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基因工程笔记

绪论

第一节基因工程的诞生

第二节基因工程的安全性

第三节基因工程的应用

第四节基因工程技术的商业化发展

一、定义

※ Genetic engineering：

?在体外将核酸分子

?插入病毒, 质粒或其它载体系统中 ,构成遗传物质的新组合

?再整合到那些本来不含该类物质的宿主中

?从而形成一种新的可连续繁殖的有机体

＆就是有意识地把一个生物体中有用的目的基因转入另一个生物体中，使后者获得新的遗传性状或表达所需要的产物。

※Clone:从一个共同祖先无性繁殖下来的一群遗传上同一的DNA分子、细胞或个体所组成的特殊的生命群体。

二、特征

1. 跨物种性外源基因到另一种不同的生物细胞内进行繁殖。

2. 无性扩增外源DNA在寄主细胞内可大量扩增，和高水平表达。

三、基因工程的主要操作内容（供体、受体、载体是重组DNA技术的三大基本元件）

1. 目的基因的获取：从复杂的生物基因组中，经

过酶切消化或PCR扩增等步骤，分离出带

有目的基因的DNA片断。

2. 重组体的制备：将目的基因的DNA片断插入到

能自我复制并带有选择性标记（抗菌素抗性）的载体

分子上。

3.重组体的转化;将重组体（载体）转入适当的

受体细胞中。

4.克隆鉴定:挑选转化成功的细胞克隆（含有目的

基因）

5.目的基因表达:使导入寄主细胞的目的基因表

达出我们所需要的基因产物。

安全性

一、基因工程的安全措施

（1）实验室的物理安全

① P1级实验室一般装备良好的普通微生物实验室。

② P2 级实验室在P1级实验室的基础上还装备有负压的安全操作柜。

③ P3 级实验室全负压的实验室，同时装备安全操作柜

④ P4级实验室专用的实验大楼，周围与其它建筑物应有隔离带。

具有最高安全防护措施

（2）实验室的生物安全（分3 级（大肠杆菌）：EK1—EK3级。）

EK1：在自然环境中一般都要死亡。

EK2：在自然环境中无法存活。

EK3；应该是失去了自我迁移的能力。

（3）载体的安全

应该是失去了自我迁移的能力。不会自动从“安全”的菌株转移到“不安全”的菌株中。（容易构建）。如pMB9，pBR322等

基因工程的应用 ppt 20页左右

第一章基因操作的主要技术原理

第一节 DNA的提取与纯化

第二节 DNA的凝胶电泳

第三节核酸的分子杂交

第四节基因扩增技术---PCR

第五节 DNA序列分析

第六节酵母双杂交系统

DNA的提取与纯化 DNA的提纯有很多方法。其中最常用的是碱抽提法。

原理

闭合环状的质粒DNA，在变性后不会分离，复性快；

染色体线性DNA和或有缺口的质粒DNA变性后双链分离，难以复性而形成缠绕的结构，与蛋白质—SDS复合物结合在一起，在离心的时候沉淀下去。

所用的试剂作用

①溶菌酶能水解菌体细胞壁的主要化学成分肽聚糖中的 -1，4糖苷键。在碱性条

件（pH>8）下有活性

②葡萄糖增加溶液的粘度，维持渗透压，防止DNA受机械力（震荡）的作用而降解

③ EDTA Mg2+、Ca 2+的螯合剂，可抑制DNA酶的活性，防止DNA被酶降解。

④NaOH-SDS NaOH：强碱，提供pH>12的碱性条件，使DNA双链变性。SDS: 溶解细胞

膜蛋白和细胞内蛋白，并结合成“蛋白—SDS”复合物，使蛋白质（包括DNA酶）变性沉淀。

⑤ NaAc-HAc缓冲液冰醋酸把醋酸钠溶液的pH调到4.8。用来中和NaOH变性液，使

DNA复性，高浓度的NaAc有利于变性的大分子（蛋白质、DNA、RNA等）沉淀

⑥乙醇用于沉淀DNA ，DNA分子以水合状态“溶于”水里，乙醇能夺去DNA分子的水环境。

⑦ RNase A 降解RNA渣滓。以免提取后的DNA中含有小分子的RNA。

⑧ TE缓冲液：DNA保存液。由Tris-HCl和EDTA配制Tris-HCl不含金属离子（不同

于磷酸缓冲液或硼酸缓冲液），有利于以后操作；EDTA抑制DNA酶，防止DNA被酶降解

⑨酚-氯仿（选用）蛋白变性剂，进一步抽提DNA溶液中的蛋白质，使蛋白质沉淀。

但苯酚会残留在DNA溶液中。

提取质粒DNA的步骤

溶菌破膜蛋白质和DNA变性中和离心除去沉淀纯化DNA 沉淀DNA

溶菌：使用“溶液Ⅰ”溶解细菌细胞壁。

溶液Ⅰ：

50mM葡萄糖，

25mM Tris-HCl(pH8.0)，

10mM EDTA，

4-5mg/ml溶菌酶，

RNase A

溶液II

0.2N NaOH，1.0%SDS

溶液III

3M 醋酸钠（用冰醋酸调pH至4.8）

影响质粒DNA产量的因素

◆菌株的遗传背景，

◆质粒自身的拷贝数

DNA的定量和纯度测定

1. 紫外光谱法（DNA（或 RNA）在260nm波长处有

特异的紫外吸收峰。蛋白质280）

2. 琼脂糖凝胶电泳估计（溴化乙锭（EB）能插入DNA

分子中，紫外光照射下能发红色荧

光与已知浓度的DNA电泳带荧光强度

对比，就可以估计出DNA含量。）

DNA分子量的估计

一般使用琼脂糖凝胶电泳，与已知分子量的DNA标准混合液对比得知。Marker

???

?????????

?电压的大小胶的浓度外因构象、极性

分子大小、带电量、

内因：1. 带电荷的分子在电场中会以一定的速率向与其电荷性质相反的电极移动，速度称为移率。

2. 电泳迁移率同电场的强度和分子本身所带的净电荷数目成正比。

3. 电泳迁移率同分子与介质的摩擦系数成反比。

电场条件相同分子在电场中迁移的速度主要取决于分子本身的大小和形状。闭合环状卷曲超螺旋迁移最快，线性分子次之，伸展开环状最慢。

琼脂糖凝胶电泳（空隙大小决定其分辨分子大小的能力。）

聚丙烯酰胺凝胶电泳优点是比琼脂糖凝胶的分辨率高的多。辨别一个碱基差迁移速率影响因素核酸的分子杂交

DNA-DNA 或DNA-RNA 链杂交。用放射性同位素（32P 或125I ）标记的DNA 或RNA 探针。

探针的标记：

原理:

Southern杂交：

Northern blot：用DNA（或RNA）探针检

测RNA样品。

Western blot：Western杂交的总体过程

也与Southern 杂交相似，只不过在Blotting 过程中转移的是蛋白质而不是 DNA ，这种将蛋白质样品从 SDS-PAGE 凝胶通过电转移方式转移到滤膜的方法，称为 Western blotting 。

几种核酸分子杂交比较

作用材料目的

Southern杂交 DNA 判断某生物样品中是否含有某一基

因。

Northern blot RNA 检测细胞或组织样品中是否存在与

探针同源的 mRNA 分子，从而判断

在转录水平上某基因是否表达。Western blot 蛋白 Western 杂交主要用来检测细胞或

组织样品中是否存在能被某抗体

识别的蛋白质，从而判断在翻译水

平上某基因是否表达。

原位杂交：对应的菌斑或噬菌斑位置不变，可以直接找出阳性菌落（原位杂交就是将细菌菌落影印到滤膜上，或将菌种点种在滤膜上然后再生长出可见的菌落，对滤膜上的菌体进行原位裂解使DNA 释放出来，并使之固定在滤膜上。然后通过分子杂交，判断哪个或哪些菌落含有与探针同源的DNA 。菌落杂交主要用来从用质粒或Cosmid 构建的基因文库中寻找阳性克隆子，当得到阳性克隆子后，再通过Southern 杂交进一步验证。通过这种方法在一张直径为9cm 的滤膜上，可检测成几百到一千甚至上万个菌落，达到高通量筛选的目的。）

72oC 2min

斑点杂交：斑点杂交是分子杂交中最简单的一种，直接将 DNA 或 RNA 分子以斑点的形

式固定在滤膜上，然后进行分子杂交。

第四节基因扩增技术---PCR

基因扩增指生物体内或体外人工方式使基因拷贝数大规模增加。有下列五种方式

?基因的程序性扩增环境诱发扩增进行前先95oC 5min 2. PCR 技术的原理 PCR 的过程：（1）第一步变性（denature ）94-95 oC 下5分钟模板DNA 双链完全变性

成单链。

（2）第二步复性（anneal ）50-60 oC 下1分钟，引物优先与模板复性。优先的原因是因为引物的浓度高，链短

（3）第三步延伸（extend ）72 oC 下1-2分钟，Taq DNA 聚合酶在引物的

3‘端上加上核苷酸。

（4）第四步变性（denature ）94 oC 下1分钟，新合成的DNA 双链又变性

成单链模板。

（5）第五步重复（repeat ）

反应体系：（注意添加顺序，考虑经济原则）

Dd 水 10*buffer 氯化镁 dNTPS PRIME TAQ 酶模板影响 PCR 的因素（1）Taq DNA 聚合酶 ① 热稳定性② 最适温度高③ Taq 酶的功能缺点：具5’→3’

聚合酶活性和5’→3’外切酶活性，但没有3‘→5’外切酶活性。因此不能修复错误的碱基配对（合成超过600bp 长度的DNA 就有可能出现错配，用于克隆基因时必须测序）④ Taq DNA 聚合酶的激活剂：当dNTP （能结合Mg2+）的浓度为0.7-0.8mmol/L 时，MgCl2的最佳浓度应是2.0mmol/L 。需做正交试验得到结果。（2）引物（primer) ①位置与待扩增的模板DNA 区段的两3’端序列互补（ 5‘端

相同）的短DNA 。②引物的长度一般引物设计为长15—30bp （按概率与特异性计算得到）③引物的碱基序列：3‘端必须与模板正确配对，5’端可以不配对。5’端另有很多作用④引物的碱基组成：尽可能提高G+C 含量，以提高引物与模板的结合力避免连续相同碱基排列或内部回文序列

（形成发夹结构）； ⑤引物的Tm 值：原始按照计算公式计算，现程序设计。

套嵌引物（nested primers) 设计多组引物，结合位点依次位于前一组引物之间。增加扩增产物的特异性。

（3）dNTPs 一般反应体系中dNTP 混合液终浓度用0.2mmol/L 。浓度过高会抑制Taq

DNA 聚合酶的活性并增加错配率。

（4）模板（template ）① 纯度：但不能有蛋白质变性剂、DNA 酶、Mg2+的螯合剂等

影响DNA 聚合酶的活性。② 模板的量：不能太多，100μl 反应体系中100ng 足够。

PCR 技术的扩展

PCR 技术的应用

（1）扩增某一段DNA （2）基因的体外诱变（3）基因组的比较研究 DNA 序列分析

一、双脱氧链终止法

双脱氧核苷酸分子的脱氧核糖的 3' 位置的 -OH 缺失。当它与其他正常核苷酸混合在同一个扩增反应体系中时，在 DNA 多聚酶的作用下，虽然它也能够

象正常核苷酸一样参与 DNA 合成，以其 5' 位置的磷酸基，与上位脱氧核苷酸的 3' 位置的 -OH 结合，但是，由于它自身 3' 位置 -OH 的缺失，至使下位核苷酸的 5' 磷酸基无法与之结合。

