3种石斛叶绿素荧光_碳同化_气孔联动关系研究

第33卷第6期2011年11月北京林业大学学报JOURNAL OF BEIJING FORESTRY UNIVERSITY

Vol．33，No．6Nov．，2011

收稿日期：2011--05--25基金项目：“948”国家林业局引进项目（2006-

-4--C07）。第一作者：任建武，博士，副教授。主要研究方向：花卉栽培生理、药用植物学、农产品贮藏与加工。电话：010--62337116Email ：jianwur@

bjfu．edu．cn

地址：100083北京市清华东路35号北京林业大学生物科学与技术学院。

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3种石斛叶绿素荧光、碳同化、气孔联动关系研究

任建武

王兴枝

杨丽娜

高荣孚

（北京林业大学生物科学与技术学院）

摘要：一些石斛属（Dendrobium ）植物光合作用表现为景天酸代谢特征。以鼓槌石斛（D．chrysotoxum ）、金钗石斛（D．nobile ）、报春石斛（D．primulinum ）为材料，以长寿花（Kalanchoe blossfeldiana ）为对照，运用LI-COR-6400-40便携式光合作用测定系统，同步测定了4种试验材料的光系统Ⅱ电子传递状况和碳同化速率；同时以鲜叶快速制片技术在扫描电镜和激光共聚焦显微镜上观察了相应条件下气孔运动状态及气孔复合体结构。结果表明：CAM 植物报春石斛光下气孔近乎关闭，但是光合作用系统电子传递正常进行。鼓槌石斛、金钗石斛明显存在气孔不均匀开闭现象。具有明显C 3植物特征的鼓槌石斛的PS Ⅱ光化学有效量子产量最高。而其他3种具有CAM 植物特征材料的光化学效率相对较低，因此干物质积累缓慢。活体实时观测试验材料光合电子传递、碳同化以及气孔运动的联动状态是研究其景天酸代谢特征的有效手段。关键词：光合作用；叶绿素荧光；景天酸代谢；气孔中图分类号：S718.43

文献标志码：A

文章编号：1000-

-1522（2011）06--0166--07REN Jian-wu ；WANG Xing-zhi ；YANG Li-na ；GAO Rong-fu．Comprehensive linkage among

chlorophyll fluorescence ，carbon assimilation and stomatal movement of three dendrobia．Journal of Beijing Forestry University （2011）33（6）166--172［Ch ，21ref．］College of Biological Sciences and Biotechnology ，Beijing Forestry University ，100083，P．R．China．

Some species within Dendrobium demonstrated characteristics of crassulacean acid metabolism．Our objective was to establish an effectvie measurement system to clarify the comprehensive linkage among chlorophyll fluorescence ，carbon assimilation and stomatal movement of three dendrobia．In the research ，three species of dendrobia were selected ，including D．chrysotoxum ，D．nobile and D．primulinum．Meanwhile ，Kalanchoe blossfeldiana was employed as control．By using Li-6400portable photosynthesis system equipped with leaf chamber fluorometer ，the electron transport of PS Ⅱand rate of carbon assimilation were inspected．Meanwhile ，the corresponded stomatal movement and the structure of stomata complex on fresh leaf were observed under scanning electronic microscope and confocal laser scanning microscope．The results showed that CAM plant D．primulinum 's stoma almost closed under light ，but the electron transported in photosynthesis system．The phenomenon of stomatal opening and closing non-uniform was obvious in D．chrysotoxum and D．nobile．The PS Ⅱphotochemistry of D．chrysotoxum with obvious characteristics of C 3plant had the highest yield of effective quantum．However ，the other three materials accumulated dry matter slowly as low photochemical efficiency．Real-time observation on electron transfer ，carbon assimilation and stomatal movement of fresh leaf would be the efficient means to research their characteristics of crassulacean acid metabolism．Key words

photosynthesis ；chlorophyll fluorescence ；crassulacean acid metabolism ；stomata

CAM （crassulacean acid metabolism ）植物有专性和兼性之分，

叶片年龄和外界条件变化会导致其光合碳同化途径在C 3和CAM 之间转换［1］

。

Cushman ［2］认为，遗传因素、个体发育及环境因素诸

如光强、相对湿度和水分都可以在一定程度上从生理生化方面影响CAM 植物的表达。Winter 和Holtum ［3］认为环境导致了冰叶日中花（Mesembryanthemum crystallinum ）的CAM 碳同化途

径。Ulrich［4］从分子起源、代谢机制、生理、个体生态、群体生态等不同层面论述了Clusia属植物的CAM特征及其调控方式，并将其分为4种光合生理

方式：C

3、CAM、C

3

-CAM、CAM-idling。

石斛属（Dendrobium）植物光合作用碳同化途径具有CAM植物特征［5--9］。对于兼性和专性CAM植物来说，以气体交换的方式测得的表观光合作用速率并不能反映叶绿体内实际光合作用状况；而叶绿素荧光动力学技术可以不受气孔开闭的限制，用来探测光系统I和光系统II的电子、质子以及能量传递运输状况［10--11］。界定不同程度的CAM植物［12］，需要有C

4

双羧酸含量［13--14］、PEPC活性［15--16］、Rubisco活性、气孔的昼夜变化节律作为佐证。其中最直接的证据莫过于观察到气孔的实时运动状态［17--18］。因此，活体实时观测石斛属植物光合电子传递［19］、碳同化以及气孔运动的联动状态应是研究其CAM植物特征的有效手段。

1材料与方法

1.1材料

试验材料为盆栽报春石斛（D．primulinum）、金钗石斛（D．nobile）、鼓槌石斛（D．chrysotoxum）；对照材料选用长寿花（Kalanchoe blossfeldiana）。分别采用0、100、500μmol/（m2·s）的光照强度处理试验材料8h，试验采用LED人工光源，3组光源从不同角度辐照以确保叶片受光均匀，3组光源均为距离叶片（20?5）cm；试验环境温度昼（25?2）?，夜（20?2）?，空气湿度60%，于09：00—11：00测定。

试验在北京林业大学分析测试平台、植物光生物学研究室完成。

1.2方法

1.2.1二氧化碳同化速率和叶绿素荧光动力学测定

采用美国LI-COR-6400-40，荧光叶室同步测定净光合作用速率和叶绿素荧光动力学参数。选用生长状态中等、均匀一致的4种试验材料各10株，每株标定同一生长方向的成熟叶片3片，仪器稳定后，

测定叶片的净光合作用速率（P

n ）、气孔导度（G

s

）、

胞间二氧化碳浓度（C

i ）、蒸腾速率（T

r

），连续3次

读数，取平均值，记录。

6h黑暗适应处理后，采用调制式荧光测量原理测定叶绿素荧光参数，作用光强度分别为100、500μmol/（m2·s）。

1.2.2扫描电镜法观察气孔变化

仪器设备：日立（HITACHI）S-3400N型扫描电子显微镜。加速电压模式，5kV，分辨率4.0nm，放大倍数200 5100。

清理样品台，剪下长10mm、宽8mm双面碳导电胶带，撕掉下面保护膜，粘贴在样品台上并撕下上表面保护膜，用锋利刀片迅速切取4 5mm宽、6 mm长的带中脉叶块，粘贴于导电胶带上，做好标记。安装样品，高度13cm。

分别于放大倍数200、1000、部分细部3000观察气孔状态。

1.2.3激光扫描共聚焦显微镜技术研究气孔动态变化

仪器系统为：Confocal Laser Scanning Microscope-Leica TCS SP5；荧光显微镜：Leica DMI6000CS。采用断层扫描，多重荧光的断层扫描及重叠技术研究气孔动态，制片方法运用鲜叶快速切片法。

鲜叶快速切片法：迅速剪切LI-COR-6400测定过的叶片，纯净水漂洗，于盛有薄层纯净水的培养皿中切取叶块，叶块包含中脉，叶块面积为3mm?5 mm，轻轻夹住叶块使之直立，记住叶片正反面；以锋利刀片沿铲形镊内侧切下，得到厚度小于0.1mm 均匀的材料；将材料平展放在滴有纯净水的载玻片上，盖上盖玻片，上镜观察。

所有数据均用EXCEL和DPS统计软件进行整理。

2结果与分析

2.1光合作用、叶绿素荧光、气孔运动之间的关系

使用LI-COR-6400-40光合仪配荧光叶室，光合作用碳同化与叶绿素荧光指标同步测定，得到4种试验材料的光合作用及叶绿素荧光相关参数，列于表1、2。

由表1可见，报春石斛从其光合作用指标的数值来看，具有比较鲜明的景天酸代谢植物特征，微弱光下其光合作用速率较高，气孔开张；而在相对强光下，气孔关闭，表观光合作用速率显示为负值。鼓槌石斛随着光照强度的增大，气孔开度增大，蒸腾速率加强，光合作用速率加速，数值分别达到161μm2、0.3983mmol/（m2·s）、2.96μmol/（m2·s）；金钗石斛在低光强下光合作用速率高，气孔开度较大，黑暗中气孔关闭，二氧化碳交换速率为负值，低至－1.04μmol/（m2·s），当光合有效辐射达到500μmol/（m2·s）时，产生光抑制，但是气孔并没有关闭。另外，鼓槌石斛和金钗石斛的叶片气孔随光合作用有效辐射的增强而开张增大，表观光合作用速率、气孔导度、胞间二氧化碳浓度、蒸腾速率都发生相应变化，表现出一定程度的C

