纸片法(KB)药敏实验原理及实际操作方法

纸片扩散药敏试验的原理：将含药物的纸片贴在接种有待测菌的固体培养基上，通过药物在培养基上的扩散，观察是否出现抑菌环，推断是否抑制细菌的生长。药物扩散的距离越远，药物浓度越低抑菌能力越强，因此可根据抑菌环的大小，判定药物对细菌的抑制作用强弱。药敏试验根据美国临床标准委员会(NCCLS) 推荐的K–B 琼脂法进行。本实验通过纸片药敏试验法观察多酸化合物对细菌有无抑制作用，为试管二倍稀释法提供有效基础数据。

用无菌棉拭子蘸取已经校正的0.5 麦氏比浊浓度的菌液，挤掉多余菌液。用棉拭子涂布整个MH 培养基表面，每次将平板旋转60°，涂抹三次，最后沿周边擦绕两圈，以保证菌液涂抹均匀。待平板上的水分被琼脂完全吸收后贴含药纸片。用无菌镊子取药敏纸片贴在平板表面，纸片一贴后不可再拿起。每个平板贴5 张纸片，纸片间距不少于24 mm，纸片中心距平皿边缘不少于15 mm。在菌接种后15 min 内贴完纸片。将平板反转，37℃恒温孵育18~24 h 后取出，用游标卡尺测量抑菌圈直径，由平板背面测量最接近的整数毫米数并记录，每个平板各设三个平行组平板，测量抑菌直径时，应取三个平板的平均值为最终结果。抑菌环边缘以肉眼见不到细菌明显生长为限。

每次药敏试验用大肠杆菌ATCC25922 和金黄色葡萄球菌ATCC25923 做质控。药敏判读标准根据CLSI 标准(2009 年) 所载受试药对质控菌的抑菌环直径范围作为实验质控标准（判读标准见表5-2）[84]。

表5-2 纸片扩散法－用质控菌株抑菌环直径(mm)允许范围监测抗菌药物敏感性试验准确

性

Table 5-2 Disc diffusion test －according the admissible range of quality-control strain’s

inhibition zone diameter to monitor the accuracy of antibiotics susceptibility test (mm)

抗菌药物纸片含药量

（μg）

抑菌环直径(mm)

S I R

大肠埃希菌

ATCC25922

金黄色葡萄球菌

ATCC25923

KF 30 ≥1815–17 ≤1416–22 27–35 AMP 10 ≥1714–16 ≤1328–35 27–28 CIP 5 ≥2116–20 ≤1530–40 22–30 NOR 5 ≥1713–16 ≤1215–21 29–37 KF: 头孢噻吩；AMP: 氨苄西林；CIP: 环丙沙星；NOR: 诺氟沙星；S: 敏感；I: 中介；R: 耐药

药敏试验方法

一、纸片扩散法 该法是将含有定量抗菌药物的滤纸片贴在已接种了测试菌的琼脂表面上，纸片中的药物在琼脂中扩散，随着扩散距离的增加，抗菌药物的浓度呈对数减少，从而在纸片的周围形成浓度梯度。同时，纸片周围抑菌浓度范围内的菌株不能生长，二抑菌范围外的菌株则可以生长，从而在纸片的周围形成透明的抑菌圈，不同的抑菌药物的抑菌圈直径因受药物在琼脂中扩散速度的影响而可能不同，抑菌圈的大小可以反映测试菌对药物的敏感程度，并与该药物对测试菌的MIC呈负相关。 二、稀释法 稀释法药敏试验可用于定量测试抗菌药物对某一细菌的体外活性，分为琼脂稀释法和肉汤稀释法。实验时，抗菌药物的浓度通常经过倍比（lg2）稀释，能抑制待测菌肉眼可见生长的最低药物浓度成为最小抑菌浓度（MIC），一个特定抗菌药物的测试浓度范围应该包含能够检测细菌的解释性折点（敏感、中介和耐药）的浓度，同时也应该包含质控参考菌株的MIC. 2.1 琼脂稀释法首先制备含抗菌药物的琼脂稀释平板。再接种待测菌株，然后是结果判读。 2.2 肉汤稀释法 三、抗生素浓度梯度法 四、自动化仪器法 一、实验材料 普通营养琼脂培养基：可去生化试剂店购买，做不同细菌的药敏试验可选择不同的培养基，如做大肠杆菌的药敏试验可选择普通营养琼脂或麦糠凯培养基。做沙门氏菌可选择血清培养基。 药敏试纸：购买或自制（详见实验准备）

细菌：待做药敏试验的细菌 仪器：接种环、酒精灯、打孔器、牛津杯、移液器、滴头 二、实验准备 2.1 药敏片的准备：购买或自制 2.1.1 制备方法：取新华1号定性滤纸，用打孔机打成6毫米直径的圆形小纸片。取圆纸片50片放入清洁干燥的青霉素空瓶中，瓶口以单层牛皮纸包扎。经15磅15-20分钟高压消毒后，放在37℃温箱或烘箱中数天，使完全干燥。 2.1.2 抗菌药纸片制作：在上述含有50片纸片的青霉素瓶内加入药液0.25毫升，并翻动纸片，使各纸片充分浸透药液，翻动纸片时不能将纸片捣烂。同时在瓶口上记录药物名称，放37℃温箱内过夜，干燥后即密盖，如有条件可真空干燥。切勿受潮，置阴暗干燥处存放，有效期3-6个月。 2.2 药液的制备（用于商品药的试验）：按商品药的使用治疗量的比例配制药液；如商品药百病消按其说明量治疗量0.01%饮水，可按这个比例配制药液，可取10毫克加入10毫升的水中混匀。此稀释液即为用于做药敏试验的药液。 三、实验操作方法 3.1 药敏片法 3.1.1 在“超净台”中，用经（酒精灯）火焰灭菌的接种环挑取适量细菌培养物，以划线方式将细菌涂布到平皿培养基上。具体方式；用灭菌接种环取适量细菌分别在平皿边缘相对四点涂菌，以每点开始划线涂菌至平皿的1/2。然后，找到第二点划线至平皿的1/2，依次划线，直至细菌均匀密布于平皿。（另：可挑取待试细菌于少量生理盐水中制成细菌混悬液，用灭菌棉拭子将待检细菌混悬液涂布于平皿培养基表面。要求涂布均匀致密） 3.1.2 将镊子于酒精灯火焰灭菌后略停，取药敏片贴到平皿培养基表面。为了使药敏片与培养基紧密相贴，可用镊子轻按几下药敏片。为了使能准确的观察结果，要求药敏片能有规律的分布于平皿培养基上；一般可在平皿中央贴一片，外周可等距离贴若干片（外周一般可贴七片），每种药敏片的名称要记住。 3.1.3 将平皿培养基置于37℃温箱中培养24小时后，观察效果。 3.2 牛津杯法 3.2.1 在“超净台”中，用经（酒精灯）火焰灭菌的接种环挑取适量细菌培养物，以划线方式将细菌涂布到平皿培养基上。具体方式；用灭菌接种环取适量细菌分别在平皿边缘相对四点涂菌，以每点开始划线涂菌至平皿的1/2。然后，找到第二点划线至平皿的1/2，