1. 原理（1）DNA 复制是以一条链为模板，按碱基配对的原则进行的。

（2）脱氧核糖的连接是以3’ 5’磷酸二脂键。（3）复制反应可以在体外进行。

（4）2’和3’双脱氧的ddNTP 会使复制反应终止。

技术要点：（1）制备单链DNA 模板（2）特殊的DNA 多聚酶

（3）制备2’和3’双脱氧的ddNTP 。dNTP / ddNTP = 100 / 1 （4）制备一小段单链引物（DNA 或RNA ）带有放射性或荧光标记

批注：

①不能有5’3’和3’5’的外切酶活性；

②与模板的亲和力高，不会提前脱离模板。（高保真）。

还有很多测序方法：见ppt 。留意自动测序。

第二章基因工程的酶学基础

一、(II 类)限制性内切酶

（1）识别位点 4—8bp ，回文结构

（2）（3）切割位点（识别位置处）切开双链DNA 。end ）或平齐末端（blunt end ）。

（4）粘性末端（sticky ends ，cohensive ends ）：①

（如EcoR I 切点）或① 3’端凸出（如EcoR I 切点）

（5）同尾酶(Isocaudamers ）识别的序列不同，但能切出相同的粘性末端。如Bam H I 、

Bgl Ⅱ、Bcl I 、Xho Ⅱ等（同尾酶的粘性末端互相结合后形成的新位点一般不能再被原来的酶识别。）

? DNA 末端长度对限制酶切割的影响：限制酶切割 DNA 时对识别序列两端的非识别序

列有长度的要求，也就是说在识别序列两端必须有一定数量的核苷酸，否则限制酶将难以发挥切割活性

? 位点偏爱（Site preference ）某些限制酶对同一介质中的有些位点表现出偏爱性

切割，即对不同位置的同一个识别序列表现出不同的切割效率的现象称作位点偏爱。

? 星号（*）活性在极端非标准条件下，限制酶能切割与识别序列相似的序列，这

个改变的特殊性称星号（*）活性。 ▲ ：酶切反应条件;

（1）缓冲液的化学组成

MgCl2、NaCl/KCl ：提供Mg2+和离子强度；

ris-HCl ：维持pH ；

二硫苏糖醇（DTT ）：保持酶稳定性；牛血清白蛋白BSA 等：有助于酶的稳定；温度：不同的限制性内切酶的最适反应温度不同。大多数是37 oC ，少数要求40-65oC 。反应时间：反应时间通常为1小时或更多，许多酶延长反应时间可减少酶的用量。终止酶切的方法：EDTA + 加热 + 苯酚

EDTA 可鏊合镁离子，从而可终止酶切反应，终止浓度为 10mM ；加热是常用的方法，对于最佳反应温度为 37℃ 的酶，在 65℃ 或 80℃ 处理 20 分钟可使酶活性大部分丧失。对于在 80℃ 作用 20 分钟也有不失活的酶可用苯酚抽提去除蛋白，或用试剂盒纯化 DNA 。

▲ 完全消化与局部消化 1）、完全消化：内切酶在DNA 上的所有识别位点都被切开。 2）、局部消化：只有有限数量的酶切位点被切开。 ▲ 影响限制性内切酶活性的因素:

外因：外因是可预见和控制的，如反应条件、底物的纯度（是否有杂质、是否有盐酚的

污染）、何时加酶、操作是否恰当、反应体积的选择以及反应时间的长短等等内因：内因包括位点偏爱性、甲基化底物、底物的构象。构象的影响主要指切割线性 DNA

和超螺旋 DNA 时的活性，如与切割 DNA 相比， EcoR Ⅰ、Pst Ⅰ、Sal Ⅰ 需要至少 2.5-10 倍的酶来切割 pBR322 的超螺旋 DNA ▲ 位点偏爱（Site preference ）

某些限制酶对同一介质中的有些位点表现出偏爱性切割，即对不同位置的同一个识别序列表现出不同的切割效率的现象称作位点偏爱。二、连接酶

两种DNA 连接酶大肠杆菌连接酶 T4噬菌体连接酶

只能连接粘性末端。不但能连接粘性末端，还能连接

齐平末端。

??非接合型质粒接合型质粒

?拷贝数多

松弛型质粒拷贝数少

严紧型质粒------

◎连接条件：（1）必须是两条双链DNA （2）DNA3’端有游离的-OH ， 5’端有一个磷酸基团（P ）（3）需要能量

▲ 连接反应的温度：最佳温度为37度但实际温度为4-16度。（考虑到氢键的稳定性）影响连接反应的因素：

1、插入片段与载体的浓度比例（10-20倍）增加机会。防止自连

2、反应温度 4-16 三、修饰酶

▲ 末端脱氧核苷酸转移酶

用途：1.同聚物加尾给外源DNA 片断和载体分子分别加上互补的同聚物尾巴，以使它们有效地连接。（2）再生酶切位点（3）非放射性标记DNA 片断的3’端 ▲ 碱性磷酸酶分类（1）细菌性碱性磷酸酶（2）小牛肠碱性磷酸酶碱性磷酸酶的功能 1）防止线性化的载体份子自我连接

第三章基因工程的载体

载体：在基因工程操作中，把能携带外源DNA 进入受体细胞的DNA 分子叫载体

基因工程对载体有哪些要求：（1）在宿主细胞内能独立复制。（2）有选择性标记。

（3）有一段多克隆位点。外源DNA 插入其中不影响载体的复制。（4）分子量小，拷贝数多。

（5）容易从宿主细胞中分离纯化。一、质粒型载体

质粒（plasmid ）是独立于染色体以外的能自双链闭合环状DNA 分子。

质粒的类型（大肠杆菌中）

质粒的复制类型

质粒的选择标记及其工作原理

氨苄青霉素抗性（Ampr ）

卡那霉素抗性（Kanr ）四环素抗（Tetr ）

链霉素抗性（Strr ）

氯霉素抗性（Cmlr）

有关质粒载体的构建

天然质粒的局限性（1）分子量大，拷贝数低2）筛选标志不理想

经典的大肠杆菌质粒载体：

1、 pBR322（F. Bolivar和R.L. Rodriguez人工构建载体。）

（1）元件来源①复制起点 ori pMB1系列（来源于ColE1）的高拷贝型复制起点②Ampr基因pSP2124质粒的Ampr基因③ Tetr基因pSC101的Tetr 基因。

（2）长度 4363bp

（3）选择标记氨苄青霉素和四环素抗性

（4）克隆位点 24个克隆位点

（5）pBR322的优点

①双抗菌素抗性选择标记（没有获得载体的寄主细胞→在Amp或Tet中都死亡。获得载体的寄主细胞在Amp或Tet其中之一中死亡。）

②分子小，克隆能力大

③高拷贝数氯霉素扩增后达到1000-3000拷贝

④安全失去了转移蛋白基因mob（mobilization）。

不能通过接合转移。

3、PUC系列（University of California的J.

Messing和J. Vieria于 1978年，在

pBR322的基础上改造而成。属正选择载体。）

（1）元件来源①复制起点 pBR322的 ori ② Ampr

基因 pBR322的Ampr基因③ lacZ的启动子大肠

杆菌④lacZ’基因大肠杆菌lacZ的α-肽链序列，

是LacZ 的氨基端片断。

（2）长度约2.7kb

（3）克隆位点10个连续的单一限制酶切位点，位于lacZ’基因的5’端。

（4）选择标记 Ampicillin 抗性和 lacZ的α肽互补（蓝白斑）相结合。

蓝白斑选择原理：

① Xgal

②β-半乳糖苷酶Xgal显色反

应：

β-半乳糖苷酶能把无色的化合

物Xgal分解成半乳糖和一个深

蓝色的物质5-溴-4-氯靛蓝。

③ lacZ的α肽互补

1）α-肽（lacZ’ ）：β-半乳糖苷酶N端的一段氨基酸片断（11-41氨基酸）。

lacZ只有在4聚体的状态下才有功能，受体菌

基因组的β-半乳糖苷酶基因的氨基端有缺失

（缺失α肽），不能形成4聚体的活性酶，不能分解Xgal 。pUC质粒载体上的lacZ’ 编码α肽与这个缺失突变的β-半乳糖苷酶“互补”，使它能形成4聚体。又能分解Xgal。产生蓝色物质。

pUC载体上LacZ’的5‘端有一段多克隆位点(MCS)区，本身虽不干扰LacZ’的合成，但插入外源基因就会阻止LacZ’的合成。不能互补。

④IPTG的诱导作用 IPTG是乳糖的类似物。能诱导lac操纵子的启动转录，使受体菌基因组中的lacZ 的C端部分和载体的lacZ’α肽都表达。从而互补。但载体MCS

上插入外源DNA后，仍然不能产

生α肽

（5）pUC系列载体的优点

①更小的分子量：

②选择方便

③克隆便利

④测序方便（pUC的MCS与M13噬菌

体载体的MCS完全相同，便于把外源DNA转

移到M13载体上测序。）

由质粒载体演化而来的载体

3. 穿梭质粒载体（shuttle plasmid vectors）

人工构建的、具有两种不同复制起点和选择标记、可以

在两种不同的寄主细胞中存活和复制的质粒载体。

穿梭载体的优点：①利用大肠杆菌进行基因克隆、表达②也能利

用其它细胞系统（酵母、枯草杆菌、哺乳动物细胞等）进行基因表达。

③可以自如地在两种不同寄主细胞之间来回转移基因。

二、噬菌体型载体

噬菌体（一类细菌病毒）的一般特性结构：蛋白质外壳内包裹着DNA（双链、单链、线性、环状等）。

噬菌体的生活周期 1. 溶菌周期：烈性噬菌体（virulent phage)感染细菌后立即在菌体内复制和合成蛋白质外壳，重新组装成噬菌体颗粒，并导致细菌细胞解体，释放出大量子代噬菌体。

2. 溶原周期：温和噬菌体（temperate phage)感染细菌后，将自己的DNA整合到细菌的染色体DNA中。形成这一过程称为溶源化（lysogenization)