3

植物特征。

761

第6期任建武等：3种石斛叶绿素荧光、碳同化、气孔联动关系研究

表14种试验材料的光合作用相关参数表

Tab．1Parameters related to photosynthesis measured via LI-COR-6400-40for four species employed in the trials

种名

有效辐射

（PAR）/（μmol·

m－2·s－1）

P

n

/（μmol·

m－2·s－1）

G

s

/（mol·

m－2·s－1）

C

i

/

（μmol·mol－1）

T

r

/

（mmol·m－2·s－1）

气孔开度

S

a

/

μm2

气孔宽度

W/μm

气孔长度

L/μm

长寿花01．210?0．1020．00584?0．001136?2．660．1120?0．02462．4?7．22．6?0．1224．0?3．2 1000．147?0．0130．00506?0．001356?18．350．0842?0．01834．5?4．11．5?0．0323．0?3．5

500－1．690?0．1280．00249?01150?69．870．0475?0．00510．4?1．80．4?0．0126．0?2．8

鼓槌石斛0－2．620?0．2250．00199?01660?108．360．0692?0．00411．4?1．30．6?0．0219．0?2．1 1001．040?0．0910．00326?0216?19．680．2365?0．02954．6?7．32．6?0．1821．0?2．6

5002．960?0．2280．00890?0．001132?5．210．3983?0．048161．0?18．07．0?0．6223．0?3．0

金钗石斛0－1．040?0．0860．00056?01237?112．660．0226?0．00312．0?1．91．5?0．098．0?0．9 1001．550?0．1390．00425?0266?28．270．0961?0．00682．8?9．16．0?0．3813．8?1．4

500－0．051?0．0030．00634?0．001472?39．260．0682?0．007147．0?15．47．0?0．4921．0?2．2

报春石斛02．700?0．2260．00196?0171?19．320．1126?0．09572．0?9．54．0?0．3818．0?2．1 1000．493?0．0380．00139?0603?69．220．0836?0．00915．6?2．11．3?0．1212．0?1．7

500－2．020?0．1960．00108?0732?83．510．0092?0．0029．6?1．10．6?0．0316．0?1．9注：表中样本数为30。下同。

表24种试验材料叶绿素荧光相关参数表

Tab．2Parameters related to chlorophyll fluorescence measured via LI-COR-6400-40for four species employed in the trials

种名PAR/（μmol·

m－2·s－1）

最小荧光

（F0）

最大荧光

（F m）

光下最小荧光

（F0'）

光下最大荧光

（F m'）

瞬态荧光

（F s）

最大光量

子效率

（F v/F m）

光下最大

光量子效率

（F v'/F m'）

有效光量

子产量

（ΦPS

Ⅱ

）

长寿花0180．6?12．6969．3?83．90000．813?0．06500 100188．5?15．2989．6?92．4559．2?48.51297．3?93.8670．2?62.30．810?0．0320．569?0.0280．483?0.038

500189．3?19．6955．2?92．2402．4?39.2678．1?51.6512．0?44.20．802?0．0430．407?0.0330．245?0.019

鼓槌石斛0197．3?16．31089．4?102．30000．819?0．05100 100176．5?18．1903．8?86．2214．7?22.3887．1?62.7287．7?31.50．805?0．0520．758?0.0460．676?0.039

500207．8?21．31245．4?113．5289．0?29.21297．3?88.2602．0?58.20．833?0．0480．777?0.0520．706?0.057

金钗石斛0160．0?15．5762．1?82．50000．790?0．04900 100179．0?18．1771．1?80．6167．1?15.3483．1?32.1210．5?19.30．768?0．0560．654?0.0380．564?0.044

500221．0?19．8855．7?82．6447．9?42.6702．0?54.7615．7?46.80．742?0．0390．362?0.0190．123?0.009

报春石斛0154．7?16．2656．9?79．10000．764?0．04500 100168．6?18．8789．2?72．5177．3?19.3707．1?61.8248．9?16.90．786?0．0470．749?0.0290．648?0.031

500172．2?18．2819．2?80．3239．8?20.8803．4?69.5391．8?22.50．790?0．0380．702?0.0310．512?0.022

由表2可知，金钗石斛的F

相对最小，说明捕

光天线系统的热耗散较多，其叶片利用弱光的能力

较强。鼓槌石斛的F

m

最大，表明其潜在光合作用

能力最强。金钗石斛的最大光量子化学效率偏低，

而且在500μmol/（m2·s）光照时，F

v /F

m

低至

0.742，说明这一光照强度已不适合金钗石斛生长，对其产生强烈的光抑制。具有明显C

3

植物特征的鼓槌石斛的PSⅡ光化学有效量子产量最高。

本试验中气孔开度总体来说与各个种的试验材料净光合作用速率成正相关关系，而与光系统Ⅱ的实际光量子光化学效率没有明显的联系。也正说明气孔开度只是与经过气孔的二氧化碳有关系，而CAM植物在细胞内部的二氧化碳同化过程显然无论气孔开、闭都在进行，光下气孔关闭时的碳同化受光系统电子传递形成同化力的直接推动，但是与气孔开度的确关系不大（表3）。表3光合作用速率、叶绿素荧光及气孔运动综合相关关系Tab．3Comprehensive relationship among apparent photosynthetic rate，chlorophylla fluorescence

and stomatal movement

相关系数

P

n

G

s

C

i

T

r

ΦPSⅡ

S

a

0.6107*0.8563＊＊－0.5726*0.6740*0.0673

W0.6516*0.7563＊＊－0.5678*0.5833*0.0520 L0.08370.6019*－0.22200.3739－0.0019注：*代表显著，＊＊代表极显著。

2.2石斛叶片气孔不均匀开闭

2.2.1气孔复合体观察

显微观察结果表明：金钗石斛、鼓槌石斛叶表皮细胞排列整齐、紧凑、致密，而报春石斛叶表皮细胞呈囊泡状。3种石斛叶片上表皮没有气孔分布，气孔全部位于叶片背面，属于兰科植物常见Hypostomaty类型；报春石斛气孔密度为33个/

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mm 2；金钗石斛气孔密度为88个/mm 2；鼓槌石斛气

孔密度为172个/mm 2

。

3种石斛中，金钗石斛和鼓槌石斛叶片表面角质层明显，角质层突起在气孔上形成环状构造，轮廓与气孔相似。角质层的突起将气孔到表皮间的空腔一分为二，形成双重开关。

鼓槌石斛叶片下表皮细胞垂周壁平直，叶片表面具稠密的表皮角质层条纹，表皮细胞轮廓不明显；角质层较厚，纹脊突起处厚度达到6.8μm ，角质层在气孔外测周围紧贴保卫细胞形成保护性圆环（如图1 5），圆环内缘光滑，稍加厚；在保卫细胞外包被有拱形盖，

厚度达1.66μm ，保卫细胞22.82μm ?8.21μm ，半月形，气孔侧细胞壁加厚，厚度达到1.98μm ，内部有大量叶绿体存在；表面看，气孔复合体外侧饰纹为两层同心圆环，

圆环呈现波状条纹，内层不明显，外层明显突出，整个气孔复合体近圆形，激光共聚焦光学层切后得到连续的光学切片，通过这样的显微CT 图片可以看到：在角质层后面，两个保卫细胞为4个表皮细胞所环绕组成气孔复合体，没有副卫细胞，气孔复合体为不规则型

。

图1

鼓槌石斛叶片下表皮气孔关闭图（2000?）

Fig．1

Close stomata of leaf backside for D．chrysotoxum （2000?

）

图2鼓槌石斛叶片下表皮气孔半开图（1000?）Fig．2

Half-open stomata of leaf

backside for D．chrysotoxum （1000?）

金钗石斛叶片下表皮细胞垂周壁平直（如图6 11），表面密被角质层，角质层成线形沿气孔纵轴平行排列，

在气孔周围成网状，角质层边缘在紧靠气孔外围形成圆环。

下表皮表面角质层外形呈浅波

图3

鼓槌石斛叶片下表皮气孔打开图（1000?）Fig．3

Open stomata of leaf backside for D．chrysotoxum （1000?

）

图4

鼓槌石斛气孔不均匀开闭图（200?）

Fig．4

Non-uniform stomata closure for D．chrysotoxum （200?

）图5

表面看鼓槌石斛气孔复合体图（2000?）Fig．5

Image of stomata complex viewed

from outside for D．chrysotoxum （2000?

