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CRISPR RNA-guided activation of endogenous human genes

genome of human cells using 16 pre-validated sgRNAs (Supplementary Results and Supplementary Table 1) designed to bind sequences within three DNase I hyper-sensitive sites (HSSs) located upstream, downstream or at the VEGFA gene transcription start site (Fig. 1b). 15 of these 16 sgRNAs (designated V1-V16) induced significant increases in VEGFA protein expression when co-expressed with dCas9-VP64 in human 293 cells (Fig.1c). Expression of a codon optimized dCas9-VP64 did not enhance the level of VEGFA activation observed (Supplementary Fig. 1). Expression of each of the 16 sgRNAs alone,dCas9-VP64 alone, or dCas9-VP64 together with an “off-target” sgRNA designed to bind an EGFP reporter gene sequence all failed to induce elevated VEGFA expression (Fig. 1c). In addition, experiments with a subset of three sgRNAs demonstrate that activation depends on the presence of the VP64 domain in the dCas9-VP64 fusion (Supplementary Results).We next tested whether RNA-guided activators could also induce expression of the human NTF3 gene. To do this, we used six sgRNAs targeted to sequences within a predicted DNase HSS in the human NTF3 promoter and codon-optimized dCas9-VP64 (Fig. 1d; Methods).All six sgRNAs induced significant increases in NTF3 transcript levels (Fig. 1e) with mean levels of activated expression varying over a four-fold range. Experiments with a subset of three sgRNAs showed that activation depends on the VP64 domain (Supplementary Results). Decreasing the amounts of sgRNA and dCas9-VP64 expression plasmids transfected resulted in less activation of the NTF3 gene (Fig. 1e), demonstrating a dose-dependent effect.We envisioned that expression of multiple guide RNAs in a single cell might enable synergistic activation of endogenous gene targets as recently described for TALE-based activators 12,13, thereby enabling combinatorial control of endogenous gene expression over a wide dynamic range. Co-expression of dCas9-VP64 with four sgRNAs (V1, V2, V3 and V4) as well as with subsets of three of these four sgRNAs induced synergistic activation of VEGFA protein expression (i.e.—levels of expression significantly greater than the

expected additive effects of individual activators) (Fig. 2a). Similarly, co-expression of

dCas9-VP64 with three sgRNAs (N4, N5, and N6) and all possible pairs of these sgRNAs

led to large increases in NTF3 expression with three of the four combinations yielding a

mean NTF3 mRNA level greater than the expected additive effects of the individual

activators (Fig. 2b). Because synergy is mediated by binding of multiple activators to a

single promoter, our results strongly suggest that multiple sgRNA/dCas9-VP64 complexes

can function efficiently together in a single cell.

Our experiments define an RNA-guided activator platform that can be easily used to induce

expression of endogenous genes in human cells. 21 of 22 sgRNAs tested successfully

induced significant gene activation at the VEGFA and NTF3 gene promoters (although these

activators showed substantial variability in activity even when targeted to the same locus

(Supplementary Discussion)). However, the magnitude of VEGFA and NTF3 gene

expression increases induced by our dCas9-VP64 activators generally appeared to be lower

than what we previously observed using VP64-based TALE activators at these same

endogenous genes.12 Larger-scale testing will be needed to more definitively determine the

relative success rates and potencies of RNA-guided activators and TALE-based activators in

human cells.

An important priority for future experiments will be to define the extent of off-target effects

induced by RNA-guided activators. sgRNA-guided Cas9 nuclease can induce off-target

mutations at sites that differ by as many as five positions from the on-target sequence in

human cells but bona fide off-target sites can be difficult to predict 14. However, although

nucleases can in principle alter the DNA sequence of any off-target site, a transcriptional

activator may not always induce changes in gene expression when it binds to an off-target

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site. Consistent with this, we note that a recent study found minimal, if any, changes in gene

expression changes in human cells (as measured by RNA-Seq) induced by an RNA-guided

dCas9-KRAB repression domain fusion 10. Additional studies will be needed to determine

whether this high degree of specificity is a general property of RNA-guided dCas9 fusions.

In summary, our results (and those recently reported by others 10) provide proof-of-principle

that heterologous effector domains can be fused to dCas9 without disrupting its ability to

complex and function with sgRNAs in mammalian cells. These findings open the door to

fusion of dCas9 to other novel effector domains (e.g.--histone modifying enzymes,

modifiers of DNA methylation). The simplicity of sgRNA-mediated targeting together with

the ability to recruit dCas9 fusions in multiplex fashion should enable important applications

of these tools for biological research and synthetic biology.Online Methods Construction of sgRNA expression plasmids Pairs of DNA oligonucleotides encoding the variable 20 nt sgRNA targeting sequences were annealed together to generate short double-strand DNA fragments with 4bp overhangs (Supplementary Table 2). These fragments were ligated into BsmBI-digested plasmid pMLM3636 to yield DNA encoding a chimeric +103 single-chain guide RNA 3,5 under the expression of a human U6 promoter. The pMLM3636 plasmid and its full DNA sequence are available from Addgene (https://www.wendangku.net/doc/a2164091.html,/crispr-cas ).Construction of dCas-VP64 expression plasmids DNA encoding the Cas9 nuclease harboring inactivating D10A/H840A mutations (dCas9)was amplified by PCR from plasmid pMJ841 (Addgene plasmid #39318) using primers that add a T7 promoter site 5’ to the start codon and a nuclear localization signal at the carboxy-terminal end of the Cas9 coding sequences and cloned into a plasmid containing a CMV

promoter as previously described 3 to yield plasmid pMLM3629. Oligonucleotides encoding

a triple FLAG epitope were annealed and cloned into XhoI and PstI sites in plasmid

pMLM3629 to generate plasmid pMLM3647 expressing dCas9 with a C-terminal flag

FLAG tag. DNA sequence encoding a Gly 4Ser linker followed by the synthetic VP64

activation domain was introduced downstream of the FLAG-tagged dCas9 in plasmid

pMLM3647 to yield plasmid pSL690. The D10A/H840A mutations were also introduced by

QuikChange site-directed mutagenesis (Agilent) into plasmid pJDS246, which encodes a

FLAG-tagged Cas9 sequence that has been codon optimized for expression in human cells,

to yield plasmid pMLM3668. DNA sequence encoding the Gly 4Ser linker and the VP64

activation domain were then cloned into pMLM3668 to yield a codon-optimized dCas9-

VP64 expression vector named pMLM3705. The full amino acid sequence of the dCas9-

VP64 protein is shown in Supplementary Figure 6.