（整合到细菌染色体的噬菌体DNA称为原噬菌体，随细菌的染色体复制而复制。）

三、单链噬菌体载体

单链环状DNA的丝状大肠杆菌噬菌体：

M13（典型）

1. 单链DNA噬菌体的特点

（1）+DNA。（ssDNA）

（2）复制型（RF）是双链环状DNA。

（3）RF DNA和ssDNA都能转染感受态大肠杆菌。并

产生噬菌斑。

（4）不存在包装限制。

（5）可产生大量的含有外源DNA插入片断的单链分子，

便于作探针或测序。

2. M13 噬菌体

（1）寄主 M13噬菌体只感染雄性大肠杆菌。但M13

DNA可以转染雌性大肠杆菌。

（2）DNA长度 6407bp

（3）DNA提纯 RF dsDNA在寄主细胞内以高拷贝形式存在。成熟的噬菌体里只包装有 + DNA，也容易提取。（4）M13的生活周期

（5）没有包装限制

包装过程;

3. M13载体的构建：

（1）克隆区域的选定①基因间隔区（intergenic region, IG区基因2与5之间507bp）（2）加入酶切位点

4. M13系列载体的优点

（1）有MCS，便于克隆不同的酶切片段

（2） Xgal显色反应，可供直接选择

（3）无包装限制，克隆能力大

（4）可以克隆双链DNA分子中的每一条链（双酶切）子代M13噬菌体中包含的是单连+DNA。

5. M13载体的缺点

①插入外源DNA后，遗传稳定性显著下降

②实际克隆能力小于1500bp。虽无包装限制，并非无限包装！

6. 噬菌粒载体（phagemid vectors）由质粒载体与单链噬菌体载体的复制起点结合而成的新型载体系列。

（1）噬菌粒载体的特点

①分子量小（3000bp）②克隆能力大（可插入10kb外源基因）③两种复制形式（既具有质粒的复制起点，又具有噬菌体的复制起点。——既能在大肠杆菌中以质粒的形式双链复制，又能在噬菌体内进行单链复制。）

2.pUC118/pUC119

①构成 1）M13的基因间隔区（带有M13的复制起点）（IG）2）pUC18/pUC19质粒载体：质粒复制起点Ampr l acZ’ MCS

② pUC118/119的复制模式

1）双链质粒复制模式每个细胞500个拷贝

2）单链滚环噬菌体复制模式

③噬菌粒载体的包装

1）辅助噬菌体：自身的复制起点发生了突变，复制效率低下，但感染细菌后能表达出外壳蛋白和复制蛋白，帮助噬菌粒载体复制。

2）包装：如右图

???

?替换型载体半乳糖苷酶失活β基因）不能进入溶源期（位点位于阻遏物合成区—免疫功能失活型插入型载体-

ci （5）PCR 产物克隆载体

结构：pUC 的质粒部分、fi 噬菌体ori 、Kanr 和Ampr 抗性。

② 特点MCS 的中部已经切开，各有一个3’端突出的T 。PCR 产物往往在3’端突出一个A ，所以能与这个载体

直接连接。——Promega 公司的

T 载体系列

四、双链噬菌体载体—λ载体

1. λDNA 分子的特点（1）长度为48502 bp ；（2）双链线性DNA ；（3）但在两端有cos 位点，可以环化。 λDNA 两端各有12bp 的粘性末端，粘性末端形成的双链互补区域称为cos 位点

2. λ噬菌体的基因组特点

λDNA 上有至少61个基因，有一半是必须的，与自身的活动有关，成簇排列。其他约1/3是非必须基因（位于尾部合成至阻遏之间的区段）。 3. λDNA 的复制模型

1.早期是θ型复制。晚期是（2）滚环复制形成多联体λDAN 分子。

这种多联体分子必须在cos 位点被切断成单体分子才能被包装起来。

4. λ噬菌体载体的构建

（1）构建原理：删除λ噬菌体的非必需区，留出插入空间。

（2）构建过程①在这个非必须区内制造限制酶切点②引进某些突变表型，作为选择标记 ③突变某些基因，使它成为安全载体

④删除λDNA 必须区段上常用的限制酶切点

（3）人工构建的λ噬菌体载体有两种类型：免疫功能失活：插入导致载体不能合成阻遏

物， λ载体DNA 不能进入溶源期，受体菌全部裂解，形成清晰的噬菌斑。没有外源DNA 插入的λ载体感染受体菌形成混浊噬菌斑。 ② 替换型载体（substitution vectors)

（4）λ载体的筛选标记

① 置换型载体可取代片断中如果包含LacZ ’，可用Xgal 显色作筛选标记

② 插入型载体根据插入所引起的表型突变 5. λ载体的体外包装

λ DNA 象质粒载体那样直接转化细菌时效率远比质粒低。（必须利用噬菌体外壳的作用！）

体外包装：在试管中与λ噬菌体的头部和尾部蛋白人工装配成噬菌体颗粒，才能高效地感染细菌，把重组DNA 注入受体菌中。

体外包装的容量限制：

必须在正常野生型容量的75%—105%

（36—51kb ）之间。野生型λDNA 的必须区是28kb ，所以λ载体的最大克隆容量是23kb 。（实际上为15kb ）。（既不能超过正常野生型容量的5%；又不能低于正常野生型容量的75%）（4）λDNA 载体的优点

比一般的质粒载体的容量大的多。用在真核生物基因组文库的建立。 6. cosmid 载体（粘粒）

1978年J. Collins 和 B. Hohn 等人发展出cosmid vector （cos site-carrying plasmid)

（1）大小 4-6k b

（2）组成一是λDNAcos 序列和控制包装的的序列。二是

PBR322的质粒的复制子、抗药性基因、几个限制性酶的单一位点

（3）cosmid vector 的特点

①具有λ噬菌体的特性：在寄主细胞内形成环化DNA （但不

能形成新的噬菌体颗粒而溶菌）。克隆外源DNA 后可以体外包装成噬菌体颗粒。

②具有质粒载体的特性：大多带有pMB1或ColE1的复制子，

能象质粒一样复制。

③方便的选择：有抗菌素抗性基因，和插入失活的克隆位点。

④高容量的克隆能力：45kb （最少不能低于30kb ）。51kb-5kb=45kb （5）cosmid cloning

应用cosmid 载体在大肠杆菌中克隆大片端的真核基因组DNA 技术，叫“柯斯克隆”（cosmid cloning ）。①理论依据：cos 位点:包装识别。2：“多联体”复制：λ噬菌体的生命周期中，会产生数百个λDNA 通过cos 位点连接的“多联体”分子。Ter 体系：在包装的时候， λ噬菌体具有位点特异的末端酶（terminase ）体系（Ter 体系），识别cos 位点，把多联体切成单个λDNA 长度。包装限制：两个cos 位点之间，必须保持38—45kb 的DNA ，Ter 体系才能识别。（6）cosmid 克隆的一般过程

①用特定的核酸内切酶消化真核生物DNA 。②用同样的内切酶消化cosmid 载体。③连接产物中将有一定比例的分子是两端各有一个cos 位点、长度40kb 左右的真核DNA 与载体的连接物。④ Ter 体系识别并切割切割合适长度的杂种DNA 连接物，并包装入噬菌体头部。分子环化，并按质粒的方式复制。

（7）cosmid 载体克隆的缺点

①载体片断自我连接。②外源DNA 多个本来不在一起的外源DNA 插入载体

（8）cosmid 载体的改良

第四章目的基因：准备要分离、改造、扩增或表达的基因。

第一节基因组DNA 片断化

? 用限制性内切酶把基因组DNA 切成不同大小的片断。 1. 优点由于带有粘性末端，产物可以直接与载体连接。

2. 缺点目的基因内部也可能有该内切酶的切点。目的基因也被切成碎片！ ? 二、随机片断化

1. 限制性内切酶局部消化法：控制内切酶的用量和消化时间，使基因组中的酶切位点

?高速搅拌

超声波

只有一部分被随机切开。（1）限制性内切酶的选用原则① 内切酶识别位点的碱基数（4或6bp 的概率不同）② 内切酶粘性末端能与常用克隆位点相连。

2. 机械切割法

第二节化学合成目的基因

1976年H.G. Khorana 提出了用化学方法合成基因的设想，并于1979年在science 上发表了率先成功地合成大肠杆菌酪氨酸tRNA 基因的论文。一、目前常用的方法

磷酸二酯法、亚磷酸三酯法、磷酸三酯法、固相合成法、自动化合成法。 1. 磷酸二酯法

（1）原理① 保护dNTP 的5’端P 或3’端-OH ——保证反应定向进行。② 带保护的单核苷酸连接——带5‘保护的单核苷酸与带3’保护的另一个单核苷酸以磷酸二酯键连接起来。③ 用酸或碱的脱保护

2. 磷酸三酯法——原理与磷酸二酯法一样。只是参加反应的单核苷酸都是在3’端磷酸和5’-OH 上都先连接了一个保护基团。

二、化学合成DNA 片断的组装（化学合成的DNA 片断一般在200bp 以内。） 1. 互补连接法

（1）互补配对——预先设计合成的片断之间都有互补区域，不同片断之间的互补区域形成有断点的完整双链。（2）5’端磷酸化——用T4多核苷酸激酶使各个片段的5’端带上磷酸。（3）连接酶连成完整双链

2. 互补延伸连接法——预先设计的片断之间有局部互补区，可以相互作为另一个片断延长的引物，用DNA 聚合酶延伸成完整的双链。右下图三、寡聚核苷酸化学合成的优点

1. 直接合成基因

2. 合成引物（20bp 左右）

3. 合成探针序列

4. 定点突变合成（合成带有定点突变的基因片断。）

5. 合成人工接头或衔接物第三节目的基因的保存和扩增基因文库：（gene liberary ）;指在细菌中增殖来自某一生物的染色体DNA 或cDNA 所形成的全部DNA 片段克隆集合体。基因库（gene pool ）：天然存在于该生物物种体内的全部完整DNA 序列的基因集合体。基因银行（genebank ）：所有物种的DNA 或cDNA 或mRNA 的序列都是经过测定的（称为基因组数据库更合适）。

2. 构建基因文库的载体选用（载体能够容载的DNA 片断大小直接影响到构建完整的基因文库所需要的重组子的数目。）

（1）对载体的要求载体容量越大，所要求的DNA 片断数目越少（片断越大）。

（2）目前常用的载体 λ载体系列：容量为24kp ；cosmid 载体：容量为50kb ；

YAC ：容量为1Mb 。BAC: 容量为 300kb 3. 基因文库构建的一般步骤

（1）染色体DNA 大片段的制备断点完全随机，片断长度合适于载体连接。不能用一般的限制性内切酶消化法。

① 物理切割法：超声波（300bp ）或机械搅拌（8kb ）。

② 酶切法：内切酶Sau3A 进行局部消化。可得到10-30kb 的随机片断。（2）载体与基因组DNA 大片段的连接（直接连接、人工接头或同聚物加尾。） 4. 基因组文库的大小

