实验三 酸性磷酸酶的显示方法2007.9.10

学号姓名班级细胞生物学实验报告

实验三酸性磷酸酶的显示方法

一、实验原理

酸性磷酸酶分解磷酸脂而释放出磷酸基。在PH5.0的环境中，磷酸基与铅盐反应形成磷酸铅。但磷酸铅是无色的，所以再与硫化铵作用，形成棕黑色的硫化铅沉淀，由此就能显示酸性磷酸酶在细胞内的存在与分布。

二、实验步骤

1.取洋葱内表皮（1cm×0.6cm每瓶放3片）沉于10%中性富尔马林液中，4℃下

固定30分钟，（置冰箱贮藏室），对照实验置50℃烘箱中。（加液至青霉素瓶1/3体积）

2.去福尔马林液，自来水漂洗5分钟。（青霉素瓶水加满，换3次）

3.去水，加酸性磷酶作用液，室温下置30分钟。（加液至青霉素瓶1/3体积）

4.去作用液，自来水漂洗10分钟。（青霉素瓶水加满，换3次）

5.去水，加1%硫化铵处理3-5分钟。（加液至青霉素瓶1/3体积）

6.去硫化铵，加水漂洗。（青霉素瓶水加满，换1次）

7.置载玻片上，加盖玻片。

8.显微镜观察（注意液泡中标黑色的小颗粒，表示有酸性磷酸酶的活力）。

三、实验结果（画酸性磷酸酶在细胞中的分布图）

四、结果讨论

组织及血液酸性磷酸酶(ACP)活性检测试剂盒说明书 可见分光光度法

组织及血液酸性磷酸酶（ACP）活性检测试剂盒说明书可见分光光度法 注意：正式测定前选择2-3个预期差异大的样本做预测定。 货号：BC2130 规格：50T/24S 产品内容： 提取液：液体30mL×1瓶，4℃保存。 试剂一：液体10mL×1瓶，4℃避光保存。 试剂二：液体10mL×1瓶，4℃避光保存。 试剂三：液体30mL×1瓶，4℃避光保存，变成蓝绿色不能使用。 标准品：液体1mL×1支，2μmol/mL酚标准液，4℃保存。临用前蒸馏水稀释至0.5μmol/mL备用。产品说明： ACP在酸性条件下催化磷酸单酯水解称无机磷酸，常见于巨噬细胞的溶酶体内。ACP常用于前列腺癌的辅助诊断。 在酸性环境中，ACP催化磷酸苯二钠水解生成苯酚，苯酚与4-氨基安替比林和铁氰化钾反应生成红色亚醌衍生物，在510nm有特征光吸收；通过测定510nm吸光度增加速率，来计算ACP活性。 试验中所需的仪器和试剂： 可见分光光度计、台式离心机、可调式移液器、1mL玻璃比色皿、冰和蒸馏水。 操作步骤： 一、粗酶液提取： 称取约0.1g组织，加提取液1mL充分研磨，4℃、10000rpm离心10min，取上清液待测。血液可直接用于测定，如果浓度高的话，用提取液稀释。 二、测定步骤： 1.分光光度计预热30min以上，调节波长到510nm，蒸馏水调零。 2.试剂一置于37℃水浴中预热30min以上。

试剂名称（μL）测定管对照管空白管标准管蒸馏水--100- 0.5μmol/mL标准品---100 上清液100--- 试剂一200200200200 试剂二200200200200 混匀后置于37℃水浴中保温15min 试剂三600600600600 上清液-100--混匀后于510nm测定吸光度，分别记为A测定管、A对照管、A空白管、A标准管。 三、ACP活性计算： 1.按蛋白浓度计算 活性单位定义：37℃中每毫克蛋白每分钟催化产生1μmol酚为一个酶活力单位。 ACP(U/mg prot)=[C标准品×(A测定管-A对照管)÷(A标准管-A空白管)×V样]÷(Cpr×V样)÷T =0.033×(A测定管-A对照管)÷(A标准管-A空白管)÷Cpr 2.按样本鲜重计算 活性单位定义：37℃中每克组织每分钟催化产生1μmol酚为一个酶活力单位。 ACP(U/g鲜重)=[C标准品×(A测定管-A对照管)÷(A标准管-A空白管)×V样]÷(W÷V提取×V样)÷T =0.033×(A测定管-A对照管)÷(A标准管-A空白管)÷W 3.按血液体积计算 活性单位定义：37℃中每毫升血液每分钟催化产生1μmol酚为一个酶活力单位。 ACP(U/mL)=[C标准品×(A测定管-A对照管)÷(A标准管-A空白管)×V样]÷V样÷T =0.033×(A测定管-A对照管)÷(A标准管-A空白管) C标准品：标准品浓度，0.5μmol/mL；V样：加入反应体系中上清液体积，0.1mL； T：反应时间，15min；V提取：加入提取液体积，1mL； W：样本鲜重，g。

抗酒石酸酸性磷酸酶

30-40岁2型糖尿病患者血清TRACP-5b及BALP临床分析 目的：分析30-40岁糖尿病患者血清骨形成指标TRACP-5b及BALP 骨吸收指标水平与骨重建失衡的机理，为糖尿病骨质疏松的早期诊断提供可能的依据。方法：选择30-40岁2型糖尿病患者23例及对照组病例21例，分别对其血清TRACP-5b及BALP进行测量，并做统计分析。结果：T2DM患者组血清TRACP-5b水平高于对照组（P<0.05）具有统计学差异,T2DM患者组血清BALP水平低于对照组（P<0.05）具有统计学差异。结论：1. 2型糖尿病患者较健康对照组患者血清骨吸收指标TRACP-5b水平升高，骨形成指标BALP 水平降低，成骨作用小于破骨作用，骨质疏松的风险有增加的可能性。（2型糖尿病患者骨质疏松风险的增加可能与BALP及TRACP-5b 存在一定的关系）。 2.骨形成标记物BALP及骨吸收标记TRACP-5b可能是2型糖尿病骨质疏松早期预测的敏感指标。