(推荐)纸片扩散法药敏试验

纸片扩散法药敏试验 纸片扩散法（K-B法）药物敏感试验是在涂有细菌的琼脂平板培养基上按照一定要求贴浸有抗菌药的纸片，培养一段时间后测量抑菌圈大小，并根据相关解释标准进行结果分析，从而得出受试菌株药物敏感性的结论。 中文名 纸片扩散法药敏试验 临床意义 得出受试菌株药物敏感性的结论 目录 .1试验原理 .2试验步骤 .3结果分析 .4注意事项 基本信息 中文名 纸片扩散法药敏试验 临床意义 得出受试菌株药物敏感性的结论 试验原理 纸片扩散药敏试验的原理：将含有定量的抗菌药物的纸片贴在接种有待测菌的固体培养基上，通过抗菌药物在培养基上的扩散，观察是否出现抑菌环，推断是否抑制细菌的生长。药物扩散的距离越远，药物浓度越低抑菌能力越强，因此可根据抑菌环的大小，判定药物对细菌的抑制作用强弱。 试验步骤

1. 待测菌株接种物制备 （1）通用情况：从过夜孵育的平板，优先选择哥伦比亚血琼脂平板上的菌落上挑取数个单个菌落，直接接种4.5%生理盐水制成菌悬液，使用比浊仪调整悬液的浊度使其达到0.5麦氏单位，使菌悬液中含有相当于ATCC 25922大肠埃希菌（1-2）*1012CFU/mL浓度。 （2）特殊情况：嗜血杆菌属（本程序中所指的嗜血杆菌仅包括流感嗜血杆菌、副流感嗜血杆菌）：从过夜孵育的HTM平板，直接接种4.5%生理盐水制成菌悬液，使用比浊仪调整悬液的浊度使其达到0.5麦氏单位，使菌悬液中含有相当于ATCC 25922大肠埃希菌（1-2）*1012CFU/mL浓度。 2.接种平板 （1）调整好悬液的浊度后，用无菌棉签浸入悬液内，紧贴试管内壁在液体上方旋转拭子数次，除去棉签上多余的液体，但也应适度。 （2）用拭子划线整个琼脂表面，从平板顶部到底部，均匀涂布，重复两次此过程（一共三次）每次旋转平板约60度，确保每次接种菌液均匀分布，最后在琼脂平板的边缘涂抹一圈，防止有流动的菌悬液，并使菌液涂布于整块平板的每个角落。 （3）涂布菌液完成的平板，可在室温放置一会（3-5分钟），以便在放置含有药物的纸片前使琼脂吸收表面多余的水分，但放置时间不应超过15分钟。 3.放置测试药敏纸片 根据测试菌的不同，按照预先设定的分组，将抗菌药物纸片贴于已接种细菌的琼脂表面，每个纸片必须压下以确保与琼脂表面完全接触无论是单独放置的纸片或有纸片分配设备纸片必须分布均匀，两纸片之间圆心的距离不少于24mm，纸片边缘距离琼脂边缘不少于15mm。我室使用的MH平板直径为90mm，放置不超过5块纸片。由于一些药物几乎是瞬间扩散的，因此，一旦纸片与琼脂表面接触就不能再移动位置，若位置不佳可在琼脂的另一个位置重新放置一个纸片。 4.孵育 （1）通用情况：在放置好纸片后，15分钟内，将MH琼脂倒置于号孵箱（35℃）中，孵育16～18小时（除外下面列出的需要延长孵育时间的情况）。嗜血杆菌属、淋病奈瑟菌、脑膜炎奈瑟菌和链球菌KB纸片法测试平板应放置于含有5% CO2的环境进行孵育。 （2）延长时间培养：①测试苯唑西林、头孢西丁对葡萄球菌的敏感性时，孵育时间必须达到24h，才能满足对结果判断的要求。②测试万古霉素对金黄色葡萄球菌及肠球菌属的敏感性，孵育时间必须达到24小时。 5.抑菌环直径测量 （1）通用情况：35℃，经过16～18小时的孵育后，将贴有纸片的MH平板置于黑色不反光的背景上，采用游标卡尺，来测量抑菌环的直径（完全抑制区的直径），可以从平板的背面，利用反射光，用肉眼观测，读取最接近的毫米数（读取一个整数）。没有肉眼可见的明显的生长的部位即是抑菌环的边缘。一般情况下，在抑菌环边缘出现只能在放大镜下观察到的微小菌落，可以忽略不计。 MH平板上的抑菌环呈均匀的圆形，测试菌株在平板上呈现融合生长菌苔，若出现单个菌落稀疏生长的情况，则说明接种时调制的菌液浓度过稀，需要寻找可能的原因，并重新再一次进行测试。 （2）特殊情况：①苯唑西林对葡萄球菌的抑菌环：抬起平皿，对向光源，利用透射光观察苯唑西林纸片周围的抑菌环中是否有任何细微的菌落生长，若是出现任何可以辨别的生长，均应判定苯唑西林耐药。②利奈唑胺对葡萄球菌的抑菌环：利用透射光，用游标卡尺读取抑菌环的数值。③复方新诺明的抑菌环：MH平板中存在一定量叶酸抑制剂的拮抗剂，会导致测试菌轻微的生长，因此，在测量复方新诺明的抑菌环直径时应当忽略细微的生长情况（约20%），而将明显出现生长的地方作为抑菌环的边界进行测量。 结果分析