一个文库要包含99%的基因组DNA 时所需要的克隆数目。

p: 文库包含了整个基因组DNA的概率（99%）

f: 插入载体的DNA片断的平均长度占整个基因组DNA的百分数

N：所需的重组载体数（克隆数）记住书上的两个例子的算法

二、 cDNA文库的构建

以mRNA为模板逆转录出的DNA称cDNA。 cDNA library

利用某种生物的总mRNA合成cDNA，再将这些cDNA与载体连接，转入细菌细胞中进行繁殖、保存和扩增，称cDNA文库。

3. cDNA文库的特点

（1）不含内含子序列。（2）可以在细菌中直接表达。（3）包含了所有编码蛋白质的基因。（4）比DNA文库小的多，容易构建。

4. 构建cDNA文库的一般步骤

（1）总RNA（total RNA）提取（商业化的试剂盒）（2）mRNA的分离纯化 1原理：利用mRNA都含有一段polyA尾巴，将mRNA从总RNA（rRNA、tRNA等）中分离纯化。mRNA 只占总RNA的1%-2%。② mRNA的分离纯化——分离mRNA用商业化的Oligo dT纤维柱。（3）cDNA的合成① cDNA第一链合成——逆转录酶能以RNA为模板合成DNA。

用Oligo dT（或随机引物）作引物，合成cDNA的第一链。②降解mRNA模板——用碱处理或用RNaseH降解mRNA-DNA杂交分子中的mRNA。③ cDNA第二链合成（很多方法见教材，大部分都造成缺失唯pcr不会）剩下的cDNA单链的3‘末端一般形成一个弯回来的双链发卡结构（机理不明），可成为合成第二条cDNA链的引物。用DNA聚合酶合成第二链DNA.。④去掉发卡结构——用核酸酶S1可以切掉发卡结构（这会导致cDNA 中有用的序列被切掉！）。5.cDNA与载体连接：在双链cDNA末端接上人工接头，即可与载体连接，转入受体菌。或借助末端转移酶给载体和双链cDNA的3’端分别加上几个C或G，成为粘性末端。

6. cDNA文库的大小——一个cDNA文库要包含99%的mRNA时所需要的克隆

数目。

同样详情见教材

三、文库的查询（screening）用目的基因探针与文库中的重组载体进行Southern blot 杂交。

第四节目的基因的分离和扩增

一、目的基因的分离

1. 探针柱分离特异mRNA——根据已知的基因序列合成探针，结合到纤维素柱上，用来分离纯化该基因的mRNA。

2. mRNA消解杂交

原理：羟磷灰石柱只结合单链DNA，不结合双链DNA。

从表达A蛋白和不表达A蛋白的组织细胞中分别提取和分离总mRNA。

将表达A蛋白的mRNA合成cDNA第一链。再同不表达A的总mRNA杂交成cDNA-mRNA双链。不能杂交的cDNA就包括特异表达的A基因的cDNA单链。

用羟磷灰石柱收集单链cDNA，合成为双链DNA进行扩增、克隆、测序。

二、PCR扩增获得目的基因

1. 直接从基因组中扩增适合扩增原核生物基因（真核生物含有内含子）。

（1）提取基因组DNA作模板（2）根据目的基因序列设计引物（3）PCR扩增

2. 从mRNA中扩增: RT-PCR （适合扩增真核生物基因——原核生物不易得到mRNA，也不含有polyA尾。）

1. 直接从基因组中扩增

（1）提取基因组总RNA（2）反转录合成总cDNA作模板（3）根据目的基因序列设计引

物（4）PCR 扩增 2. 从mRNA 中扩增: RT-PCR （适合真核。原核生物不易得到mRNA ，也不含有polyA 尾。）（1）提取基因组总RNA （2）反转录合成总cDNA 作模板（3）根据目的基因序列设计引物（4）PCR 扩增

第五章基因的重组与转移

第一节 DNA 片段的体外连接一、粘性末端的连接

D NA 连接酶把相互靠近的5’端磷酸与3’-OH 连到一起。二、齐平末端（blunt end ）的连接 1. 直接连接

5’端与3’端并列靠近的时间太短，不容易被连接酶连接。 T4DNA 连接酶虽然能连接平末端，但效率

很低，只有粘性末端的1%。 2. 人工加尾形成 “粘性末端” （1）同聚加尾法

1.原理：DNA 末端转移酶能在没有模板的情况下给DNA 的3’-OH 端加上脱氧核苷酸。 ②加尾—碱基互补分别给载体和插入片断加上互补的核苷酸。

（2）衔接物(linker)连接

① linker

用化学合成法合成的一段10-12bp 的特定限制性内切酶识别位点序列的平端双链。 ② linker 的作用——用T4 DNA 连接酶连到平端DNA 上，然后再用酶切，形成一个人工粘性末端。

③优点：1）可以用内切酶把插入片段切下来。2）能给载体连接上Polylinker:

④缺点：如果插入片段内部也有该酶位点，不能切下完整的插入片段

（3）DNA 接头 (adapter)连接法

① adapter

一头平末端、另一头粘性末端（某种酶切位点序列）。

② adapter的作用

用T4DNA连接酶连到DNA分子的两端，直接成为人工粘性末端。

④缺点：接头与接头会彼此以粘性末端接在一起，影响与DNA片段的连接。可是不用担心：先用小牛肠碱性磷酸酶（CIP）处理接头，水解掉其5’端的磷酸，防止自我连接。（以后再用T4多核苷酸激酶加上磷酸。）

三、PCR产物的连接

1. 在引物的5’端设计酶切位点

（1）设计原则——符合载体的多克隆位点；避免与所扩增的DNA片断内部酶切位点重复。

（2）带酶切位点的引物的结构

3’端15~20bp与模板互补；

5’端6~10bp是某个内切酶的识别序列。（5’端多余的3~5bp属保护碱基）

2. 与T载体直接连接

（1）PCR产物两个3’端一般都有一个A，Taq DNA聚合酶的特性：在DNA双链的3’端再加上一个多余的核苷酸（优先加A）。

（2）T载体的两个3’端人为地各加一个T，利用Taq DNA聚合酶，当原料中只有dTTP 时，被迫在平端载体上添加T！

四、DNA体外连接应注意的事项

♂插入片断与载体的酶切位点互补

♂ DNA插入的方向正确——（1）用双酶切

♂插入基因的开放阅读框（ORF）正确

（1）DNA定向插入（2）起始密码（尤其当载

体上有ATG起始密码的时候，更要注意。）

♂防止载体自身环化连接

（1）提高插入片断的用量——连接反应体系中，插入片断比载体多10倍以上。

（2）用碱性磷酸酶处理载体——载体切口的5’磷酸被除去，不能自我连接。但可以与插入片断以单链连接。

五、载体和外源DNA插入片段的连接结果

（见下页右上角）

重组率的定义：

重组率 = 含有外源DNA的重组分子数 /

载体分子总数

在常规实验条件下，重组率一般为25

- 75%，重组率是衡量连接反应效率的重要

指标，较高的重组率可以大大简化DNA重

组的后续操作。

第二节受体细胞

一、什么是受体细胞（receptor cell）?

又称host cell，从实验技术上讲是能摄取外源DNA并使其稳

定遗传的细胞；从实验目的上讲是有应用价值和理论研究价值

的细胞。

九大原则！

1、便于重组DNA分子的导入。

2、能使重组DNA分子稳定的存在于细胞中

3、便于重组体的筛选。

4、遗传稳定性高，易于扩大培养或发酵生长

5、安全性高无致病性，不会对外界环境造成生物污染

6、选用内源蛋白水解酶基因缺失或蛋白酶含量低的细胞。

7、受体细胞在遗传密码的应用上无明显偏倚性

8、具有较好的转译后加工机制，便于真核目的基因的高效表达

9、在理论研究和生产实践上有较高的应用价值。

原核细胞是较为理想的受体细胞？

原核生物细胞作为受体存在的缺陷！

真核细胞——酵母菌

外源真核基因最理想的表达系统

优势：基因表达调控机理比较清楚；具有真核生物蛋白翻译后修饰加工系统；不含有特异性的病毒，不产生毒素；培养简单、利于大规模发酵生产，成本低廉；能将外源基因表达产物分泌至培养基中

植物细胞——优势：具有全能性

动物细胞

优势：能识别和除去外源真核基因中的内含子；真核生物蛋白翻译后能被正确加工或修饰；易被重组DNA质粒转染；可将表达产物分泌至培养基中

缺点;组织培养技术要求高

第三节重组体导入受体细胞

一、如何将重组DNA分子转入原核生物细胞？

什么是转化（transformation）？重组质粒DNA分子通过与膜蛋白结合进入受体细胞，并在受体细胞内稳定维持和表达的过程。

感受态（competent ）：——能够吸收 DNA 的细胞

细菌细胞在一定的生长阶段，自身或通过人为处理而具有摄取外源DNA，并使其基因型和表型发生相应变化的能力。

一、感受态大肠杆菌的制备

1.目的增加受体菌细胞膜的通透性。

2. 菌种的选择；野生型的大肠杆菌并不是理想的受体细胞——实验室常用菌株JM109，DH5α，Top10，DH10B HB101

5、制备注意事项

①生长状态制备感受态菌必须使用对数生长期的菌。

②必须在冰冷的条件下制备。

基因工程习题及答案

第二章习题一、单选题 1.在基因操作中所用的限制性核酸内切酶是指（ B ） A．I类限制酶 B. II类限制酶 C. III类限制酶 D.核酸内切酶 E. RNAase 2.下列关于同裂酶的叙述错误的是( B ) A. 是从不同菌种分离到的不同的酶,也称异源同工酶。 B. 它们的识别序列完全相同。 C. 它们的切割方式可以相同，也可以不同。 D. 有些同裂酶识别的完整序列不完全一样，但切割位点间的序列一样。 E. 两种同裂酶的切割产物连接后，可能会丢失这两个同裂酶的识别位点。 3. 多数限制酶消化DNA的最佳温度是（ A ） A. 37℃ B.30℃ C.25℃ D.16℃ E.33℃ 4. 下列关于限制酶的叙述错误的是( B ) A. I类限制酶反应需要 Mg2+、ATP和S-腺苷蛋氨酸。 B. II类限制酶反应需要Mg2+、ATP。 C. III类限制酶反应需要Mg2+、ATP，S-腺苷蛋氨酸能促进反应，但不是绝对需要。 D. I、III类限制酶对DNA有切割和甲基化活性，II类限制酶对DNA只有切割活性而无甲基化活性。 E. II类限制酶要求严格的识别序列和切割点，具有高度精确性。 5. 如果一个限制酶识别长度为6bp ,则其在DNA上识别6bp的切割概率为( D ) A. 1/44 B. 1/66 C. 1/64 D.1/46 E. 1/106 6. 多数II类限制酶反应最适PH是 ( C ) A. PH:2-4 B. PH:4-6 C. PH:6-8 D. PH:8-10 E. PH:4-10 7. 下列关于限制酶反应的说法错误的是 ( D ) A. 限制酶识别序列内或其邻近的胞嘧啶、腺嘌呤或尿嘧啶被甲基化后，可能会阻碍限制酶的酶解活性。 B. 许多限制酶对线性DNA和超螺旋DNA底物的切割活性是有明显差异的。 C. 有些限制酶对同一DNA底物上不同酶切位点的切割速率会有差异。 D. 限制酶反应缓冲系统一般不用磷酸缓冲液，是由于磷酸根会抑制限制酶反应。 E. BSA对许多限制酶的切割活性都有促进作用，所以酶切反应中常加入一定量的BSA。 8. II类限制酶反应中必须的阳离子是（ C ）

