灰树花多糖对四氯化碳肝细胞损伤保护作用体外实验
灰树花多糖对四氯化碳肝细胞损伤保护作用体外实验
张媛媛1刘甜甜1李霞2辛华2
（山东大学医学院1.03级医学影像班(六年制) 2.细胞生物学研究所, 山东济南，
250012）
【摘要】目的：探讨灰树花多糖(GFP)对四氯化碳（CCl4）诱导的肝HepG2细胞损伤的保护作用。方法:培养肝HepG2细胞，用CCl4模拟肝损伤模型，将细胞分为正常组、CCl4损伤组和不同浓度的损伤保护组。用Ho3342和PI荧光探针双染技术、Giemsa、吖啶橙荧光染色等倒置相差显微镜观察肝细胞（HepG2）形态学变化，从形态学角度观察灰树花多糖对肝细胞损伤的保护作用；MTT法测定细胞活性，为灰树花多糖对肝细胞损伤有保护作用提供统计学支持。以及通过流式细胞术分析单个细胞的活性及对细胞周期各期的百分率及凋亡率分析。结果：形态学观察：正常组细胞轮廓清晰，形态良好，增殖分裂旺盛；损伤组有大量凋亡细胞，表面凹凸不平，有凋亡小体的形成，部分凋亡小体可从细胞上脱落；损伤保护组细胞形态较好，细胞呈梭形或者不规则的多边形，核圆形；从而可见灰树花对细胞有较明显的保护作用，并且有浓度依赖性，最佳的保护浓度为100μg/ml。最佳作用时间为损伤前12小时。结论：灰树花多糖对四氯化碳损伤的肝细胞（HepG2）有明显的保护作用。
【关键词】灰树花多糖；肝细胞（HepG2）；细胞凋亡；保护作用
The Eexperiment in vitro of Grifola Frondosa Polysaccharide Protection to Injury HepG2 Liver Cell by CCl4 【Abstract】Objective : To investigate protection of Grifola Frondosa Polysaccharide(GFP) to injury HepG2 liver cell. Methods:Culture the HepG2 cell, and build the injury model with CCl4. The cells are divided into there groups: normal control group , CCl4injuring group and Grifola Frondosa Polysaccharide prorective group（in different concentration）. Giemsa、Ho33342 and PI dual-labeling 、acridine orange(AO) staining provide morphology evidence to the protection of the Grifola Frondosa Polysaccharide. The protection of Grifola Frondosa Polysaccharide to injuryed HepG2 liver cell was investigated with MTT assay and flow cytometry
methods (FCM), to give statistics evidence. Conclusion:Observed in morphology : Cells in normal group have clear outline, and multiply well; the surfaces of cells in injury group are uneven. The apoptosis bodies form, some of which falled; the cells of protection group have good shape, cells’ forms fusiform ,and the nuclear are round, which show obvious protection to the injured cells. The protection action depends on the concentration. The best protection is 100ug/ml, and the best action time is 12 hours before injury. Conclusion：Grifola Frondosa Polysaccharide have obvious protection to CCL4 injuryed HepG2 liver cell.
【Key words】Grifola Frondosa Polysaccharide(GFP); HepG2 liver cell；Apoptosis; Protection.
前言
随着社会交往日益频繁和生活水平的不断提高，酒已成为餐桌上不可缺少的饮料。随之而来的是酒精性肝病发病率的上升。调查结果显示：我国每年有12％的酒精性脂肪肝患者发生肝硬化，在西方国家80％肝硬化是由于酒精中毒引起的。
近年来，天然植物在肝脏损伤防治方面的特殊疗效受到国内外众多学者的关注，灰树花多糖的保健功能及药用价值日益受到人们的重视。对灰树花菌丝体多糖理化性质及生物活性研究表明，该多糖具有细胞保护、清除氧自由基, 保护辐射受损小鼠，显著促进小鼠淋巴细胞增殖的生物活性功能，为我们开展肝脏损伤保护研究提供了重要信息。目前尚未见灰树花多糖对动物肝损伤保护作用的相关文献。
本课题组的体外预实验结果已经提示灰树花多糖对四氯化碳诱导的肝细胞损伤具有明显的保护作用，我们将以体外原代培养的新生鼠肝细胞为研究对象，用四氯化碳损伤方法建立体外肝细胞损伤模型，来探讨灰树花多糖对肝细胞损伤的保护作用，为发掘灰树花在肝损伤保护方面的作用提供实验依据。
一、材料和方法
1、材料
1.1 人肝癌细胞（HepG2）由山东大学医学院细胞生物学研究所提供。
1.2 试剂：灰树花多糖由济南澳利生物工程有限公司提供；、DMSO和CCl4、
MTT等染料、胰蛋白酶、RPM1640和DMEM培养液、小牛血清、MTT溶液、（5mg/ml）(Gibco公司)；DMSO（二甲基亚砜）；0.01%吖啶橙染液；Giemsa染液；PBS液（Ph7.0）;Carnoy固定液。24孔、96孔板及一次性塑料培养瓶、无菌滤器（注射器小滤器，抽滤大滤器等）。
2、方法
2.1 细胞培养
用含10%小牛血清的1640培养液，内含庆大霉素100IU/ml，pH7.0 ，37℃ 5%CO2 ，饱和湿度条件下静置培养实验细胞为对数生长期细胞，此阶段细胞状态良好，增殖分裂旺盛。
2.2 实验分组
将细胞分为正常组、CCl4损伤组和不同浓度的灰树花保护组。灰树花保护组分为不同的浓度，分别为50μg/ml 、100μg/ml、 200μg/ml、 400μg/ml。
2.3 CCl4损伤模型建立
在HepG2细胞对数生长期加入CCl4损伤液（DMSO和CCL4水溶液按一定比例配制），损伤浓度为6umol/ml。2小时后观察细胞，即可出现凋亡。
2.4 细胞凋亡形态学染色观察
人肝癌细胞HepG2接种于放有飞片的24孔培养板中，细胞浓度为6万/ml，培养24小时后加灰树花保护，浓度分别为50μg/ml 、100μg/ml、 200μg/ml、400μg/ml，作用12小时后加四氯化碳(CCl4)损伤（损伤浓度为6umol/ml）,损伤2～3个小时后取出飞片染色。
2.4.1 Giemsa染色法：
取出飞片自然晾干后入甲醛固定10min,滴加 Giemsa染液染色30min,蒸馏水轻轻冲洗，洗去浮色。充分干燥后二甲苯透明，最后用中性树胶封片。
