简易厌氧罐

海洋放线菌代谢产物蒽环类化合物研究进展

药物生物技术 Pharmaceutical Biotechnology2011，18（6）：559 562 海洋放线菌代谢产物蒽环类化合物研究进展 马毅敏，陆园园，邢莹莹，奚涛* （中国药科大学生命科学与技术学院，江苏、南京210009） 摘要海洋放线菌代谢产物是抗肿瘤活性物质的重要来源。近年来，从海洋放线菌中分离到很多新化合物，其中许多结构新颖的蒽环类代谢产物具有良好的抗菌抗肿瘤活性。文章对近年来从海洋放线菌中分离得到的蒽环类代谢产物进行了归纳，并展望今后海洋天然产物的发展方向。 关键词海洋放线菌；蒽环类化合物；抗生素；抗肿瘤活性 中图分类号Q514．3文献标志码A文章编号1005-8915（2011）06-0559-04 海洋放线菌作为海洋微生物中一个重要的类别，被认为是生物活性代谢产物的重要的来源。据报道大约有23000个具有生物活性的次级代谢产物由微生物产生，其中超过10000个化合物由放线菌产生，即所有微生物来源的活性代谢产物，45%来自于放线菌。根据不完全统计，在21世纪分离自海洋放线菌的新型化合物的数量是上个世纪的两倍还要多。跟陆生放线菌一样，海洋放线菌也将成为医药产业的另一个重要的微生物来源。 微生物代谢产物是最重要的肿瘤化学治疗药物［1］，它们最早出现在1940年，海洋放线菌中，大部分的化合物由链霉菌属产生，其中许多次级代谢产物都是有效的抗生素。备受关注的抗生素有：放线菌素D，多柔比星、柔红霉素、丝裂霉素、博莱霉素和平阳霉素、烯二炔类抗生素力达霉素等。其中多柔比星，柔红霉素等蒽环类抗生素是最有效的抗肿瘤化合物，比其他的化学治疗药物能够更有效的治疗各种癌症［2］。它们被用于治疗多种癌症，包括白血病，淋巴瘤，乳腺癌，子宫癌，卵巢癌以及肺癌［3］。 1海洋放线菌来源的蒽环类化合物 蒽环类化合物都拥有醌类的骨架，由芳香环状结构组成的刚性平面再通过一个氧-糖苷键连接一个氨基糖［4］。蒽环类化合物是通过插入DNA双链，形成复合物来抑制DNA或者RNA的形成。它们也能通过拓扑异构酶Ⅱ触发DNA的降解，最终引起细胞凋亡。它们的不良反应是呕吐和具有心脏毒性，心脏毒性会部分限制这类化合物的效用。 第一个被成功发现的蒽环类抗生素是1966年的柔红霉素，由海洋放线菌Streptomyces peucetius中分离得到。阿霉素在1967年被发现。在柔红霉素和阿霉素之后，一系列半合成的化合物（如伊达比星和表柔比星）诞生了并且进入了临床应用。表柔比星在1999年通过FDA认证，在化学治疗过程中要优选于多柔比星，因为它表现出更少的副作用。表柔比星的糖的4位碳上有一个独特的空间取向，这可能决定了它快速的功效及较少的毒性。表柔比星最早用于乳腺癌，卵巢癌，胃癌，肺癌和淋巴癌。戊柔比星是多柔比星的半合成类似物，在1999年作为化学治疗药物，用于治疗膀胱癌。 近年来许多蒽环类化合物及蒽醌类物质展现出很好的生物学活性，如抗真菌活性，抗病毒活性，抗肿瘤活性以及抑制蛋白质合成的活性。很多新型的蒽环类抗生素及醌类物质成功的从海洋放线菌中分离出来，见表1。 Lomaiviticins A和Lomaiviticins B分离自一株嗜盐放线菌（LL371366）［5］。这两个化合物都被证明具有较强的DNA损伤活性，而且Lomaiviticins A能够裂解双链DNA，对许多肿瘤细胞株具有细胞毒活性。这两个化合物对金黄色葡萄球菌和屎肠球菌表现出了有效的抗菌活性。 Komodoquinone A及Komodoquinone B分离自链霉菌Streptomyces sp.KS3，其中Komodoquinone B是Komodoqui-none A的苷元［6］。Komodoquinone A是一个特有的蒽环类抗生素，其结构中有一个未知的氨基糖连接在4位碳上，而不是连在我们普遍知道的蒽环类抗生素的7位碳上［7］。研究发现Komodoquinone A在浓度为1μg/mL时，能够诱导成神经瘤细胞（Neuro-2a）分化。以Komodoquinone A治疗癌症时，能在G1期就阻止Neuro-2a细胞分裂，这些数据表明连在4位碳上的氨基糖对于Komodoquinone A在神经细胞中的作用十分重要［8］。 955 收稿日期：2011-03-28修回日期：2011-05-06 基金项目：国家自然科学基金青年科学基金项目（No．81001395）。 作者简介：马毅敏（1985-），女，汉，江苏南通人，硕士研究生，主要从事海洋放线菌代谢产物研究。E-mail：zdj123727@https://www.wendangku.net/doc/9617696541.html,。*通讯作者：奚涛，男，中国药科大学，教授，博士生导师。Email：xi_tao18@https://www.wendangku.net/doc/9617696541.html,。