基因工程应用实例及基因工程前景展望

基因工程应用实例及基因工程前景展望高一（6）陈韬 1、什么是基因工程（又称基因拼接技术和DNA重组技术）？是以分子遗传学为理论基础，以分子生物学和微生物学的现代方法为手段，将不同来源的基因按预先设计的蓝图，在体外构建杂种DNA分子，然后导入活细胞，以改变生物原有的遗传特性、获得新品种、生产新产品。基因工程技术为基因的结构和功能的研究提供了有力的手段。 2、原理？基因重组：通过将外源基因通过体外重组后导入受体细胞内，从而使这个基因能在受体细胞内复制、转录、翻译表达。它是用人为的方法将所需要的某一供体生物的——DNA 提取出来，在离体条件下用适当的工具酶进行切割后，把它与作为载体的DNA分子连接起来，然后与载体一起导入某一更易生长、繁殖的受体细胞中，以让外源物质在其中进行正常的复制和表达，从而获得新物种。 3、应用？（1）农牧业、食品工业运用基因工程技术，不但可以培养优质、高产、抗性好的农作物及畜、禽新品种，还可以培养出具有特殊用途的动、植物。

（2）环境保护基因工程做成的DNA 探针能够十分灵敏地检测环境中的病毒、细菌等污染。利用基因工程培育的指示生物能十分灵敏地反映环境污染的情况，却不易因环境污染而大量死亡，甚至还可以吸收和转化污染物。（3）医药卫生 1.基因工程药品的生产： ⑴基因工程胰岛素 ⑵基因工程干扰素 ⑶其它基因工程药物 2.基因诊断与基因治疗： ◆SCID 的基因工程治疗 1. 转基因鱼 2. 转基因牛 3.转黄瓜抗青枯病基因的甜椒 4.转鱼抗寒基因的番茄 5.转黄瓜抗青枯病基因的马铃薯 6.不会引起过敏的转基因大豆 7.超级动物 8.特殊动物 9.抗虫棉

扬州大学基因工程期末试题复习要点整理

基因工程期末试题复习要点整理基因工程是70年代出现的一门科学，是生物学最具生命力和最引人注目的前沿科学之一，是现代生物技术的代表，是生命科学类专业中的一门重要的专业课。本课程主要介绍基因工程概述、重组DNA基本技术及原理、基因克隆、基因的分离及鉴定、基因工程的表达系统、基因工程的应用等。通过本课程的学习，使学生掌握基因工程技术的基本原理和了解该技术在动物、植物和微生物等方面的应用，为今后从事生物学教学、生物技术研究和产品开发，或进一步的研究生学习科研打下坚实的理论及专业基础。扬州大学试题纸一、名词解释：共10题，每题2分，共20分。 1. 基因: 是DNA分子中含有特定遗传信息的一段核苷酸序列，是遗传物质的最小功能单位。 2. 定位克隆: 获取基因在染色体上的位置信息，然后采用各种方法对该基因进行定位和克隆 3. 融合基因: 是指应用DNA体外重组技术构建的一类具有来自两个或两个以上的不同基因核苷酸序列的新型基因。 4. 转化子: 导入外源DNA后获得了新遗传标志的细菌细胞或其他受体细胞，又称重组体。 5. 人工接头：是人工合成的具有一个或数个特定限制性内切酶识别和切割序列的双股平端DNA短序列。 6. RT-PCR: 是指以mRNA在反转录酶作用下合成cDNA第一链为模板进行的PCR。 7. ORF : 起始于AUG、止于UAA、UGA、UAG的连续的密码子区域，是潜在的编码区。 8. MCS: 指载体上人工合成的含有紧密排列的多种限制核酸内切酶的酶切位点的DNA片段。 9. gene targeting : 基因工程中利用活细胞染色体DNA可与外源DNA的同源性DNA序列发生重组的性质，来进行定点修饰改造染色体上某一目的基因的技术 10. 5’RACE: 是一种通过PCR进行cDNA末端快速克隆的技术，是以mRNA为模板反转录成cDNA第一链后用PCR技术扩增出某个特异位点到5’端之间未知序列的方法。四、简答题：共4题，共20分。 1．简述获得目的基因常用的几种方法。（5分）

有关基因工程的看法

有关转基因植物争论的看法摘要与前言：植物转基因工程是指通过基因枪等基因工程手段,将一种或几种外源基因转移到原本不具有这些基因的植物体内,并使之有效表达,产生相应性状,这种具有相应性状的植物称之为转基因植物。植物转基因工程的目的旨在通过导入有用的外源基因,获得转基因植物,用于植物的改良和有效成分的生产。目前在抗除草剂、抗虫、抗病、控制果实成熟以及植物生物反应器等方面已获得了一系令列人鼓舞的成果。毫无疑问,能够按照人类意愿来“创造”优良作物新品种的植物基因工程近年来所取得的长足进展是激动人心的,它必将为未来农业的发展和满足人类日益增长的器要发挥巨大的作用。但是.在给人们带来明显经济效益和社会效益的同时,植物基因工程也可能带来一些重大的潜在危险。所以.必须从利弊两方面来考虑转基因植物的最终应用，并要对其做出正确的安全性评价。

目录一：什么是转基因植物。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。3 二：转基因植物的发展方向。。。。。。。。。。。。。。。。。。。4 三：转基因安全性评价。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。5 四：对转基因争论的看法。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。6

一：什么是转基因转基因植物是经过遗传改良进天然物种不具有基因序列的植物。这些基因序列来自不同的物种，并通过引入改变植物的一些基本特性。农作物是最经常实施转基因工程的植物，能通过引入新遗传材料提高产量和品质。其中一些能培育进这些转基因植物的优良品质包括抗病虫害，提高产量，更高品质的水果、蔬菜或花卉，以及天气条件耐受性增加等。在发明人工插入新遗传材料之前，植物只是简单的在同一物种中找出最好的种子加以培育以期获得更高产量和品质。而转基因能让这一过程变的更有效。首先要做的是确定需要替代的基因。DNA的每一个部分都管辖不同的植物部位。遗传专家必须确定用哪些基因控制每一个特定过程，并确定要被替代的植物部分。在本土环境中，植物通过授粉过程获得新遗传材料。转基因植物可以通过多种方式在这一过程中人工插入新信息。例如，基因枪是一个把新DNA通过细胞壁直接注射进植物细胞的新技术。这种方法在单子叶植物植入过程中很受欢迎。在创造转基因双子叶植物时，农杆菌介导法最成功。该过程把基于土壤的农杆菌当做载体。在注入新的DNA后，细菌被导入植物根茎附近的土壤。这种独特的菌株会侵入植物并用植物自己的细胞再生，然后引入新的遗传品系。

生物选修3专题1 基因工程知识点复习学案

专题1 基因工程基因工程的概念基因工程是指按照人们的愿望，进行严格的设计，通过________________________，赋予生物以 _____________________，创造出______________________________________。基因工程是在____________上进行设计和施工的，又叫做__________________。 1. （1 （2 （3 2. (1)两种DNA ②区别：E· (2)与DNA 酸二酯键。 3. （1 （2 _____________________的双链___________DNA （3）其它载体： _________________________________ (二)基因工程的基本操作程序第一步：__________________________ 1.目的基因是指： ______________________________________________________ 。 2.目的基因可采取_______________-获得，也可以用_____________________。人工合成目的基因的常用方法有________________和_________________。 3.PCR技术扩增目的基因（1）原理：_____________________ 将目的基因导入植物细胞：采用最多的方法是________________，其次还有基因枪法和花粉管通道法等。将目的基因导入动物细胞：最常用的方法是 _______________。此方法的受体细胞多是 ____________。将目的基因导入微生物细胞：★原核生物作为受体细胞的原因是繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对较少，最常用的原核细胞是 ____________，其转化方法是：先用 ________处理细

基因工程的发展历程

基因技术的发展历程 2011级初等教育理科代林宏 [摘要]基因技术作为２１世纪生物科技的核心技术之一，通过操纵、改变DNA上基因的容易来改变生物属性和特点，包括胰岛素生物工程、干细胞技术、克隆技术等。基因科技术的每一次突破和发展对人类的生产生活都有着重要的影响。 [关键词] 基因技术；成就；发展历程；基因技术是指通过操纵、改变（增加或减少)DNA上基因的容易来改变生物属性和特点，以达到有利于人类目的的生物科学技术。如把胰岛素基因置入大肠杆菌产生人类稀缺的胰岛素生物工程；干细胞技术，克隆技术等。这一系列的技术由基因到伟大的人类基因组计划以及后来的一系列生物高科技的发展有一个漫长的历程。 19世纪60-80年代间确定了细胞中的两种核算，脱氧核糖核算及核糖核酸；染色质，染色体等物质，对细胞结构有了基本的认识。 1909年，丹麦的约翰逊把遗传因子命名为“基因”。随后美国人摩尔根和他的学生发表了《遗传的物质基础》和《基因论》。证明了基因是染色体上的遗传单位。 1944年美国的艾弗里证明了遗传基因就在DNA上。剑桥大学的卡文迪许实验室里，沃森和克里克研究发现了DNA分子双螺旋结构，并在科学期刊《自然》上面发表了论文，这位之后的基因技术发展奠定了基础。 1956年，美国的肯恩伯格从大肠杆菌里分离出了一种催化核苷酸形成DNA 的酶－DNA聚合酶，作为DNA体外复制技术的起始。随后提出了中心法则、操纵子学说，并成功的破译了遗传密码，使生物学的发展进入了另一个阶段。所有用于治疗糖尿病的胰岛素都来自一种细菌，其DNA中被插入了人类可产生胰岛素的基因，细菌便可自行复制胰岛素。基因工程技术使得许多植物具有了抗病虫害和抗除草剂的能力；在美国，大约有一半的豆和四分之一的玉米都是转基因的。运用胚胎遗传病筛查技术可使患儿的父母生一个和患儿骨髓匹配的孩子，然后再通过骨髓移植来治愈患儿。[1] 基因工程在20世纪取得了很大的进展，这至少有两个有力的证明。一是转基因动植物，二是克隆技术。转基因动植物由于植入了新的基因，使得动植物具有了原先没有的全新性状，如抗虫西红柿，生长迅速的鲫鱼，转基因烟草等。1997