2.4.2 吖啶橙染色法：
取出飞片充分干燥后入95%酒精固定10min，滴加0.01%吖啶橙染色5min，临时封片后荧光显微镜下观察。
2.4.3 Ho33342和PI荧光双染法：
取出飞片入凹槽，PBS轻轻漂洗两遍后滴加荧光染料Ho33342和PI，
37℃30min，荧光封片剂封片后荧光显微镜下观察。（激发光为紫外光）。
2.5 细胞凋亡形态学活体观察
人肝癌细胞HepG2接种于24孔培养板中，共分为4个实验组：空白组、正常组、损伤组，不同浓度灰树花保护组（浓度分别为50μg/ml 、100μg/ml 、200μg/ml、 400μg/ml）。每组设4个复孔。细胞浓度为6万/ml，培养24小时后加灰树花保护，作用12小时后加四氯化碳（CCl4）损伤（损伤浓度为6umol/ml），损伤2小时后于倒置相差显微镜下观察活体细胞形态学变化。
2.6 MTT法测细胞活力
人肝癌细胞HepG2接种于96孔培养板中，共分为4个实验组：空白组、正常组、损伤组，不同浓度灰树花保护组（浓度分别为50μg/ml 、100μg/ml 、200μg/ml、 400μg/ml）。每组设4个复孔。细胞浓度为6万/ml，培养24小时后加灰树花多糖保护，保护作用12小时后加四氯化碳（CCl4）损伤（损伤浓度为6umol/ml），损伤2小时后加MTT20ul(MTT浓度为5mg/ml),放入培养箱继续培养，四小时后取出培养板，吸净培养液后加入100ul二甲基亚砜（DMSO）,培养箱孵育20min,用全自动酶联仪测定每孔的吸光度（OD值），（测试波长570nm）。以下式计算试验组细胞的相对存活率，细胞相对存活率=（OD实验-OD空白/OD
对照-OD空白）×100%。
2.7 流式细胞术
HepG2细胞以6×104接种于25cm2培养瓶中，培养24小时后进行分组实验。实验分成三组(正常对照组，损伤组，灰树花保护组)，每组两瓶。，实验前换液，每瓶精确定量4.0ml培养液，保护组加入灰树花多糖(终浓度为100μg/ml)。静止培养12小时后，损伤组和损伤保护组分别加入CCl4溶液（浓度为6umol/ml），继续培养2小时后制备细胞悬液。
细胞悬液的制备：
分别收集各瓶培养液于试管中，在培养瓶中加入用0.25%胰蛋白酶消化，加入原培养液，吸管吹打分散细胞，1000r/min×8min离心收集细胞，移去上清液，600μlPBS悬浮细胞。加入含10μg/mlRNase的PI，4℃染色30min。经200目滤网过滤后上机检测。实验结果采用Modifit软件进行细胞周期各期的百分率及凋亡率分析。
二、实验结果
1、细胞形态学活体观察
1.1 倒置相差显微镜观察：正常人肝癌HepG2细胞在对数生长期，细胞呈梭形或者不规则的多边形，核圆形，约占细胞直径的1/2左右，细胞轮廓清晰;凋亡细胞表面凹凸不平，有凋亡小体的形成，部分凋亡小体可从细胞上脱落。
1.2 Giemsa染色观察：
正常人肝癌HepG2细胞核被染成蓝紫色，呈圆形，较大，细胞质成浅蓝色。凋亡细胞体积缩小，染色质边集成新月形或帽状，蓝紫色，有的核碎裂成多个块状。细胞周围有多个浅蓝色小泡或者球状小体，部分凋亡小体内染成蓝紫色的染色质小块。
1.3 吖啶橙荧光染色观察：
正常细胞核较大、圆形，DNA显示黄绿色荧光，细胞质均匀，RNA与核仁染色都显示橘红色荧光,细胞体积较大且铺展。凋亡细胞明显变小，核呈黄绿色，断裂为多个碎块状，碎裂的核由膜包裹着凸起于细胞表面呈黄绿色，其周围凋亡小体胞质发出橘红色荧光。
1.4 Ho33342和PI荧光双染观察：
正常细胞核较大，圆形，呈蓝色荧光，细胞质均匀，细胞体积大小一致。坏死细胞呈紫红色，细胞体积大小不一。凋亡细胞显示蓝色荧光，可见凋亡小体。凸起于细胞表面。
2、不同浓度灰树花多糖对损伤肝癌HepG2细胞保护作用
MTT法检测细胞的相对存活率提示：50μg/ml 、100μg/ml、 200μg/ml、400μg/ml灰树花多糖对CCl4损伤的肝癌HepG2细胞均有保护作用，且随着灰树花多糖浓度的增加出现抛物线的曲线，保护作用与时间和剂量相关。具体实验数据如下：
组别空白正常纯损伤保护
50
保护
100
保护
200
保护
400
A 0.133 0.209 0.21 0.2 0.22 0.201 0.195
B 0.149 0.211 0.174 0.179 0.2 0.203 0.197
C 0.14 0.216 0.159 0.161 0.22 0.2 0.22
D 0.179 0.255 0.143 0.192 0.215 0.22 0.2
平均0.150
25
0.222
75
0.1715 0.183
0.2137
5
0.206 0.203
相对存活率
0 1 0.293103 0.451724 0.875862 0.768966 0.727586 （注：相对存活率=（实验组－空白组）/（正常组－空白组）） 相对存活率
00.2
0.4
0.6
0.8
1
1.2
空白
正常
纯损伤
保护5
0保护10
0保护20
0保护400
不同组别相对存活率相对存活率
3、 流式细胞术 结果显示：正常组细胞凋亡率为0，损伤组凋亡率为9.29 %，损伤保护组（PGP 浓度为100μg/ml ）凋亡率为 6.10 %。各组细胞G1、G2、S 期细胞分布变化很小。结果显示PGP 对CCl 4损伤HepG2细胞有保护作用，对细胞周期没有影响（如图）
Diploid: 100.00 %
Dip G1: 70.50 % at
44.75
Dip G2: 10.36 % at
83.06
Dip S: 19.14 %
G2/G1: 1.86
Apoptosis: 0 % Diploid: 100.00 % Dip G1: 63.52 % at 38.02 Dip G2: 12.78 % at 72.50 Dip S: 23.70 % G2/G1: 1.91 Apoptosis: 9.29 % Diploid: 100.00 % Dip G1: 65.39 % at 39.72 Dip G2: 18.59 % at 72.11 Dip S: 16.02 % G2/G1: 1.82
Apoptosis:
6.10 %
三、讨论
中国的酒文化和酿酒工艺技术已有9000年历史，但酒精毒性对人体健康的损害以往研究很少，其机制研究在我国尚属空白。随着社会交往日益频繁和生活水平的不断提高，酒已成为餐桌上不可缺少的饮料。随之而来的是酒精性肝病发病率的上升。调查结果显示：我国每年有12％的酒精性脂肪肝患者发生肝硬化，在西方国家80％肝硬化是由于酒精中毒引起的。我国１２亿人口中，长期饮酒者已超过３亿，其中大约有8000万人为青少年。酒精性肝病正日益威胁人们的生命健康，如何降低酒精对人体健康的损害，是目前国内外医学研究的热点领域之一。迄今尚未发现特别令人满意的药物，所以寻找对酒精性肝病有预防、治疗作用的药物对临床应用具有重要的价值。
近年来，天然植物在肝脏损伤防治方面的特殊疗效受到国内外众多学者的关注，寻找可用于预防和治疗酒精性肝病的食、药兼用的天然植物，是开展肝脏损伤保护研究的重要途径。有文献报道，灰树花是一种生长在亚热带至温带的食、药兼用真菌。对从中提取的众多多糖组分的研究表明，虽然不同组分的化学结构及具体生理功能有所差异，但各组分的活性基础结构均为具有高度分支的β-1,3-葡聚糖和β-1,6-葡聚糖的多糖。[1]这些多糖具有保护辐射受损小鼠，促进小鼠淋巴细胞增殖，清除氧自由基等多项功能[2]，这为我们开展肝脏损伤保护研究提供了重要信息，但目前尚未见灰树花多糖对动物肝损伤保护作用的相关文献。