引言： 2型糖尿病是一种严重威胁人类健康的慢性疾病，在造成起心、脑、肾损伤的同时，还极易引起骨重建负平衡，导致骨质疏松。有研究明，TRACP-5b是骨吸收的特异性标志物,可反映破骨细胞的活性及骨吸收的状态；BALP是骨形成的特异性标志物，可反映成骨细胞的活性及骨形成的状态。本课题通过对40岁以下T2DM患者观察组和健康人对照组的血清TRCAP-5b及BALP水平测量，分析骨重建失衡的机理，为糖尿病骨质疏松的早期诊断提供可能的理论依据。 1.对象和方法 1.1研究对象 观察组：选取23例为我院2015年3月~2015年6月住院病人，按WHO标准确诊为T2DM 患者，其中男10例，女13例，年龄30-40岁，平均年龄 (65. 5 ±1 0. 7)岁, 体质量指数[ BMI=体重( kg) /身高2( m2)] 平均为24. 4 ±3. 1, 病程6月～21 年, 均为口服降糖药及通过饮食控制血糖 健康对照组：同期我院健康体检者21例，其中男10例，女11例，年龄30-40岁，平均年龄xx岁，体重指数xx.且经口服葡萄糖耐量试验排除糖尿病。各组均排除由衰老或卵巢功能减退引起的原发性骨质疏松，代谢性骨病，转移性骨肿瘤，慢性肾功能不全，甲状旁腺机能异常，库欣综合征，胃切除等导致骨重建失衡的疾病。半年内无服用维生素D，钙剂、皮质类固醇激素史、免疫抑制、抗癫痫药等影响维生素钙磷代谢的药物史。 方法 血清TRACP-5b测定： 血清BALP测定： 统计学处理：应用SPSS17.0统计学软件，计量资料x珋±s 表示，两组之间比较选用独立样本t 检验，

植物根系酸性磷酸酶活性测定

植物根系酸性磷酸酶活性测定 1原理 该方法以对硝基苯磷酸二钠（即P-NPP）为底物，该底物在土壤酸性磷酸酶的催化 下水解生成黄色的对硝基苯酚（即p-NP），该黄色溶液在410nm处有最大吸收光值，根_ 据对硝基苯酚的生成数量与黄色溶液的吸光度呈正比来进行定量分析，以此来反映土壤 酸性磷酸酶的活性。酶活性是以单位时间内单位重量鲜根或单株根系水解p-NPP生成的 对硝基苯酚（p-NP）的量来表示（⑷h-1 g-1鲜根或口 g -1/i株）。 2?测定方法 1）称取（1.2 ±.1） g鲜根，加入8mL 0.2mol/L醋酸钠缓冲液（pH 5.8）,然后进行冰浴研磨，双层纱布过滤，12000 r/min离心15min，静置。 2）取上清液1mL于15mL离心管中，加入 2mL 0.05mol/L对硝基苯磷酸二钠（醋酸钠缓冲液配制），摇匀后加盖，于 37C水浴30min。 3）水浴后加入 2mL 0.5mol/L CaCI 2及2mL 2mol/L NaOH 以终止反应，摇匀。 4） 2500r/min离心5min，取上清液于15mL离心管中，4000r/min下再离心5min。 5）取上清液在410nm波长比色，并记录吸光值 A410。 3?标准曲线的制作 1 ）取13支15mL离心管，按顺序编号，并按表 1加入试剂 表1对硝基苯酚标准曲线配制表

2）混匀后，在2500r/min下离心5min ,再在4000r/min下离心5min以0号作为对照， 在410nm波长下测光吸收值，并记录光吸收值A410。 3）以吸光值为横坐标、对硝基苯酚的含量为纵坐标计算直线回归方程y=a+bx及相关系数R,即对硝基苯酚含量n（ mol） a b A410。 4?计算方法 根系酸性磷酸酶活性是以单位时间内单位重量鲜根或单株根系水解p-NPP生成的对 硝基苯酚（p-NP）的量来表示（° h-1 g-1鲜根或口 g心株）。 即根系酸性磷酸酶活性（g h 1 g 1鲜根）n M 稀释倍数/（W t） 式中：n—标准曲线上查得样品中对硝基苯酚的浓度（卩mo）; M —对硝基苯酚的相对分子质量（139.11g/mol）; t —反应时间（h）; W—样品鲜重（g）。 稀释倍数一8 a.醋酸盐缓冲液（pH=5.0 ） A: 0.2mol/L 醋酸溶液（11.5mL，稀释至1000mL ） B: 0.2mol/L 醋酸钠溶液（16.4g C z H s O z Na 或27.2g C z H s O z Na - 3出0 定容至1000mL ） 14.8ml A + 35.2ml B 混合即得

P0332 抗酒石酸酸性磷酸酶检测试剂盒

抗酒石酸酸性磷酸酶检测试剂盒 产品简介： 碧云天生产的抗酒石酸酸性磷酸酶检测试剂盒(Tartrate Resistant Acid Phosphatase Assay Kit)是一种用于快速、便捷地检测细胞或组织的裂解液或匀浆液、血浆、血清、尿液等样品中内源性的抗酒石酸酸性磷酸酯酶活性的试剂盒。 酸性磷酸酶(Acid Phosphatase)，也称酸性磷酸酯酶，在酸性条件下可以催化磷酸酯键的水解。酸性磷酸酶是一个蛋白家族，哺乳动物中其分子量从18kD到100kD不等。酸性磷酸酶主要分为两类，一类为抗酒石酸酸性磷酸酶(tartrate resistant acid phosphatase, TRAP)，一类为抗氟离子酸性磷酸酶。 抗酒石酸酸性磷酸酶是一种糖基化的含金属蛋白酶，在破骨细胞(osteoclast)和破软骨细胞(chondroclast)中高表达。在活化的巨噬细胞和神经元中也有表达。抗酒石酸酸性磷酸酶在细胞信号转导、细胞增殖和分化等方面起重要作用，也和活性氧产生和铁离子转运等有关。抗酒石酸酸性磷酸酶可以被破骨细胞释放到血液中，几乎被认为是是机体破骨活性的唯一血液指标。 在一些疾病状态下，如白血病性网状内皮组织增生症(leukaemic reticuloendotheliosis)、戈谢病(Gaucher’s disease)、艾滋病导致的脑病(HIV-induced encephalopathy)、破骨细胞瘤(osteoclastoma)、骨质疏松(osteoporosis)和代谢性骨疾病(metabolic bone disease)有关。TRAP敲除小鼠有轻微的骨骼石化症，TRAP转基因小鼠有轻微的骨质疏松。 本试剂盒可以检测细胞或组织的裂解液或匀浆液、血浆、血清、尿液或纯化的酶样品等中的抗酒石酸酸性磷酸酶活性。 Para-nitrophenyl phosphate (pNPP)是一种常用的磷酸酶显色底物，在酸性条件下，可在酸性磷酸酶作用下生成para-nitrophenol。para-nitrophenol (p-nitrophenol)在碱性条件下，呈黄色产物，可以在400-415nm检测吸光度。产物黄色越深，说明酸性磷酸酶检活性越高，反之则酶活性越低。据此通过比色分析就可以计算出酸性磷酸酶活性水平。在适量的酒石酸存在的情况下进行酸性磷酸酶的活性检测，检测得到的酸性磷酸酶活性就是抗酒石酸酸性磷酸酶活性。 包括标准品和空白对照，本试剂盒共可进行120个样品的检测。 保存条件： -20℃保存，一年有效。显色底物和p-nitrophenol溶液需避光保存。 注意事项： 如果希望进行酶活性的绝对定量，进行酶反应时必须注意精确计时。此时推荐采用孵育30分钟等较长的时间，以减小操作过程中的时间误差。同时如果样品中酶活性较高，则可以预先适当稀释样品。 样品溶液中须避免出现各种酸性磷酸酶抑制剂。 一管显色底物配制后需当日使用完毕，因此请注意适当多准备一些样品一起检测，以避免试剂盒浪费。 p-nitrophenol溶液对人体有害，请注意适当防护。反应终止液有腐蚀性，请小心操作。 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。 使用说明： 1.试剂准备：将所有试剂取出，恢复至室温使用。 a.显色底物溶液：取一管显色底物，溶解于2.5ml的检测缓冲液中，充分溶解和混匀，冰上放置。新鲜配制的显色底物 溶液需在6小时内使用。 b.标准品工作液：取10μl p-nitrophenol溶液(10mM)，用检测缓冲液稀释至0.2ml，最终浓度为0.5mM。 2. 样品准备： a. 细胞或组织裂解液的准备：采用适当细胞或组织裂解液裂解细胞和细胞，如果有必要需进行适当匀浆，随后离心取上 清，用于抗酒石酸酸性磷酸酶的检测。注意：裂解液中不能含有磷酸酶抑制剂。样品可以-80℃冻存，但需避免反复