基因工程技术笔记整理

基因工程技术：按照人们的愿望，进行严密的设计，通过体外DNA重组和转移等技术，有目的地改造生物种性，使现有物种在较短的时间内趋于完善，创造出新的生物类型。质粒是一种染色体外的稳定遗传因子，大小从1-200kb不等，为双链、共价闭合环状DNA分子cccDNA，并以超螺旋状态存在于宿主细胞中，它具有自主的复制和转录系统。质粒在细胞内的复制一般有二种：紧密控制型（stringent control）和松弛控制型（relaxed control）。前者只在细胞周期的一定阶段进行复制，通常每个细胞内只含有一个或几个质粒分子；后者在整个细胞周期中随时可以复制，在每个细胞中有许多拷贝。质粒的不相容性：利用共同复制系统的不同质粒不能在同一宿主细胞中共存。从细胞中分离质粒DNA 的方法都包括3个基本步骤：培养细菌使质粒扩增；收集和裂解细胞；分离和纯化质粒DNA。溶菌酶：破坏菌体细胞壁；SDS和Triton X-100：使细胞膜裂解。染色体DNA通常用于构建基因组文库和Southern杂交等。基因组DNA的提取植物基因组DNA提取：提取缓冲液（Tris.Cl—保持pH,EDTA,NaCl,SDS），氯仿/戊醇/乙醇溶液—沉淀和抽提DNA，异丙醇—沉淀DNA（提染色体），TE（Tris.Cl,EDTA）--溶解DNA，RNase—保存液，降解RNA，NaAC—加盐，70%乙醇—漂洗。细菌基因组DNA提取：SDS，蛋白酶K，氯仿：异戊醇（24：1）-- 沉淀DNA，苯酚：氯仿：异戊醇（25：24：1）-- 抽提，70%乙醇—漂洗，TE,NaCl—调节离子强度，RNase A，CTAB/NaCl 溶液—CTAB--一种阳离子去污剂，具有从低离子强度溶液中沉淀核酸和酸性多聚糖的特性，异丙醇/无水乙醇—沉淀上清液。总RNA制备 mRNA的分子结构容易受到RNA酶的攻击反应而降解，加上RNA 酶极为稳定而且广泛存在，因此，在提取过程中应严格防止RNA 酶的污染并设法抑制其活性，这是实验成败的关键。仪器—玻璃器皿：200℃烘2h，塑料器皿：DEPC水液处理—所有器皿最后硅烷化处理。 RNA酶抑制剂：DEPC--强烈但不彻底，与氨水溶液混合会产生致癌物；异硫氰酸胍--最有效，使RNA酶失活；其他--RNA酶蛋白抑制剂（RNasin）SDS, 尿素等。细胞内总RNA制备方法：异硫氰酸胍热苯酚法、酚/SDS法、Trizol法。（均先将组织在液氮中研磨成粉末）异硫氰酸胍热苯酚法：异硫氰酸胍(GIT)与β－巯基乙醇共同作用抑制RNase的活性，GIT与十二烷基肌氨酸钠(Sarcosyl)作用使蛋白质变性。酚/SDS法：用酚和SDS破碎细胞和去除蛋白质，用LiCl选择沉淀RNA以去除DNA 和其它不纯物。 Trizol法：Trizol试剂（含酚、异硫氰酸胍和溶解剂等）。 mRNA提取制备mRNA原理：分离的总RNA 可利用mRNA3’端含有poly(A)的特点，用oligo(dT)纤维素柱分离，当RNA流经oligo(dT)纤维素柱时，在高盐缓冲液作用下，mRNA被特异的吸附在oligo(dT)纤维素上，然后逐渐降低盐浓度洗脱，在低盐溶液或蒸馏水中，mRNA被洗下。然后经过两次oligo（dT）纤维素柱，可得到较纯的mRNA。纯化的mRNA在70%乙醇中-70℃可保存一年以上。（上样buffer和洗脱buffer）。溶液中无盐时要沉淀RNA，必须加盐NaAC。琼脂糖凝胶电泳 DNA凝胶电泳：琼脂糖-- 分离DNA片段大小范围广；聚丙烯酰胺-- 小片段，分辨力高。

基因工程知识点梳理

生物选修3知识点专题1 基因工程基因工程的概念基因工程是指按照人们的愿望，进行严格的设计，通过，赋予生物以，创造出。基因工程是在上进行设计和施工的，又叫做。（一）基因工程的基本工具 1.“分子手术刀”—— （1）来源：主要是从中分离纯化出来的。（2）功能：能够识别的核苷酸序列，并且使每一条链中的两个核苷酸之间的断开，因此具有。（3）结果：经限制酶切割产生的DNA片段末端通常有两种形式：和。 2.“分子缝合针”—— (1)两种DNA连接酶（）的比较： ①相同点：都缝合键。 ②区别：来源于大肠杆菌，来源于T4噬菌体，只能将双链DNA片段互补的黏性末端之间的磷酸二酯键连接起来；而能缝合两种末端，但连接的之间的效率较低。 (2)与DNA聚合酶作用的异同: DNA聚合酶只能将加到已有的核苷酸片段的末端，形成磷酸二酯键。 DNA连接酶是连接两个DNA片段的末端，形成磷酸二酯键。必须需要模板 3.“分子运输车”—— （1）载体具备的条件：①。 ②，供外源DNA片段插入。 ③，供重组DNA的鉴定和选择。（2）最常用的载体是 ,它是一种。

（3）其它载体： (二)基因工程的基本操作程序第一步： 1.目的基因是指：基因。 2.原核基因采取获得，真核基因是。人工合成目的基因的常用方_ 和_。 3. 从基因文库中获取基因文库（1）概念：将含有某种生物不同基因的许多DNA片段，导入受体菌的群体中储存，各个受体菌分别含有这种生物的不同的基因，称为基因文库。（2）类型：基因组文库和部分基因文库（如cDNA文库）（1）原理：（2）过程：第一步：加热至90～95℃；第二步：冷却到55～60℃，；第三步：加热至70～75℃，。第二步：（核心步骤）

基因工程技术的现状和前景发展

基因工程技术的现状和前景发展摘要从20世纪70年代初发展起来的基因工程技术，经过30多年来的进步与发展，已成为生物技术的核心内容。许多科学家预言，生物学将成为21世纪最重要的学科，基因工程及相关领域的产业将成为21世纪的主导产业之一。基因工程研究和应用范围涉及农业、工业、医药、能源、环保等许多领域。基因工程应用于植物方面农业领域是目前转基因技术应用最为广泛的领域之一。农作物生物技术的目的是提高作物产量，改善品质，增强作物抗逆性、抗病虫害的能力。基因工程在这些领域已取得了令人瞩目的成就。由于植物病毒分子生物学的发展，植物抗病基因工程也也已全面展开。自从发现烟草花叶病毒(TMV)的外壳蛋白基因导入烟草中，在转基因植株上明显延迟发病时间或减轻病害的症状，通过导入植物病毒外壳蛋白来提高植物抗病毒的能力，已用多种植物病毒进行了试验。在利用基因工程手段增强植物对细菌和真菌病的抗性方面，也已取得很大进展。植物对逆境的抗性一直是植物生物学家关心的问题。由于植物生理学家、遗传学家和分子生物学家协同作战，耐涝、耐盐碱、耐旱和耐冷的转基因作物新品种(系)也已获得成功。植物的抗寒性对其生长发育尤为重要。科学家发现极地的鱼体内有一些特殊蛋白可以抑制冰晶的增长，从而免受低温的冻害并正常地生活在寒冷的极地中。将这种抗冻蛋白基因从鱼基因组中分离出来，导入植物体可获得转基因植物，目前这种基因已被转入番茄和黄瓜中。随着生活水平的提高，人们越来越关注口味、口感、营养成分、欣赏价值等品质性状。实践证明，利用基因工程可以有效地改善植物的品质，而且越来越多的基因工程植物进入了商品化生产领域，近几年利用基因工程改良作物品质也取得了不少进展，如美国国际植物研究所的科学家们从大豆中获取蛋白质合成基因，成功地导入到马铃薯中，培育出高蛋白马铃薯品种，其蛋白质含量接近大豆，**提高了营养价值，得到了农场主及消费者的普遍欢迎。在花色、花香、花姿等性状的改良上也作了大量的研究。基因工程应用于医药方面目前，以基因工程药物为主导的基因工程应用产业已成为全球发展最快的产业之一，发展前景非常广阔。基因工程药物主要包括细胞因子、抗体、疫苗、激素和寡核甘酸药物等。它们对预防人类的肿瘤、心血管疾病、遗传病、糖尿病、包括艾滋病在内的各种传染病、类风湿疾病等有重要作用。在很多领域特别是疑难病症上，基因工程工程药物起到了传统化学药物难以达到的作用。我们最为熟悉的干扰素(IFN)就是一类利用基因工程技术研制成的多功能细胞因子，在临床上已用于治疗白血病、乙肝、丙肝、多发性硬化症和类风湿关节炎等多种疾病。目前，应用基因工程研制的艾滋病疫苗已完成中试，并进入临床验证阶段；专门用于治疗肿瘤的“肿瘤基因导弹”也将在不久完成研制，它可有目的地寻找并杀死肿瘤，将使癌症的治愈成为可能。由中国、美国、德国三国科学家及中外六家研究机构参与研制的专门用于治疗乙肝、慢迁肝、慢活肝、丙肝、肝硬化的体细胞基因生物注射剂，最终解决了从剪切、分离到吞食肝细胞内肝炎病毒，修复、促进肝细胞再生的全过程。经4年临床试验已在全国面向肝炎患者。此项基因学研究成果在国际治肝领域中，是继干扰素等药物之后的一项具有革命性转变的重大医学成果。基因工程应用于环保方面

基因工程基本过程

基因工程基本过程基因工程（genetic engineering），也叫基因操作、遗传工程，或重组体DNA 技术。它是一项将生物的某个基因通过基因载体运送到另一种生物的活性细胞中，并使之无性繁殖（称之为"克隆"）和行使正常功能（称之为"表达"），从而创造生物新品种或新物种的遗传学技术。一般说来，基因工程是专指用生物化学的方法，在体外将各种来源的遗传物质（同源的或异源的、原核的或真核的、天然的或人工合成的DNA片段）与载体系统（病毒、细菌质粒或噬菌体）的DNA 结合成一个复制子。这样形成的杂合分子可以在复制子所在的宿主生物或细胞中复制，继而通过转化或转染宿主细胞、生长和筛选转化子，无性繁殖使之成为克隆。然后直接利用转化子，或者将克隆的分子自转化子分离后再导入适当的表达体系，使重组基因在细胞内表达，产生特定的基因产物。常用的工具酶限制性内切酶—主要用于DNA分子的特异切割 DNA甲基化酶—用于DNA分子的甲基化核酸连接酶—用于DNA和RNA的连接核酸聚合酶—用于DNA和RNA的合成核酸酶—用于DNA和RNA的非特异性切割核酸末端修饰酶—用于DNA和RNA的末端修饰其它酶类--用于生物细胞的破壁、转化、核酸纯化、检测等。主要过程有为四步：一．获得目的基因有多种方法可获得目得基因 1.构建cDNA文库分离目的基因过程：（1）从真核细胞中提取mRNA，以其为模板，在反转录酶的作用下合成cDNA的第一条链。（2）以第一条链为模板，以反转录酶或DNA聚合酶Ｉ作用下合成cDNA的第二条链。（3）在甲基化酶作用下使cDNA甲基化。