Cell culture and transfection

Human Flp-In T-Rex HEK293 cells were obtained from Life Technologies and cultured and

transfected as previously described 12. Cells were tested every two weeks for mycoplasma

contamination. Briefly, all transfections were performed in triplicate using Lipofectamine

LTX (Life Technologies). For transfections involving regulation of VEGFA , 160,000 cells

were seeded into 24 well plates the day before transfection. 250 ng of plasmid encoding

VEGFA -targeted sgRNA, 250 ng of plasmid encoding dCas9-VP64 or recoded dCas9-

VP64, and 30 ng pmaxGFP plasmid (Lonza) were co-transfected using 0.5 μl PLUS reagent

and 2.65 μl Lipofectamine LTX. For synergy experiments, the amount of each sgRNA was

kept constant such that all transfections contained 62.5 ng of each sgRNA and empty U6

promoter plasmid was used to fill up to a total of 250 ng. For transfections involving

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regulation of NTF3, 350,000 cells were seeded in 12 well plates the day before transfection.

100, 250, or 500 ng of plasmid encoding NTF3-targeted sgRNA, 250ng or 500ng of plasmid

encoding codon optimized dCas9-VP64, and 60 ng pmaxGFP plasmid (Lonza) were co-

transfected using 1 μl PLUS reagent and 2.1, 2.65, or 5.1 μl Lipofectamine LTX,

respectively. For synergy experiments, the amount of each sgRNA was kept constant such

that all transfections contained 83.3 ng of each sgRNA and empty U6 promoter plasmid was

used to fill up to a total of 500 ng.

Enzyme-Linked Immunoblot Assays of VEGFA protein

Culture medium of Flp-In T-Rex HEK293 cells transfected with plasmids encoding

VEGFA -targeted sgRNA and dCas9-VP64 was harvested 40 hours post-transfection and

VEGFA protein expression was measured by ELISA as previously described 12.

Quantitative reverse-transcription polymerase chain reaction (qRT-PCR)

Total RNA from Flp-In T-Rex HEK293 cells transfected with plasmids encoding NTF3-

targeted sgRNAs and codon-optimized dCas9-VP64 was isolated two days post-transfection

using the PureLink RNA Mini Kit (Ambion) and treated with TurboDNA-Free (Ambion)

according to manufacturer’s instructions. NTF3 mRNA levels were measured by

quantitative RT-PCR using a Taqman assay as previously described 12Supplementary Material Refer to Web version on PubMed Central for supplementary material.Acknowledgments This work was supported by a National Institutes of Health (NIH) Director’s Pioneer Award DP1 GM105378, NIH R01 NS073124, NIH P50 HG005550, Defense Advanced Research Projects Agency (DARPA)

W911NF-11-2-0056, and the Jim and Ann Orr Massachusetts General Hospital Research Scholar Award. We thank

Jeffry D. Sander for providing plasmid pJDS246 and for helpful discussions.

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Figure 1. RNA-guided activation of endogenous human genes

(a ) Schematic depicting recruitment of dCas9-VP64 fusion protein to a specific genomic target sequence by an sgRNA. (b ) 16 sgRNAs targeted to the endogenous human VEGFA gene promoter. Red arrows represent the first 20 nts of the sgRNA pointing 5’ to 3’. Grey bars indicate DNaseI hypersensitive sites previously defined in human 293 cells 15,

numbered relative to the transcription start site (black arrow). (c ) Activation of VEGFA protein expression in 293 cells by various sgRNAs, each expressed with (blue bars) or without (red bars) dCas9-VP64. Asterisks indicate samples that are significantly elevated above the off-target control as determined by a paired, one-sided t-test (n = 3, P < 0.05);error bars represent s.e.m. (d ) Six sgRNAs targeted to the endogenous human NTF3 gene promoter represented as in (b) Grey line indicates region of potential open chromatin

identified from the ENCODE DNaseI hypersensitivity track on the UCSC genome browser with the thicker part of the bar indicating the first transcribed exon. Numbering shown is relative to the transcription start site (black arrow). (e ) Activation of NTF3 gene expression by RNA-guided dCas9-VP64 in 293 cells. Relative expression of NTF3 mRNA is shown for 293 cells co-transfected with the indicated amounts of codon-optimized dCas9-VP64 and NTF3 -targeted sgRNA expression plasmids. Asterisks indicate samples that are

significantly greater than the off-target sgRNA control as determined by a paired, one-sided t-test (n = 3, P < 0.05); error bars represent s.e.m.

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Figure 2. Synergistic activation of the endogenous human VEGFA and NTF3 genes by RNA-

guided activators

(a ) Multiplex sgRNA expression induces synergistic activation of VEGFA protein

expression by dCas9-VP64 protein. The calculated sum of mean VEGFA protein expression induced by individual sgRNAs is shown for each combination as green bars. Asterisks

indicate all combinations that were found to be significantly greater than the expected sum as determined by an analysis of variance (ANOVA) (n = 3, P < 0.05). Error bars represent standard errors of the mean. (b ) Multiplex sgRNA expression induces increased activation of NTF3 mRNA expression by dCas9-VP64 protein. Relative expression of NTF3 mRNA is shown for 293 cells in which the indicated individual or combinations of sgRNAs were co-

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expressed with dCas9-VP64. The calculated sum of mean NTF3 mRNA expression induced

by individual sgRNAs is shown for each combination as green bars. P values were

determined by a paired, one-sided T-test (n = 3). Error bars represent standard errors of the NIH-PA Author Manuscript

mean.