2.1土壤酸性磷酸酶活性测定

土壤酸性磷酸酶活性测定 土壤有机磷转化受多种因子制约，尤其是磷酸酶的参与，可加速有机磷的脱磷速度。在pH 4-9 的土壤中均有磷酸酶。积累的磷酸酶对土壤磷素的有效性具有重要作用。研究证明，磷酸酶与土壤碳、氮含量呈正相关，与有效磷含量及pH也有关。磷酸酶活性是评价土壤磷素生物转化方向的强度的指标。 磷酸苯二钠比色法 1.试剂配制 （1）0.5%磷酸苯二钠（用缓冲液配制）。 （2）pH5醋酸盐缓冲液。 a.醋酸盐缓冲液（pH=5.0） A：0.2mol/L 醋酸溶液（11.5mL，稀释至1000mL） B：0.2mol/L 醋酸钠溶液（16.4g C2H3O2Na 或27.2g C2H3O2Na·3H2O 定容至1000mL） 14.8ml A + 35.2ml B混合即得 （3）氯代二溴对苯醌亚胺试剂：取0.125g 2,6-二溴苯醌氯酰亚胺，用10ml 96%乙醇溶解，贮于棕色瓶中，存放在冰箱里。保存的黄色溶液未变褐色之前均可使用。 （4）酚的标准溶液： 酚原液——取1g重蒸酚溶于蒸馏水中，稀释至1L，贮于棕色瓶中。 酚工作液——取10ml 酚原液稀释至1L（每毫升含0.01mg酚）。 （5）甲苯。 （6）0.3%硫酸铝溶液。 标准曲线绘制：取1、3、5、7、9、11、13ml 酚工作液，置于50ml容量瓶中，每瓶加入5ml 缓冲液和4滴氯代二溴对苯醌亚胺试剂，显色后稀释至刻度，30min后比色测定。以吸光度为横坐标，浓度为纵坐标（mg）绘成标准曲线。 2.操作步骤 称5g风干土置于200ml三角瓶中，加2.5ml 甲苯，轻摇15min后，加入20ml 0.5%磷酸苯二钠（用醋酸盐缓冲液配制），仔细摇匀后放入恒温箱，在37℃下培养24h后于培养液中加100ml 0.3%硫酸铝溶液并过滤。 吸取3ml 滤液于50ml 容量瓶中，然后按绘制标准曲线所述方法显色。用硼酸缓冲液时，呈现蓝色，在分光光度计上于660nm 处比色。 3.结果计算 磷酸酶活性，以24h后1g土壤中释出的酚的毫克数表示。 酚（mg）=a*8 式中a—从标准曲线上查得的酚毫克数 8—换算成1g 土的系数

抗洒石酸酸性磷酸酶5b(TRACP 5b)定量测定

抗酒石酸酸性磷酸酶5b（TRACP 5b）定量测定 一、简介和用途、适用范围 大量的抗酒石酸酸性磷酸酶（TRACP）是由骨吸收的破骨细胞和有活力的巨噬细胞所释放的。在血液循环中的TRACP有TRACP 5b 和TRACP 5a二种形式， TRACP 5b 来源于破骨细胞，而TRACP 5a来源于巨噬细胞。 由破骨细胞刚分泌到血液中的TRACP 5b是有活性的酶，但当TRACP 5b在血液循环中被清除之前已无活性，并被降解为碎片。这样TRACP 5b不会因肝、肾功能受损而在血液中积蓄。血清中TRACP 5b均来源于破骨细胞，此酶在昼夜的活性水平变化不明显，且不受进食的影响，故可在一天的任何时候都可以采集标本进行检验。 此试剂盒依据测定由破骨细胞释放的TRACP 5b的特异性测定方法。它可以用于测定骨吸收亢进的病人，如原发性骨质疏松和肾性骨病，也可以预测骨折的危险性，并便于了解抗骨吸收治疗的效果。在肿瘤病人中，当TRACP 5b 的活力增高提示肿瘤骨转移。 在体外，培养基中TRACP 5b的活力大小代表了破骨细胞数量的多少，因此应用于此试剂盒在进行人的破骨细胞培养时，可用于检测破骨细胞的数量。 二、试验原理 测试孔内已包被抗TRACP单克隆抗体→加入校准液、质控品和样品→加入释放剂→有活性的TRACP 5b从结合蛋白质上离解→TRACP 5b与孔内包被的抗TRACP单克隆抗体结合→加入底物pNPP孵育→加入终止液终止反应→在酶标仪上检测结果。 此试验的优点 1、所测定的TRACP 5b是由破骨细胞专一释放的。 2、此试验对TRACP 5a或其它磷酸酶没有干扰。 3、溶血不影响结果。 4、不受昼夜变化的影响。 5、不受肝脏、肾脏疾病的影响。 6、不受进食的影响。 7、酶标板容易拆卸，方便检测。 三、试剂盒 （一）组成 1、酶标板：96孔，已包被抗—TRACP抗体。 2、质控液：3×0.5ml。 3、校准液：3×0.5ml(3×1U/L,3×5U/L,3×10U/L)。 4、冲洗缓冲液：1×100ml，浓缩10倍。 5、样品稀释液：1×15ml。 6、释放剂：1×8ml。 7、底物缓冲液：2×15ml。 8、底物：4片。 9、终止液：1×6ml。 （二）贮存和试剂的有效期 1、试剂在2-8度中保存，在此温度中可稳定到试剂包装上所标定的日期。 2、试剂使用后应及时放回至2-8度中保存。 3、在外包装盒的有效期内使用为准。 4、过期的试剂不得使用。 （三）、自备器材 1、重蒸馏水