药敏试验操作方法

药敏试验操作方法 药敏试验根据美国临床标准委员会（NCCLS）推荐的K-B琼脂法进行，药敏纸片选择中国生物制品鉴定所药敏纸片，试验所选择药物必须包括下列抗生素：氨苄西林（AMP），阿莫西林/克拉维酸（AMC），头孢噻吩（CFT），头孢噻肟（CTX），庆大霉素（GEN），萘啶酸（NAL），诺氟沙星（NOR），四环素（TBT），利福平（RFA），复方新喏明（SMZ）。 1 操作方法： (1)将待检菌接种于普通营养琼脂平板，37℃培养16～18小时，然后挑取普通营养琼脂平板上的纯培养菌落，悬于3ml生理盐水中，混匀后与菌液比浊管比浊。以有黑字的白纸为背景，调整浊度与比浊管（0.5麦氏单位）相同。 (2)用无菌棉拭子蘸取菌液，在管壁上挤压去掉多余菌液。用棉拭子涂布整个M-H培养基表面，反复几次，每次将平板旋转60度，最后沿周边绕两圈，保证涂均匀。 (3)待平板上的水分被琼脂完全吸收后再贴纸片。用无菌镊子取药敏纸片贴在平板表面，纸片一贴就不可再拿起。每个平板贴5张纸片，每张纸片间距不少于24mm，纸片中心距平皿边缘不少于15mm。在菌接种后15分钟内贴完纸片。 (4)将平板反转，孵育18～24小时后取出，用游标卡尺测量抑菌圈直径，从平板背面测量最接近的整数毫米数并记录（附表5）。抑菌环的边缘以肉眼见不到细菌明显生长为限。有的菌株可出现蔓延生长，进入抑菌环，磺胺药在抑菌环内出现轻微生长，这些都不作为抑菌环的边缘。结果判断依据鉴定所药敏纸片判定标准。 2 注意事项： (1)制备MH琼脂平板应用直径90mm平皿，在水平的实验台上倾注。琼脂厚为4±0.5mm（约25-30ml培养基），琼脂凝固后塑料包装放4℃保存，在5日内用完，使用前应在37℃培养箱烤干平皿表面水滴。倾注平皿前应用pH计测pH值是否正确(pH应为7.3)。pH过低会导致氨基糖苷类，大环内酯类失效，而青霉素活力增强。 (2) 药敏纸片长期储存应于－20℃，日常使用的小量纸片可放在4℃，但应至于含干燥剂的密封容器内。使用时从低温取出后,放置平衡到室温后才可打开，用完后应立即将纸片放回冰箱内的密封容器内。过期纸片不能使用, 应弃去。 (3) 不稳定药物如亚胺培南, 头孢克洛, 克拉维酸复合药等, 应冷冻保存, 最好在-40 ℃以下。 (4) 保证质控菌株不变异的简便方法，将新得到的冻干菌株接种含血的M-H平板复活。然后每株细菌接种10支高层琼脂管，放置冰箱保存。每月取出一支，传出细菌供常规用。待用剩至最后一支，可传种在M-H平板上，再接种一批高层琼脂管备用。如此可保证原始菌种永不接触抗菌素。

药敏试验方法1

药敏试验方法： K-B法： 1 从孵育了16-24小时的琼脂平板上（血平板），挑出单个菌落，直接用生理盐水制成0.5麦氏单位。 2 在15分钟内，用无菌棉拭子蘸取调好的菌液，在液面上方管壁处旋转并用力挤压几次，以从中挤出过多的菌液。 3 用棉拭子在无菌的M-H培养基表面化线接种，再重复操作两次，每次将平板转动60度，每次接种都应保证接种物均匀分布，最后用棉拭子涂抹平板的边缘。 4 将确定好的药敏纸片分贴到平板表面。每个纸片都应压一下，以保证与平板表面完全接触。每个纸片中心间距24mm。纸片一旦与平板接触，不应再移动。 5 贴完纸片后，应在15分钟内放入35度孵箱。嗜血杆菌属，链球菌属放入3%-5%的CO2烛缸。 6 孵育24小时以后，测量各药敏纸片抑菌圈直径，与NCCLS手册比较，作出结果判断。 说明：细菌药敏结果的判断以NCCLS为标准，所以药敏试验的每一步都应严格按照NCCLS操作，否则将失去意义。链球菌、奈瑟菌属、流感嗜血杆菌、除铜绿假单孢菌和不动杆菌外的假单孢菌属不用K-B法. 肺炎链球菌胶乳凝集测定法 1 在一干净玻片上分别滴两滴生理盐水。 2 从冰箱取出鉴定试剂(Slidexpneumo-kit)于室温。 3 在其中一滴生理盐水上滴加R1试剂，在另外一滴上滴加R2试剂，用搅拌棒混匀。 4 轻轻晃动玻片2分钟，观察结果。 5 2分钟内，如R1出现凝集为阳性；如R1和R2均未出现凝集为阴性。 注：R3为阳性对照。 药敏纸片的选择 1、革兰阴性杆菌（肠杆菌科） 头孢噻肟（CTX）头孢唑林（CZ）头孢他定（CAZ） 氨苄西林（AM）哌拉西林（PIP）阿米卡星（AN） 头孢噻吩（CF）环丙沙星（CIP）头孢呋辛（CXM） 庆大霉素（GM）头孢噻肟/棒酸（CTX/CA） 头孢他定/克拉维酸（CAZ/CA）羧苄青霉素（CB） 奥格门丁（AMX/CA）哌拉西林/三唑巴坦（PIP/TZ） 亚安培南头孢匹肟（FEP）头孢克罗（CEC） 2、铜绿假单孢菌/不动杆菌 妥布霉素（TM）阿米卡星（AN）安曲南（AZT） 头孢哌酮（CFP）哌拉西林（PIP）头孢匹肟 头孢噻肟（CTX）环丙沙星（CIP）头孢他定（CAZ） 左旋氧氟沙星（OFL）亚安培南哌拉西林/三唑巴坦 3、金黄色葡萄球菌 苯唑西林（OX）青霉素G（P）头孢唑林（CZ）阿米卡星（AN） 红霉素（E）头孢噻肟（CTX）环丙沙星（CIP） 万古霉素奥格门丁（AMX/CA）哌拉西林/三唑巴坦 头孢噻吩（CF） 4 、肠球菌 氨苄西林（AM）万古霉素环丙沙星（CIP） 庆大霉素（GM）红霉素（E）氧氟沙星（OFL） 5、除肺炎链球菌外链球菌 氨苄西林（AM）头孢噻肟（CTX）万古霉素

药敏试验方法

药敏试验方法： 默认分类 2009-05-06 22:37 阅读285 评论0 字号：大中小 K-B法： 1 从孵育了16-24小时的琼脂平板上（血平板），挑出单个菌落，直接用生理盐水制成0.5麦氏单 位。 2 在15分钟内，用无菌棉拭子蘸取调好的菌液，在液面上方管壁处旋转并用力挤压几次，以从中挤 出过多的菌液。 3 用棉拭子在无菌的M-H培养基表面化线接种，再重复操作两次，每次将平板转动60度，每次接 种都应保证接种物均匀分布，最后用棉拭子涂抹平板的边缘。 4 将确定好的药敏纸片分贴到平板表面。每个纸片都应压一下，以保证与平板表面完全接触。每个 纸片中心间距24mm。纸片一旦与平板接触，不应再移动。 5 贴完纸片后，应在15分钟内放入35度孵箱。嗜血杆菌属，链球菌属放入3%-5%的CO2烛缸。 6 孵育24小时以后，测量各药敏纸片抑菌圈直径，与NCCLS手册比较，作出结果判断。 说明：细菌药敏结果的判断以NCCLS为标准，所以药敏试验的每一步都应严格按照NCCLS操作，否则将失去意义。链球菌、奈瑟菌属、流感嗜血杆菌、除铜绿假单孢菌和不动杆菌外的假单孢菌属不用K- B法. 肺炎链球菌胶乳凝集测定法 1 在一干净玻片上分别滴两滴生理盐水。 2 从冰箱取出鉴定试剂(Slidex pneumo-kit)于室温。 ·3 在其中一滴生理盐水上滴加R1试剂，在另外一滴上滴加R2试剂，用搅拌棒混匀。 4 轻轻晃动玻片2分钟，观察结果。 5 2分钟内，如R1出现凝集为阳性；如R1和R2均未出现凝集为阴性。 注：R3为阳性对照。 药敏纸片的选择 1、革兰阴性杆菌（肠杆菌科）