（4）接头或衔接子连接。（5）凝胶过滤分离cDNA。（6）通过核酸探针法或免疫反应法从cDNA文库中分离特异cDNA克隆。 2.人工化学合成法适于已知的核苷酸序列且校小的ＤＮＡ片断合成，常用方法有磷酸二酯法、磷酸三酯法、亚磷酸三酯法、固相合成法、自动化合成法等。过程：先用以上方法合成基因DNA不同部位的两条链的寡核苷短片段，再退火成为两端形成粘性末端的DNA双链片段。然后将这些DNA片段按正确的次序进行退火连接起来形较长的ＤＮＡ片段，再用连接酶连接成完整的基因。 3.利用PCR技术直接扩增目的基因 PCR（Polymerase Chain Reaction）法，又称为聚合酶链反应或PCR扩增技术，已知待扩增目的基因或DNA片段两侧的序列，根据该序列化学合成聚合反应必需的双引物，类似于DNA的天然复制过程，用ＰＣＲ法进行扩增，特异地合成目的cDNA链，用于重组、克隆。二．载体的选择与制备 1.载体的选择（以质粒为例） ⑴载体必须是复制子。 ⑵具有合适的筛选标记，便于重组子的筛选。 ⑶具备多克隆位点（MCS），便于外源基因插入。 ⑷自身分子量较小，拷贝数高。 ⑸在宿主细胞内稳定性高。 (6)应具有很强的启动子，能为大肠杆菌的RNA聚合酶所识别 (7)应具有阻遏子，使启动子受到控制，只有当诱导时才能进行转录。 (8)应具有很强的终止子，以便使RNA聚合酶集中力量转录克隆的外源基因，而不转录其他无关的基因，且所产生的mRNA较为稳定。 (9)所产生的mRNA必须具有翻译的起始信号。 2.制备有多种分离质粒的方法，如碱裂解法、煮沸裂解法、层析柱过滤法等。目前一般使用碱变性法制备质粒DNA。这个方法主要包括培养收集细菌菌体，裂解细胞，将质粒DNA与染色体DNA分开及除去蛋白质和RNA。

基因工程复习笔记

第一章一、电泳电泳(eletrophorosis) :带电荷的分子在电场中以一定的速率向与其电荷性质相反的电极移动.移动速度称为电泳迁移率。影响因素：1 电泳迁移率同电场的强度和分子本身所带的净电荷数目成正比。 2. 电泳迁移率同分子与介质的摩擦系数成反比。 3当电场强度一定,电泳介质相同,电荷相同的分子在电场中迁移的速度主要取决于分子本身的大小和形状(构型)。 4分子形状相似的分子的迁移速度主要与分子量相关: 分子量越大，移动越慢。指示剂：溴酚蓝（Bb）：常用指示剂。分子量670，分子筛效应小，近似于自由电泳，呈蓝紫色。二甲苯青(Xc)：分子量554.6，呈蓝色，迁移速度比Bb慢。染料：溴化乙锭（EB） 1、聚丙烯酰胺凝胶电泳优点：比琼脂糖凝胶的分辨率高的多；回收DNA样品纯度高，无色透明，韧性好，银染的凝胶干燥后可长期保存；能装载的DNA量大，达每孔10μgDNA。 2 、SDS-PAGE 原理：SDS是蛋白质的变性剂，使煮沸变性的蛋白质维持线性状态，并与蛋白质结合，使蛋白质带上相同密度负电荷。SDS与蛋白质结合使蛋白质构象改变，成为形状近似雪茄状的长椭圆棒，SDS-蛋白质复合物短轴相同，而长轴与蛋白质的分子量成正比。

蛋白质-SDS复合物电泳的迁移率不受蛋白质原有电荷和形状的影响，只与椭圆棒的长度，即蛋白质分子量有关。二、PCR技术定义：聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）技术，以DNA为模板，在引物、dNTPs、Taq酶的作用下，经变性－退货－延伸反复循环，使某个基因在体外特异性地扩增。 PCR法的原理也是利用人工合成带突变位点的诱变引物，通过PCR 扩增而获得定点突变的基因或DNA片段。影响因素：（1）Taq DNA聚合酶（具有5’→3’聚合酶活性和5’→3’外切酶活性，但没有3’→5’外切酶活性因此不能修复错误的碱基配对）。（2）引物（primer）一般引物设计为长15—30bp；位置与待扩增的模板DNA区段的两3’端序列互补（5‘端相同）的短DNA；引物的碱基组成：尽可能提高G+C含量，避免连续相同碱基排列或内部回文序列，避免形成引物二聚体。（3）引物的Tm值：实际复性温度选择低于Tm值5 oC。（4）dNTPs 含量适中（5）Mg 2+ 的浓度（6)对照实验三、PCR技术的扩展：反向PCR：不对称PCR：差异显示PCR。反向PCR 原理：扩增两个引物外侧的未知序列，使引物的外侧序列“转变” 成内侧序列。扩增前先用限制性内切酶酶切样品DNA，

基因工程主要知识点整理

第一章基因克隆基因工程的基本技术有哪些？答：对核算分子的分离、纯化、回收、分析和检测、切割、连接和修饰，以及序列测定、诱变、扩增和转移等基因操作技术。构建基因文库一般使用什么作为载体？答：一般使用大肠杆菌作为载体克隆与亚克隆？答：克隆在一等程度上等同于基因的分离。亚克隆是将目的基因所对应的小段的DNA片段找出来。 PCR对基因克隆有什么作用？答：现在基因克隆可以不用通过构建基因文库来实现，可以通过理性设计和PCR扩增获得大多数所需要的基因。但是尽管如此，在不知道基因序列的情况下，如相互作用的基因，表达调控因子，新基因等，还需要构建基因文库来进行基因克隆。第二章分子克隆工具酶限制与修饰系统？答：限制系统可以排除外来DNA。限制的作用实际就是降解外源DNA，维护宿主稳定的保护机制。甲基化是常见的修饰作用，宿主通过甲基化来达到识别自身遗传物质和外来遗传物质的作用。并且能够保证自身的DNA不被降解。使用最广泛的限制酶？答：EcoR I是应用最广泛的限制性内切酶限制性内切酶的命名？答：宿主属名第一字母、种名头两个字母、菌株号+序列号。如：HindIII 限制与修饰系统分类？答：至少可分为3类。II类所占比例最大，其酶分子为内切酶与甲基化分子不在一起，识别位点为4-6bp的回文序列，切割位点为识别位点中或者靠近识别位点。其限制反应与甲基化反应是分开的反应。不需要ATP的参与。限制酶识别的序列长度？结构？

答：一般为4-6个bp，即每256和每4096个碱基中存在一个识别位点。回文序列，不对称序列，多种不同序列，间断对称序列限制酶产生的末端？答：1、黏末端2、平末端3、非对称突出末端什么是同裂酶？分类？答：识别相同序列的限制酶称为同裂酶。但他们的切割位点有可能不同。分为：1、同位同切酶2、同位异切酶3、同工多位酶4、其他限制性内切酶的作用是什么？它的反酶是什么？答：什么是同尾酶？答：许多不同的限制酶切割DNA产生的末端是相通的，切实对称的，即他们可产生相同的黏性突出末端。酶切的缓冲液中一般含有什么？作用是？答：调控pH的缓冲剂：稳定溶液的pH M g2+：稳定酶的作用，提高酶的活性，提高酶的特异性 DDT（二硫苏糖醇）：防止DNA二聚化，影响酶切结果 BSA（小牛血清蛋白）：防止了酶的贴壁效应（可使酶变形），同时减少非特异性吸附，对酶有稳定和促进的作用。酶切的反应温度？反应时间？中止酶切的方法? 答：反应温度大多为37℃，时间一般为2-3h。中止的方法是在65℃下反应20min。什么星星活性？抑制其发生的办法？答：在极端非标准条件下，限制酶能够切割与识别序列相似的序列，这个改变的特性称为星星活性。抑制星星活性的措施有很多，如减少酶的用量（可避免过分酶切）、减少甘油浓度、保证反应体系中唔有机溶剂或乙醇、提高离子强度到100-150mmol/L（如果不会抑制酶活性的话）和降低反应pH至pH7.0以及保证使用M g2+作为2价阳离子。影响酶活性的因素有？答：可分为内因和外因外因是可预见的，可控的：反应条件、底物的纯度（是否有杂质、是否有盐离子和苯酚的污染）、何时加酶、操作是否恰当、反应提及的选择以及反应时间的长短等。内因有：星星活性、底物甲基化和底物构象（线性还是超螺旋）原核细胞有几种DNA聚合酶？其特点是什么？答：DNA聚合酶I是单链多肽，可催化单链或者双链DNA的延长；DNA聚合酶II则与低分子脱氧核苷酸链的延长有关；DNA聚合酶III在细胞中存在的数目不多，是促进DNA链延长的主要酶。

基因工程的现状与发展趋势

题目：基因工程的现状与发展趋势专业：13食品科学与工程学号：132701105 姓名：盛英奇日期：2015/7/1

【摘要】从20世纪70 年代初发展起来的基因工程技术，经过40多年来的进步与发展，已成为生物技术的核心内容。生物学成为21世纪最重要的学科，基因工程及相关领域的产业将成为21世纪的主导产业之一。基因工程研究和应用范围涉及农业、工业、医药、能源、环保等许多领域。【关键词】基因工程技术；应用；前景；现状一、墓因工程的原理及研究内容基因工程是人们在揭示生命之谜的过程中建立起来的。早在300多年前，人们就发现，世界上生物尽管种类繁多，千姿百态，但都是细胞(如肉眼看不见的细菌等微生物)或者是由细胞构成的(如现存的200多万种多细胞动植物)。人们还发现，生物有遗传和变异的特征，遗传保证了生物种类的延续不断，变异则赋予生物种的进化，保证生物种类对环境的适应。而生物的所有特性及遗传变异都是由生物体细胞内的遗传物质所决定的，这种遗传物质就是被科学家称之为脱氧核糖核酸(简称DNA)的大分子物质，一般位于生物的细胞核内。DNA是由许多核昔酸连接而成的高分子化合物，如把DNA比喻成长链条，核昔酸就是组成这链条的一个个环节。生物细胞核内的DNA分子是由两条成对的多核昔酸长链互相缠人类开始学会干预生物的变异，即通过杂交、筛选等方式改变生物物种的某些特性，使之有利于人类，如水稻、小麦等作物的育种，家禽家畜优良品系的培育等，它是通过动植物父、母本交配繁殖时，生殖细胞内DNA上相应性状基因互相间可能出现的交换来实现的，这种交换的概率是人们不能控制的，所以选种的过程较为缓慢，需几年乃至几十年的时间，而且亲缘关系相差较远的生物种之间很难杂交。而本世纪}o年代初诞生的基因工程，则是按照人类的需要，从某种生物体的基因组中，分离出带有目的基因(即所需基因)的DNA片段，运用重组DNA技术，对这些DNA片段进行体外操作，把不同来源的基因按照设计的蓝图，重新构成新的基因组(即重组体)，再将重组DNA分子插入到原先没有这类DNA 片段的受体细胞(亦称宿主细胞)的DNA上，并使其不仅能“安家落户”，而且能“传种接代”，即能准确地把该外源基因的遗传特性在新的细胞(宿主细胞)里增殖和表达出来。就像一台机器上的零部件拆下来安装到另一台机器上。在生物体中，这种生命零件就是基因。因为用的是工程技术的方法原理，故称基因工程，亦叫遗传工程。用这种方法所形成的杂种DNA分子与神话中的那种狮首、羊身、