土壤酸性磷酸酶活性测定

2.1土壤酸性磷酸酶活性测定 土壤酸性磷酸酶活性测定 土壤有机磷转化受多种因子制约，尤其是磷酸酶的参与，可加速有机磷的脱磷速度。在pH 4-9 的土壤中均有磷酸酶。积累的磷酸酶对土壤磷素的有效性具有重要作用。研究证明，磷酸酶与土壤碳、氮含量呈正相关，与有效磷含量及pH也有关。磷酸酶活性是评价土壤磷素生物转化方向的强度的指标。 磷酸苯二钠比色法 1.试剂配制 （1）0.5%磷酸苯二钠（用缓冲液配制）。 （2）pH5醋酸盐缓冲液。 a.醋酸盐缓冲液（pH=5.0） A：0.2mol/L 醋酸溶液（11.5mL，稀释至1000mL） B：0.2mol/L 醋酸钠溶液（16.4g C2H3O2Na 或27.2g C2H3O2Na·3H2O 定容至1000mL） 14.8ml A + 35.2ml B混合即得 （3）氯代二溴对苯醌亚胺试剂：取0.125g 2,6-二溴苯醌氯酰亚胺，用10ml 96%乙醇溶解，贮于棕色瓶中，存放在冰箱里。保存的黄色溶液未变褐色之前均可使用。 （4）酚的标准溶液： 酚原液——取1g重蒸酚溶于蒸馏水中，稀释至1L，贮于棕色瓶中。 酚工作液——取10ml 酚原液稀释至1L（每毫升含0.01mg酚）。 （5）甲苯。 （6）0.3%硫酸铝溶液。 标准曲线绘制：取1、3、5、7、9、11、13ml 酚工作液，置于50ml容量瓶中，每瓶加入5ml 缓冲液和4滴氯代二溴对苯醌亚胺试剂，显色后稀释至刻度，30min后比色测定。以吸光度为横坐标，浓度为纵坐标（mg）绘成标准曲线。 2.操作步骤 称5g风干土置于200ml三角瓶中，加2.5ml 甲苯，轻摇15min后，加入20ml 0.5%磷酸苯二钠（用醋酸盐缓冲液配制），仔细摇匀后放入恒温箱，在37℃下培养24h后于培养液中加100ml 0.3%硫酸铝溶液并过滤。 吸取3ml 滤液于50ml 容量瓶中，然后按绘制标准曲线所述方法显色。用硼酸缓冲液时，呈现蓝色，在分光光度计上于660nm 处比色。 3.结果计算 磷酸酶活性，以24h后1g土壤中释出的酚的毫克数表示。 酚（mg）=a*8 式中a—从标准曲线上查得的酚毫克数 8—换算成1g 土的系数 1 / 1

酸性磷酸酶的临床意义

酸性磷酸酶的临床意义 酸性磷酸酶是一种广泛存在于人体组织内的一种物质，主要存在于细胞和体液里面，血液里面的酸性磷酸酶，主要来源于前列腺，来源于血小板，白细胞等，其中在前列腺里面，含量是最丰富的。在日常的医疗检查当中，通过对酸性磷酸酶的检查，能够取得前列腺癌的辅助诊断的作用，另外对于血液病、骨类疾病也有一定的诊断的作用和效果。 ★临床意义 正常人血清中的酸性磷酸酶来源于骨、肝、肾、脾、胰等组织，故不论男女老幼，其含量大致相同。而前列腺患者以及出现肝炎、甲状旁腺机能亢进、红血球病变等疾病时，血清中酸性磷酸酶的活力都会升高。为了鉴别血清中增加的酸性磷酸酶是来自前列腺还是来自其他器官，必须加以区别。为此可进一步采用某些抑制剂进行选择性抑制作用。例如：乙醇和酒石酸对前列腺酸性磷酸酶有显着的抑制作用，而对红血球酸性磷酸酶的抑制作用较弱。

ACP测定主要用于前列腺癌的辅助诊断。 (1)前列腺癌：尤其是转移癌ACP明显升高。PAP对前列腺癌的诊断较ACP敏感，二者对晚期前列腺的诊断、疗效观察及预后监测价值更大。 (2)血液病：粒细胞白血病、高雪病、尼曼匹克病、原发性血小板减少性紫癜、溶血性贫血等ACP活性亦增高。 (3)非恶性前列腺疾病：前列腺炎、前列腺肥大、前列腺梗死等ACP活性也增高。 (4)骨疾病：变形性骨炎、成骨不全、软骨病、骨肉瘤、多发性骨髓瘤及某些非前列腺恶性肿瘤的骨转移，ACP活性也可升高。 (5)其他：甲状腺功能亢进，急、慢性肾炎、尿潴留等ACP

活性可增高。 正常男性血清中酸性磷酸酶1/3～1/2来自于前列腺，女性血清中的酸性磷酸酶主要来自肝脏、红细胞和血小板。酸性磷酸酶有20种同工酶，临床测定的同工酶大致为两大类：一类是前列腺酸性磷酸酶；另一类是非前列腺酸性磷酸酶。酸性磷酸酶测定主要用于前列腺癌的辅助诊断。