本实验采用人肝癌HepG2细胞株为研究对象。HepG2细胞株与人正常肝细胞有许多共同生理功能，不仅可替代肝细胞的代谢解毒功能，而且有在肝损害患者血浆中存活并生长的特性，被认为是较理想的肝细胞替代物。现已作为人正常肝细胞的替代细胞应用于基础研究，并已应用于临床作为人工肝的应用细胞。所以本实验以HepG2细胞株为研究对象，初步探讨PGP对肝细胞损伤保护作用研究本实验用四氯化碳(CCl4)诱导的肝细胞损伤模型，从细胞和分子水平探讨灰树花多糖在肝细胞损伤中的保护作用，为开展灰树花多糖在肝细胞损伤中保护作用中的分子机理研究打下了基础。
本实验初步验证了灰树花多糖对肝细胞损伤的保护作用，确定了灰树花多糖在体外对HepG2细胞有明显的损伤保护作用，最佳保护时间为损伤前12小时，最佳保护浓度为100μg/ml,其作用机理有待进一步深入探讨。为进一步研究PGP 对肝细胞的保护作用和机制提供了实验依据。
四参考文献
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茶多酚的抗氧化作用及其在食品中的应用
茶多酚的抗氧化作用及其在食品中的应用 摘要:茶多酚是一种天然的食品添加剂,本文介绍了茶多酚的成分和儿茶素的 结构,全面地综述了茶多酚的抗氧化性能茶多酚在油脂、肉制品加工和果蔬保鲜、糕点和糖果以及饮料生产等方面的发展和应用。 关键词:茶多酚;抗氧化作用;食品 Abstract: Tea polyphenols is a natural food additives, ingredients of tea polyphenols and catechin structure, a comprehensive overview of the antioxidant properties of tea polyphenols in tea polyphenols grease, meat processing, and aquatic preservation,the development and application of pastries and candy and beverage production. Key word: tea polyphenols;antioxidation;food 茶多酚是从茶叶中提取的纯天然多酚类物质,又叫茶单宁,茶鞣质,是茶叶中多酚类物质的总称。茶多酚主体成分是儿茶素,占茶叶干物量的20 %一30 % [1]。茶多酚分子结构中具有活泼的羟基氢能终止自由基的连锁反应,捕获过量的自由基,因此是一类理想的天然抗氧化剂。 1 茶多酚的性质和结构 茶多酚在碱性介质中极不稳定,在酸性中则稳定、耐热、与柠檬酸、苹果酸、酒石酸都有较好的协同作用。在潮湿的空气中能被氧化成棕色物,遇铁变成绿黑色络合物,与重金属盐溶液作用生成灰黄色沉淀,也能被高锰酸钾、硫酸铈等氧化剂氧化,与酒石酸铁生成红紫色络合物[2]。 茶多酚的主要成分按其化学结构可分为: 黄烷酮类、花色素类、黄酮醇类、 花白素类、酚酸及缩酚酸类等6类化合物。其中以黄烷酮类(主要是儿茶素类化合物)最为重要,占茶多酚总量的60% ~80% 。其次是黄酮类,其他酚类物质含量比较
32种菌类的功效
32种菌类的功效 菌类的营养价值十分丰富，含有较多的蛋白质，碳水化合物，维生素等等，还有微量元素和矿物质，多吃可增人体免疫力。 以下就为大家介绍32种营养美味的菌类植物的价值： 1、竹荪 富含人体必需多种矿物质和维生素，营养价值高，其特点是蛋白质高，脂肪低，对人的健康非常有利。具有健脾益胃、补气止痛和解腻减肥之功用，可 治疗弱症、伤症和咳嗽等病症，对降低高血压、高胆固醇等症有一定疗效。 2、杏鲍菇 具有追风散寒、舒筋活血、降低血压、降低血糖、降低胆固醇等功能。适宜于肠胃功能衰退、高血压、高血脂、高胆固醇等病人食用。 U n R e g i s t e r e d
3、草菇 富含维生素C，常吃草菇，可促进新陈代谢，加速伤口愈合，草菇中含有的异蛋白可抑制癌细胞生长，主要用于消化道肿瘤。能加强肝、肾的活力，保护肝脏功能，增强机体免疫力，减少体内胆固醇含量，对预防高血压、冠心病有益、有解毒、滋阴壮阳、抗坏血病、健胃功效。 4、牛肝菌 具有提高免疫力、增加巨噬细胞吞噬、抵制肿瘤活性、抗流感病毒、舒筋 活血、补虚提神等方面功能。适宜感冒咳嗽、食积、脘腹胀满、水肿病人食 用。 5、滑子菇 U n R e g i s t e r e d
所含粗蛋白质高于香菇，并富含丰富的多糖、乳酸与甲酸等成分。具有抑制肿瘤活性等功能，是一种低热量、低脂肪的保健食品。 6、姬松茸 富含丰富的多糖，如丙三醇、甘露醇、葡萄糖、海藻糖等，营养价值极 高，具有抗癌、抗凝血、降血脂、安神等方面的功能。 7、灵芝 灵芝所含多糖物质可加速核酸与蛋白质的代谢，促进造血，增强体质；增 加冠状动脉血流量，降低心肌耗氧量，增强心肌收缩力，对抗动脉粥样硬化形成，可升高白血球的数量，有镇静和镇痛作用，有镇咳、祛痰和平喘的作用；可保护肝脏、降低血清丙谷转氨酶，促进肝细胞再生;显著降低血清醛缩酶，有抗癌和抗衰老作用。 U n R e g i s t e r e d
(完整版)植物化学保护试验指导
农 药 学 植物化学保护 实验指导 华南热带农业大学植物保护学 院 二○○三年十一月 编 者 骆焱平 杨 叶
前言 本实验指导是在九七年编写的《植物化学保护实验指导》的基础上，根据华南热带农业大学二OO二年制定的专业课程教学计划和实验课程教学大纲的要求进行修订的。该书在原实验指导的基础上，经过增加实验项目、补充并修改部分内容后完成。全书共分为三大部分：第一部分介绍农药方面的基本知识，要求学生掌握常见农药的配制方法和鉴别方法；第二部分介绍农药的室内生物测定技术，即利用有害生物（或称靶标生物），如昆虫、螨类、病菌、线虫、杂草、鼠类等对农药的反应来测定农药的毒力和药效的基本方法；第三部分介绍农药的田间药效试验。本书以《农药学》、《植物化学保护》为理论基础，是植物保护专业的必修课程，也是一门实用性强的技术课程。通过实验，可验证、巩固和充实理论教学，加深学生对理论知识的理解，增强学生对病虫方面的实践操作能力，以便在生产和科研上合理利用不同的测定方法，开发新农药，新剂型，新的施药方法。 本书可作为《农药学》、《植物化学保护》、《农药生物测定技术》、《农药剂型与加工》等课程的实验指导。因此更名为《农药实验指导》。本实验指导的任务是： 1、采取实验教学的方法，加深学生对理论课的理解，掌握实验中的一般技术。
2、注意与有关学科的配合，如昆虫学、病理学、生物学、化学、统计学等学科的衔接。 3、突出学生的创新能力。 尽管我们付出了许多汗水，但由于时间仓促，加上编者水平有限，难免会出现一些缺点和错误，希望大家批评指正，并提出宝贵的意见和建议，以便逐步完善。 化保教研组 二○○三年十一月
灰树花栽培与管理