头孢噻肟（CTX）头孢唑林（CZ）头孢他定（CAZ） 氨苄西林（AM）哌拉西林（PIP）阿米卡星（AN） 头孢噻吩（CF）环丙沙星（CIP）头孢呋辛（CXM） 庆大霉素（GM）头孢噻肟/棒酸（CTX/CA） 头孢他定/克拉维酸（CAZ/CA）羧苄青霉素（CB） 奥格门丁（AMX/CA）哌拉西林/三唑巴坦（PIP/TZ）亚安培南头孢匹肟（FEP）头孢克罗（CEC） 2、铜绿假单孢菌/不动杆菌 妥布霉素（TM）阿米卡星（AN）安曲南（AZT） 头孢哌酮（CFP）哌拉西林（PIP）头孢匹肟 头孢噻肟（CTX）环丙沙星（CIP）头孢他定（CAZ） 左旋氧氟沙星（OFL）亚安培南哌拉西林/三唑巴坦 3、金黄色葡萄球菌 苯唑西林（OX）青霉素G（P）头孢唑林（CZ）阿米卡星（AN）红霉素（E）头孢噻肟（CTX）环丙沙星（CIP） 万古霉素奥格门丁（AMX/CA）哌拉西林/三唑巴坦 头孢噻吩（CF） 4 、肠球菌 氨苄西林（AM）万古霉素环丙沙星（CIP） 庆大霉素（GM）红霉素（E）氧氟沙星（OFL） 5、除肺炎链球菌外链球菌 氨苄西林（AM）头孢噻肟（CTX）万古霉素 红霉素（E）氧氟沙星（OFL）克林霉素(CM) 肺炎克雷伯菌产酸克雷伯菌和大肠杆菌ESBLs的检测

纸片法药敏试验相关知识

纸片法药敏试验相关数据 表一纸片法药敏试验纸片含药量和结果解释（肠杆菌科、铜绿假单胞菌）抗菌药物纸片含药量抑菌圈直径(mm) 耐药中介敏感青霉素G 10unit ≤28 －≥29 氨苄青霉素30ug ≤13 14～16 ≥17 苯唑青霉素1ug ≤10 11～12 ≥13 氧哌嗪青霉素100ug ≤17 －≥18 先锋Ⅵ* 30ug ≤14 15~17 ≥18 先锋Ⅴ30ug ≤14 15~17 ≥18 复达欣30ug ≤14 15～17 ≥18 阿莫西林* 100ug ≤19 20～22 ≥23 氨苄西林/舒巴坦10/10ug ≤11 12～14 ≥15 丁胺卡那霉素30ug ≤14 15～16 ≥17 庆大霉素10ug ≤12 13～14 ≥15 复方新诺明 1.25/23.75ug ≤10 11～15 ≥16 万古霉素* 30ug －－≥17 诺氟沙星10ug ≤12 13～16 ≥17 安灭菌20/10ug ≤13 14～17 ≥18 克林霉素2ug ≤14 15～20 ≥21 克拉霉素15ug ≤13 14～22 ≥23 氯霉素30ug ≤12 13～17 ≥18 表二纸片法药敏试验纸片含药量和结果解释（葡萄球菌）抗菌药物纸片含药量抑菌圈直径(mm) 耐药中介敏感青霉素G 10unit ≤28 －≥29 氨苄青霉素30ug ≤28 －≥29 苯唑青霉素1ug ≤10 11～12 ≥13 氧哌嗪青霉素100ug ≤17 －≥18 先锋Ⅵ* 30ug ≤14 15~17 ≥18 先锋Ⅴ30ug ≤14 15~17 ≥18 复达欣30ug ≤14 15～17 ≥18 阿莫西林* 100ug ≤19 20～22 ≥23 氨苄西林/舒巴坦10/10ug ≤11 12～14 ≥15 丁胺卡那霉素30ug ≤14 15～16 ≥17 庆大霉素10ug ≤12 13～14 ≥15 复方新诺明 1.25/23.75ug ≤10 11～15 ≥16 万古霉素30ug －－≥15 诺氟沙星10ug ≤12 13～16 ≥17 安灭菌20/10ug ≤19 －≥20 克林霉素2ug ≤14 15～20 ≥21 克拉霉素15ug ≤13 14～17 ≥18 氯霉素30ug ≤12 13～17 ≥18

细菌自动鉴定及药敏系统的研究进展

细菌自动鉴定及药敏系统的研究进展(2) 录入时间:2011-2-23 9:13:34 来源：中华检验医学网 （四）Vitek Ⅱ： 在第一代Vitek的基础上发展而成。有4个架子，每个架子能容纳15片试验卡。司同时容纳60片试验卡，每片试验卡包含64个反应孔，采用快速荧光法测定细菌，2小时提供鉴定报告，鉴定敏感度高，分辨能力强。可在鉴定的同时进行药敏试验，结果可分级报告(先完成的药敏结果先报告)。该仪器具有高级专家系统，可根据药敏试验的表则结果提示有何种耐药机制的存在，对耐药机制推断准确性大于90％，MIC 平均药敏检测所需时间9.74小时，比传统方法缩短1天检测时间，能对药敏试验的结果进行“解释性”判读。该专家系统还能自动复核检验结果，如发现鉴定与药敏不符合的现象，即发出提示，要求进行复查。 （五）SENSITITRE MICROBIOLOGY SYSTEMS ARIS英国先德荧光快速微生物鉴定/药敏系统工作原理 1.概述： SENSITITRE MICROBIOLOGY SYSTEMS ARIS由英国Accu Med公司于20世纪70年代开始研制生产。1996年12月美国惠好公司正式成为SENSITITRE在中国的总代理。分为全自动SENSITITRE Aris和半自动Auto-Reader两种组合。可鉴定细菌180种。数据库含500种细菌资料。可对200种抗生素进行分析，在全世界有800家用户。1996年12月进入中国。国内5家用户。 2．原理： (1)鉴定原理： 通过检测荧光的增加间接地测定MIC值。SENSITITRE系统采用传统生化反应，8进位数码鉴定及荧光分析项结合。荧光分析是用荧光标记细菌表面特异酶的底物，经细菌水解底物产生荧光来判断结果。不同