酸性磷酸酶活性测定方法

实验九酸性磷酸（酯）酶活性测定1．目的要求 掌握酸性磷酸（酯）酶活性测定的原理和方法。 2．方法原理 酸性磷酸（酯）酶是一种存在于生物体内水解有机磷酸酯键的酶。以对硝基酚磷酸钠作为底物，在酸性磷酸酯酶的作用下，在碱性条件下水解生成黄色的对硝基酚，可用分光光度计进行比色测定。它们在各类种子中普遍存在，且含量较多，在萌发前期，随着种子的萌发进程活性增加，通常酸性磷酸酶活性与种子活力呈正比。 3．主要实验仪器及材料 干种子或吸胀种子、电子天平、分光光度计、恒温水浴箱、带塞刻度试管、小烧杯、研钵、塑料管、剪刀。 4．掌握要点 掌握常用的测定酸性磷酸（酯）酶活性的方法——对硝基酚磷酸钠法。 5．实验内容 （1）酶液提取。称取1g样品，用5mL研磨缓冲液在研钵中冰浴研磨成浆，再用5mL 研磨缓冲液冲洗，转移至离心管中，在20000rpm下离心10min。吸出上清液，即为酶粗提液。可放在冰箱中储存备用。 （2）活力测定。取酶液0.1—1mL（视酶含量多少而定），加水至1mL，然后加入缓冲液1mL和对硝基酚磷酸钠溶液0.1mL。空白对照用1mL研磨缓冲液代替酶制剂。充分混匀后，放在30℃恒温箱中保温10min，时而摇动。10min后，加入1m0.5mol/LNaOH溶液，充分混合，终止反应，并使对硝基酚呈黄色。在400nm波长下测吸光度A。 （3）计算酶活性，以每毫克种子每分钟水解底物的nmol数表示。 酶活性nmol/min.mg= ） （ ） （ 试样的 g W V V A ? ? ? min 10 1 1.3 019 .0 式中0.019为pH=14时，对硝基酚的μmol吸光系数，即对硝基酚的浓度为1mol/L时，其A=0.019； 3.1为0.0031×1000，反应混合液的体积为3.1，将μmol化为nmol乘上1000； V为酶制剂总体积； V1为每次用酶体积。

抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)检测试剂盒(PNP比色法)

抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)检测试剂盒(PNP微板法) 简介： 酸酸性磷酸酶(acid phosphatase，ACP)分布极广泛，遍布各种组织，主要存在于细胞的溶酶体内，所以常作为溶酶体标志酶。溶酶体外的酸性磷酸酶存在于内质网和胞质内，各种动物中的酸性磷酸酶各有不同，酸性磷酸酶的适宜pH为4.5～5.5。存在于正常人肺泡巨噬细胞和白血病人脾脏的抗酒石酸酸性磷酸酶(Tartrate-resistnt acid phosphatase，TRAP)均在细胞滤泡中，并不是释放入血液，血液中的TRAP绝大多数来源于破骨细胞，因此可以通过测量血液中的TRAP了解破骨细胞的功能状态，几乎被认为是是机体破骨活性的唯一血液指标。TRAP一种糖基化的含金属蛋白酶，在破骨细胞(osteoclast)和破软骨细胞(chondroclast)中高表达，在活化的巨噬细胞和神经元中也有表达。 Leagene抗酒石酸酸性磷酸酶检测试剂盒(Tartrate Resistnt Acid Phosphatase Colorimetric Assay Kit)检测原理是利用Para-nitrophenyl phosphate(pNPP)为一种常用的磷酸酶显色底物，在酸性条件下，可在酸性磷酸酶的作用下生成p-nitrophenol。在碱性条件下p-nitrophenol呈黄色，产物黄色越深，说明酸性磷酸酶活性越高，反之则酶活性越低，通过分光光度比色法(酶标仪)测定吸光度，据此通过比色分析就可以计算出酸性磷酸酶活性水平。在适量的酒石酸存在的情况下进行酸性磷酸酶的活性检测，检测得到的酸性磷酸酶的活性就是抗酒石酸酸性磷酸酶的活性。该试剂盒可用于检测细胞或组织的裂解液或匀浆液、血浆、血清、尿液等样品中内源性的抗酒石酸酸性磷酸酯酶活性。该试剂盒仅用于科研领域，不宜用于临床诊断或其他用途。 组成： 自备材料： 1、96孔板 2、水浴锅或恒温箱 3、酶标仪编号 名称TE0043 120T Storage 试剂(A): ACP Assay buffer15ml 4℃ 试剂(B): pNPP 2支-20℃避光试剂(C): T artrate Solution 1ml 4℃ 试剂(D): p-nitrophenol(10mM) 0.1ml -20℃避光使用说明书1份

人抗酒石酸酸性磷酸酶5b(TRACP5b)酶联免疫分析(ELISA) 试剂盒使用

人抗酒石酸酸性磷酸酶5b(TRACP5b)酶联免疫分析（ELISA） 试剂盒使用说明书 本试剂仅供研究使用目的：本试剂盒用于测定人血清，血浆及相关液体样本中抗酒石酸酸性磷酸酶5b(TRACP5b)的含量。 实验原理： 本试剂盒应用双抗原夹心法测定标本中人抗酒石酸酸性磷酸酶5b(TRACP5b)水平。用纯化的TRACP5b抗原包被微孔板，制成固相抗原，往包被抗原的微孔中依次加入抗酒石酸酸性磷酸酶5b(TRACP5b)，再与HRP标记的酒石酸酸性磷酸酶5b抗原结合，形成抗原-抗体-酶标抗原复合物，经过彻底洗涤后加底物TMB显色。TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的抗酒石酸酸性磷酸酶5b(TRACP5b)呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），通过标准曲线计算样品中人抗酒石酸酸性磷酸酶5b(TRACP5b)浓度。 样本处理及要求： 1. 血清：室温血液自然凝固10-20分钟，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上 清，保存过程中如出现沉淀，应再次离心。 2. 血浆：应根据标本的要求选择EDTA或柠檬酸钠作为抗凝剂，混合10-20分钟后，离心 20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清，保存过程中如有沉淀形成，应该再次离心。 3. 尿液：用无菌管收集，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清，保存过程 中如有沉淀形成，应再次离心。胸腹水、脑脊液参照实行。 4. 细胞培养上清：检测分泌性的成份时，用无菌管收集。离心20分钟左右（2000-3000转/