灰树花 灰树花（Grifola frondosa）又名莲花菌、千佛菌、栗蘑、舞茸，属担子菌亚门、层菌纲、非褶菌目、多孔菌科、树花菌属。灰树花具有松蕈芳香，肉质柔嫩，菇体内富含铁、铜、维他命C、硒、铬、灰树花多糖(Grifolan)，具有明显的抗肿瘤功能，可治小便不利、水肿、脚气、肝硬化腹水及糖尿病等，是非常珍贵的食药兼用真菌，被誉为“真菌之王，抗癌奇葩”。 一、生长发育条件 （一）营养 灰树花是木腐菌，杂木屑、棉籽壳、蔗渣、稻草、豆秆、玉米芯等可作为碳源。有机氮最适宜菌丝生长，几乎不能利用硝态氮，生产中常添加玉米粉、麸皮、大豆粉等增加氮源。维生素B1是子实体正常生长发育必不可少的营养物质。（二）温度 灰树花是中温型菌类，菌丝体生长温度范围为5-32℃,最适温度为20-25℃，菌丝耐低温能力较强，能在零下196℃的液态氮中保存数年。原基形成的适宜温度为18-22℃，子实体生长发育的温度范围为10-25℃，最适温度18-23℃，但因菌株不同有所差异。 （三）水份与湿度 菌丝体生长阶段，培养料的含水量为60-65％，含水量过低出花不整齐，过高则菌丝体分泌黄水过多，影响子实体发生。子实体生长期需要充足的水份，空气相对湿度应保持在85 -90 ％，湿度过低，子实体极易失水枯死，湿度过高，菇体易腐烂受细菌感染。 （四）空气 灰树花属强好气性真菌，不论在菌丝生长阶段还是在子实体发生阶段都需要充足的氧气，通气不足，菌丝细弱，分枝少，子实体生长迟缓、不分化，菌盖开片难，并易污染杂菌，因此培养室要注意通风换气，保证空气新鲜，子实体生长阶段要注意调节通风与保湿二者的矛盾。 （五）光照 灰树花菌丝生长阶段对光线要求不敏感，光照强度为15-50勒克斯即可，过强的光线影响菌丝生长。子实体生长需要较强散射光或稀疏直射光，适宜光照强度为200-500勒克斯，光线不仅影响子实体颜色、形状、成活率，还可以影响菇体香味，散射光越强，香味越浓，品质越好；光线不足，子实体分化困难，色泽浅，产量低，质量差，甚至不出菇。 （六）pH 值 灰树花适宜在微酸性环境中生长，适宜PH 值为5.5-6.5。 二、栽培时间 灰树花菌丝生长较慢，栽培袋发满菌需50-65天，而出菇期对温度要求较高，在选择自然环境条件下出菇时，应安排妥当出菇期，算准装袋时间，栽培袋制作应在出菇期向前推70天左右。华北地区主要在春秋两季的适宜出菇期进行栽培，春栽应在1-3月制种发菌，4-6月出菇；秋栽6-8月制种发菌，9-11月出菇。灰树花的菌丝具有较强的抗衰能力，在低温季节提前排袋，可使菌丝连接紧密，充分吸收养分，出菇势强，提高产量。 三、栽培方法与管理 （一）菌种制作
附保护第三人作用之合同研究(一)
附保护第三人作用之合同研究(一) 摘要]附保护第三人作用之合同突破合同相对性原理，使与合同当事人有特殊关系的第三人能够基于合同获得损害赔偿。本文对附保护第三人作用之合同的起源、适用条件等问题作了探讨，并对我国是否借鉴此制度发表了意见。 关键词]合同合同效力德国民法 附保护第三人作用之合同，是指特定合同一经成立，不仅在合同当事人双方间产生权利义务关系，同时，债务人对于与债权人具有特殊关系的第三人，也应负有照顾、保护、通知等附随义务，债务人违反此项义务时，就该特定范围之人所遭受的损害，也应依照合同法的原则，负赔偿责任。换言之，即特定合同关系兼具保护第三人的作用。（注：王泽鉴：《民法学说与判例研究》（第二册），中国政法大学出版社1998年版，第34页、第39页。）在我国附保护第三人作用之合同尚未上升为法律，其在处理某些纠纷中具有特殊的作用，本文试就附保护第三人作用之合同制度的有关问题加以探讨。 一、附保护第三人作用之合同制度的起源探究 “附保护第三人作用之契约”系由德国判例学说孕育而成。德国判例肯定这一合同形态，系基于如下的理念：当事人默示契约兼为第三人之利益而订定，该第三人与契约约定之给付自有息息相关之关系，契约当事人对于该第三人乃有尽必要“注意”之义务。该注意义务为契约之义务，义务一有不尽，即构成违约。第三人如因而受有损害，自有予以赔偿之必要，为达此目的，自应许可该第三人得直接请求赔偿损害。（注：（台）曾世雄：《损害赔偿法原理》，三民书局股份有限公司1996年版，第275、273页。）实际上，契约订定时，名义上之当事人虽为甲乙双方，而实际上该契约之履行否仍关及甲乙以外之第三人丙丁，如依契约意旨第三人丙丁之利益亦应受保护，于契约未被履行时，该第三人倘受有损害仍以可请求赔偿为宜。（注：（台）曾世雄：《损害赔偿法原理》，三民书局股份有限公司1996年版，第275、273页。）德国判例学说最初创设此项制度，适用德国民典第328条为第三人利益契约条款的规定作为当事人请求权基础，其主要目的在于弥补德国民法典雇主责任制度的不足，加强保护与债权人具有特殊关系的第三人的利益。德国帝国法院1930年2月10日的判例堪称此说运用的典范，该案的案情是：承租人M太太委请修理行安装煤气表，由于修理行雇员的重大过失（其中一螺丝没有拧紧），酿成爆炸事故，未伤及M太太，却致其所雇女佣身体上部受重伤。依其他国家法律，于此种情形该女佣无疑可以对修理行主张侵权损害赔偿，而且修理行亦应对其雇员在职务范围内的行为负严格责任。但在德国，依德国民法典第831条，雇主可以通过证明自己对雇员之选任监督已尽相当的注意义务而免责，而在实务上关于此项免责举证，向来均从宽认定；显然，该女佣主张侵权损害赔偿甚为不利。然而，根据德国民法典第278条的规定，假若对雇主主张契约法上损害赔偿责任，则雇主不得以证明自己尽了选任和监督义务而免责。正是基于上述考虑，上诉法院遂确认M太太与修理行之承揽契约乃为第三人利益契约，受害女佣（原告）据此第三人利益契约可以对修理行（被告）主张损害赔偿。（注：王文钦：《德国法上“附保护第三人作用之契约”制度的新发展》，《中外法学》1994年第2期。） 帝国法院肯定上诉法院所持的原告为为第三人利益契约中第三人的见解，认为：契约的解释，应当以契约的目的、当事人的意图、交易的性质为依据。本案中，依《德国民法典》第628条，承租人M太太对原告之祸福负有注意义务。被告应该意识到，契约当事人M太太不但有权要求煤气表安装适当，而且有权要求不能对其本人及其依法对之祸福负责之人的身体健康造成损害。依《德国民法典》第157条，M太太与修理行的承揽契约，应当解释为已包含赋予第三人直接的损害赔偿请求权这一内容。因此，根据《德国民法典》第328、278条的规定，帝国法院判决原告胜诉。 帝国法院将《德国民法典》第328条为第三人利益契约条款作为原告请求权的基础，遭到了
解读亚健康和慢性病
各位伙伴、各位朋友大家好： 今天，要和大家谈一个健康的话题，拥有健康不等于拥有一切，但失去健康将失去一切。世界教科文组织对全世界人民的忠告是：健康是“1”，其他的都是“0”，健康就是财富，健康就是幸福。在对待健康的观念上，好多人觉得自己没有病，更不需要去预防；觉得自己有点小病也没有什么，认为很多疾病需要长期治疗或终生治疗，所以就把健康交给了医生。其实健康不仅仅是身体没有疾病，还要有完整的生理、心理状态和社会适应能力。大部分人都知道健康的重要，却不知道如何去掌握自己的健康，最重要的原因是缺乏健康知识，大部分人只知道爱吃什么，却不知道该吃什么，更不知道吃与健康有何关系，有位营养学家说得好，如果你吃的对，根本不需要看医生，如果你吃的不对，医生也救不了你！所以说大多数人不是死于疾病，而是死于无知！ 健康观念的落后和现代人生活方式的改变，使得亚健康和慢性病成为社会的普遍现象。在我国居民健康状况调查中发现，健康人占5%，疾病占20%，亚健康占75%，大部分人处于亚健康状态，亚健康是非常可怕的，长期的亚健康会发展成为慢性病而且可能致人突然死亡。社会的迅速发展给人们造成了巨大的精神压力，使得人们经常处于高度紧张的状态，精神压力对机体的伤害是非常大的，精神压力会造成失眠，会产生疲劳综合症、免疫力下降、免疫失调、高血压等慢性疾病;我们的工农业发达了，高科技进步了，但它是用惨痛的代价——重污染换来的，我们呼吸空气污染、吃粮食化肥污染、吃水果蔬菜农药污染，51.6%的儿童铅超标铅中毒，交通警察的平均寿命47岁，白领阶层6年前的平均寿命是58.52岁，近几年他们的平均寿命降到了52.52岁。由于这些重污染引起来的文明病、现代病，靠传统的中西医已经感觉力不从心，束手无策，世界食品药品检测组织美国的FDA最近宣布，靠传统中
压风机安全保护试验规定