高中生物基因工程试题

阶段质量检测（一）基因工程（时间：45分钟，满分：100分）一、选择题（每小题3分，共45分） 1 ?下列有关基因工程技术的叙述，正确的是（） A. 重组DNA技术所用的工具酶是限制酶、连接酶和载体 B. 所有的限制酶都只能识别同一种特定的核苷酸序列 C. 只要是细菌中的质粒都可以直接作为基因工程中的载体 D. 载体必须具备的条件之一是有多个限制酶切割位点，以便与外源基因进行连接 2. （浙江高考）天然的玫瑰没有蓝色花，这是由于缺少控制蓝色色素合成的基因B,而开蓝色花的矮牵牛中存在序列已知的基因B。现用基因工程技术培育蓝玫瑰，下列操作正确的是（） A. 提取矮牵牛蓝色花的mRNA经逆转录获得互补的DNA再扩增基因B B. 利用限制性核酸内切酶从开蓝色花矮牵牛的基因文库中获取基因B C. 利用DNA聚合酶将基因B与质粒连接后导入玫瑰细胞 D. 将基因B直接导入大肠杆菌，然后感染并转入玫瑰细胞 3. 日本下村修、美国沙尔菲和钱永健因在发现绿色荧光蛋白（GFP）等研究方面做出突出贡献，获得2008年度诺贝尔化学奖。GFP在紫外光的照射下会发出绿色荧光。依据GFP的特性，你认为该蛋白在生物工程中的应用价值是（） A. 作为标记基因，研究基因的表达 B. 作为标记蛋白，研究细胞的转移 C. 注入肌肉细胞，繁殖发光小白鼠 D. 标记噬菌体外壳，示踪DNA路径 4. 下列有关质粒的叙述，正确的是（） A. 质粒是广泛存在于细菌细胞中的一种颗粒状细胞器 B. 质粒是细菌细胞质中能自主复制的小型环状 DNA C. 质粒只有在侵入宿主细胞后，才能在宿主细胞内复制 D. 基因工程中常用的载体除了质粒外，还有核 DNA动植物病毒以及入噬菌体的衍生物

基因工程知识点总结归纳(更新版)

基因工程绪论 1、克隆（clone）：作名词：含有目的基因的重组DNA分子或含有重组分子的无性繁殖。作动词：基因的分离和重组的过程。 2、基因工程（gene engineering）：体外将目的基因插入病毒、质粒、或其他载体分子中，构成遗传物质的新组合，并使之掺入到原先没有这些基因的宿主细胞内，且能稳定的遗传。供体、受体和载体是基因工程的三大要素。 3、基因工程诞生的基础三大理论基础：40年代发现了生物的遗传物质是DNA；50年代弄清楚DNA 的双螺旋结构和半保留复制机理；60年代确定遗传信息的遗传方式。以密码方式每三个核苷酸组成一个密码子代表一个氨基酸。三大技术基础：限制性内切酶的发现；DNA连接酶的发现；载体的发现 3、基因工程的技术路线：切：DNA片段的获得；接：DNA片段与载体的连接；转：外源DNA片段进出受体细胞；选：选择基因；表达：目的基因的表达；基因工程的工具酶 1、限制性内切酶（restriction enzymes）：主要是从原核生物中分离纯化出来的，是一类能识别双链DNA分子中某种特定核苷酸序列，并由此切割DNA双链的核酸内切酶。 2、限制酶的命名：属名（斜体）+种名+株系+序数 3、II型限制性内切酶识别特定序列并在特定位点切割 4、同裂酶：来源不同，其识别位点与切割位点均相同的限制酶。 5、同尾酶：来源不同，识别的靶序列不同，但产生相同的黏性末端的酶形成的新位点不能被原来的酶识别。 6、限制性内切酶的活性：在适当反应条件下，1小时内完全酶解1ug特定的DNA 底物，所需要的限制性内切酶的量为1个酶活力单位。 7、星号活性：改变反应条件，导致限制酶的专一性和酶活力的改变。 8、DNA连接酶的特点：具有双链特异性，不能连接两条单链DNA分子或闭合单链DNA，连接反应是吸能反应，最适反应温度是4至15度，最常用的是T4连接酶。 9、S1核酸酶：特异性降解单链DNA或RNA。

(整理)专题一基因工程.(最新整理)

专题一基因工程单元测试 A卷一、选择题(共50分) 1．限制性内切酶的特点是( ) A．只能识别GAATTC序列 B．识别特定的核苷酸序列和具有特定的酶切位点 C．识别黏性末端 D．切割质粒DNA的标记基因 2．上海医学遗传研究所成功培育出第一头携带白蛋白的转基因牛，可以想象这头牛( ) A．发生了基因突变 B．发生了染色体变异 C．发生了基因重组 D．没发生可遗传的变异 3．“工程菌”是指( ) A．用物理或化学方法诱发菌类自身某些基因得到高效表达的菌类细胞株系 B．用遗传工程的方法，把相同种类不同株系的菌类通过杂交得到的新细胞株系 C．用基因工程的方法，使外源基因得到高效表达的菌类细胞株系 D．从自然界中选择出的能迅速增殖的菌类 4．基因工程技术也称为DNA重组技术，其实施必须具备的四个必要条件是( ) A．目的基因限制性内切酶运载体受体细胞 B．重组DNA RNA聚合酶内切酶连接酶 C．模板DNA信使RNA质粒受体细胞 D．工具酶目的基因运载体受体细胞 5．用DNA限制酶切割DNA时识别的核苷酸序列和切口是( ) A．一种限制酶只识别一种核苷酸序列，有专一性酶切位点 B．一种限制酶在DNA双链上识别的核苷酸序列不同 C．一种限制酶在DNA双链上识别的核苷酸序列相同，但酶切位点不同 D．一种限制酶在DNA双链上识别的核苷酸序列和酶切位点都不同 6．根据mRNA的信息推出并获取目的基因的方法是( ) A．用DNA探针测出目的基因 B．用mRNA探针测出目的基因 C．用mRNA反转录形成目的基因 D．用PCR技术扩增mRNA 7．在人类染色体DNA不表达的碱基对中，有一部分是串联重复的短序列，它们在个体之间具有显著的差异性，这种短序列可用于( ) A．生产基因工程药物 B．侦查罪犯 C．遗传病的产前诊断

生物选修三基因工程习题(打印)

生物选修3专题一基因工程习题一．单选题： 1．下列有关基因工程的叙述，正确的是：（） A ．DNA 连接酶的作用是将两个黏性末端的碱基连接起来 B ．目的基因导入受体细胞后，受体细胞即发生基因突变 C ．目的基因与运载体结合的过程发生在细胞外 D ．常使用的运载体有大肠杆菌、噬菌体和动植物病毒等 2．下列关于基因工程的叙述，正确的是：（） A ．基因工程经常以抗菌素抗性基因为目的基因 B ．细菌质粒是基因工程常用的运载体 C ．通常用一种限制性内切酶处理含目的基因的DNA ，用另一种处理运载体DNA D ．为育成抗除草剂的作物新品种，导入抗除草剂基因时只能以受精卵为受体 3．下列四条DNA 分子，彼此间具有粘性末端的一组（） ① ② ③ ④ A ．①② B ．②③ C ．③④ D ．②④ 4．下面图中a 、b 、c 、d 代表的结构正确的是：（） A ．a —质粒RNA B ．b —限制性外切酶 C ．c —RNA 聚合酶 D ．d —外源基因 5．目的基因与运载体结合所需的条件是：（） ①同一种限制酶 ②具有标记基因的质粒 ③RNA 聚合酶 ④目的基因 ⑤DNA 连接酶 ⑥四种脱氧核苷酸 ⑦ATP A ．①②③④⑤⑥⑦ B ．①②④⑤⑥⑦ C ．①②③④⑤⑦ D ．①②④⑤⑦ 6．科学家用纳米技术制造出一种“生物导弹”，可以携带DNA 分子。把它注射入组织中，可以通过细胞的内吞作用的方式进入细胞内，DNA 被释放出来，进入到细胞核内，最终整合到细胞染色体中，成为细胞基因组的一部分，DNA 整合到细胞染色体中的过程，属于( ) A ．基因突变 B ．基因重组 C ．基因互换 D ．染色体变异 7．人们常选用的细菌质粒分子往往带有一个抗菌素抗性基因，该抗性基因的主要作用是 A . 提高受体细胞在自然环境中的耐药性 ( ) B. 有利于对目的基因是否导入进行检测 C. 增加质粒分子的分子量 D ．便于与外源基因连接 8．下列不可作为基因工程中的标记基因的是：（） A ．抗性基因 B ．发光基因 C ．产物具有颜色反应的基因 D ．贮藏蛋白的基因 9．如果科学家通过转基因工程，成功地把一名女性血友病患者的造血干细胞进行改造，使其凝血功能恢复正常。那么，她后来所生的儿子中：（） A ．全部正常 B ．一半正常 C ．全部有病 D ．不能确定 10．下表关于基因工程中有关基因操作的名词及对应的内容，正确的组合是：（） 11．1987年，美国科学家将萤火虫的萤光素基因转入烟草植物细胞，获得高水平的表达。长成的植物通体光亮，堪称自然界的奇迹。这一研究成果表明：（） ①萤火虫与烟草植物的DNA 结构基本相同 ②萤火虫与烟草植物共用一套遗传密码 ③烟草植物体内合成了萤光素 ④萤火虫和烟草植物合成蛋白质的方式基本相同 A ．①和③ B ．②和③ C ．①和④ D ．①②③④ 12．人们常用DNA 进行亲子鉴定。其原理是：从被测试者的血滴或口腔上皮提取DNA ，用限制性内切酶将DNA 样本切成特定的小片段，放进凝胶内，用电泳推动DNA 小片段分离，再使用特别的DNA “探针”去寻找特定的目的基因。DNA “探针”与相应的基因凝聚在一起，然后，利用特别的染料在X 光下，便会显示由DNA 探针凝聚于一起的黑色条码。被测试者这种肉眼可见的条码很特别，一半与母亲的吻合，一半与父亲的吻合。反复几次过程，每一种探针用于寻找DNA 的不同部位形成独特的条码，用几组不同的探针，可得到超过99.9%的父系分辨率。请问，DNA “探针”是指：（） A ．某一个完整的目的基因 B ．目的基因片段的特定DNA C ．与目的基因相同的特定双链DNA D ．与目的基因互补的特定单链DNA 13．2003年我国科学工作者用基因工程迅速研制出“非典”诊断盒。其作用及机理是：（） A ．治疗“非典”,利用的是抗原抗体反应 B ．诊断“非典”,利用的是DNA 分子杂交原理 C ．诊断“非典”，利用的是抗原抗体反应 D ．治疗“非典”，利用的是DNA 分子杂交原理 T A G G C C A T T A C C G G T A