分）。仔细收集上清。检测细胞内的成份时，用PBS（PH7.2-7.4）稀释细胞悬液，细胞浓度达到100万/ml左右。通过反复冻融，以使细胞破坏并放出细胞内成份。离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清。保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。5. 组织标本：切割标本后，称取重量。加入一定量的PBS，PH7.4。用液氮迅速冷冻保存备 用。标本融化后仍然保持2-8℃的温度。加入一定量的PBS（PH7.4），用手工或匀浆器将标本匀浆充分。离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清。分装后一份待检测，其余冷冻备用。 6. 标本采集后尽早进行提取，提取按相关文献进行，提取后应尽快进行实验。若不能马上 进行试验，可将标本放于-20℃保存，但应避免反复冻融. 7. 不能检测含NaN3的样品，因NaN3抑制辣根过氧化物酶的（HRP）活性。 操作步骤 1.标准品的稀释与加样：在酶标包被板上设标准品孔10孔，在第一、第二孔中分别加标 准品100μl，然后在第一、第二孔中加标准品稀释液50μl，混匀；然后从第一孔、第二孔中各取100μl分别加到第三孔和第四孔，再在第三、第四孔分别加标准品稀释液50μl，混匀；然后在第三孔和第四孔中先各取50μl弃掉，再各取50μl分别加到第五、第六孔中，再在第五、第六孔中分别加标准品稀释液50ul，混匀；混匀后从第五、第六孔中各取50μl分别加到第七、第八孔中，再在第七、第八孔中分别加标准品稀释液50μl，混匀后从第七、第八孔中分别取50μl加到第九、第十孔中，再在第九第十孔分别加标准品稀释液50μl，混匀后从第九第十孔中各取50μl弃掉。（稀释后各孔加样量都为50μl，浓度分别为2400pg/ L，1600pg/ L ，800pg/ L，400pg/ L，200pg/ L）。 2.加样：分别设空白孔（空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同）、待测样 品孔。在酶标包被板上待测样品孔中先加样品稀释液40μl，然后再加待测样品10μl（样品最终稀释度为5倍）。加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀。 3.温育：用封板膜封板后置37℃温育30分钟。 4.配液：将30（48T的20倍）倍浓缩洗涤液用蒸馏水30（48T的20倍）倍稀释后备用。 5.洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30秒后弃去，如此 重复5次，拍干。 6.加酶：每孔加入酶标试剂50μl，空白孔除外。 7.温育：操作同3。 8.洗涤：操作同5。 9.显色：每孔先加入显色剂A50μl，再加入显色剂B50μl，轻轻震荡混匀，37℃避光显色 15分钟. 10.终止：每孔加终止液50μl，终止反应（此时蓝色立转黄色）。 11.测定：以空白空调零，450nm波长依序测量各孔的吸光度（OD值）。测定应在加终止 液后15分钟以内进行。 注意事项： 1．试剂盒从冷藏环境中取出应在室温平衡15-30分钟后方可使用，酶标包被板开封后如未用完，板条应装入密封袋中保存。 2．浓洗涤液可能会有结晶析出，稀释时可在水浴中加温助溶，洗涤时不影响结果。 3．各步加样均应使用加样器，并经常校对其准确性，以避免试验误差。一次加样时间最好控制在5分钟内，如标本数量多，推荐使用排枪加样。 4．请每次测定的同时做标准曲线，最好做复孔。如标本中待测物质含量过高（样本OD值大于标准品孔第一孔的OD值），请先用样品稀释液稀释一定倍数（n倍）后再测定，计

土壤酸性磷酸酶(Solid-acid phosphatase,S-ACP)活性测定试剂盒

货号：MS2900 规格：100管/96样土壤酸性磷酸酶（Solid-acid phosphatase，S-ACP）活性测定试剂盒 微量法 注意：正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定。 测定意义： 土壤磷酸酶是一类催化土壤有机磷矿化的酶，其活性的高低直接影响着土壤中有机磷的分解转化及其生物有效性，是评价土壤磷素生物转化方向与强度的指标。土壤磷酸酶受到土壤碳、氮含量、有效磷含量和pH显著影响，根据最适pH范围，通常分为酸性、中性和碱性三种类型。 测定原理： 酸性环境中，S-ACP催化磷酸苯二钠水解生成苯酚和磷酸氢二钠，通过测定酚的生成量即可计算出S-ACP活性。 自备实验用品及仪器： 可见分光光度计/酶标仪、微量玻璃比色皿/96孔板、台式离心机、37℃恒温培养箱、分析天平、可调式移液器、冰、蒸馏水、乙醇和甲苯。 试剂组成和配制： 试剂一：液体×1瓶，4℃避光保存。 试剂二：粉剂×1瓶，4℃保存。用前加100mL蒸馏水充分溶解。 试剂三：液体×1瓶，4℃保存。 试剂四：粉剂×1支，4℃避光保存。临用前加576 μL无水乙醇（自备），24 μL蒸馏水充分溶解。（变褐色后不能再使用） 标准品：液体×1支，0.5μmol/mL苯酚标准液，4℃保存。 粗酶液提取： 称取风干混匀土壤约0.1g，加入50μL甲苯（自备），轻摇15min；加0.4 mL试剂一并且摇匀后，置于37℃恒温培养箱，开始计时，催化反应24h；到时后迅速加入1mL试剂二充分混匀，以终止酶催化的反应。8000g，25℃离心10min，取上清液置于冰上待测。 测定步骤： 1. 分光光度计/酶标仪预热30 min以上，调节波长到660 nm，蒸馏水调零。 2. 空白管：取微量玻璃比色皿/酶标板，加入10μL蒸馏水，20μL试剂三，4μL试剂四，充分混匀，显色后再加蒸馏水166μL，混匀后25℃静置30 min，于660 nm测定吸光度，记为A 空白管。 3. 标准管：取微量玻璃比色皿/酶标板，加入10μL标准液，20μL试剂三，4μL试剂四，充分混匀，显色后再加蒸馏水166μL，混匀后25℃静置30 min，于660 nm测定吸光度，记为A 标准管。 4. 测定管：取微量玻璃比色皿/酶标板，加入10μL上清液，20μL试剂三，4μL试剂四，充分混匀，显色后再加蒸馏水166μL，混匀后25℃静置30 min，于660 nm测定吸光度，记为A 测定管。 注意：空白管和标准管只需测定一次。 S-ACP活性计算公式： 第1页，共2页