特殊细菌药敏试验规范化操作系列

特殊细菌药敏试验的规范化操作 一、目前我国细菌药敏试验现状 20年以来，我国在卫生部和各地临床检验中心和检验学会的共同努力下引进CLSI药敏系列标准，使全国微生物实验室能在同一标准下进行质量控制活动。当前，微生物实验室对常见临床分离细菌的药物敏感试验的水平已有了显著的提高，但对特殊细菌的药敏试验的各个环节的规范操作还不能得到普及，对目前还无折点的细菌能否做药敏试验，以及如何判断细菌的药物敏感和耐药，仍然概念模糊，有待进一步规范和普及。 目前常见错误做法： （一）铜绿假单孢菌的药敏判断标准用于其他非发酵细菌；嗜血杆菌的标准用于卡他莫拉菌等的错误做法时有发生。 （二）借用同属细菌敏感标准 （三）借用同类抗生素的敏感标准 二、各菌属的药物敏感性报告及试验方法的CLSI药敏标准 （一）“嗜麦芽”菌属药敏报告标准 1.CLSI对“嗜麦芽”纸片药敏判断标准 药物名称纸片含量ug/片耐药 R 中介I 敏感S 米诺环素30 ≤1415-18 ≥19 左氧氟沙星 5 ≤1314-16 ≥17 复方新诺明 1.25/23.75 ≤1011-15 ≥16 2.CLSI对“嗜麦芽”稀释法判断标准 药物名称S I R 替卡西林/棒酸≤16/232/2-64/2 128/2 头孢他定≤816 ≥32 米诺环素≤48 ≥16 左氟沙星 2 4 ≥8 复方新诺明≤2/38- 4/76 氯霉素≤816 ≥32（二）无折点细菌的药物敏感试验报告 1. 其他药物的敏感性报告: CLSI推荐的药物可以报告MIC值和敏感度（S、I、R），临床需要的其他药物的药敏试验报告可以直接报告MIC值但不报告S、I、R。 2. 不要用认为相近细菌的折点代替报告S、I、R，这会误导医生用药。

药敏纸片的制备完整版

药敏纸片的制备 HEN system office room 【HEN16H-HENS2AHENS8Q8-HENH1688】

药敏纸片的制备及药敏试验方法 抗菌药物对预防或治疗动物疾病发挥了巨大的作用，但随着抗菌药物在兽医临床的广泛使用，尤其为了防治疾病，常常以亚剂量水平的药物添加于饲料中，以致长期使用后病原微生物产生了耐药性，使本来对治疗病原微生物感染有效的抗菌药物失去作用，给兽医临床上有效地预防和治疗疾病的发生带来一定的困难。通过制作自家药敏纸片进行试验,可快速进行药物的筛选,获得对病原微生物敏感的药物, 对指导临床合理用药，提高治疗效果，节约养殖过程的用药费用，有着重要的意义。 一. 药敏纸片的制备 1.材料 抗菌药物、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、冰醋酸、新华1号定性滤纸、50mL容量瓶、无菌过滤器或一次性过滤器等 2．方法 PBS的配制 A.制备L储备液 LNa 2HPO 4 ： +1000 mL蒸馏水 或 +1000 mL蒸馏水 L NaH 2PO 4 : +1000 mL蒸馏水 或 +1000 mL蒸馏水 B.将两种储备液按下表比例，配制成不同pH值的PBS,室温保存备用 L磷酸缓冲液的配制

抗菌药物原液的配制和保存期限 －20℃4℃抗菌药物溶剂浓度 （?g/mL） 青霉素 PBS 1280 3个月1周半合成青霉素类 PBS 1280 3个月1周头孢菌素类 PBS 1280 3个月1周氨基糖苷类 PBS 1280 3个月4周四环素类 PBS 12803个月1周 PBS 12803个月2周多粘菌素B硫酸 盐 PBS 12803个月2周林可或氯林可霉 素 12803个月2周红霉素先用少量乙醇溶解，再 用 PBS 1280长期长期氯霉素先用少量乙醇溶解，再 用 PBS 12803个月1周利福平先用甲醇溶解，再用 PBS 万古霉素蒸馏水12803个月2周两性霉素B 蒸馏水12803个月1周 12803个月2周5－氟胞嘧啶先用少量二甲基甲酰胺 溶解，再用蒸馏水 1280长期长期甲氧苄氨嘧啶先用L乳酸溶解再用蒸 馏水稀释 各种磺胺药先用NaoH溶解再用蒸2560长期长期

药敏试验程序及步骤

药敏试验程序及步骤 微生物标本的采集 通常有血液、脑脊液、尿液、伤口的脓液、胸水腹水、粪便、痰液及泌尿生殖系统的分泌物。1）采集的一般原则： a早期采集 b 无菌采集注意对局部及周围皮肤的消毒，渎道底部采集的标本（外通道）正常菌群 寄生部位采集的标本应明确目的菌，采用选择培养基。 C 不同菌不同采集方法 D 采集适量标本，量不应过少，注意采集不同时间不同部位标本，要全面有特征 E 安全采集 2）标本处理 2h送到检验处，部分菌应保温于一定环境中保存注意安全尤其对烈性传染病。有时可以直接用抽取标本的注射器 如尸检组织、支气管洗液、心包液、痰、尿等标本要保存于4℃环境中，脑脊液保存于25℃ 3）各部位标本的采集及注意事项 A 血液 皮肤消毒采血部位采血量采血次数采血时间不同动物有所不同血液应马上送检室温保存不可冷藏。 配置的培养基血液和肉汤比为1：5～1：10 血液中常见的病原体引起的疾病有葡萄球菌菌血症，肠球菌菌血症、革兰隐性杆菌、厌氧菌菌血症真菌血症。 B 脑脊液 采集脑脊液一般用腰椎穿刺术获得。采集后立即送检，一般不要超过1h，避免凝固和混入血液一般取3～5ml 35度保温送检不可至于冰箱保存做病毒检查时应放置冰块4度保存72h