压风机安全保护试验规定 由电检修工进行试验，当班司机监督，每天对在用机做事故功能保护测试（测试时先把在用机打至全卸荷位置，测试结果在用机停机，电机高压柜分闸为合格），对备用机做故障功能保护测试（测试结果为报警电铃响为合格），测试结束后及时将保护试验界面恢复原状态。 1、安全阀 每天试验一次，由机检修工试验，操作工监督，安全阀可靠动作为合格。 2、一、二级排气超温保护 试验时在工控机上用鼠标点到保护试验界面，将鼠标点到“1级排气温度＞155”、“2级排气温度＞155”时发出报警电铃响不停车为合格；将鼠标点到“1级排气温度＞160”、“2级排气温度＞160”时停车、电动机高压开关柜分闸为合格。 3、一、二级排气超压保护 试验时在工控机上用鼠标点到保护试验界面，将鼠标点到“1级排气压力＞0.22”、“2级排气压力＞0.7”时发出报警电铃响不停车为合格；将鼠标点到“1级排气压力＞0.24”、“2级排气压力＞0.8”时停车、电动机高压开关柜分闸为合格。 4、润滑油压力保护 试验时在工控机上用鼠标点到保护试验界面，将鼠标点到“润滑油压＜0.18”时发出报警电铃响不停车为合格；将鼠标点到“润滑油压＜0.15”时停车、电动机高压开关柜分闸为合格。 5、断水保护 试验时在工控机上用鼠标点到保护试验界面，将鼠标点到“冷却水进水压力＜0.12”时发出报警电铃响不停车为合格；将鼠标点到“冷却水进水压力＜0.1”时停车、电动机高压开关柜分闸为合格。 6、润滑油温度保护 试验时在工控机上用鼠标点到保护试验界面，将鼠标点到“润滑油温度＞65”时发出报警电铃响不停车为合格；将鼠标点到“润滑油温度＞70”时停车、电动机高压开关柜分闸为合格。 7、后冷却器排气温度保护 试验时在工控机上用鼠标点到保护试验界面，将鼠标点到“后冷却器排气温度＞80”时发出报警电铃响不停车为合格；将鼠标点到“后冷却器排气温度＞100”时停车、电动机高压开关柜分闸为合格。 8、储气罐温度保护 试验时在工控机上用鼠标点到保护试验界面，将鼠标点到“储气罐温度＞60”时发出报警电铃响不停车为合格；将鼠标点到“储气罐温度＞100”时停车、电动机高压开关柜分闸为合格。
肾保护作用药物的研究新进展详解
肾保护作用药物的研究新进展 近年来，慢性肾脏病(chronic kidney disease，CKD)及其引起的终未期肾病(end—sfage renal disease，ESRD)在全球的发病率逐年提高。美国第三次健康营养调查数据(NHANESⅢ)显示，20岁以上人群CKD患病率高达11％：尿毒症患者心血管疾病病死率则是普通人群的35倍。我国广州市城区普通人群流行病学凋查结果显示，CKD的患病率高达为10．1％。CKD具有患病率高、医疗费用巨大、易合并心血管疾病而导致病死率、致残率高等特点。因此，不论为肾功能正常还是患有CKD的患者处方药物时，临床医师都应关注并使用具有肾保护作用的药物，使患者长期药物治疗的获益最优化。本综述对具有肾保护作用的中西成药进行总结，为临床药物治疗提供依据，促进合理用药。 1 活性维生素D 维生素D通过多种途径减少蛋白尿，降低甲状旁腺激素(parathy-roid hormone，PTH)水平，降低CKD患者心血管事件的发生率和死亡率，抑制肾脏纤维化，延缓CKD向终末期肾脏病的发展。 1．1 对CKD蛋白尿的影响 活性维生素D通过作用于肾素-血管紧张素系统(reninangiotensinsystem，RAS)发挥降蛋白尿的作用。Fishbon S等对61例CKD蛋白尿>400mg／d的患者给予活性维生素D制剂和安慰剂治疗观察6个月，研究结果发现，维生素D治疗组患者的蛋白尿下降了17．6％。另一项对CKD3-5期非透析患者随访调查结果显示，应用骨化三醇后，患者蛋白尿减少。 1．2 对CKD心血管事件发生率和患者生存率的影响 CKD维生素D缺乏者心血管事件死亡率及总死亡率较非维生素D缺乏者死亡风险明显增高。Sugiura等研究结果发现，CKD患者骨化三醇治疗24周，心血管事件的发生率较对照组明显减少。另外一项帕立骨化三醇临床对照试验结果发现，患者口服帕立骨化三醇48周后，左心室容积指数明显下降。Wolf等对5万多例CKD透析患者生存率的调查结果发现，给予活性维生素D制剂患者2年生存率提高26％。 2抗高血压药 2．1 血管紧张素转化酶抑制剂(angiotertsin converting enzyme inhibitor，ACEI)或血管紧张素受体拮抗剂(angiotensin receptorinhibitor，ARB) 目前，已经明确ACEI或ARB类降乐药能够降低尿蛋白、保护肾功能。国内、外治疗指南也将ACEI及ARB列为高血压病合并肾损害患者的首选降压药。大量临床研究结果显示，ACEI 对非糖尿病肾病有明确的肾脏保护作用。REIN研究结果证实，雷米普利可延缓非糖尿病肾病患者肾功能的进展。而对于糖尿病肾病(diabetic nephropathy，DN)患者，其结果并不完全一致。有6项研究观察了352例2型糖尿病患者，结果发现ACEI降蛋白尿作用明显优于其他降压药。Ruggenenti等报道雷米普利在2型DN患者未出现延缓肾功能不全的进展的作用。RENAAL研
灰树花种植基地建设可行性研究报告
可行性研究报告
####灰树花种植基地建设项目可行性研 究报告 一、项目概况 灰树花属食、药兼用蕈菌，夏秋间常野生于栗树周围，又名贝叶多孔菌、舞茸、千佛菌、栗子蘑、莲花菇等，属多孔菌科树花菌。灰树花具有松蕈样芳香、肉质柔嫩、味如鸡丝、脆似玉兰等特点，被我国较早权威专著《中国的真菌》所采用，灰树花便成为比较通用的汉语名称。据农业部质量检测中心分析专家介绍，灰树花具有蛋白质，氨基酸、多糖、锌、硒等多种微量元素，营养和口味胜过号称菇中之王的香菇，能烹调成多种美味佳肴，被誉为“食用菌王子”。近年研究发现，灰树花具有抗癌和免疫增强作用，并具有抗高血压，降低血糖和血脂及抗各类肝炎病毒；对糖尿病、水肿、脚气病、小便不利、动脉硬化、脑血栓、肥胖、预防贫血、坏血病、白癜风等症有显著疗效。 近年日本相关文献也报导研究结果：灰树花由于富含铁、铜和维他命C，具有抑制高血压和肥胖症的功效，它能预防贫血、坏血病、白癜风，防止动脉硬化和脑血栓的发生；灰树花的硒和铬含量较高，有保护肝脏、胰脏，预防肝硬化和糖尿病的作用；高含量的维生素E 和硒配合，使之能抗衰老、增强记忆力和灵敏度。近年来，我国科学家和日本科学家都发现了灰树花作为抗癌药源的功效，较高的硒含量有抗御癌症的作用，尤其是所含灰树花多糖(Grifolan)，以β-葡聚
糖(glucan)为主，其中抗癌活性最强，带6条支链的β-(1，3)-葡聚糖占相当大的比重。已经面市的香菇多糖(Lentinan，日本的PSK,)、云芝多糖 (上海的PSP)等有更强的抗癌能力。日本福岛核事故以来，一方面是惧怕核污染种植和水产业，使日本灰树花生产量急剧锐减；另一方面则是需要灰树花作为保健食品和抗癌药物的原料，由此推动市场需求的增大和消费的增加。 由于野生资源的匮乏和产量的急剧减少，导致对灰树花的需求源源大于供给。灰树花生长条件需要在海拔800米以上，日降水量在200毫升的山区或丘陵地区适宜生长，因此国内虽然在浙江、河北、山东、福建、吉林、四川等地都有商业化栽培，但因环境因素，除浙江、河北发展得好外，其余地区生长较一般。 2002-2011年，我国食用菌产量年增长率达到18.97%，其中2010年实现销售1500亿元，出口23亿美圆。随着食用菌的食品和药品两个方向需求、国际国内两个市场的发展，以灰树花为代表的珍稀食用菌需求强劲。为满足市场需求，充分利用######适宜的气候条件，建设年产灰树花200万棒、年产灰树花菌棒500万棒的农业产业化基地。 项目完成后，将实现年销售收入8600万元，年企业利润2830万元，上缴所得税700万元，企业净利润2130万元。项目将带动500户农户进行生产，实现1500多名农民就业，经济和社会效益显著。 二、企业基本情况 ##有限公司##珍稀食用菌研发分公司是##有限公司在##设立的独立法人分支机构，专门从事“####灰树花种植基地建设”和灰树花