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冲突+行动+结局=故事

转自龙空。感谢墨文诚的分享—— 这篇帖子的主要目的是让更多刚刚写作的新手了解小说的基本结构，并且知道如何去用写作技巧完善自己的小说，同时也是对我自己学习写作技巧的一种总结和深化。（感谢小说写作教程：虚构文学速成全攻略这本书）当然，在写作这条举步维艰的路上，我同样只是刚刚起步，所以如果你有什么想法或者建议请加，让我们共同进步！本群欢迎您的加入！在探讨写作技巧之前，我有一个问题想问你们，你们知道什么是小说的基本结构？我猜你现在一定很不屑一顾的告诉我，这个问题太简单了！开始！中间！结尾！的确，这个问题实在是太简单，太基础了，甚至看上去我问的问题真的很愚蠢！但是为什么同样是这三个基本元素构成的小说，有的会大卖而有的不会呢？这就是我们接下来讨论的问题。为了更好的理解，我把这三个元素扩展延伸开来：开始=吸引力、中间=期待感、结尾=满足感。现在他们不再是定义而变得鲜活起来，也明确了每个部分应当实现的目标。什么是小说的吸引力？就是能吸引读者的注意力！当你创造出的主要角色遇到非解决不可的问题时，这就是吸引力！你要让你的读者产生这样的想法：我真想知道主角是如何解决这个难题的！

什么是小说的期待感？你要让读者感到将有更多有趣的事情将要发生！因为读者希望主角成功，也因为希望主角成功，所以主角必须行动起来，要去克服重重困难，一个接一个的障碍！什么是小说的满足感？当你的主角通过他竭尽其能的手段终于克服了一个又一个的障碍后，也就迎来了故事的结局。不管最后的结局是喜是悲，读者都对故事的完整性而感到满足。现在我又有了一个新的问题，我们应该如何在小说的每个阶段达到应有的目标呢？让我们再来把三个要素深化一下：开始=吸引力=冲突、中间=期待感=行动、结局=满足感=解决问题。在讲解之前，你先看看下面这个故事：王瑞喜欢班上的一个女生，他和他的朋友说：“如果我能跟她在一起，真的太美妙了！你看她很漂亮也很温柔！” 于是他的朋友鼓励他：“你要是真的喜欢她，就一定要去表白！” 终于有一天王瑞鼓起勇气表白了，那个女生听完他的表白很羞涩的点了点头说道：“其实我也喜欢你！” 于是他们手拉着手走在了一起。你看这个结局多么的美满幸福，可是这个故事有趣吗？可信度高吗？你有幸福感吗？没有！什么也没有！

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小学语文《西顿动物故事的结局》群文阅读教案设计

《西顿动物故事的结局》群文阅读活动目标： 1、采用“群文阅读”形式，促进个性化阅读与合作性阅读的融合。 2、通过比较阅读感受西顿作品的悲剧结局，体会悲情情，引起心灵共鸣。 3、创编结局，感受结局对整个故事的意义。活动准备：色 1、课前阅读西顿动物小说《遛蹄的野马》、《泉原狐》、《信鸽阿诺》。 2、多媒体课件制作。 3、小组阅读单和小圆片。活动过程：第一板块：聚焦结局，探究发现 1、今天的阅读课，我们来读西顿的动物故事。（出示题目《泉源狐》《信鸽阿诺》《遛蹄的野马》）这三篇文章都是西顿动物小说的节选。因为篇幅很长，所以提前让大家读了，简单地介绍一下故事情节。 2、介绍得不错，现在我们可以切入正题了，来聊一聊动物故事的结局。（板书：动物故事的结局）3、用快速浏览的方式继续阅读这三个故事，重点关注结尾部分，分别用一个词语概括出故事的结局，写在结尾处。 4、小组讨论故事的结局，完成小组阅读单。任务单题目故事结局《泉源狐》毒子离乡《信鸽阿诺》葬身隼爪

《遛蹄的野马》跳崖身亡 5、组际分享：（选两组贴于黑板，预设《泉原狐》比较） 6、故事的结局都已呈现在我们眼前，把这三个结局联系起来看看，再联系一下故事，你发现有什么相同点，又有什么不同点？预设：相同点——主人公都可怜地死去，非常悲惨；都受到了人类的迫害；不同点——死去的方式各不相同；造成这样结局的原因也不同。第二板块：结局背后，各述喜恶 1、尽管死的原因不同、方式不同，结局却都充满了悲情色彩。对于西顿这样的写法，作为一个读者，你喜欢吗？喜欢的用这个手势，不喜欢的用拳头。 2、跟与你观点相同的同学就近组合成三到五人的小组，去交流探讨喜欢抑或不喜欢的理由，看哪组理由最充分。合作提示： ◆说说理由。 ◆整合理由。 ◆写关键词。 3、组际交流，贴关键词，分享理由。 4、喜欢不喜欢，理由都很充分，都是你们真实的阅读感受。有人是这样诠释西顿动物故事的悲剧结局的。（链接资料：西顿动物小说充分尊重动物的个性，没有任何人为虚构。在生存的本能前提下，它们不虚不假，真性真情。对于一些精神层面的执著，动物们比人要真实、勇敢，它们甚至不在乎死亡，因为比死亡让它们更在意的东西有很多，比如自由、尊严、忠诚、信任……）小结：的确，西顿动物故事的悲剧结局是来源于现实世界里动物们真实的情感和生存状态，真实的总会被存在，感动的总会被喜欢，所以西顿动物小说风靡世界一百多年，全球销量上亿册。