常见细菌性脑膜炎如流行性脑脊髓膜炎肺炎球菌脑膜炎，链球菌脑膜炎等 真菌性脑膜炎常见隐球菌脑膜炎假丝酵母菌脑膜炎等特别是免疫功能低下和恶性疾病患者易并发。如AIDS 恶性肿瘤严重糖尿病等 流行性乙型脑炎是一种人兽共患病肠道病毒可见多种病毒引起脑膜炎和肺炎 c 脓液标本的采集 首先用无菌生理盐水清洗脓液及病灶的杂菌，在采集标本，用针和注射器抽吸采取，再移入无菌容器立即送检也可用拭子在伤口深部采集渗出物，对于皮肤或下表皮的散播性感染，应采集病灶出边缘而非中央处的感染组织送检。脓肿标本以无菌注射器抽取为好，也可用排液法取得，先用70的酒精擦拭病灶部位，袋干燥后用以无菌刀切开排脓，以无菌拭子采取，不能及时送检可放冰箱冷藏，厌氧菌培养的标本只能放于室温下。厌氧菌感染的脓液常有腐臭味，采集和运送要注意不要接触空气，可直接针筒送检或置于厌氧运送培养基送检。 外伤性创伤感染以葡萄球菌和链球菌多见，放线菌，结核分枝杆菌，大肠埃希菌，铜绿假单胞杆菌也常见。深部感染极易引起破伤风和气性坏死感染。 烧伤创面最常见革兰阴性杆菌感染和革兰阳性球菌感染 急性化脓性骨关节炎常由金黄色葡萄球菌感染溶血性链球菌肺炎链球菌感染所致慢性化脓性骨关节炎慢性骨髓炎常由结合分支杆菌感染所致。 放线菌感染可发生在免疫功能下降时或由于拔牙口腔粘膜损伤一起的感染。 d痰液标本的采集 自然咳痰法和支气管镜采集法对呼吸道感染诊断有重要意义，细菌性肺炎为下呼吸道感染最常见的类型。支原体肺炎常以不典型肺炎表现。真菌性肺炎和病毒性肺炎也常见。 E 粪便标本的采集 用药前自然排便采集脓血粘液部分2～3g，粪便表面采样，液体便取絮状物1～2ml置于无菌容器内送检。 细菌性痢疾细菌真菌病毒引起的胃肠炎细菌性食物中毒致病性大肠埃希菌的肠道感染幽门螺杆菌感染导致消化性溃疡，主要部位是十二指肠球部。 F 尿液标本采集 采集清洁中段尿最好早晨取样，先清洗尿道口。必要时导尿或膀胱穿刺留尿样本采集容器要求清洁无菌、密封、加盖、防渗透、广口、容积大于50ml。主要主要经尿道口上行感染，极少数血道感染，可反映肾脏，膀胱，尿道，前列腺等处的炎症变化。

纸片扩散法药物敏感试验

纸片扩散法药物敏感试验 若只根据是否出现抑菌环而不考虑抑菌环的直径大小来判断细菌是否对抗菌药物敏感的实验方法，其结果是不正确的。而纸片扩散法试验是应用标准的方法学原理，根据抑菌环直径大小与最低抑菌浓度的相关性，结合临床上已知敏感或耐药菌株的状态，其结果是可靠的。WHO推荐K-B法，其目的在于技术的简单和可重复性。本法特别适用于肠杆菌科细菌，也可用于快速生长的致病菌，但不适用于其他细菌，如嗜血杆菌、奈瑟菌、专性厌氧菌及酵母样菌等。 无论用哪种方法接种，只要质控菌株的抑菌环在预期范围内，均可按同一解释标准报告结果。但并非从感染患者分离到的微生物都必须做敏感试验，对于污染、机体共生的正常细菌群和那些与感染无关的细菌，可不必做敏感试验，只有那些被认为引起感染的微生物，应先分离提纯、鉴定菌种后再做敏感试验。 试验方法： 一、试验材料： (一)培养基： Kirby-Bauer法指定用Mueller-Hinton琼脂。多年大量的有关敏感试验的方法学研究，均采用该培养基；维持细菌正常发育，绝大多数细菌在此培养基上生长良好。此培养基不拮抗抗菌药物活性以及商品的批次间差异等方面均优于其他培养基。若检测肺炎链球菌的敏感性

时，须在培养基中加5％的脱纤维羊血，制成血平板。测嗜血杆菌及淋病奈瑟菌的敏感性时，在培养基中须加入1％血红素和 2.5mg/ml 辅酶I后应校正pH 7.2～7.4。 制备MH琼脂平板应用直径90cm平皿。在水平的实验台上倾制。琼脂厚为4mm，允许误差为土1mm。琼脂凝固后，应测一下pH。琼脂于板应放4℃保存，在7日内用完。若当天不用，用塑料袋密封包装贮藏于冰箱（2-8℃）。 每批平板都应抽样，在30-50℃下培养24h或更长时间检查是否被感染。 MH琼脂培养基配方(1L)： Beef Extract 2.0g Acid Hydrolysis of Casein 17.5g Starch 1.5g Agar 17.0g Final PH 7.3 at 25℃ 高压灭菌后立即水浴冷却至45-50℃。 (二)药物纸片 抗菌药物纸片直径约为6.00～6.35mm，每片的吸水量约20μl。采用K-B法，纸片的药物含量必须与该法规定的一致，不得任意更改。药物纸片可以购买，也可自制，用前必须做质量鉴定。用以下两个指标判定纸片的质量： 1、片间差：是衡量不同纸片含药是否均一的指标。 测定方法：以质控菌株接种M-H琼脂平板，一块平板上贴6张相同的纸片。35C过夜培养后，记录6个抑菌环直径，其最大和最小之

纸片法 KB 药敏实验原理及实际操作方法

纸片扩散药敏试验的原理：将含药物的纸片贴在接种有待测菌的固体培养基上，通过药物在培养基上的扩散，观察是否出现抑菌环，推断是否抑制细菌的生长。药物扩散的距离越远，药物浓度越低抑菌能力越强，因此可根据抑菌环的大小，判定药物对细菌的抑制作用强弱。药敏试验根据美国临床标准委员会 (NCCLS) 推荐的 K–B 琼脂法进行。本实验通过纸片药敏试验法观察多酸化合物对细菌有无抑制作用，为试管二倍稀释法提供有效基础数据。 用无菌棉拭子蘸取已经校正的 0.5 麦氏比浊浓度的菌液，挤掉多余菌液。用棉拭子涂布整个 MH 培养基表面，每次将平板旋转 60°，涂抹三次，最后沿周边擦绕两圈，以保证菌液涂抹均匀。待平板上的水分被琼脂完全吸收后贴含药纸片。用无菌镊子取药敏纸片贴在平板表面，纸片一贴后不可再拿起。每个平板贴 5 张纸片，纸片间距不少于 24 mm，纸片中心距平皿边缘不少于 15 mm。在菌接种后 15 min内贴完纸片。将平板反转，37℃恒温孵育 18~24 h 后取出，用游标卡尺测量抑菌圈直径，由平板背面测量最接近的整数毫米数并记录，每个平板各设三个平行组平板，测量抑菌直径时，应取三个平板的平均值为最终结果。抑菌环边缘以肉眼见不到细菌明显生长为限。 每次药敏试验用大肠杆菌 ATCC25922 和金黄色葡萄球菌 ATCC25923 做质控。药敏判读标准根据 CLSI 标准 (2009 年) 所载受试药对质控菌的抑菌环直径范围作为实验质控标准（判读标准见表 5-2）[84]。 表5-2 纸片扩散法－用质控菌株抑菌环直径(mm)允许范围监测抗菌药物敏感性试验准确性Table 5-2 Disc diffusion test － according the admissible range of quality-control strain’s inhibition zone diameter to monitor the accuracy of antibiotics susceptibility test (mm) 抗菌药物纸片含药量 （μg） 抑菌环直径(mm) S I R 大肠埃希菌 ATCC25922 金黄色葡萄球菌 ATCC25923 KF 30 ≥1815–17 ≤1416–22 27–35 AMP 10 ≥1714–16 ≤1328–35 27–28 CIP 5 ≥2116–20 ≤1530–40 22–30 NOR 5 ≥1713–16 ≤1215–21 29–37