各种保护性试验
一、皮带机保护装置试验方法： 1、防滑保护装置 防滑保护装置试验方法：将滚轮提起使其脱离皮带表面，胶带输送机应能自动停机。 2、堆煤保护 堆煤保护试验方法：胶带输送机正常运行时，人为的推动堆煤保护传感器触头，使保护动作，以胶带输送机自动停机为正常。 3、跑偏保护 跑偏保护试验方法：带式输送机正常运行时，人为的推动跑偏传感器的滚动导杆，在延时5-10s后限位开关动作，以能自动停机为正常。 4、.撕裂保护装置 撕裂保护试验方法：带式输送机正常运行时，人为的用手轻轻压按传感器传感面，以能自动停机为正常。 5、温度保护装置和烟雾保护装置 温度传感器和烟雾传感器皮带运行前检查一次（每天一次），使用单位检查后温度和烟雾保护装置损坏，及时通知机电队检查处理或更换。 二、煤电钻综保保护性试验方法： 将煤电钻综保电源开关（隔离开关）闭合，此时绿色指示灯亮，同时煤电钻空载运行，然后按下位于机壳侧方的试验按钮（下方第二个按钮，红色）。若漏电保护功能正常时，煤电钻停止运行，煤电钻综保则红色指示灯给出发光信号指示。若再次进行试验时，将隔离刀
闸瞬间分断后再闭合，以便解除线路中的闭锁作用。若按下试验按钮后，红色指示灯不亮，在指示灯供电系统无故障的情况下，则说明漏电保护失灵，应查出原因并处理正常后方可使用。 三、照明综保保护性试验方法： 将照明综保电源开关（隔离开关）闭合，此时绿色指示灯亮，照明灯正常运行后，然后按下位于机壳侧方的漏电试验按钮（上下按钮的上方按钮，红色）。若漏电保护功能正常时，照明灯熄灭，则红色指示灯给出发光信号指示，再次进行试验时，将隔离刀闸瞬间分断后再闭合，以便解除线路中的闭锁作用。若按下试验按钮后，红色指示灯不亮，在指示灯供电系统无故障的情况下，则说明漏电保护失灵，应查出原因并处理正常后方可使用。
植物多糖的研究现状和发展展望
植物多糖的研究现状和发展展望 摘要：本文阐述了植物多糖提取分离纯化主要的方法，简要叙述了植物多糖生物活性的研究现状，并对植物多糖未来的研究方向进行了建议。 关键词：植物多糖，研究现状，发展展望 Abstract: This paper describes the plant polysaccharide extraction separation purification method, briefly describes theresearch status of biological activities of plant polysaccharide,and some suggestions for future research direction of plant polysaccharides. Keywords: plant polysaccharide,research situation, development prospect 多糖研究开始于20世纪40年代，经过几十年的努力人们对于多糖这一类重要的生命物质有了较为深刻的认识，也使这一学科成为当今生命科学研究最为活跃的领域之一。多糖根据来源可分为动物多糖、植物多糖、微生物多糖，广泛存在于动植物体内和微生物的细胞壁中。植物多糖因其来源广泛，无细胞毒性，应用生命体后毒副作用小、药物质量可通过化学手段进行控制等优点成为当今新药及功能性保健食品和绿色食品添加剂发展的新方向。目前对于植物多糖的研究大体分可分为以下几个方面：植物多糖的测定、植物多糖生物活性的研究、植物多糖的应用。 1、植物多糖的测定 植物多糖的测定包括提取和分离纯化的研究、植物多糖的纯度鉴定及相对分子量的测定、植物多糖的含量测定、植物多糖的结构分析。 1.1提取及分离纯化 1.1.1提取 由于大多数植物多糖都是极性大分子化合物，对于植物多糖的提取通常是用水、盐或者稀酸液、稀碱液在不同温度下进行提取。采用不同溶剂提取的多糖成分不同，其生物活性也有较大差异。 水提醇沉法提取多糖操作简单且效果较佳，在中药有效成分提取中应用已久，大多是作为澄清液体的一种方法，但由于其提取多糖纯度不高，且随着新的活性多糖的发现，水提醇沉法的单独使用已难以满足提取要求。而有些多糖更适合用酸碱溶液进行提取，但是需对酸碱度进行严格的控制以防酸碱度过高使多糖糖苷键被破坏而失去生理活性，且容易引入杂质，这一操作要求提高了提取操作和后续分离的复杂性，限制了应用范围。总体来说，从成本及操作安全方面来看，溶剂提取多糖中水法提取更为简单宜用。 现在随着科学技术的发展，酶法提取、微波提取法、超声提取法等新兴提取方法也开始广泛应用于多糖提取中。 酶提取法是利用酶对细胞结构的破坏作用，是存在于细胞内部的多糖释放出来，从而提高多糖的提取率。在使用酶提取多糖的过程中，酶可降低提取条件，在温和的条件下分解植物组织，加速多糖的释放或提取。植物中除含有多糖外，还含有一定量的蛋白质、淀粉、胶质、粗纤维及脂肪，使用酶还可分解提取液中的这些物质，从而有利于多糖的分离和纯化。酶提取法多糖具有条件温和、杂质易除、提取率高和生物活性高等特点。常用的酶有蛋白酶、纤维素酶、果胶酶等。在实际使用酶对多糖提取操作时，有时根据提取物质的不同和多糖提取难易度将几种酶结合起来共同使用，可大大提高提取率，这种方法称为复合酶提取法。超声波提取法是利用超声辐射产生的空化作用、机械作用和热学作用对植物细胞进行破碎，之后再用水醇沉法对多糖进行提取，这一方法及有效缩短了提取时间又提高了多糖提取率。微波提取法是一种新型萃取技术，利用高频电磁波穿透萃取介质，细胞液吸收微波能，细胞内温度迅速升高，压力增大，使细胞壁破裂，有效成分被释放出来进入溶剂中，从而被提取。
有一个美丽的传说—灰树花
一、多糖研究的历史背景 人类对多糖的研究与蛋白和核酸同步，但糖链的结构比核算和蛋白质复杂，核酸是由4种核苷酸组成的2条支链状结构，蛋白质是由20种氨基酸构成的链状和环状结构。而糖链是由单糖组成的4—5条链扭结在一起，而且结合方式多样，还带有复杂的分支机构。由这种复杂的寡糖结构构成的糖缀合物，其结构就更为复杂。由于人们早期只把多糖看做细胞结构成分与事物能源，而使人类对多糖的研究远远落后于蛋白质与核酸。以多糖结构、功能和药用研究为核心的糖工程被认为是继蛋白质工程、基因工程后生物化学和分子生物学领域中最后一个巨大的科学前沿。如同20世纪是蛋白质和核酸时代一样，21世纪应当 是“多糖生命科学”的时代。 糖工程是继20世纪70年代基因工程，80年代蛋白质工程，而于90年代 发展起来的一个新的科学技术领域。它是以糖生物学的最新知识为依据，研究提高糖链在应用领域的实用价值并使之实用化的一门新兴科学。我国对多糖的研究起步比较晚，始于20世纪70年代，但近年来发展迅速，研究对象涉及真菌类、地衣类、植物、花粉和动物等。研究的范围包括多糖的分离纯化、结构分析、理化性质、免疫学、药理学以及治疗应用等，对其免疫增强作用机制的研究已深入倒分子和受体水平。研究的方法涉及化学、生物学和医药学等诸多领域。1969年日本发现（真菌）多糖具有抗肿瘤活性。1996年美国能源部创建了复合糖类研究中心，建立了复合糖类数据库重要作用。 二、多糖药物学 糖、蛋白质和核酸是涉及生命活动本质的三类重要生物分子。糖不仅可以以多糖或游离寡糖的形式直接参与生命过程，而且可以作为糖复合物，如糖蛋白，蛋白多糖及糖脂等参与许多重要的生命活动。此外，糖复合物还与许多疾病，如癌症、细菌和病毒感染等疾病有密切关系。由于糖分子自身的结构特点，使得对糖的研究工作非常复杂。