实验三+酸性磷酸酶的组织器官定位

实验三植物体内酸性磷酸酶的组织定位 一、实验目的 1、掌握植物体内酸性磷酸酶的金属盐―铅法染色进行组织定位的原理与技术。 2、掌握制作徒手切片的技术。 二、实验原理 酸性磷酸酶(acid phosphatase，ACP)广泛分布于机体各种组织细胞内，主要存在于细胞的溶酶体内，常作为溶酶体的标志酶，此外，还存在于内质网和胞质内。在核酸和蛋白质代谢活动增加时，酸性磷酸酶活性增强。酸性磷酸酶还参与酯类代谢。因此，它在疾病、免疫反应和细胞损伤与修复过程中具有一定生物学意义。 酸性磷酸酶金属盐―铅法，其基本原理是在酸性环境下，底物β―甘油磷酸钠被酸性磷酸酶水解，释放出磷酸，磷酸遇铅离子则生成磷酸铅沉淀，最后与硫化铵作用形成棕褐色硫化铅沉淀。 三、实验材料、试剂和仪器 1、实验材料：甘蓝叶片与小白菜叶片。 2、实验试剂：丙酮、β―甘油磷酸钠溶液、2%硫化铵等。 3、实验用品：刀片、镊子、培养皿、托盘等。 四、实验步骤 1、甘蓝叶脉染色 （1）徒手切片的制作：在切片时，用左手的拇指与食指、中指夹住甘蓝叶脉，右手平稳地拿住刀片。然后，在材料的切面上均匀地滴上清水，以保持材料湿润。将刀口向内对着材料，并使刀片与材料切口基本上保持平行，自左前方向右后方均匀地拉切。当切到一定数量后，可在培养皿内挑选透明的薄片用于材料染色。 （2）将一部分材料薄片铺在载玻片上，滴加蒸馏水铺平材料，加入1滴冰的丙酮溶液，固定15min。固定完成后，用蒸馏水水洗，一边滴加蒸馏水，一边用吸水纸吸，反复2-3次。用滴管慢慢的将切片挑起来，放置在含有10ml的底物溶液中，37℃保温1h。将切片用蒸馏水水洗2~3次后，放置在含有2% 的硫化铵溶液中1-2min，蒸馏水水洗2-3次。将染色的切片盖上盖玻片，制作成临时玻片。显微镜下观察，拍照记录染色结果。 （3）将另一部分切片放置蒸馏水中加热用作空白对照。其余操作同上。 2、小白菜根系染色 （1）将小白菜的根系蒸馏水洗净后，用刀切开，一半用于组织染色，另一半放在蒸馏水中加热煮死，作为空白对照。 （2）将根系放置在含有冰的丙酮溶液中固定15min，用蒸馏水水洗2~3次。固定完

抗酒石酸酸性磷酸酶检测试剂盒(PNP比色法)

抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)检测试剂盒(PNP比色法)简介： 酸酸性磷酸酶(acid phosphatase，ACP)分布极广泛，遍布各种组织，主要存在于细胞的溶酶体内，所以常作为溶酶体标志酶。溶酶体外的酸性磷酸酶存在于内质网和胞质内，各种动物中的酸性磷酸酶各有不同，酸性磷酸酶适宜pH。存在于正常人肺泡巨噬细胞和白血病人脾脏的抗酒石酸酸性磷酸酶(Tartrate-resistnt acid phosphatase，TRAP)均在细胞滤泡中，并不是释放入血液，血液中的TRAP绝大多数来源于破骨细胞，因此可以通过测量血液中的TRAP了解破骨细胞的功能状态，几乎被认为是是机体破骨活性的唯一血液指标。TRAP一种糖基化的含金属蛋白酶，在破骨细胞(osteoclast)和破软骨细胞(chondroclast)中高表达，在活化的巨噬细胞和神经元中也有表达。 Leagene抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)检测试剂盒(PNP比色法)(Tartrate Resistnt Acid Phosphatase Colorimetric Assay Kit)检测原理是利用Para-nitrophenyl phosphate(pNPP)为一种常用的磷酸酶显色底物，在酸性条件下，可在酸性磷酸酶的作用下生成p-nitrophenol。在碱性条件下p-nitrophenol呈黄色，产物黄色越深，说明酸性磷酸酶活性越高，反之则酶活性越低，通过分光光度计测定吸光度，据此通过比色分析就可以计算出酸性磷酸酶活性水平。在适量的酒石酸存在的情况下进行酸性磷酸酶的活性检测，检测得到的酸性磷酸酶的活性就是抗酒石酸酸性磷酸酶的活性。该试剂盒可用于检测细胞或组织的裂解液或匀浆液、血浆、血清、尿液等样品中内源性的抗酒石酸酸性磷酸酯酶活性。该试剂盒仅用于科研领域，不宜用于临床诊断或其他用途。 组成： 自备材料： 1、比色杯 2、水浴锅或恒温箱 3、分光光度计编号 名称TE0045 60T Storage 试剂(A): ACP Assay buffer50ml 4℃ 试剂(B): pNPP 2支-20℃避光试剂(C): T artrate Solution 2ml 4℃ 试剂(D): p-nitrophenol(10mM) 0.2ml -20℃避光试剂(E): Stopping Solution 80ml RT 使用说明书1份

抗酒石酸酸性磷酸酶染色液说明书

抗酒石酸酸性磷酸酶染色液说明书 货号：G1492 规格：4×10ml/4×20ml 保存：-20℃避光，3个月 产品内容： 名称4×10ml4×20ml Storage 试剂(A):TRAP固定液50ml100ml4℃避光 试剂(B): TRAP孵育液B1:AS-BI Buffer1ml2×1ml-20℃避光B2:GBC染色液0.1ml0.2ml-20℃避光B3:TRAP Buffer9ml18ml RT避光 临用前，按B1:B2:B3=10:1:90混合，即为TRAP孵育液，即配即用。 试剂(C):苏木素染色液10ml20ml4℃避光 试剂(D):甲基绿染色液10ml20ml RT避光 产品说明： 酸性磷酸酶(acid phosphatase，ACP)分布极广泛，遍布各种组织，主要存在于细胞的溶酶体内，所以常作为溶酶体标志酶。溶酶体外的酸性磷酸酶存在于内质网和胞质内。各种动物中的酸性磷酸酶各有不同，酸性磷酸酶的适宜pH为4.5～5.5。存在于正常人肺泡巨噬细胞和白血病人脾脏的抗酒石酸酸性磷酸酶(Tartrate-resistnt acid phosphatase，TRAP)均在细胞滤泡中，并不是释放入血液。血液中的TRAP绝大多数来源于破骨细胞，因此可以通过测量血液中的TRAP了解破骨细胞的功能状态。 抗酒石酸酸性磷酸酶染色液以萘酚AS-BI为底物，在酸性pH下被酸性磷酸酶水解释放出磷酸和萘酚，萘酚与重氮盐偶联生成有色产物，定位于细胞质中，若细胞内的ACP有抗酒石酸的活性，则呈阳性反应。该染色液可用于新鲜血涂片、细胞涂片，亦可用于冰冻切片、石蜡切片。 自备材料： 1、蒸馏水、恒温箱 2、载玻片、推玻片