药敏试验实验报告

药敏试验： 用药敏实验进行药物敏感度的测定，以便准确有效的利用药物进行治疗。目前，临床微生物实验室进行药敏试验的方法主要有纸片扩散法，稀释法（包括琼脂和肉汤稀释法），抗生素浓度梯度法（E-test 法），和自动化仪器等。 体外抗菌药物敏感性试验简称药敏试验（AST），是指在体外测定药物抑菌或杀菌能力的试验。 根据美国国家临床实验室标准化委员会(NCCLS)近期推荐的标准，对非苛氧菌（肠杆菌科细菌、铜绿假单胞菌、和其他非肠科杆菌、葡萄球菌属细菌、肠球菌属细菌）和苛氧菌（嗜血杆菌属细菌、淋病奈瑟菌、肺炎链球菌和其他链球菌）选择常规药敏试验的首选药物（A 组抗生素）或临床使用的主要抗生素（B组抗生素）进行药敏试验。 抗菌药对细菌性传染病的控制起到了非常重要的作用，但由于养殖过程中不科学的、盲目的滥用抗菌药，很多致病性细菌产生了耐药性，使得抗菌药对细菌性疾病的控制效果越来越差，不但造成药物浪费，而且还延误病情，给养殖户造成了很大的经济损失。 随着新型致病菌的不断出现，抗菌药的防治效果越来越差。并且各种致病菌对不同的抗菌药物的敏感性不同，同一细菌的不同菌株对不同抗菌药物的敏感性也有差异。长期以来，各种致病菌耐药性的产生使各种常用抗菌药物往往失去药效，以及不能很好的掌握药物对细菌的敏感度，所以一个正确的结果，可供临床医师选用抗菌药物的参考，并提高疗效。农业部动物检疫所青岛易邦生物工程有限公司动物

疫病诊疗中心总结出几套适合基层进行药敏试验的操作方法，现简单介绍如下。 纸片扩散法 该法是将含有定量抗菌药物的滤纸片贴在已接种了测试菌的琼脂表面上，纸片中的药物在琼脂中扩散，随着扩散距离的增加，抗菌药物的浓度呈对数减少，从而在纸片的周围形成浓度梯度。同时，纸片周围抑菌浓度范围内的菌株不能生长，而抑菌范围外的菌株则可以生长，从而在纸片的周围形成透明的抑菌圈，不同的抑菌药物的抑菌圈直径因受药物在琼脂中扩散速度的影响而可能不同，抑菌圈的大小可以反映测试菌对药物的敏感程度，并与该药物对测试菌的MIC呈负相关。 稀释法 稀释法药敏试验可用于定量测试抗菌药物对某一细菌的体外活性，分为琼脂稀释法和肉汤稀释法。实验时，抗菌药物的浓度通常经过倍比（lg2）稀释，能抑制待测菌肉眼可见生长的最低药物浓度成为最小抑菌浓度（MIC），一个特定抗菌药物的测试浓度范围应该包含能够检测细菌的解释性折点（敏感、中介和耐药）的浓度，同时也应该包含质控参考菌株的MIC.

微生物自动鉴定及药敏系统的研究进展

微生物自动鉴定及药敏系统的研究进展 一、细菌自动鉴定及药敏系统的发展史 细菌的鉴定是细菌分类的实验过程，长期以来，临床微生物实验室一直沿用100多年前由Gram、Pasteur、Koch、Petri等创造的传统的微生物学鉴定方法。这些传统的鉴定方法不仅过程烦琐，费时费力，且在方法学和结果的判定、解释等方面易发生主观片面而引起的错误，难以进行质量控制。 20世纪60年代以后，微生物学家和工程技术人员密切合作，对微生物的研究采用了物理的、化学的分析方法，发明了许多自动化仪器，并根据细菌不同的生物学性状和代谢产物的差异，逐步发展了微量快速培养基和微量生化反应系统，使原来缓慢、烦琐的手工操作变得快速、简单，并实现了自动化和机械化。微生物鉴定自动化方法，包括(1)临床微生物鉴定系统；(2)气液色谙分析；鉴定厌氧菌和分枝杆菌多用于研究；(3)核酸杂交；多用于研究； (4)化学发光技术；可鉴定一些细菌少数分枝杆菌属和一些真菌。80到90年代发展迅速，并广泛用于临床。1985年第一台自动化细菌分析仪器Vitek-AMS进入中国并成功使用。1999年底法国梅里埃公司推出VITEK2系统，从接种物稀释、密度计比较及卡冲填和封卡等步骤均实现了全自动化。目前已有多种微生物自动鉴定及药敏测试系统问世，如 VITEK-AutoMicrobicSystem(AMS)、PHOENIXTM、MicroScan、Sensititre、ABBott(MS-2 System)、AUTOBACIDXSys-tern等。这地自动化系统具有先进的微机系统，广泛的鉴定功能，适用于临床微生物实验室、卫生防疫和商检系统，主要功能包括细菌鉴定、细菌药物敏感性试验及最低抑菌浓度(MIC)的测定等。其准确性和可靠性均已大大提高。 二、细菌自动鉴定及药敏系统原理及性能比较 1.原理： 临床微生物鉴定系统使细菌鉴定过程规范化和程序化，将细菌对底物的生化类型与已建立数据库类型相比较。测试原理主要是利用物质产生PH值变化，能释放色源或荧光源复合物的酶学反应，四氮唑标记碳水化合物代谢活性的产生，挥发或非挥发酸产生，或可见生长。鉴定系统反应原理 非发酵菌，革兰阳性球菌，革兰阴性球菌，厌氧菌和酵母