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给故事一个结局

【题记：这是朋友给我讲的真实故事的其中一则，其中的两位主人公皆是朋友的同学。这么些天来我就一直在酝酿某种情感，我在想，应该用自己的笔触，采用怎样的写作手法将其原汁原味的呈现于读者的视野心间？思索再三，终是谈不上什么写作技巧，还是想为这则故事添些枝加些叶，但力求接近生活的真实！】（一）他的画就如他的眸子，深邃却又不失其清澈，意蕴悠远，总是易使人浮想联翩，恍若梦境！若熙已经在他的画展前足足站了三个多小时，直到来参观画展的同学、老师零零散散的散去，她才踩着一路的轻歌，不紧不慢的踱回教室！这个被全校公认的“未来的画家”一直是她的骄傲！冯慕轩，他就像他画里的风景，让她沉醉。若用一个很贴切的词来形容他们之间有小到大走过的历程，那就是“青梅竹马”！慕轩一直很内向，不擅交流，表达，只是把思想寄于画间。庆幸的是，他们住对门，有更多可以相处的机会，但每晚和若熙一同写作业，除了探讨些学校的情况，班级的琐事，从不涉及其它。若熙更是腼腆的如一剪弯月，映照着他的眸子，盈盈然听其略带磁性的嗓音如流淌的优美乐曲。带着一点点的遗憾，也带着如许的知足，高三的生活即将结束，毕业的脚步款款而来，面临着最后的冲刺，他们是否还能够像小学、初中、高中这样同步一个学堂？慕轩想过，凭若熙的能力，名牌大学触手可及；若熙也想过，普通大学相对于慕轩的功底也没有什么问题，可是......可是什么呢？担心？还是恐惧分离？若熙心底那份隐秘的情感在这个关键的时刻是那样的急于表达和宣泄！可是她无从知晓慕轩的心思，一直以来，他的心思就在他的画里，而他却一直在她的梦里！终于，她找到了一个恰当的时机告诉给了她的闺蜜！对他的欣赏，对他的渴慕，对他的依恋，对他的沉迷...... 闺蜜默然，在未来还未决定的最后阶段，情感太苍白无力。（二）若熙如愿以偿的拿到了另一个城市一所名牌大学寄来的录取通知书！慕轩意料之中的留在了本地！临别，慕轩送她到了车站，他嗫嚅着，颠三倒四的重复着一句话：注意身体，路上注意安全！若熙凝视着这个伴他走了十二个春、夏、秋、冬的大男孩，竟无语凝咽！别过脸，她无奈的一转身迅疾的踏进了车，门合上的瞬间，他挥动的双手永远留在了她含泪的视线里！车行驶的越来越远，慕轩的身影却越来越清晰，就像若熙的心，一直与他相依。 “我每天会发信息给你，一定要回！把你的情况如实的告诉我啊？”随着短信息的发送，若熙知道，她的日子里又多了一项日程，那就是牵挂和殷殷的期盼！慕轩还真的挺听话，每天一条短信，最多的内容是他的画展，有一次，他竟然给她打了一个小时的电话，只是想要告诉她，他的画在市组织的画展中获奖，并拿了500元的奖金！若熙在电话里捕捉着他的快乐！她默默聆听着，是的，从始至终她就知道，慕轩一定能行，他的天赋和灵性融进了画里，他的灵魂融进了画里.....

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中国石油局级单位列表油田企业：中国石油大庆油田公司中国石油辽河油田公司中国石油长庆油田公司中国石油塔里木油田公司中国石油新疆油田公司中国石油西南油气田公司中国石油吉林油田公司中国石油大港油田公司中国石油青海油田公司中国石油华北油田公司中国石油吐哈油田公司中国石油冀东油田公司中国石油玉门油田公司中国石油浙江油田公司（中国石油南方勘探开发有限公司）中石油煤层气公司中国石油对外合作经理部炼化企业：中国石油大庆石化公司中国石油吉林石化公司中国石油抚顺石化公司中国石油辽阳石化公司中国石油兰州石化公司中国石油独山子石化公司中国石油乌鲁木齐石化公司中国石油宁夏石化公司中国石油大连石化公司中国石油大连西太平洋石油化工有限公司中国石油锦州石化公司中国石油锦西石化公司中国石油大庆炼化公司中国石油哈尔滨石化公司中国石油广西石化公司中国石油四川石化公司中国石油广东石化公司中国石油大港石化公司中国石油华北石化公司中国石油呼和浩特石化公司中国石油辽河石化公司中国石油长庆石化公司中国石油克拉玛依石化公司中国石油庆阳石化公司中国石油东北炼化工程公司中国石油炼化工程建设公司中国石油东北化工销售公司中国石油西北化工销售公司中国石油华东化工销售公司中国石油华北化工销售公司中国石油华南化工销售公司中国石油西南化工销售公司中国石油吉林燃料乙醇公司销售企业：中国石油东北销售公司中国石油西北销售公司中国石油燃料油销售公司中国石油润滑油公司中国石油辽宁销售公司中国石油四川销售公司中国石油广东销售公司中国石油内蒙古销售公司中国石油北京销售公司中国石油上海销售公司中国石油黑龙江销售公司中国石油河北销售公司中国石油新疆销售公司中国石油山东销售公司中国石油陕西销售公司中国石油吉林销售公司中国石油江苏销售公司中国石油甘肃销售公司中国石油河南销售公司中国石油湖北销售公司中国石油浙江销售公司中国石油云南销售公司中国石油重庆销售公司中国石油湖南销售公司中国石油安徽销售公司中国石油广西销售公司中国石油福建销售公司中国石油大连销售公司中国石油山西销售公司中国石油天津销售公司中国石油宁夏销售公司中国石油贵州销售公司中国石油青海销售公司中国石油江西销售公司中国石油西藏销售公司中国石油海南销售公司中国石油大连海运公司天然气与管道储运企业：北京油气调控中心中国石油管道建设项目经理部中国石油管道公司中国石油西气东输管道公司北京天然气管道公司中国石油西部管道公司中国石油唐山液化天然气公司中国石油大连液化天然气公司中国石油江苏液化天然气公司中国石油华北天然气销售公司