因此，有关糖类生化的研究远落后于其生物活性研究。对糖类的研究特别是作为药物研究与对蛋白质和核酸的研究工作相比，无论是在我国还是在国外都还处于“初级阶段”。完全阐明了作用机制并应用于临床的多糖类药物为数不多。 近十几年来，糖类结构测定技术快速发展和作用机制研究不断深入，发现了糖类的作用远不止为生物活动的能源和组织结构的材料，还在生命活动中发挥重要作用。人类大约有40亿—50亿个细胞，这些细胞又组成了许许多多的 细胞集团。每个集团的细胞以不同方式相互黏附，细胞和基质之间也存在着相互识别和相互作用。集团之间又相互识别、相互作用和相互制约，调节和控制着高等生物沿着固有的空间轴和时间轴并燃有序地发展。在如此复杂的发展过程中所需的极其巨大的“生物信息”只能由所含信息量比核酸和蛋白质大几个数量级的糖链分子来承担。这就导致了“糖生物学”和“糖工程学”的诞生，并引发了一场研究糖和多糖生物活性和药理作用以及应用多糖制备抗炎和抗癌药物的全球运动。 随着现代医学研究的进步、糖类合成化学和结构鉴定技术的发展，人们逐步认识到寡糖和多糖作为信息分子调控许多生命历程。现代科学研究发现，在细胞发展过程中，糖类分子决定两个相反的基本细胞操作过程：一是正确地保持自身免疫防御体系（抗细菌和抗病毒感染）；二是当细胞脱轨、出现自身免疫疾病或癌症时，细胞表面的糖分子就改变结构和组成。从天然药物中提取分离出的多糖成分大多为免疫调节，可以提高机体免疫功能，产生抗肿瘤、抗病
PPARγ的神经保护作用研究进展
?９２? 文章编号：１６７１—２８９７（２０１０）０９—０９２—０３ ＰＰＡＲ一、／的神经保护作用研究进展 ?综述? 邓永兵１唐文渊２’（１重庆市急救医疗中心神经外科，重庆４０００１４；２重庆医科大学第一附属医院神经外科，重庆４０００１６） 关键词ＰＰＡＲ－ｒ；脑损伤；神经保护 中国图书资料分类号Ｒ７４１．０５文献标识码Ａ 过氧化物酶体增殖物激活受体（ｐｅｒｏｘｉｓｏｍｅｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｏｒ－ａｃｔｉｖａｔｅｄｒｅｃｅｐｔｏｒｓ，ＰＰＡＲｓ）是配体活化的核转录因子，属Ⅱ犁核受体超家族成员之一，有仅、Ｂ、Ｙ３种亚型。ＰＰＡＲ＾ｙ在１９９０年由Ｉｓｓｅｍａｎ等首次发现存在于脂肪细胞的分化调控通路中，故又称为脂激活转录冈子。该受体被其配体激活后町以和特异的ＤＮＡ反应元件结合，调控多种基因的转录和表达，参与体内多种牛理和病理过程，如ｌＩＩＬ糖调节、脂肪代谢…。研究表明ＰＰＡＲ．、／的激活能促进神经细胞的分化和成熟，参与神经细胞程序性夕匕亡，近年研究也发现ＰＰＡＲｙ的激活与神经细胞的炎症和氧化应激有关１２１。本文就ＰＰＡＲ＾ｙ激活后的神经保护作用作一综述。 一、中枢神经系统急慢性损伤及炎症反应 炎症反应对于组织修复，细胞再生起着重要作用，但失控的炎症反应将会导致大餐细胞夕Ｅ亡。在中枢神经系统缺血、创伤和慢性退行性疾病巾，炎症反应导致大嚣细胞凋亡，引起继发性损伤，加重神经功能损害。 血脑屏障的内皮细胞是中枢神经系统炎症反应的蓖要调控兀件。炎症反应时，由于粘附分子表达增加，促使白细胞聚集于内皮细胞，导致血脑屏障破坏，白细胞渗入脑实质。渗入的白细胞（嗜中性粒细胞和臣噬细胞）可激活小胶质细胞、星形胶质细胞、少突胶质细胞，产牛大萤的炎症介质，如细胞因子、趋化因了、前列腺素类物质、氧自由基等，这些物质将加重神经细胞损伤ｐ１。 研究表明，短暂性脑缺血可使细胞因子表达增加，如肿瘤坏死冈子．ｄ（ｔｕｍｏｒｎｅｃｒｏｓｉｓｆａｃｔｏｒ．ａｌｐｈａ，ＴＮＦ．ａ）、白细胞介素．１ｐ（ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ一１ｂｅｔａ，ＩＬ－ＩＢ），细胞圜子同时也使如细胞内粘附分子一１（ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒａｄｈｅｓｉｏｎｍｏｌｅｃｕｌｅ．１，ＩＣＡＭ．１）、整联蛋白等粘附分子表达增加。这些粘附分子可促进白细胞在血管壁聚集和粘附，最后渗入脑组织中ＨＪ。激活的ｎ噬细胞、小胶质细胞释放的趋化因子，如单核细胞趋化蛋白．１（ｍｏｎｏｃｙｔｅｃｈｅｍｏａｔｔｒａｃｔａｎｔｐｒｏｔｅｉｎ一１，ＭＣＰ－！）等，诱导和加强ｒ粘附分子与白细胞间的相互作用，在白细胞浸入脑实质过程中起着重要作用‘５１。 氧化活性物质已被证实是缺血再灌注损伤后早期反应元 作者简介：邓永兵，主治医师，电话：（０２３）６３６９２１５２，Ｅ．ｍａｉｌ：ｄｙｂ０９１３＠１２６．ｃｏｒｎ ＋通讯作者：唐文渊，教授、主任医师，电话：（０２３）８９０１１１５２件之一。血管闭塞导致其周围组织缺氧，损害组织有氧代谢。扰乱细胞代谢平衡，同时，线粒体中氧化磷酸化过程受到抑制，各种代谢产物堆积，直接或间接地导致细胞损害。缺血后再灌注虽恢复Ｊ，脑组织的供氧，恢复ｒ细胞代谢平衡，但同时也使氧、氮自由基表达Ｉ：调，使脑组织发生强烈氧化应激反应，脂质过氧化反应和ＤＮＡ损伤旧Ｊ。 二、激活的ＰＰＡＲｌ抗炎、抗氧化作用机制 炎症基冈表达是炎症反应发牛的第一步，通过减弱炎症基因表达、增强抗炎基因表达就能在炎症反应初始阶段减弱炎症反应，从而减轻炎症反应引起的继发性损伤。研究证实，ＰＰＡＲ＾ｙ被其配体嚷唑烷二酮类药物（ｔｈｉａｚｏｌｉｄｉｎｅｄｉｏｎｅｓ，ＴＺＤｓ）激活后，能直接阻止细胞因子的信号传导通路，抑制小胶质细胞的激活，减少嗜中性粒细胞、巨噬细胞的渗入，减弱炎症基冈的表达，增强抗氧化酶的活性和增加热休克蛋白的表达，发挥财神经组织、细胞的保护作用¨Ｊ。 ＰＰＡＲＴ可通过以卜．信号转导途径抑制炎症反应和氧化应激反应。①ＰＰＡＲｌ活化的途径：ＰＰＡＲ７直接与配体结合，配体调节ＰＰＡＲｌ磷酸化状态并参与有丝分裂原激活蛋白激酶（ｍｉｔｏｇｅｎ．ａｃｔｉｖａｔｅｄｐｒｏｔｅｉｎｋｉｎａｓｅ，ＭＡＲＫ）和Ｐ１３Ｋ活性调节；②ＰＰＡＲｌ激活和调节靶基因转录表达途径：包括配体激活ＰＰＡＲ＾ｙ、活化ＰＰＡＲ＾ｙ与ＰＰＡＲｙ反应元件（ｐｅｒｏｘｉｓｏｍｅｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｏｒｒｅｓｐｏｎｓｅｅｌｅｍｅｎｔ，ＰＰＲＥ）相互作用，通过调节基冈转录和翻译等生物学效应参与脂类代谢，细胞增殖、分化和凋亡等；③ＰＰＡＲ７影响其他转录因子及信号途径：如在炎症反应中竞争抑制核因子一ｋａｐｐａＢ（ｎｕｃｌｅａｒｆａｃｔｏｒ—ｋａｐｐａＢ，ＮＦ－ＫＢ）、ＪＡＫ—ＳＴＡＴ（Ｊａｎｕｓｋｉｎａｓｅ－ｓｉｇｎａｌｔｒａｎｓｄｕｃｅｒａｎｄａｃｔｉｖａｔｏｒｏｆｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ）等途径。 三、ＰＰＡＲｙ在脑缺血、缺ＪｌＩＬ再灌注损伤中的作用 近年来，国内外大量研究表明ｔＰＰＡＲ－ｙ激活后对脑缺血及其再灌注损伤后有脑保护作用，其保护作用机制主要与抑制炎症反应，抑制氧化应激反应，抑制细胞凋亡等有关。 研究发现在小鼠脑缺血模型中，采用ＰＰＡＲ７激动剂罗格列酮治疗能显著增加内皮细胞中一氧化氮合酶的表达，促进血管的再生，增加脑组织对缺血的耐受性，显著减少脑梗死面积，明显改善神经功能预后评分，而应用ＰＰＡＲｌ拈抗荆ＧＷ９６６２却显著增加了梗死面积川。ＰＰＡＲｌ激动剂皮格列酮治疗成年鼠脑缺血模型，在缺血半球中，小胶质细胞、巨噬细胞渗入减少，环氧化酶．２（ｃｙｃｌｏｏｘｙｇｅｎａｓｅ，ＣＯＸ－２）、诱导型一氧化氮合酶（ｉｎｄｕｃｉｂｌｅｎｉｔｒｉｃｏｘｉｄｅｓｙｎｔｈ船ｅ，ｉＮＯＳ）、ＩＬ—ｌ１３等炎症 万方数据
多酚抗氧化性的研究进展(张云丽)