）

图6金钗石斛叶片下表皮气孔关闭图（1000?）

Fig．6

Close stomata of leaf backside for D．nobile （1000?）

纹状，激光共聚焦层切分析表明，角质层厚度达3.5μm 。气孔为宽椭圆形，外被角质层拱形盖，拱形盖

9

61第6期任建武等：3种石斛叶绿素荧光、碳同化、气孔联动关系研究

厚度为0.65μm 。在扫描电镜下，叶片下表皮的气孔外拱盖均为单层，表面光滑或具蜡质小颗粒。外拱盖内缘平滑，或呈不规则的波状。保卫细胞大小为13.82μm ?36.65μm ，内部分布有大量叶绿体，气孔侧细胞壁中间加厚达1.52μm 。从切面来看，两个保卫细胞被4个表皮细胞围合，没有副卫细胞，气孔复合体亦为不规则型

。

图7

金钗石斛叶片下表皮气孔半开图（1000?）

Fig．7

Half-open stomata of leaf backside for D．nobile （1000?

）

图8金钗石斛叶片下表皮气孔打开图（1000?）

Fig．8

Open stomata of leaf backside for D．nobile （1000?

）

图9金钗石斛气孔不均匀开闭图（200?）

Fig．9

Non-uniform stomata closure for D．nobile （200?）

报春石斛叶片下表皮细胞垂周壁平直稍成弧形（图12 17），未见表面覆盖有角质层，表皮细胞清晰可见，成圆球形囊泡状。保卫细胞气孔侧细胞壁稍加厚，达到0.43μm ，保卫细胞大小为15.36μm ?36.21μm ，肾形，包括两个保卫细胞的气孔器近圆形，密布叶绿体颗粒。保卫细胞外被拱形盖，

边

图10

金钗石斛气孔复合体（1000?）

Fig．10

Image of stomata complex for D．nobile （1000?

）

图11金钗石斛下表皮被角质层覆盖图（3000?）Fig．11

Image of top surface on lower epidermis covered by cuticle for D．nobile （3000?）

缘不规则波形，有犬牙突起，外缘加厚，厚度为1.6μm 。两个保卫细胞外围由4 5个形状明显更大的表皮细胞包围。没有副卫细胞，整个气孔复合体为不规则型

。

图12

报春石斛叶片下表皮气孔打开图（1000?）

Fig．12

Open stomata of leaf backside for D．primulinum （1000?）

2.2.2气孔不均匀开闭

参见图4、9、15，试验材料中存在气孔的不均匀开闭现象

［20-

-21］，特别是金钗石斛和鼓槌石斛，表现

十分明显，同一视野中气孔的开闭状态差异非常大；在报春石斛、长寿花叶片气孔中也有不同程度的开度差异。

气孔的不均匀开闭主要是影响胞间二氧化碳浓度的计算结果。北京林业大学植物光生物学研究室

071北京林业大学学报第33卷

图13报春石斛叶片下表皮气孔半开图（2000?）Fig．13

Half-open stomata of leaf

backside for D．primulinum （2000?

）

图14

报春石斛叶片下表皮气孔关闭图（1000?）

Fig．14

Close stomata of leaf backside for D．primulinum （1000?

）

图15

报春石斛气孔不均匀开闭图（200?）

Fig．15

Non-uniform stomata closure for D．primulinum （200?）

在玉竹的光合作用研究中，发现气孔不均匀开闭的存在，以气孔的长轴长度和短轴长度的乘积表示气孔开度，以一天中所观测到的气孔开度最大值为基数，

其他气孔开度值与其相比得到气孔的相对开度，进而计算气孔相对开度与气孔导度的函数关系，得到G s =196.76ln x +414.61（其中x 代表气孔相对开度）。由于发生气孔不均匀开闭时，各个气孔导度不同，如果以气孔导度的平均值计算胞间二氧化碳浓度，显然会产生误差。因此通过观测到的气孔相对开度值计算气孔导度，代入公式C i =C a －1.6P n /G s ，得到比较准确的胞间二氧化碳浓度值（其中C

a

图16

报春石斛气孔复合体图（3000?）

Fig．16

Image of stomata complex for D．primulinum （3000?

）

图17

报春石斛气孔内侧图（5010?）

Fig．17

Image of stomata inside for D．primulinum （5010?）

为气孔周围单位体积空气中CO 2摩尔数）。

但是该方法源于Rubisco 活性和NADPH 变化的推导，适合于C 3植物；而对于CAM 植物目前尚没有可信的计算胞间二氧化碳浓度的模型。本研究表明，在5种试验材料中，气孔的不均匀开闭是不同程度地普遍存在的。目前看来，采用单一的测定气体交换或者辅之以独立分离的气孔动态观测都不可能准确地测定CAM 植物胞间二氧化碳浓度的真实变化。而是应该以同步联动的方法，测定气体交换（二氧化碳、氧气）的同时，非损伤观测气孔实时变化以及电子传递。通过测定电子传递了解真实的叶

肉细胞内二氧化碳同化作用动态，而二氧化碳的同化作用最终决定了叶肉组织与外界环境交换气体的来源、组份、绝对数量；通过净光合作用速率的测定掌握叶肉组织内外气体交换的状况；通过同步显微

1

71第6期任建武等：3种石斛叶绿素荧光、碳同化、气孔联动关系研究

观察，研究气孔实时变化动态，明确气体交换与气孔变化的内在关系。而目前国内外尚没有专门用来同步测定三者联动关系的仪器，用来进行非损伤活体实时测定。

3结论与讨论

CAM植物报春石斛光下气孔近乎关闭，但是光合作用系统电子传递正常进行。鼓槌石斛、金钗石斛明显存在气孔不均匀开闭现象。

3种石斛的气孔结构相似，气孔复合体为不规则型，没有副卫细胞；保卫细胞外侧罩有拱盖。金钗石斛、鼓槌石斛的叶表皮覆盖有花纹的角质层，而报春石斛没有，叶片下表皮外观与前两者有明显的不同。金钗石斛、鼓槌石斛通过角质层保护来减少水分散失，而报春石斛通过内在生理机制提高水分利用效率。

电镜观察和显微制片都会对植物材料进行预处理，无论这些处理方法是物理的还是化学的，均不同程度地造成对材料的影响，改变气孔的状态。因此显微镜下观察到的气孔往往与活体状态有很大差别。本研究经过多次反复试验，首次使用扫描电镜观察活体植物材料，取得了良好的试验结果，尽可能保持了叶片功能状态的气孔形态；在confocal显微制片方面，本研究通过巧妙的创新设计，开创了用最简单的操作工具快速无化学损伤制片的方法。

尽管在试验设计和方法方面有创新，但是碳同化、电子传递、气孔变化研究依然没有做到活体、无损伤、完全同步。可以明确的是，目前的科研技术已经具备开发这样仪器的条件。基本思路应该是：以倒置荧光显微镜为基础，观察一般说来气孔分布比较多的叶片背面，位于形态学下方；而叶片放置在透明底的叶室内，上部加装LED光源用来提供作用光；气体交换测定装置与叶室相连。这样便可以同步、实时、非损伤测定碳同化、气体交换、气孔动态。将显微技术、荧光动力学分析技术、光合气体交换测定技术结合起来。

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（责任编辑李丰刀女）

271北京林业大学学报第33卷

叶绿素的光敏性质探究

叶绿素的光敏性质探究（与二氢卟吩e4对比） 研究背景 光敏剂的光漂白（photobleaching）是指在光的照射下，光敏剂所激发出来的荧光强度随着时间推移逐步减弱乃至消失的现象，这是光动力诊断临床应用中考虑光剂量和检测需用时间的一个重要因素。 长波红光在组织中具有较大的穿透深度，从而能保证足够的治疗深度：大的吸光度能保证充分利用光能量和尽可能减少药物剂量；光敏剂吸光度的大小是决定药物剂量的理论依据。过多的光敏剂分布于癌组织中势必会影响光的穿透深度，然而使用过少的光敏剂又不能产生应有的疗效。因此，光敏剂的使用剂量要依据其吸光度的大小和肿瘤组织的大小来权衡。 对于同一种光敏剂，它的漂白时间将随入射光的光能流率的增大而减小。再次，除了与光敏剂的类型有关外，还与初始浓度和入射光源的波长有关。初始浓度越大，光漂白时间越长。 实验意义：探究不同浓度的叶绿素在不同光源、不同时间的照射下，其吸光度随时间的变化，探测其光漂白特性，为更好地在临床应用上要保持光敏剂的有效杀伤浓度，且控制好光敏剂的激发时间，这样才能保证治疗的效果。 初步设想： 探究叶绿素在不同浓度，不同光源，不同光照时间对光的敏感性：（1）用紫外检测得到叶绿素的紫外可见吸收光谱，与二氢卟吩e4的光谱图比较。（最好能同时测定荧光光谱） （2）在叶绿素的最大吸收波长处检测浓度为0.05 mg/ml ，0.1 mg/ml ，0.2 mg/ml ，0.3 mg/ml， 0.4mg/ml的叶绿素的吸光度，并制作曲线图，验证其是否符合朗伯-比尔定律。 （3）实验设置了不同的六组光源：白光、红外光、黄光、绿光、蓝光、紫外光，分别对0.4mg/ml的叶绿素待测样品进行垂直照射10min、20min、30min、40min、50min、60min、80min、100min，取照射后的各样品进行紫外-可见吸收光谱的检测，通过光谱的变化，探究光敏剂叶绿素明显的光漂白特性。