故事里的巧妙结局

群文阅读《故事里巧妙的结局一组》 (2013-12-27 13:30:38) 转载▼ 分类：教学设计故事里巧妙的结局一组何玲姓名何玲年级六年级议题群文阅读 ——故事里巧妙的结局一组选文篇目及来源选自《学语文之友》上的《摩尔根掉井里去了》、《老鼠夹》、《遗嘱与狗》教学目标1、把握故事的主要内容。 2、知道故事真相到最后点出，这么安排的好处。 3、巧妙的故事结局带给我们的启示。 4、掌握并正确运用各种阅读方法。教学重点把握三个故事的主要内容。掌握并正确运用各种阅读方法。教学步骤一、谈话引入，激发兴趣 1、孩子们，都喜欢听故事吗？（想）今天，老师给你们带来一个很有趣的故事，名字叫《摩尔根掉井里去了》。听—— 2、PPT出示故事题目，听讲故事。 3、老师过渡：咦，故事听到这里却没有了结尾，聪明的你们有兴趣来猜一猜吗？二、学生猜想结尾。 1、学生猜想预设：（1）消防队员救出了摩尔根。

附：阅读材料

摩尔根掉井里去了（美）史梯曼徐建华/译男孩比尔住在爷爷家。这天，爷爷外出干活，比尔便像往常一样，和他的好朋友摩尔根在家门前的枯井边玩耍。可是没过多久，摩尔根却不小心掉进了枯井里！比尔连忙走过去，俯身向黑漆漆的井里探望：井很深，什么也看不见。就在这时，一个老人经过这里，看见比尔向井里俯着身子。 “你在看什么？”老人问。 “摩尔根掉井里去了。”比尔说。 “摩尔根是谁呀？”老人问。 “摩尔根，我的好朋友。”比尔回答。 “我希望你的朋友没有伤着。”老人走到了井边，关切地说，“井下的孩子没事儿吧？” 这时，黑漆漆的井里传来了摩尔根“哇哇哇”的声音，这在老人听起来像是在说“我没法爬上去”。因为老人已经很老了，所以他的耳朵并不是太好使。这时，爷爷的邻居，一位大叔打井边经过。 “这儿发生了什么事？”邻居问。 “摩尔根掉井里去了。”老人答道。当邻居从老人的口中得知摩尔根是男孩的好朋友时，马上说：“小孩子千万别到井边玩耍。”然后转身对比尔说，“摩尔根准是比你笨多了。” 接着，邻居的太太也走了过来。

我还在等待这个故事的结局

我还在等待这个故事的结局其实我也不知道想说的，是什么样的故事，而这个故事会是什么样的结局。我也不知道想要的，又会是什么样的明天。我不知道。也许故事的一切，都只不过是一场长长的电影，或者是一部长长的小说，也许这个故事，就是未完待续的。塞北的夏天，不会太热。但对我这样苦*的上班族来说，骑车在柏油路里穿梭，即使在这样凉快的夏天，也还是有炎热的风吹在脸上，挡不住的汗一点一点浸湿速干衣。骑车上班不是因为没有钱坐车，公司的班车总是很准时地从西城出发。骑车是因为自己觉得身体需要锻炼，需要在骑车的过程中将一天中所有不好的情绪踩走。于是，总是飞快地蹬着踏板，无所谓路两旁的杨柳和穿梭的人流和车流。初夏那时候，风吹过的街道上会飞扬起朵朵的杨花，每当这时候，我总是会忍不住伸出手，试图去抓住一些飞舞着的纯净。路过垂下的柳树，也会不管不顾地将双手放开车把，好触摸心动的绿绦。我喜欢纯净的白，喜欢醉人的绿，也欢空明的蓝。我认为这几种色彩，真的就是我内心天真的写照。喜欢看的，都是没有任何杂质的白，是一山连一山的绿，还有就是一整片一整片的蓝天和大海。而骑

车的时候，正好有蓝天，有白云，有绿柳。都是喜欢的色彩。每天晚上，我都会在下班后，6点到9点，到一个不怎么有名的Times咖啡馆里驻唱。每次到这，我就会换上一件蓝色的短袖运动上衣，宽松的可以遮住半条大腿，不像上班时候的衬衫那么紧凑，压抑。头发也永远是那么错乱，像是一个流浪歌手一样。但即使这样，我却感觉很开心，在这唱着自己愿意唱的歌，轻柔的小调响起的时候，好像每一个音符都能够走入我的心一样。所以每个人看到我唱的时候，我的脸上总是会带着一抹阳光，微笑地望着墙面上暗暗的灯光。她在一家国企上班，我总是看到她独自来到这个不怎么出名的咖啡馆，安静地坐在离我不远的地方。她总是穿着一身蓝色的裙子，一头烫过的大波浪长发，黑发染带些深金色，弯月般细腻的眉毛，黑珍珠样的灿烂的眼睛，小小的嘴唇紧抿着，暗暗的灯光照在她脸上，映着她的蓝，略显得有些忧伤。有一天，她说，她喜欢我唱的轻柔的小曲，喜欢我穿着的简单的蓝。而我，喜欢她的安静，喜欢她跟我聊天的自然。偶尔有些天，她不来这，我就会觉得心有些不安，不知道她那里出了什么样的状况。有时候她来得晚了，或是走得晚了，我都会等着，看着，悄悄地目送她回到她的家。