酸性磷酸酶(ACP)检测试剂盒(Folin-酚比色法)

酸性磷酸酶(ACP)检测试剂盒(Folin-酚比色法) 简介： 酸性磷酸酶(acid phosphatase ，ACP)分布极广泛，遍布各种组织，主要存在于细胞的溶酶体内，所以常作为溶酶体标志酶。溶酶体外的酸性磷酸酶存在于内质网和胞质内，各种动物中的酸性磷酸酶各有不同，酸性磷酸酶的适宜pH 为4.5～5.5。酸性磷酸酶是一个蛋白家族。 Leagen 酸性磷酸酶(ACP)检测试剂盒(Folin-酚比色法)(Acid Phosphatase Colorimetric Assay Kit)检测原理是以磷酸苯二钠作为底物，在酶促反应的最适条件下采用每隔一定时间测定产物生成量的方法，通过Folin-酚(又称福林酚)显色，于分光光度计680nm 处检测吸光度，以酶促反应时间为横坐标以产物生成量为纵坐标绘制进程曲线。曲线的起始部分在某一段时间内呈直线。该试剂盒主要用于组织的裂解液或匀浆液、血浆、血清、尿液等样品中内源性的酸性磷酸酯酶活性。该试剂盒仅用于科研领域，不宜用于临床诊断或其他用途。 组成： 自备材料： 1、 蒸馏水 2、 离心管或试管 3、 水浴锅 4、 比色杯 5、 分光光度计 操作步骤(仅供参考)： 1、 准备样品： ①血浆、血清和尿液样品：血浆、血清按照常规方法制备后可以直接用于本试剂盒的测定， 编号 名称 TE0029 50T Storage 试剂(A): Phenol(10mM) 1ml 4℃ 避光 试剂(B): 样品稀释液 100ml RT 试剂(C): ACP assay buffer 15ml -20℃ 避光 试剂(D): ACP 终止液 100ml RT 试剂(E): Folin-酚显色液 15ml 4℃ 避光 使用说明书 1份

凯基抗酒石酸酸性磷酸酶染液试剂盒

凯基抗酒石酸酸性磷酸酶染液试剂盒 KEYGEN tartrate-resistant acid phosohate stain，TRAP stain 说明书修订日期：2016.01.14 Cat number：KGA221 Store at4℃for3months For Research Use Only（科研专用） 一、检验原理 在酸性的缓冲液中，细胞内酸性磷酸酶催化底物水解，其生成物进而与一种稳定的重氮盐偶联，生成不溶性的偶氮染料沉淀，当底物中存在酒石酸时，该反应只出现在特异性细胞中。 二、试剂组成及配制 *简明试剂组成表 试剂组成试剂编号包装规格 一、固定液40ml×1瓶 二、底物液底物反应液（一）甲液①A粉×1支 ②B液500μL×1支 乙液③C粉×1支 ④D液，500μL×1支底物反应液（二）①E粉×1支 ②F液，500μL×1支 底物反应液（三）G液，1ml×1支 底物反应液（四）①H粉×1支 ②I液，500μL×1支 三、复染液苏木素10ml×1瓶 甲基绿10ml×1瓶 *具体试剂配制及操作 一、固定液：液体，40ml×1瓶 新鲜血涂片、细胞涂片或爬片、冰冻切片用固定液固定5~10min，石蜡包埋的切片经脱蜡后不需要再固定。 二、底物反应液（一）、（二）、（三）、（四）的组成及配制： 底物反应液（一）组成及配制： 组成：（1）A粉×1支（2）B液500μL×1支 （3）C粉×1支（4）D液500μL×1支 配制：临用前用移液器将B液吸入A粉中充分溶解配成甲液，备用。再用移液器将D液吸入C粉中充分溶

解配成乙液，备用。 最后将甲液与乙液混合成底物反应液（一），现用现配 底物反应液（二）组成及配制： 组成：（1）E粉×1支（2）F液500μL×1支 配制：临用前用移液器将F液吸入E粉中充分溶解配成底物反应液（二），备用。 底物反应液（三）： G液1ml×1支 底物反应液（四）组成及配制： 组成：（1）H粉×1支（2）I液1ml×1支 配制：临用前用移液器将I液吸入H粉中充分溶解配成底物反应液（四），备用。 底物孵育液的配制 染缸孵育液的准备： （1）将底物反应物（一），（二），（三），（四）的备用液混合并充分混匀， （2）先在染缸内加30ml蒸馏水，37℃水浴10分钟， （3）将底物反应物（一），（二），（三），（四）依次加入已预温的蒸馏水中， （4）然后将样本玻片固定，水洗后还未完全干，立即放入已经准备好的反应孵育液中，避光孵育60分钟。注：配置好的孵育液需现用现配，一次性用完，不可反复使用。 三、复染液： 苏木素液，10ml×1瓶 甲基绿液，10ml×1瓶 孵育完后，取出样本玻片水洗1~2分钟，在玻片尚未完全干之前进行复染。 可用苏木素复染1~2分钟，或用甲基绿复染2~3分钟，两者取其一。 三、染色结果 阳性反应为鲜红色或深红色颗粒，定位胞浆中。 四、玻片保存 样本玻片如需长期保存，苏木素复染可用中性树胶封片，甲基绿复染可用水性的甘油明胶封片。 五、所需仪器设备 光学显微镜、染缸、玻片、滴管、秒表、记号笔等。 六、样本染色前准备 血涂片及骨髓涂片的样本前处理 1、推片：取全血或骨髓3微升左右置载玻片上，将推玻片保持与载玻片30度角，置于血滴正前方，稍往后移与血滴接触，血滴沿推片下缘散开，再匀速沿载玻片平面平稳向前滑动，至血液铺完血膜为止。满意效果为不太薄，以免细胞太少，也不要太厚，以免太重叠。 2、晾干：使涂片在空气中自然晾干，再放入本试剂盒中的固定液内固定2~3分钟，水洗约30~60秒。 3、水洗后注意在不要太干时放入底物孵育液中37℃避光孵育60分钟（太干后染色效果欠佳） 石蜡切片的样本前处理 1、脱蜡：二甲苯中脱蜡5~10分钟，再换用新鲜的二甲苯，脱蜡5~10分钟。 2、下行入水：无水乙醇5分钟，再用90%、70%乙醇、蒸馏水各2分钟。