高级植物生态学试题

《高级植物（生理）生态学》课程考试试题 生命科学学院周晓丽学号：G2004477 一、名词解释（30分） 1.光补偿点和光饱和点 光补偿点：光合作用吸收的二氧化碳与呼吸作用放出的二氧化碳数量相等时的光强。阴生植物的光补偿点低于阳生植物，C3植物低于C4植物。 光饱和点：在一定的光强范围内，植物的光合强度随光照度的上升而增加，当光照度上升到某一数值之后，光合强度不再继续提高时的光照度值。 2.CO2饱和点和CO2补偿点 CO2饱和点：CO2浓度增加到一定程度时光合速率不再增加,此时环境中CO2的浓度称二氧化碳饱和点。 CO2补偿点：光合作用释放的氧气与呼吸作用消耗的氧气相等时外界环境中的CO2浓度，就是光合作用的CO2补偿点。 3.量子产率与羧化效率 量子产率：体系吸收每一个光子所引发的某种事件的数目。符号为ψ，Y。积分量子产率为Ф=事件数/吸收光子数。对于光化学反应，ψ=反应物消耗(或产物产生)的数量/吸收光子数量。微分量子产率为φ=(d[x]/dt)/n。式中d[x]/dt为某可测量量的变率，n为单位时间内所吸收的光子数(摩尔或爱因斯坦)。ψ可用于光物理过程或光化学反应。 羧化效率：在低CO2浓度条件下，CO2浓度是光合作用的限制因子，直线的斜率(CE)受羧化酶活性和量的限制。因而，CE被称为羧化效率。CE值大，则表示Rubisco的羧化效率较高。 4.叶面积指数：单位土地面积上植物植株绿叶面积与土地面积的比值。是反映作物群体大小的较好的动态指标。 5.植物的碳同位素区异：主要指C3、C4在植物体内的不同含量。

二、简答题（40分） 1、画图示意光合速率的光响应曲线，并标示出暗呼吸、光补偿点和光饱和 点。 光和响应曲线 2、如何理解叶绿素荧光动力学中的F V/F m和NPQ，它们在分析植物光合生 理分析有何意义？ 调制叶绿素荧光全称脉冲-振幅-调制（Pulse-Amplitude-Modulation,PAM）叶绿素荧光，我们国内一般简称调制叶绿素荧光，测量调制叶绿素荧光的仪器叫调制荧光仪，或叫PAM。 调制叶绿素荧光（PAM）是研究光合作用的强大工具，与光合放氧、气体交换并称为光合作用测量的三大技术。由于其测量快速、简单、可靠、且测量过程对样品生长基本无影响，目前已成为光合作用领域发表文献最多的技术。 调制叶绿素荧光仪的工作原理 1983年，WALZ公司首席科学家，德国乌兹堡大学教授Ulrich Schreiber 博士利用调制技术和饱和脉冲技术，设计制造了全世界第一台脉冲振幅调制（Pulse-Amplitude-Modulation，PAM）荧光仪——PAM-101/102/103。 所谓调制技术，就是说用于激发荧光的测量光具有一定的调制（开/关）频

荧光分析法检测原理及应用举例

1 荧光定义 某些化学物质从外界吸收并储存能量而进入激发态，当其从激发态回到基态时，过剩的能量以电磁辐射的形式放射出去即发光，称之为荧光。可产生荧光的分子或原子在接受能量后引起发光，供能一旦停止，荧光现象随之消失。 2 荧光分类 由化学反应引起的荧光称为化学荧光，由光激发引起的荧光称为光致荧光，课题主要研究光致荧光。按产生荧光的基本微粒不同，荧光可分为原子荧光、X 射线荧光和分子荧光，课题主要研究分子荧光。 3 光致荧光机理 某一波长的光照射在分子上，分子对此光有吸收作用，光能量被分子所吸收，分子具有的能量使分子的能级由最低的基态能级上升至较高的各个激发态的不同振动能级，称为跃迁。分子在各个激发态处于不稳定的状态，并随时在激发态的不同振动能级下降至基态，在下降过程中，分子产生发光现象，此过程为释放能量的过程，即为光致荧光的机理。光致荧光的过程按照时间顺序可分为以下几部分。 分子受激发过程 在波长为10~400nm的紫外区或390~780nm的可见光区，光具有较高的能量，当某一特征波长的光照射分子时，是的分子会吸收此特征波长的光能量，能量由光传递到分子上，此过程为分子受激发过程。分子中的电子会出现跃迁过程，在稳定的基态向不稳定的激发态跃迁。跃迁所需要的能量为跃迁前后两个能级的能量差，即为吸收光的能量。分子跃迁至不稳定的激发态中即为电子激发态分子。 在电子激发态中，存在多重态。多重态表示为2S+1。S为0或1，它表示电子在自转过程中，具有的角动量的代数和。S=0表示所有电子自旋的角动量代数和为0，即所有电子都是自旋配对的，那么2S+1=1，电子所处的激发态为单重态， 用S i 表示，由此可推出，S 即为基态的单重态，S 1 为第一跃迁能级激发态的单重 态，S 2 为第二跃迁能级激发态的单重态。S=1表示电子的自旋方向不能配对，说明电子在跃迁过程中自旋方向有变化，存在不配对的电子为2个，2S+1=3，电子 在激发态中位于第三振动能级，称为三重态，用T i 来表示，T 1 即为第一激发态中 的三重态，T 2 即为第二激发态中的三重态，以此类推。

叶绿素荧光参数及意义

第一节 叶绿素荧光参数及其意义 韩志国，吕中贤（泽泉开放实验室，上海泽泉科技有限公司，上海，200333） 叶绿素荧光技术作为光合作用的经典测量方法，已经成为藻类生理生态研究领域功能最强大、使用最 广泛的技术之一。由于常温常压下叶绿素荧光主要来源于光系统II 的叶绿素a ，而光系统II 处于整个光合 作用过程的最上游，因此包括光反应和暗反应在内的多数光合过程的变化都会反馈给光系统II ，进而引起 叶绿素a 荧光的变化，也就是说几乎所有光合作用过程的变化都可通过叶绿素荧光反映出来。与其它测量 方法相比，叶绿素荧光技术还具有不需破碎细胞、简便、快捷、可靠等特性，因此在国际上得到了广泛的 应用。 1 叶绿素荧光的来源 藻细胞内的叶绿素分子既可以直接捕获光能，也可以间接获取其它捕光色素（如类胡萝卜素）传递来 的能量。叶绿素分子得到能量后，会从基态（低能态）跃迁到激发态（高能态）。根据吸收的能量多少， 叶绿素分子可以跃迁到不同能级的激发态。若叶绿素分子吸收蓝光，则跃迁到较高激发态；若叶绿素分析 吸收红光，则跃迁到最低激发态。处于较高激发态的叶绿素分子很不稳定，会在几百飞秒（fs ，1 fs=10－15 s ）内通过振动弛豫向周围环境辐射热量，回到最低激发态（图1）。而最低激发态的叶绿素分子可以稳定 存在几纳秒（ns ，1 ns=10－9 s ）。 波长吸收荧光红 B 蓝 荧光 热耗散 最低激发态较高激发态基态吸收蓝光吸收红光能量A 图1 叶绿素吸收光能后能级变化（A ）和对应的吸收光谱（B ）（引自韩博平 et al., 2003） 处于最低激发态的叶绿素分子可以通过几种途径（图2）释放能量回到基态(韩博平 et al., 2003; Schreiber, 2004)：1）将能量在一系列叶绿素分子之间传递，最后传递给反应中心叶绿素a ，用于进行光化 学反应；2）以热的形式将能量耗散掉，即非辐射能量耗散（热耗散）；3）放出荧光。这三个途径相互竞 争、此消彼长，往往是具有最大速率的途径处于支配地位。一般而言，叶绿素荧光发生在纳秒级，而光化 学反应发射在皮秒级（ps ，1 ps=10－12 s ），因此在正常生理状态下（室温下），捕光色素吸收的能量主要用 于进行光化学反应，荧光只占约3%～5%(Krause and Weis, 1991; 林世青 et al., 1992)。 在活体细胞内，由于激发能从叶绿素b 到叶绿素a 的传递几乎达到100％的效率，因此基本检测不到 叶绿素b 荧光。在常温常压下，光系统I 的叶绿素a 发出的荧光很弱，基本可以忽略不计，对光系统I 叶 绿素a 荧光的研究要在77 K 的低温下进行。因此，当我们谈到活体叶绿素荧光时，其实指的是来自光系 统II 的叶绿素a 发出的荧光。