北京东方化工厂爆炸事故始末

历时1284天的艰难结案——北京东方化工厂?97.6.27?特大爆炸火灾事故结案始末 1997年?6.27?北京东方化工厂特大爆炸火灾事故已经过去了整整10年。这是一起艰难的结案，这是一次真实与虚假的较量，科学与权利的博奕，是坚守道德的良知、职业操守还是听命于权势的良心拷问。这起事故调查的处理历经3年半的时间，最终以科学与良知的胜出而告结束。今天，我们重新把它翻检出来，放到阳光下晾晒。在事故频发、安全生产形势尚未明显好转的今天，仍有现实意义，在事故处理中，我们谨防权力的介入而付出高昂的社会成本和降低政府的公信力。我们希望，能够把惨痛的事故教训变成宝贵的财富，化黑暗为光明，并照亮生命。罕见的大事故1997年7月1日，香港将告别—百多年的殖民统治回到祖国的怀抱。1997年5月11日，国务院召开全国安全生产电视电话会议，国务院副总理吴邦国在电视电话会议上强调，现在距香港回归只剩下50多天，党的十五大也将召开，一定要做好安全生产工作，创造一个良好的气氛。 6月27日，离香港回归仅剩3天时间，北京到处漾溢着节日的气氛，北京历史博物馆前竖立的巨型香港回归倒计时牌上，时间一分一秒地流逝，首都北京盛装装扮准备迎接这个隆重的日子。 6月27日晚上8点，一辆油罐车停在北京东方化工厂卸油站台上，准备向罐区卸油。北京东方化工厂隶属北京化工集团总公司，地处北京市通县，该厂原是一个生产丙稀酸脂的化工厂，1996年新建成为年生产能力为15万吨的乙烯裂解装臵和相配套的公用系统工程，厂区占地面积1800亩，职工4500人，是一家大型化工企业。 6月27日上午，原料罐区进行石脑油罐装作业。在晚8点前，石脑油A罐（共ABCD4个万立方米罐）已经装满。液面已达到13.7米。20点交接班后，上班的工人打开阀门，向原料区的B罐灌装轻柴油。9时许，现场作业的工人闻到一股强烈的油气味，正当操作工走出操作室在罐区查找泄漏时，9时27分，突然一声突如其来的大爆炸发生了。巨大的爆炸声响彻天空，瞬间火光四起，通县上空大火冲天。油罐区的罐顶和管架都燃起熊熊大火。15分钟后，21点42分，乙烯B罐（共有ABCD4台千立方米乙烯罐）发生了解体大爆炸，又一团火球升入天空，火焰高达数百米，火舌向外翻卷达五六十米。浓烟像原子弹爆炸后形成的蘑菇云，不断向上翻滚着。烈火的啸叫声，沉闷的爆炸声接连不断，大火映红了北京城东半个天空。接连不断的爆炸声把人们从睡梦中惊醒，惶恐的人们不知发生了什么，尽力向安全地带逃离。数公里内民房玻璃被震成碎片，远在30公里外河北省三河县有震感，河北省宝坻地震台测定，爆炸威力相当于一级地震。这次事故损失巨大，后果惨重，事故中有9人死亡，39人受伤，直接经济损失1.17亿元。事故中共烧毁油罐10座，其中万立方米原料罐6座，轻重油罐4座，乙烯B罐解体成7块残片飞出，其中最重的一块为46吨，飞出234米，另一块13吨，飞到厂外840米远的麦田里。乙烯A罐被炸倒在地，顶部爆有裂口，乙烯C、D罐出入口管线均已烧毁，戍烷罐腰部爆开了一个大口子，其余10多个油罐和球罐都有不同程度的烧损。油罐和球罐保温材料脱落，铁皮被炸飞，半地下油泵房爆炸倒塌。火车卸油站台的油罐车烧损，铁轨移位变形，多处管线管架倒塌烧毁。操作室天花板、门窗和表盘炸塌炸损。罐区周边的房屋及建筑物部分被摧毁，强烈的辐射热将罐区四、五平方公里内的树木全部烤焦。三个专家组

没有结局的故事

没有结局的故事我不知道这个世界上有没有真正的故事。走过了太多的生活，我们开始倦了，有意无意的我们都变得不是那么的认真，对待自己也好，对他人也罢，少了一份真诚的热烈，多了一份，我们称之为沧桑的淡漠。时间过得真的很快，眨眼间，我们从读故事的少男少女，长成了故事的主角，在流淌的生活中，演绎着属于我们自己的故事，并认真的刻录下我们走过的岁月。站在这看不见原点的地方，我们努力地回头，看着之前，我们走到这里所经过的的每一步每一条路，那些停留在记忆深处永远也难以忘记的人，那些让人欢喜让人伤心落泪的事，曾经的这一切，是故事麽？可却是那么真实。故事总会有一个开始，可记忆中的那段时光却是那么的模糊。我们常说那是一个意外，因为回忆的那个开端是那么的难以寻找，难以划分，就好像突然之间我们已经深深地入戏，我们知道那段故事里有他有她，可他们是怎么来到我们的故事里，却只有丝丝缕缕淡到无迹可寻。于是我们就只能放弃，刻骨铭心的永远是故事中的那份轰轰烈烈，或许悲伤或许幸福，可我们得知道，那些都不会是结局，因为我们的故事永远不会有结局。不管是主动还是被动，那些故事都已经开始，并将一直进行下去，而我们，也只有继续把它写完的权利，并没有选择的自由，

所以我们并不能就真的像是对待故事那样草率而不负责任，仅仅投入感情是远远不够的，认真的对待，我们不只是故事的主角，还是编者，虽然我们没有选择的权利，可是我们拥有改变的能力，或许我们所做的那些并不能让它彻头彻尾的改变，可是至少它不会再沿着原来的轨迹前进，也许就诊时这个小小的改变，我们就会远离悲剧，所以永远不要放弃。没有结局的故事，我们期待着可以有一个美好的过程，不要小看自己，想要幸福便去大胆的努力，已经发生的便不再是故事，想象之中，那便永远不会体会到那份心动，幸福也好，心痛也罢，你要真的将你自己的生活仅仅当做是故事，那么你永远不会得到那份真切的感情，睁开眼，这个世界需要你一步步前行，而不是在梦中的天空快活的翱翔，即使再自由，那也是梦。我们有梦想，但却不会活在幻想；我们有故事，但却很真实；我们有回忆，但更加期待明天。把握今天的每时每分，没有结局的故事，我也要给它画上一个完美的句号，然后写上自己的名字，告诉所有人，这是我的故事，与众不同。