纸片法抗菌药物敏感实验操作标准

纸片法抗菌药物敏感实验操作标准 4.３标准比浊管 用硫酸钡比浊管(０、5麦氏比浊标准),标定接种菌液浓度。比浊管制备方 法如下:(１)0、048mｏl/L BaＣｌ 2,(１、175% w／v BaＣｌ 2 ·2H 2 O)0、５ml, 加到99、5ml的０、18 mol/Ｌ(0.3６N)H 2SＯ 4 (1％v/ｖ)溶液中,制成比浊管;(2) 用光径为1cｍ的分光光度计测定光吸收来标定比浊管。0、5麦氏标准比浊管在６25nｍ波长的吸收光度应为0、0８-0、1;(3)选管径与制备菌液试管相同的螺口试管,每管分装4-6ml;(4)将试管帽拧紧,放室温暗处保存;(5)用前,将比浊管在旋转振荡器上混匀。如出现大颗粒,应更换;(6)每个月更换比浊管或复检比浊管的浊度。 ５操作步骤 5、1 制备接种菌液 5、1、１增菌法步骤如下:(1)选琼脂平板上形态相同的菌落至少4-5个,用接种环挑其顶部,移至4－5ml肉汤或大豆酪蛋白消化液中;(２)置35℃培养至菌液浓度达到或超过比浊管浓度(一般需2－6小时),浓度约1－２×10８CFU/ml;(３)用生理盐水或肉汤校正菌液浓度,与比浊管相同。可用光电比浊。目测比浊须在适当光照下以黑色线条为反衬。 5、１、2 直接菌悬液法步骤如下:(1)做常规药敏试验,可直接用过夜培养的菌落(必须用无选择性培养基平板,如普通琼脂培养基)在盐水或肉汤中制备接种菌液。菌液浓度调至0、5麦氏管;(2)此法适用于在肉汤培养基中生长不好的细菌如嗜血杆菌、淋病奈瑟氏菌与链球菌及葡萄球菌的甲氧苯青霉素或苯唑青霉素的耐药试验;(３)当用此法做复方磺胺药的试验时,从平板上直接挑菌落时会携带相当量的拮抗剂,造成敏感菌株的抑菌环内出现轻微的生长菌膜。 ５.2 接种平板步骤如下:(1)校正的菌液须在15分钟内使用。用一无菌棉试子蘸取菌液并在上端管壁旋转挤压几次,去掉过多的菌液;(2)用试子涂布整个琼脂平板表面,反复涂布几次,每次将平皿旋转60度,保证涂布均匀。(3)将平皿盖打开3-5分钟,使培养基表面的水份吸收掉。然后贴药敏纸片;(4)注意:避免用过浓的菌液,禁用未经稀释菌或其她不标准菌液接种平板。 5、３贴纸片 (1)接种平板后,贴上药敏纸片。用镊子或针尖压一下纸片使其与培养基表面贴牢。纸片要贴得均匀,纸片与纸片中心距离不得小于24mm。原则上,直径150ｍm得平板贴１2张纸片,直径100mm平板贴5张纸片。纸片贴后不应再移动,因为有些药物会立即扩散;(2)贴上纸片15分钟内,须把平板倒放在35℃恒温箱中。因为抑菌环解释标准就是在普通环境中标定的,所以除嗜血杆菌与淋病 奈瑟氏菌外,平板不可放在高CO ２的环境中。ＣO 2 与某些因素作用可使抑菌环增 大。 5、4 读取结果 (１)经16-18小时培养后,观察结果。菌液浓度适合且涂得好,抑菌环规则,细菌呈融合生长。如果出现单个菌落,说明接种量小,需重做试验,测量抑菌环直径须包含纸片直径:手持平皿从背面目测检查每块平板,借反射光(黑色无放光背景),用卡尺、普通尺或特制的模板量取抑菌环直径,单位为毫米。培养基中如果加了血液,须打开平皿盖,借反射光,从正面量抑菌环。如果就是葡萄球菌或肠球菌,须培养２4小时后,经投射光检查苯唑青霉素与万古霉素的抑菌

纸片法抗菌药物敏感实验操作标准

纸片法抗菌药物敏感实验操作标准 4.3 标准比浊管 用硫酸钡比浊管（0.5麦氏比浊标准），标定接种菌液浓度。比浊管制备方法 如下：（1）0.048mol/L BaCl 2，（1.175% w/v BaCl 2 ·2H 2 O）0.5ml，加到99.5ml 的0.18 mol/L（0.36N）H 2SO 4 （1％v/v）溶液中，制成比浊管；（2）用光径为1cm 的分光光度计测定光吸收来标定比浊管。0.5麦氏标准比浊管在625nm波长的吸收光度应为0.08-0.1；（3）选管径与制备菌液试管相同的螺口试管，每管分装4－6ml；（4）将试管帽拧紧，放室温暗处保存；（5）用前，将比浊管在旋转振荡器上混匀。如出现大颗粒，应更换；（6）每个月更换比浊管或复检比浊管的浊度。 5 操作步骤 5.1 制备接种菌液 5.1.1 增菌法步骤如下：（1）选琼脂平板上形态相同的菌落至少4－5个，用接种环挑其顶部，移至4－5ml肉汤或大豆酪蛋白消化液中；（2）置35℃培养至菌液浓度达到或超过比浊管浓度（一般需2－6小时），浓度约1－2×108CFU/ml；（3）用生理盐水或肉汤校正菌液浓度，与比浊管相同。可用光电比浊。目测比浊须在适当光照下以黑色线条为反衬。 5.1.2 直接菌悬液法步骤如下：（1）做常规药敏试验，可直接用过夜培养的菌落（必须用无选择性培养基平板，如普通琼脂培养基）在盐水或肉汤中制备接种菌液。菌液浓度调至0.5麦氏管；(2)此法适用于在肉汤培养基中生长不好的细菌如嗜血杆菌、淋病奈瑟氏菌和链球菌及葡萄球菌的甲氧苯青霉素或苯唑青霉素的耐药试验；（3）当用此法做复方磺胺药的试验时，从平板上直接挑菌落时会携带相当量的拮抗剂，造成敏感菌株的抑菌环内出现轻微的生长菌膜。 5.2 接种平板步骤如下：（1）校正的菌液须在15分钟内使用。用一无菌棉试子蘸取菌液并在上端管壁旋转挤压几次，去掉过多的菌液；（2）用试子涂布整个琼脂平板表面，反复涂布几次，每次将平皿旋转60度，保证涂布均匀。（3）将平皿盖打开3－5分钟，使培养基表面的水份吸收掉。然后贴药敏纸片；（4）注意：避免用过浓的菌液，禁用未经稀释菌或其他不标准菌液接种平板。 5.3 贴纸片（1）接种平板后，贴上药敏纸片。用镊子或针尖压一下纸片使其与培养基表面贴牢。纸片要贴得均匀，纸片与纸片中心距离不得小于24mm。原则上，直径150mm得平板贴12张纸片，直径100mm平板贴5张纸片。纸片贴后不应再移动，因为有些药物会立即扩散；（2）贴上纸片15分钟内，须把平板倒放在35℃恒温箱中。因为抑菌环解释标准是在普通环境中标定的，所以除嗜血杆菌和淋病 奈瑟氏菌外，平板不可放在高CO 2的环境中。CO 2 与某些因素作用可使抑菌环增大。 5.4 读取结果（1）经16－18小时培养后，观察结果。菌液浓度适合且涂得好，抑菌环规则，细菌呈融合生长。如果出现单个菌落，说明接种量小，需重做试验，测量抑菌环直径须包含纸片直径：手持平皿从背面目测检查每块平板，借反射光（黑色无放光背景），用卡尺、普通尺或特制的模板量取抑菌环直径，单位为毫米。培养基中如果加了血液，须打开平皿盖，借反射光，从正面量抑菌环。如果是葡萄球菌或肠球菌，须培养24小时后，经投射光检查苯唑青霉素和万古霉素的抑菌环内有无耐药菌株的生长。抑菌环内有任何生长的表现都表明是耐药菌株。（2）肉眼见不到细菌明显生长的区域为抑菌环边缘，有很难辨认的细小菌落不