部分叶绿素荧光动力学参数的定义

部分叶绿素荧光动力学参数的定义： F0：固定荧光，初始荧光(minimalfluorescence)。也称基础荧光，0水平荧光，是光系统Ⅱ(PSⅡ)反应中心处于完全开放时的荧光产量，它与叶片叶绿素浓度有关。 Fm：最大荧光产量(maximalfluorescence)，是PSⅡ反应中心处于完全关闭时的荧光产量。可反映经过PSⅡ的电子传递情况。通常叶片经暗适应20 min后测得。 F：任意时间实际荧光产量(actualfluorescence intensity at any time)。 Fa：稳态荧光产量(fluorescence instable state)。 Fm/F0：反映经过PSⅡ的电子传递情况。 Fv=Fm-F0：为可变荧光(variablefluorescence)，反映了QA的还原情况。 Fv/Fm：是PSⅡ最大光化学量子产量(optimal/maximal photochemical efficiency of PSⅡin the dark)或(optimal/maximalquantum yield of PSⅡ)，反映PSⅡ反应中心内禀光能转换效率(intrinsic PSⅡefficiency)或称最大PSⅡ的光能转换效率(optimal/maximalPSⅡefficiency)，叶暗适应20 min后测得。非胁迫条件下该参数的变化极小，不受物种和生长条件的影响，胁迫条件下该参数明显下降。 Fv’/Fm’：PSⅡ有效光化学量子产量(photochemicalefficiency of PSⅡin the light)，反映开放的PSⅡ反应中心原初光能捕获效率，叶片不经过暗适应在光下直接测得。 (Fm’-F)/Fm’或△F/Fm’：PSⅡ实际光化学量子产量(actual photochemical efficiency of PSⅡin the light)(Bilger和Bjrkman,1990),它反映PSⅡ反应中心在有部分关闭情况下的实际原初光能捕获效率,叶片不经过暗适应在光下直接测得。 荧光淬灭分两种:光化学淬灭和非光化学淬灭。光化学淬灭：以光化学淬灭系数代表：qP=(Fm’-F)/(Fm’-F0’)；非光化学淬灭，有两种表示方法，NPQ=Fm/Fm’-1或qN=1-(Fm’-F0’)/(Fm-F0)=1-Fv’/Fv。 表观光合电子传递速率以[(Fm’-F)Fm’]×PFD表示，也可写成：△F/Fm’×PFD×0.5×0.84，其中系数0.5是因为一个电子传递需要吸收2个量子，而且光合作用包括两个光系统，系数0.84表示在入射的光量子中被吸收的占84%，PFD是光子通量密度；表观热耗散速率以(1-Fv’/Fm’)×PFD表示。 Fmr：可恢复的最大荧光产量，它的获得是在荧光P峰和M峰后，当开放的PSⅡ最大荧光产量平稳时，关闭作用光得到F0’后，把饱和光的闪光间隔期延长到180s/次，得到一组逐渐增大(对数增长)的最大荧光产量，将该组最大荧光产量放在半对数坐标系中即成直线，该直线在Y轴的截距即为Fmr。以(Fm-Fmr)/Fmr可以反映不可逆的非光化学淬灭产率，即发生光抑制的可能程度。 FO(初始荧光),Fm(最大荧光),Fv= Fm-FO(可变荧光),Fv /Fm(PSII最大光化学效率或原初光能转换效率),Fv /FO(PSII的潜在活性),Yield(PSII总的光化学量子产额),ETR(表观电子传递速率),PAR(光合有效辐射),LT(叶面温度)。其中FO、Fm、Fv /FO测定前将叶片暗适应20 min。各参数日变化从6: 00～18: 00,每2h测定一次。 （Fv /Fm）和（Fv /FO）分别用于度量植物叶片PSII原初光能转换效率和PSII潜在活性,-（Yield）是PSII的实际光化学效率,反映叶片用于光合电子传递的能量占所吸收光能的比例,是PSII反应中心部分关闭时的光化学效率,其值大小可以反映PSII反应中心的开放程度。常用来表示植物光合作用电子传递的量子产额,可作为植物叶片光合电子传递速率快慢的相对指标。即在光合作用进程中,PSII每获得一个光量子所能引起的总的光化学反应。因此,较高的Yield值,有利于提高光能转化效率,为暗反应的光合碳同化积累更多所需的能量,以促进碳同化的高效运转和有机物的积累。同样毛蕊红山茶和长毛红山茶的Yield值也较高。

叶绿素荧光研究背景知识介绍

叶绿素荧光研究背景知识介绍 前言 近些年来，叶绿素荧光技术已经逐渐成为植物生理生态研究的热门方向。荧光数据是植物光合性能方面的必要研究内容。目前这种趋势由于叶绿素荧光检测仪的改进而得到发展。然而荧光理论和数据解释仍然比较复杂。就我们所了解的情况来看，目前许多研究者对荧光理论不是很清楚，仪器应用仅仅限于简单的数据说明的基础上，本文在此基础上，目的在于简单明晰地介绍相关理论和研究要点，以求简单明确地使用叶绿素荧光检测设备，充分分析实验数据，重点在于植物生理生态学技术的应用和限制。 荧光测量基础 植物叶片所吸收的光的能量有三个走向：光合驱动、热能、叶绿素荧光。三个过程之间存在竞争，其中任何一个效率的增加都将造成另外两个产量的下降。因此，测量叶绿素荧光产量，我们可以获得光化学过程与热耗散的效率的变化信息。尽管叶绿素荧光的总量很小(一般仅占叶片吸收光能总量的1-2%)，测量却非常简单。荧光光谱不同于吸收光谱，其波长更长，因此荧光测量可以通过把叶片经过给定波长的光线的照射，同时测量发射光中波长较长的部分光线的量来实现。有一点需要注意的是，这种测量永远是相对的，因为光线不可避免会有损失。因此，所有分析必须把数据进行标准化处理，包括其进一步计算的许多参数也是如此。 调制荧光仪的出现是荧光研究技术的革命性的创新。在这类仪器中，测量光源是调制(高频率开关)的，其检测器也被调谐来仅仅检测被测量光激发的荧光。因此，相对的荧光产量可以在背景光线(主要是指野外全光照的条件下)存在的条件下进行测量。目前绝大多数的荧光仪采用了调制系统，同时也强烈建议选择调制荧光仪(Kate Maxwell,2000)。 为什么荧光产量会发生改变？Kautsky效应和Beyond 叶绿素荧光产量的变化最早在1960年被Kautsky和其合作者发现。他们发现，当把植物叶片从黑暗中转入光下，荧光产量瞬间上升(大约在1秒左右)这种上升可以解释为光合途径中电子受体的还原(可接受电子的受体的减少)。一旦PSII吸收光能，初级电子受体Q A(质体醌)接受了电子，它将不能再接受电子，直到它把电子传递给下一级电子载体Q B。此期间，反应中心是关闭的，反应中心关闭的比

叶绿素理化性质及含量

实验报告 课程名称： 植物生理学（乙）指导老师： 廖敏 成绩： 实验名称： 叶绿素理化性质和含量 实验类型： 定量探究型 同组学生姓名： 方昊 一、实验目的和要求（必填） 三、主要仪器设备（必填） 五、实验数据记录和处理 七、讨论、心得 二、实验内容和原理（必填） 四、操作方法和实验步骤 六、实验结果与分析（必填） 一、实验目的和要求 掌握植物中叶绿体色素的分离和性质鉴定、定量分析的原理和方法； 二、实验内容和原理 以青菜为材料，提取和分离叶绿体色素并进行理化性质测定和叶绿素含量 分析。原理如下： 1. 叶绿素和类胡萝卜素均不溶于水而溶于有机溶剂，常用95%的乙醇或80%的丙酮提取； 2. 叶绿素是二羧酸酯，与强碱反应，形成绿色的可溶性叶绿素盐，就可与有机溶剂中的类胡萝卜素 分开； 3. 在酸性或加温条件下，叶绿素卟啉环中的Mg++可依次被H+和Cu++取代形成褐色的去镁叶绿素和绿色的铜代叶绿素； 4. 叶绿素受光激发，可发出红色荧光，反射光下可见红色荧光； 5. 叶绿素吸收红光和蓝紫光，红光区可用于定量分析，其中645和663用于定量叶绿素a 、b 及总量，而652可直接用于总量分析。 专业：农业资源与环境 姓名： 吴主光 学号： 3110100403 日期： 2013.10.17 地点： 生物实验中心 装 订 线