中石化下属企业名单

中国石油化工集团直属企业如下(下属两大上市公司是仪征化纤、上海石化): 南京化学工业有限公司连云港碱厂西南石油局录井公司（四川绵阳）北京东方石油化工有限公司北京燕化有限公司环保事业部北京燕化合成橡胶事业部北京燕化石油化工股份有限公司化工一厂仪征化纤股份有限公司研究院（江苏扬州仪征）中国石化齐鲁分公司研究院（淄博）山东齐鲁科力化工研究院有限公司（淄博）山东齐隆化工股份有限公司（淄博）长炼催化剂厂成都华川石油天然气勘探开发总公司油建工程分公司北京燕山分公司炼油厂四川德阳新场气田开发有限责任公司中国石化石油勘探开发研究院中国石化天津石油化工公司化纤厂江苏油田分公司石油工程技术研究院燕化公司塑料分公司北京燕化研新技术开发公司齐鲁石化研究院科力化工公司中石化全国化工模型设计技术中心站江苏石油勘探局勘察设计研究院胜利油田广域科技有限责任公司胜利油田胜利设计科技开发公司北京石油分公司洛阳分公司炼油厂齐鲁石化公司胜利炼油厂江汉石油管理局测井工程处胜利测井公司中原石油勘探局基建工程监理公司上海高桥石化工程建设监理公司胜利石油管理局工程机械总厂中南石油局第五物探大队安徽石油勘探开发公司河南油田分公司地质调查处湖南建长石化股份有限公司河南油田工程建设监理中心北京燕山分公司炼油厂中国石化集团第二建设公司塔里木胜利钻井公司金陵石化有限责任公司烷基苯厂

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2021新版我国石化行业安全生产形势严峻

( 安全管理 ) 单位：_________________________ 姓名：_________________________ 日期：_________________________ 精品文档 / Word文档 / 文字可改 2021新版我国石化行业安全生产形势严峻 Safety management is an important part of production management. Safety and production are in the implementation process

2021新版我国石化行业安全生产形势严峻我国石化行业中，虽然3大石油石化公司事故呈下降趋势，但是仍然发生了一些重大甚至特大火灾、爆炸事故，造成群死群伤和重大财产损失，一些地方性质的石化企业更是事故多发，石化行业的安全生产形势十分严峻。 1化学事故多据美国CSB化学事故报告中心有关资料报导，2000年因化学事故造成人员死亡人数从多到少的国家依次为中国(136人)、刚果(109人)、乌克兰(82人)、尼日利亚(50人)、美国(47人)，如图1所示。尽管如此，这个数字也不能完全说明问题一是我国的统计数据不够准确，—些企业尤其是地方、乡镇企业存在漏报甚至瞒报事故的情况；二是如果按同样化工产量所造成的死亡数(即用相对死亡率)来进行比较，则统计结果会更加严峻。 2石化行业重大事故教训深刻

我国石化行业也发生过群死群伤的重大事故，不仅造成人员的巨大伤亡和财产的巨大损失，同时也影响到社会安定及我国的形象和声誉。1979年12月28日，吉林液化石油气厂由于在液化气球罐的设计制造、运行管理等方面存在的问题，导致运行中球罐破裂，酿成大火，造成36人死亡、50人受伤，直接经济损失约600万元，在社会上造成极大影响。1984年1月1日，大连石化公司丙烷脱沥青装置的丙烷抽出管线因焊接质量差，在运行中突然破裂，造成大量液化丙烷气体漏出，迅速扩散，发生空间爆炸，死亡5人、重伤18人，另有62人轻伤。近年来，重大事故仍时有发生：1997年6月27日，北京东方化工厂储罐区在装卸石脑油时，由于操作失误，造成石脑油油罐满，石脑油外溢，石脑油油气在大气中迅速扩散，遇火源发生爆炸和大火，邻近的乙烯球罐受外部烧灼并发生爆炸，引发特大爆炸和火灾事故，事故中死亡9人、伤39人，直接经济损失达1．17亿元。 1998年1月6日，陕西兴化集团有限责任公司化肥厂Ⅱ期硝铵装置生产运行中发生爆炸事故，造成22人死亡、6人重伤、52人轻

中石化下属分公司企业名录

中石化下属分公司企业名录中国石油化工集团直属企业如下(下属两大上市公司是仪征化纤、上海石化): 南京化学工业有限公司连云港碱厂西南石油局录井公司北京东方石油化工有限公司北京燕化有限公司环保事业部北京燕化合成橡胶事业部北京燕化石油化工股份有限公司化工一厂仪征化纤股份有限公司研究院中国石化齐鲁分公司研究院山东齐鲁科力化工研究院有限公司山东齐隆化工股份有限公司长炼催化剂厂成都华川石油天然气勘探开发总公司油建工程分公司北京燕山分公司炼油厂四川德阳新场气田开发有限责任公司中国石化石油勘探开发研究院中国石化天津石油化工公司化纤厂江苏油田分公司石油工程技术研究院燕化公司塑料分公司北京燕化研新技术开发公司齐鲁石化研究院科力化工公司中石化全国化工模型设计技术中心站江苏石油勘探局勘察设计研究院胜利油田广域科技有限责任公司胜利油田胜利设计科技开发公司北京石油分公司洛阳分公司炼油厂齐鲁石化公司胜利炼油厂江汉石油管理局测井工程处胜利测井公司中原石油勘探局基建工程监理公司上海高桥石化工程建设监理公司胜利石油管理局工程机械总厂中南石油局第五物探大队安徽石油勘探开发公司河南油田分公司地质调查处湖南建长石化股份有限公司河南油田工程建设监理中心北京燕山分公司炼油厂中国石化集团第二建设公司