植物多酚抗氧化性的研究进展及其运用 摘要：植物多酚( 植物单宁) 是一类广泛存在于植物体内的重要的天然产物，叙述了多酚的抗氧化性及多酚在国内外食品工业、医药保健、日用化学品等方面的应用现状, 展望了多酚在国际市场上的广阔前景。 关键词: 植物多酚；抗氧化性； 植物多酚（Plant polyphenol）又名植物单宁（Vegetable tannin），为植物体内的复杂酚类次生代谢物，具有多元酚结构，主要存在于植物的皮、根、叶、果中，在植物中的含量仅次于纤维素、半纤维素和木质素。植物多酚(polyphenol)是多羟基苯，如苯二酚、苯三酚等。植物多酚是在植物性食物中发现的、具有潜在促进健康作用的化合物。由于其羟基取代的高反应性和吞噬自由基的能力而具有很好的抗氧化活性【1】酚类化合物是众所周知的抗氧化剂。主要有黄酮类、多 酚类、多糖类和维生素类等。近年来研究发现，一些农业、食品工业副产品（如茶叶、花生壳、柑橘类果皮、果汁残渣等）的提取物中也含有丰富的多酚类物质，其中有些提取物中多酚含量很高。因此来自农业和食品工业副产品的植物多酚将成为保健食品、医药、化妆品等行业的重点开发研究对象【2-3】。 一、植物多酚研究利用的化学基础 人类最初对植物中所含多酚类化合物的利用, 是将其用于鞣制皮革, 并将这类化合物称为植物单宁( vegetable tannins)。按照White和Bate-Smith 的定义, 植物单宁是指分子量在500—3000 范围内的具有鞣性的多元酚。1981年,Haslam 提出了植物多酚这一术语,它包括单宁及相关化合物( 如单宁的前体化合物和单宁的聚合物)。这一名称能更全面地概括这类天然产物的特点, 也符合各学科领域的实际研究情况,因而被人们广泛采用。植物多酚的化学研究始于18世纪末。其结构复杂, 化学性质活泼,并且常以大量性质相似的同系物的混合物形式存在, 因此本世纪30 年代以前,多酚化学的进展一直非常缓慢。植物多酚的科学分类方法直到1920 年才由Freudenberg 提出,即根据化学结构不同,植物多酚分为水解单宁( 酸酯类多酚) 和缩合单宁( 黄烷醇类多酚或原花色素)。前者主要是酸及其衍生物与多元醇以酯键或甙键形成,可细分为单宁和鞣花单宁两类。后者主要是羟基黄烷醇类单体的缩合物, 单体间以C—C 键相连如图1所示。[4]
西地那非对阿霉素心肌病的保护作用的实验研究
西地那非对阿霉素心肌病的保护作用的实验研究 摘要目的探讨西地那非对小鼠阿霉素所致心肌病的保护作用及其机制。方法选取32只雄性10周龄C57BL/6J小鼠，随机分为阿霉素组（DOX组）与阿霉素加西地那非组（DOX+SIL组），每组16只。DOX组单一腹腔内注射阿霉素15 mg/kg；DOX+SIL组单一腹腔内注射阿霉素的同时，给予西地那非10 mg/kg 灌胃。正常饲养2周后计算存活小鼠心室体重比，并对其进行心脏超声检查；采用酶联免疫吸附试验（ELISA）法检测心肌组织中环磷酸鸟苷（cGMP）的表达情况。结果2周后DOX组存活16只小鼠，DOX+SIL组存活16只小鼠，DOX组心室体重比、左室舒张末期内径（LVEDD）、左室收缩末期内径（LVESD）、左室射血分数（LVEF）和短轴缩短率（FS）、cGMP分别为（0.41±0.15）%、（3.270±0.260）mm、（2.560±0.097）mm、（47.90±0.01）%、（18.53±1.10）%、（0.051±0.006）mmol/L，与DOX+SIL组的（0.32±0.05）%、（2.900±0.180）mm、（2.180±0.120）mm、（53.70±0.16）%、（26.50±1.70）%、（0.940±0.006）mmol/L比较差异均具有统计学意义（P＜0.05）。结论西地那非对阿霉素所致心肌病具有保护作用，可能通过cGMP通路，明显改善阿霉素诱导的小鼠左心室功能障碍。 关键词阿霉素；心肌病；西地那非；纤维化 【Abstract】Objective To investigate the protective effect of sildenafil on doxorubicin induced cardiomyopathy in mice and its mechanism. Methods A total of 32 male 10 week old C57BL/6J mice were randomly divided into doxorubicin group （DOX group）and doxorubicin and sildenafil group （DOX+SIL group），with 16 mice in each group. DOX group received single intraperitoneal injection of doxorubicin 15 mg/kg，and DOX+SIL group received gavage administration of sildenafil 10 mg/kg，on the basis of intraperitoneal injection of doxorubicin. After 2 weeks of normal feeding，ventricular weight ratio of the surviving mice was calculated and the heart ultrasonic examination was performed. The expression of cyclic guanosine monophosphate （cGMP）in the myocardium was detected by enzyme linked immunosorbent assay （ELISA）. Results After 2 weeks，DOX group had survived mice，and DOX+SIL group had survived mice. DOX group had statistically significant difference in ventricular weight ratio，left ventricular end diastolic diameter （LVEDD），left ventricular end systolic diameter （LVESD），left ventricular ejection fraction （LVEF）and fraction shortening （FS）and cGMP respectively as （0.41±0.15）%，（3.270±0.260）mm，（2.560±0.097）mm，（47.90±0.01）%，（18.53±1.10）% and （0.051±0.006）mmol/L，comparing with （0.32±0.05）%，（2.900±0.180）mm，（2.180±0.120）mm，（53.70±0.16）%，（26.50±1.70）% and （0.940±0.006）mmol/L in DOX+SIL group （P＜0.05）. Conclusion Sildenafil shows protective effect for doxorubicin induced cardiomyopathy，ang it can significantly improve doxorubicin induced left ventricular dysfunction in mice through the cGMP pathway.