三、主要仪器设备 1. 天平（万分之一）、可扫描分光光度计、离心机、研具、各种容（量）器、洒精灯等 四、操作方法、实验步骤以及实验现象 定性分析： 鲜叶5g+95%30ml（逐步加入）,磨成匀浆 过滤入三角瓶中，观察荧光现象：透射光绿色，反射光红色。 皂化反应（3ml）：加KOH数片剧烈摇均，加石油醚5ml和H2O1ml分层后观察：上层呈黄色，为类胡萝卜素，吸收蓝紫光；下层呈绿色，为叶绿素，吸收红光和蓝紫光。 取代反应（1）：加醋酸约2ml，变褐（去镁叶绿素）；取1/2加醋酸铜粉加热，变鲜绿色，为铜代叶绿素。 取代反应（2）：鲜叶2-3cm2，加Ac-AcCu 20ml加热，观察： 3 min变为褐绿色的去镁叶绿素， 5 min后，变为深绿色的铜代叶绿素。 叶绿素和类胡萝卜素的吸收光谱测定： 皂化反应的上层黄色石油醚溶液（稀释470nm OD 0.5-1） 反复用石油醚粹取，直到无类胡萝卜素，离心得叶绿素(盐)（稀释663nm OD 0.5-1) 在400-700nm处扫描光谱，分别测定类胡萝卜素和叶绿素的吸收峰. 叶绿素定量分析：鲜叶0.1g，加1.9mlH2O，磨成匀浆，取0.2ml加80%丙酮4.8ml,摇匀，4000转离心3min,上清液在645，652，663测定OD，计算Chla,Chlb 和Chl总量的值。 五、实验数据记录和处理

对于叶绿素荧光全方面的研究

对于叶绿素荧光全方面的研究 叶绿素荧光现象的发现 将暗适应的绿色植物突然暴露在可见光下后，植物绿色组织发出一种暗红色，强度不断变化的荧光。荧光随时间变化的曲线称为叶绿素荧光诱导动力学曲线。最直观的表现是，叶绿素溶液在透射光下呈绿色，在反射光下呈红色的现象。其本质是，叶绿素吸收光后，激发了捕光色素蛋白复合体，LHC将其能量传递到光系统2或光系统1，期间所吸收的光能有所损失，大约3%-9%的所吸收的光能被重新发射出来，其波长较长，即叶绿素荧光。 叶绿素荧光动力学研究的特点 1、叶绿素荧光动力学特性包含着光合作用过程的丰富信息 光能的吸收和转换 能量的传递与分配 反应中心的状态 过剩光能及其耗散 光合作用光抑制与光破坏 2、可以对光合器官进行“无损伤探查” 3、操作步骤简单快捷 光合作用的光抑制 光抑制是过剩光能造成光合功能下降的过程。过剩光能指植物所吸收的光能超出光化学反应所能利用的部分。过去人们把光抑制与光破坏等同起来，认为发生了光抑制就意味着光和机构遭到破坏。甚至把光抑制、光破坏、光氧化等，沦为一体。 光抑制的基本特征表现为： 光合效率下降说明叶片吸收的光能不能有效地转化为化学能。光破坏：PSII 是光破坏的主要场所，破坏也可能发生在反应中心也可能发生在与次级电子受体结合的蛋白上。发生光破坏后的结果：电子传递受阻、光合效率下降。当过剩的光能，不能及时有效地排散时，会对光合机构造成不可逆的伤害，如光氧化、光漂白等等。一切影响二氧化碳同化的外界因素，如低温、高温、水分亏缺、矿质元素亏缺等都会减少对光能的利用，导致过剩光能增加，进而加重光破坏。 植物防御破坏的措施 1、减少对光能的吸收 增加叶片的绒毛、蜡质 减少叶片与主茎夹角 2、增强代谢能力 碳同化 光呼吸 氮代谢 3、增加热耗散 依赖叶黄素循环的热耗散 状态转换 作用中心可逆失活 光合作用

植物表型组学研究技术(一)FluorCam 叶绿素荧光成像技术

植物表型组学研究技术（一） ——FluorCam叶绿素荧光成像技术

FluorCam叶绿素荧光成像技术 Rousseau等（High throughput quantitative phenotyping of plant resistance using chlorophyll fluorescence image analysis.Plant Methods, 2013, 9:17），利用FluorCam开放式叶绿素荧光成像系统作为高通量表型分析平台，采用图像阈值分割等分析方法，对植物病原体感染进行了定量分析检测，根据Fv/Fm将感染分为不同阶段／等级，特别是可以将用其它方法难以分辨出来的感染前期加以分辨，并对5个品种的菜豆对普通细菌性疫病的抗性进行了定量分析评价。 PSI公司首席科学家Nedbal教授与公司总裁Trtilek博士等首次将PAM叶绿素荧光技术（Pulse Amplitude Modulated technique—— 脉冲调制技术）与CCD技术结合在一起，于1996 年在世界上成功研制生产出FluorCam叶绿素荧 光成像系统（Heck等，1999；Nedbal等，2000； Govindjee and Nedbal, 2000）。FluorCam叶 绿素荧光成像技术成为上世纪90年代叶绿素荧 光技术的重要突破，使科学家对光合作用与叶 绿素荧光的研究一下子进入二维世界和显微世 界，广泛应用于植物生理生态、植物胁迫与抗 性监测、作物育种、植物表型分析等。不同于 其它成像分析技术，FluorCam叶绿素荧光成像 只对叶绿素荧光波段敏感，可以有效避免环境 光的干扰，特异性、高灵敏度反映植物生理生 态状况。 主要功能特点如下： 1)高灵敏度CCD，时间分辨率可达50帧／秒，有效抓取叶绿素荧光瞬变；可选配高分 辨率CCD，分辨率1392x1040像素，用于气孔功能成像分析、稳态荧光如GFP荧光测量等

植物体叶绿素荧光测定仪的原理与使用方法

植物体叶绿素荧光测定仪的原理与使用方法 【实验目的】 ?了解目前在光合作用研究中先进的叶绿素荧光技术，了解便携式叶绿素荧光仪测定 植物光合作用叶绿素荧光参数的基本原理和仪器的使用方法。 ?老师演示和学生分组利用便携式叶绿素荧光仪(PAM2100)测定实验植物的叶绿素荧 光基本参数(Fo, Fm, Fv/Fm, Fm’, Fo’, Yield, ETR, PAR, qP, qN等)。 ?了解荧光仪的广泛应用 【实验原理】 仪器介绍和工作原理 叶绿素荧光（Chlorophyll Fluorescence）的产生 ?传统的光合作用测定是通过测量植物光合作用时CO2的消耗或干物质积累计算出 来。叶绿素荧光分析技术通过测量叶绿素荧光量准确获得光合作用量及相关的植物生长潜能数据。 ?叶绿素荧光动力学技术在测定叶片光合作用过程中光系统对光能的吸收、传递、耗 散、分配等方面具有独特的作用，与“表观性”的气体交换指标相比，叶绿素荧光参数更具有反映“内在性”特点。 ?本实验以调制式叶绿素荧光仪PAM-2100（W ALZ）为例，测定植物叶绿素荧光主 要参数。植物叶片的生长状况不同，所处位置的不同，光照不同，叶绿素荧光参数数值也会有所不同，所以不同叶片之间叶绿素荧光产量存在着一定的差异。 【实验内容与步骤】 一、仪器使用步骤讲解 1. 仪器安装连接 将光纤和主控单元和叶夹2030-8相连接。光纤的一端必须通过位于前面板的三孔光纤连接器连接到主控单元，光纤的另一端固定到叶夹2030-B上。同时，叶夹2030-B还应通过LEAF CLIP插孔连接到主控单元。 2. 开机 按“POWER ON”键打开内置电脑后，绿色指示灯开始闪烁，说明仪器工作正常。随后在主控单元的显示器中会出现PAM-2100的表示。从仪器启动到进入主控单元界面大概要40秒。 3. PAM-2100的键盘 PAM-2100主控单元上有20个按键，现分别简要介绍主要按键的功能。