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【关于悲伤】故事要怎么写,结局才不忧伤4

故事要怎么写，结局才不忧伤4 1、执笔忧伤却苍白了等待我抒尽满纸的忧伤，却留不住你眷顾的等待，无言的结局，荒凉了我流年落寞的时光。前世的回首，让我记住了这段不了情。牵挂的轮回伤痛，走在彷徨的路上，暗自忧伤。也许人生本来就是一场浮华的梦，缠缠绕绕的一场红尘走过，留下的也只不过是眼角的清浅泪水。流失的爱恨交织，孤独的身影只剩一抹浅浅的落寞微笑。往事轻拨了一段思念的心弦，深情的走向你，却拥抱不了你的衣袂飘飘。绝爱只忧伤了我指尖的美丽文字，如泣如诉了融进红尘深处的离愁，原来让我们记住的只是一段错过再错过的时光。无法尘封红尘缱绻的过往，更无法尘封自己的记忆，一行字，千行泪，要用多少时间抚平心底的忧伤？今生相逢是三千青丝的缠绵，然而却把执手相牵遗失在了从前。你的世界已无法等待这份情缘，我的世界也只有那片时即逝的情伤恋。尘缘只是昙花的瞬间一现，又有谁会怜惜它芬芳的短暂？几度梦红尘绵绵了惆怅，寂寞的漂泊，谁又能挽住谁的天涯？红尘深远了悲凉的梦境，失所流离了物是人非的时光。秋风起时，那季丹红的飘落约定了风的同行，握住了迷恋沉醉的地老天荒。望穿秋水的等待，繁华醉染了点点墨迹，涂画了红尘牵绊的爱恨情仇。恋恋风尘的相思也挽住了流年，等待着今生相欠的那一曲离殇。迷离的双眸凝眸了一盏孤灯的守候，朦胧的诱惑也总是易碎的梦。飘渺的极致美丽，无法拾叠起花落满地的匆匆凋零，更无法走近彼此思绪里搁浅的风景。不舍的牵挂默守着流浪的记忆，几世繁华云烟成了两岸之花。凝望的凄美等待，没有归宿的相思，在紫陌境迁中梦散走远。凄凉的远古幽怨为你深情驻守，回望的凄凄缠绵，湿了奈何桥上的回眸，也风雨飘摇了红尘路上的归期。烟火点燃了一季尘缘，却又在月缺月圆中消散，陌路擦肩，注定今生我们终究成为过客。悲伤的逆流成河，山水迢迢了誓言，我已不再是你的眷恋。一笺素纸倾尽了几世爱恋，转身离去却埋葬了三生石上的恩恩怨怨，前世的无悔等待也苍白了今生的执着。相关整本阅读：https://www.wendangku.net/doc/a2164091.html,/ebook/066697d3524de518964b7deb.html

中石化下属单位

中国石油化工集团直属企业如下（分布根据名字可知，注意，分公司还有下属企业，在此不表）：南京化学工业有限公司连云港碱厂西南石油局录井公司北京东方石油化工有限公司北京燕化有限公司环保事业部北京燕化合成橡胶事业部北京燕化石油化工股份有限公司化工一厂仪征化纤股份有限公司研究院中国石化齐鲁分公司研究院山东齐鲁科力化工研究院有限公司山东齐隆化工股份有限公司长炼催化剂厂成都华川石油天然气勘探开发总公司油建工程分公司北京燕山分公司炼油厂四川德阳新场气田开发有限责任公司中国石化石油勘探开发研究院中国石化天津石油化工公司化纤厂江苏油田分公司石油工程技术研究院燕化公司塑料分公司北京燕化研新技术开发公司齐鲁石化研究院科力化工公司中石化全国化工模型设计技术中心站江苏石油勘探局勘察设计研究院胜利油田广域科技有限责任公司胜利油田胜利设计科技开发公司北京石油分公司洛阳分公司炼油厂齐鲁石化公司胜利炼油厂江汉石油管理局测井工程处胜利测井公司中原石油勘探局基建工程监理公司上海高桥石化工程建设监理公司胜利石油管理局工程机械总厂中南石油局第五物探大队安徽石油勘探开发公司河南油田分公司地质调查处湖南建长石化股份有限公司河南油田工程建设监理中心北京燕山分公司炼油厂

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群文阅读《故事中的巧妙结局》教学案例

群文阅读《故事中的巧妙结局》教学案例教学目标：一、运用默读、浏览等方式感知文章大意。二、初步了解故事巧妙的结局的作用。三、通过群文阅读后，能创作意料之外，情理之中的故事结局。教学过程：一、由故事激趣导入。师：孩子们，故事伴随着我们长大，你一定看过不少有趣的故事。今天，老师也给大家带来了一个故事，你们想听吗? 生：想！师：（师讲《摩尔根掉井里了》）孩子们，今天老师讲得这个故事和你们看的故事有什么不一样呢？生：这个故事没有结局。师：是呀，故事到这儿就戛然而止了，没有结局，那我们来猜一猜这个故事的结局吧！生1：防员救出了摩尔根。生2：所有人齐心协力救出了摩尔根。生3：摩尔根死在了枯井里。 …… 师：孩子们可真能干，一个小小的故事竞能猜出这么多不同的结局，那大家想知道作者笔下的结局吗？（想）真相马上揭晓，请大家一起来读读故事的结局。

师：刚才我看到刚才在读的时候，很多同学都笑了，我想采访一下，你们为什么笑了？生1：这个结局太出乎意料了。生2：真是白担心了一场。生3：我觉得这个结局太搞笑了。 …… 师：是呀，这个故事的结局既有幽默又出乎意料，让我们感觉故事的结局是如此的巧妙，今天就让我们一起走进《故事中的巧妙结局》。其实，像这样结局巧妙的故事还有很多，老师还为大家准备了两篇，请大家快速拿出材料阅读，猜猜它们巧妙的结局吧！（兴趣是最好的老师，故事导入激发了学生学习的兴趣，调动教学气氛。让学生放手猜想故事结局更是激发学生的阅读兴趣，感受到了学习的快乐。）二、读故事，猜想巧妙的结局。出示自学要求： 1、采用浏览、默读等方式读故事。 2、选择自己最感兴趣的一个故事猜想出乎意料的结局。 3、小组内交流，推荐最出乎意料的结局。学生阅读材料《遗嘱与狗》《艾米利凯生病了》，并猜想故事结局，小组内交流。全班交流。

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