叶绿素理化性质的测定

一、原理 叶绿素是一种二羧酸—叶绿酸与甲醇和叶绿醇形成的复杂酯，故可与碱起皂化反应而生成醇（甲醇和叶绿醇）和叶绿酸的盐，产生的盐能溶于水中，可用此法将叶绿素与类胡萝卜素分开；叶绿素与类胡萝卜素都具有光学活性，表现出一定的吸收光谱，可用分光镜检查或用分光光度计精确测定；叶绿素吸收光量子而转变成激发态，激发态的叶绿素分子很不稳定，当它变回到基态时可发射出红光量子，因而产生荧光。叶绿素的化学性质很不稳定，容易受强光的破坏，特别是当叶绿素与蛋白质分离以后，破坏更快，而类胡萝卜素则较稳定。叶绿素中的镁可以被H+所取代而成褐色的去镁叶绿素，后者遇铜则成为绿色的铜代叶绿素，铜代叶绿素很稳定，在光下不易破坏，故常用此法制作绿色多汁植物的浸渍标本。 皂化反应式如下： 二、仪器与用具 20ml刻度试管；10ml小试管；试管架；分光镜；石棉网；药匙；烧杯（100ml）；酒精灯；玻棒；铁三角架；刻度吸量管2ml、5ml各1支；火柴。 三、试剂 1. 95%乙醇；苯；醋酸铜粉末；5%的稀盐酸； 2. 醋酸-醋酸铜溶液：6g醋酸酮溶于100ml 50%的醋酸中，再加蒸馏水4倍稀释而成； 3. KOH-甲醇溶液：20g KOH溶于100ml甲醇中，过滤后盛于塞有橡皮塞的试剂瓶中。 四、方法 用叶绿体色素乙醇溶液和水研磨匀浆，进行以下实验。 1.光对叶绿素的破坏作用 （1）取4支小试管，其中两支各加入5ml用水研磨的叶片匀浆，另外两支各加入2.5ml叶绿体色素乙醇提取液，并用95%乙醇稀释1倍。 （2）取1支装有叶绿素乙醇提取液的试管和1支装有水研磨叶片均浆的试管，放在直射光下，另外两支放到暗处，40min后对比观察颜色有何变化，解释其原因。 2.荧光现象的观察 取1支20ml刻度试管加入5ml浓的叶绿体色素乙醇提取液，在直射光下观察溶液的透射光与反射光颜色有何不同？解释原因。 3.皂化作用（绿色素与黄色素的分离） （1）在做过荧光现象观察的叶绿体色素乙醇提取液试管中加入1.5ml 20%KOH-甲醇溶液，充分摇匀。

第4章第1节_叶绿素荧光参数及意义-v2.

第四章 叶绿素荧光技术应用 第一节 叶绿素荧光参数及其意义 韩志国，吕中贤（泽泉开放实验室，上海泽泉科技有限公司，上海，200333） 叶绿素荧光技术作为光合作用的经典测量方法，已经成为藻类生理生态研究领域功能最强大、使用最广泛的技术之一。由于常温常压下叶绿素荧光主要来源于光系统 II 的叶绿素 a ，而光系统 II 处于整个光合作用过程的最上游，因此包括光反应和暗反应在内的多数光合过程的变化都会反馈给光系统 II ，进而引起叶绿素 a 荧光的变化，也就是说几乎所有光合作用过程的变化都可通过叶绿素荧光反映出来。与其它测量方法相比，叶绿素荧光技术还具有不需破碎细胞、简便、快捷、可靠等特性，因此在国际上得到了广泛的应用。 1 叶绿素荧光的来源 藻细胞内的叶绿素分子既可以直接捕获光能，也可以间接获取其它捕光色素（如类胡萝卜素）传递来的能量。叶绿素分子得到能量后，会从基态（低能态）跃迁到激发态（高能态）。根据吸收的能量多少，叶绿素分子可以跃迁到不同能级的激发态。若叶绿素分子吸收蓝光，则跃迁到较高激发态；若叶绿素分析吸收红光，则跃迁到最低激发态。处于较高激发态的叶绿素分子很不稳定，会在几百飞秒（fs ，1 fs=10－15 s ）内通过振动弛豫向周围环境辐射热量，回到最低激发态（图 1）。而最低激发态的叶绿素分 子可以稳定存在几纳秒（ns ，1 ns=10－9 s ）。 A 较高激发态 B 热耗散 吸收蓝 光 吸收红光 最低激发态 能量 荧光 基态 蓝 波长 红 荧光 图 1 叶绿素吸收光能后能级变化（A ）和对应的吸收光谱（B ）（引自韩博平 et al., 2003） 处于最低激发态的叶绿素分子可以通过几种途径（图 2）释放能量回到基态(韩博平 et al., 2003; Schreiber, 2004)：1）将能量在一系列叶绿素分子之间传递，最后传递给反应中心叶绿素 a ，用于进行光化学反应；2）以热的形式将能量耗散掉，即非辐射能量耗散（热耗散）；3）放出荧光。这三个途径相互竞争、此消彼长，往往是具有最大速率的途径处于支配地位。一般而言，叶绿素荧光发生在纳秒级，而光化学反应发射在皮秒级（ps ，1 ps=10－12 s ），因此在正常生理状态下（室温下），捕光色素吸收的能量主要用于进行光化学反应，荧光只占约 3%～5%(Krause and Weis, 1991; 林世青 et al., 1992)。 在活体细胞内，由于激发能从叶绿素 b 到叶绿素 a 的传递几乎达到 100％的效率，因此基本检测不到叶绿素 b 荧光。在常温常压下，光系统 I 的叶绿素 a 发出的荧光很弱，基本可以忽略不计，对光系统 I 叶绿素 a 荧光的研究要在 77 K 的低温下进行。因此，当我们谈到活体叶绿素荧光时，其实指的是来自光系统 II 的叶绿素 a 发出的荧光。

棉花不同叶位叶绿素荧光特性初探

收稿日期:2005 01 02 作者简介:李志博(1978 ),男,助理研究员,L zb_o ea@https://www.wendangku.net/doc/ab3908696.html, 基金项目:石河子大学创新基金(200294);石河子大学高层次人才引进资金专项(R CZX 2004 YS02) 棉花不同叶位叶绿素荧光特性初探 Primary Studies on Chlorophyll Fluorescence Characteristics of Cotton Leaves at Different Leaf Position 李志博,魏亦农,张荣华,张小均 (新疆生产建设兵团绿洲生态农业重点实验室,新疆石河子832003) 植物叶绿素荧光分析技术是近年来发展起来的用于光合作用机理研究和光合生理状况检测的一种新技术。与一些 表观性 的气体交换指标相比,叶绿素荧光参数更具有反映 内在性 的特点,因而被视为研究植物光合作用与环境关系的内在探针。尽管该技术已在植物的抗逆生理、作物育种栽培、植物生态等方面得到了较为广泛的应用,但迄今用于棉花的研究报道还不多见。本文以美国OS5 FL 型饱和脉冲式叶绿素荧光分析仪对棉花不同叶位叶绿素荧光特性进行了初步研究,以期为叶绿素荧光分析技术在棉花上应用提供参考。 1 材料和方法 试验于2004年在新疆兵团农八师新湖农场实验站进行,供试品种为3个棉花高代品系22 2、22 7及22 16,4月24日播种。每个材料为一个处理,重复3次,随机区组设计。小区面积7.0m 2 ,宽窄行种植(30+60+30)cm ,田间管理同常规大田。 每个材料在花蕾期分别选取6个有代表性的 棉株进行标记,采用美国OS5 FL 型饱和脉冲式叶绿素荧光分析仪(kinetic 模式)测定标记棉株的倒1叶,倒3叶及倒5叶的叶绿素荧光参数,包括初始荧光(Fo)、最大荧光(Fm )、最大量子产额(yeild)光化学猝灭系数(qP)及非光化学猝灭系数(qN)等。计算可变荧光Fv(Fv =Fm Fo),Fv/Fm,Fv /Fo 。测定前各个叶片暗适应30min,各个参数取6次平均值。 2 结果与分析 2.1 棉花不同叶位Fv 的变化 Fv 值与植物叶片PS !氧化的水裂解释放O 2的过程有关,可作为PS !反应中心活性大小的相对指标。分析结果(表1)表明,同一棉花品系的不同叶位存在差异,22 7的倒3叶和倒5叶达到了0.05水平上的差异,但二者均与倒1叶无显著差异。22 16的倒1叶不但与倒3叶和倒5叶差异显著,而且与倒5叶的差异达到了极显著水平(r =0.01)。总体看来,各个品系的倒5叶Fv 值均比倒1叶和倒3叶的高,说明棉花倒5叶 表1不同品系的叶绿素荧光变化 Table 1C hang es of chlorophyll fluorescence characteristics in different cotton lines 品种叶位F v Fv/Fm Fv/Fo y ield qP qN 22 2 倒1叶437.000.715 2.510.6543 1.47270.5227倒3叶374.670.797 3.930.66450.93650.2975倒5叶504.500.763 3.220.6773 1.02120.3820平均 438.560.758 3.220.6654 1.14350.400722 7 倒1叶496.67ab 0.709b 2.43b 0.6571 1.03720.2605倒3叶404.67b 0.767ab 3.30b 0.66940.93610.2200倒5叶644.67a 0.870a 6.67a 0.67430.85230.3301平均 514.890.7811 4.130.66690.94190.270222 16 倒1叶424.00b(B)0.677B 2.09B 0.6045b 1.1272a 0.4433倒3叶521.67a 0.747A 2.95A 0.6670a 1.0181b 0.3422倒5叶545.00a(A )0.734A 2.75A 0.6693a 1.0715ab 0.3899平均 496.89 0.7190 2.60 0.6469 1.0723 0.3918 注:表中数值为参数的平均值,采用SSR 法方差检验;a,b 为0.05的差异水平;A ,B 为0.01的差异水平,下同。 棉花学报 Co tton Science 2005,17(3):189~190

叶绿素荧光成像技术及其在光合作用研究中的应用

Fluorcam荧光成像技术及其在光合作用研究 中的应用 Eco‐lab生态实验室 北京易科泰生态技术有限公司 info@eco‐https://www.wendangku.net/doc/ab3908696.html,

目录 1、叶绿素荧光成像技术发展过程 2、荧光参数及其生理意义 3、PSI介绍（荧光成像的发明者） 4、PSI产品介绍 5、应用案例

叶绿素荧光技术发展历程 ?Kautsky effect: Kautsky and Hirsch(1931)首次用肉眼发现叶绿素荧光现象并发表论文“CO2同化新实验”，后被称作“Kautsky effect” ?PAM(Pulse Amplitude Modulated Fluorometer): Schreiber（1986）等发明了PAM脉冲调制技术测量叶绿素荧光。?FluorCam：KineKc imaging of chlorophyll fluorescence: Ladislav Nedbal（2000）等于上世纪90年代末期发明了与 PAM技术相结合的叶绿素荧光成像技术

成像测量局部放大

荧光参数及其意义 ?Fo、Fm与QY，此外还有PAR_Abs及ETR ?Kautsky诱导效应：Fo，Fp，Fv，Ft_Lss，QY，Rfd ?荧光淬灭分析：Fo，Fm，Fp，Fs，Fv，QY，NPQ，Qp，Rfd 等50多个参数 ?OJIP曲线：快速荧光诱导曲线。Fo，Fj，Fi，P或Fm，Mo（OJIP曲线初始斜率）、FixArea固定面积、Sm（对关闭所有光反应中心所需能量的量度）、QY、PI等 ?LC光响应曲线：Fo，Fm，QY，QY_Ln

叶绿素荧光仪著名厂商 ?PSI：捷克布尔诺Brno（孟德尔在此发现著名的孟德尔遗传定律），Ladislav Nedbal为首席科学家和主要股东（另一股东为David Kramer，美国密执根州立大学教授），1997年为美国华盛顿大学H.Pakrasi教授研制成了第一台FluorCam荧光成像系统。主要产品有： –FluorCam叶绿素荧光成像系列产品 –FL3500/FL5000双调制荧光仪系列产品 –FluorPen及AquaPen等手持式荧光仪产品 –光养生物反应器等藻类培养与在线监测产品 –光源与植物培养室 ?Optics：美国，主要产品为OS5p‐PAM叶绿素荧光仪等?Walz：德国，主要产品为PAM2500叶绿素荧光仪等

X荧光光谱仪的原理结构及应用

X荧光光谱仪的原理结构及应用 【摘要】X荧光分析是一种快速、无损、多元素同时测定的分析技术，已广泛应用于材料、冶金、地质、生物医学、环境监测、天体物理、文物考古、刑事侦察、工业生产等诸多领域，可为相关生产企业提供一种可行的、低成本的、及时的检测、筛选和控制有害元素含量的有效途径。本文就X荧光光谱仪的工作原理及其应用做简单阐述。 【关键词】X荧光；光谱仪；原理；应用 一、X荧光的基本原理： 当一束高能粒子与原子相互作用时，如果其能量大于或等于原子某一轨道电子的结合能，将该轨道电子逐出，对应的形成一个空穴，使原子处于激发状态。此后在很短时间内，由于激发态不稳定，外层电子向空穴跃迁使原子恢复到平衡态，以降低原子能级。当较外层的电子跃迁（符合量子力学理论）至内层空穴所释放的能量以辐射的形式放出，便产生了X荧光。X荧光的能量与入射的能量无关，它只等于原子两能级之间的能量差。由于能量差完全由该元素原子的壳层电子能级决定，故称之为该元素的特征X射线，也称荧光X射线或X荧光。 X荧光光谱法就是由X射线光管发生的一次X射线激发样品，试样可以被激发出各种波长的特征X射线荧光，需要把混合的X射线按波长（或能量）分开，分别测量不同波长（或能量）的X射线的强度，以进行定性和定量分析的方法。该方法是一种非破坏性的仪器分析方法，常用的有能量色散型和波长色散型两种类型。广泛应用于钢铁、铁矿石、炉渣、石灰石、萤石、耐火材料、地质等行业的多种元素的测定。下面我以波长色散型X射线光谱仪为例讲一下它的原理及构造。 二、X荧光光谱仪的原理与仪器构造： 使用X荧光光谱法的仪器叫X射线荧光光谱仪。X荧光光谱仪是一种相对测量仪器，它是通过测量一定数量已知结果的标准样品，建立相应的正确的数学模型后，才能得到准确分析结果的测量。建立正确的数学模型必须依靠一组好的标样，代表性好，有一定的跨度范围，有准确的结果。 1、激发光源—X射线管 X光管可以分成端窗和侧窗二种，但是近代X光荧光光谱仪几乎都只采用端窗一种类型，因为它能接近试样安放，有利于提高测定灵敏度。 如图：管体内为高度真空。管内有阳极，阴极，灯丝，冷却水管，X射线出射窗（铍窗）；尾部有高压电缆接头，冷却水接口和灯丝电缆；头部为X射线出射窗口。

叶绿素的提取及理化性质的鉴定

叶绿素的提取及理化性 质的鉴定 文件编码（008-TTIG-UTITD-GKBTT-PUUTI-WYTUI-8256）

植物生理学实验 叶绿体色素的提取分离及其理化性质 姓名 学号 系别 班级 实验日期 同组姓名 摘要：为探究植物叶绿素理化性质，根据不同的叶绿体色素分子结构不同，在有机溶剂中的溶解性和吸附剂上的吸附性差异，本实验在提取菠菜叶片叶绿体色素（叶绿素和类胡萝卜素）后，利用纸层析法将不同的色素分离的方法，对植物叶绿素的理化性质进行观察与检验。 一、实验原理及实验目的 实验原理： 1、提取: 叶绿体中含有叶绿素(叶绿素a与b)和类胡萝卜素(胡萝卜素和叶黄素)，这两类色素均不溶于水，而溶于有机溶剂，故常用乙醇、丙酮等有机溶剂提取。 2、分离: 当溶剂沿支持物不断向前推进时，由于叶绿体中不同色素分子结构不同，在两相(流动相与固定相)间具有不同的分配系数，因此它们移动速率不同。对叶绿体色素进行层析可将不同色素分离。

3、理化性质的观察: 叶绿素是一种二羧酸酯，在碱作用下，发生皂化反应；在弱酸作用下，叶绿素中镁可被氢原子取代而成为褐色的去镁叶绿素，后者遇铜则成为绿色的铜代叶绿素，叶绿素具有荧光，故从与入射光相垂直的方向观察叶绿素溶液呈血红色。叶绿素的化学性质不稳定，易受强光氧化，特别是当叶绿素与蛋白质分离后，破坏更快。 分子吸收光能后，从基态转变到激发态。叶绿素分子有两种单线激发态，对应两个主要的光吸收区。 分子在激发态停留的时间不超过数纳秒（10-9秒） 由激发态回到基态的过程称为衰变（Decay)。 叶绿素a：C 55H 72 O 5 N 4 Mg，MW= 叶绿素b：C 55H 70 O 6 N 4 Mg，MW= 胡萝卜素：C 40H 56 ， MW= 叶黄素：C 40H 56 O 2 ， MW= 实验目的： 以植物叶片组织为材料,提取叶绿体色素;以纸层析法分离其成分;鉴定叶绿体色素的理化性质. 二、实验材料和方法 1、实验材料：菠菜 2、实验用具：天平、研钵、三角漏斗、滤纸、层析缸、毛细管、分光 镜、量筒、烧杯、试管等

叶片荧光测量实验报告

叶片荧光测量实验报告 1.实验目的 2.实验方法 利用PAM100,荧光成像系统测量叶绿素荧光 3.实验原理及一些参数的意义 荧光的变化反映光合与热耗散的变化。 光化学淬灭（Photochemical Quenching）:由于光合作用引起的荧光下降，反映了光合活性的高低。 qP=(Fm’-Fs)/Fv’=1-(Fs-Fo’)/(Fm’-Fo’) （基于“沼泽模型”） qL=(Fm’-F)/(Fm’-Fo’)·Fo’/F=qP·Fo’/F （基于“湖泊模型”） 非光化学淬灭（Non-Photochemical Quenching）:由于热耗散引起的荧光下降。 qN=(Fv-Fv’)/Fv=1-(Fm’-Fo’)/(Fm-Fo) NPQ=(Fm-Fm’)/Fm’=Fm/Fm’-1 ，不需测定Fo’，适合野外调查qN或NPQ反映了植物耗散过剩光能转化为热的能力，反映了植物的光保护能力。 Fv/Fm =(Fm-Fo)/Fm : PS II的最大量子效率，反映植物潜在最大光合能力，高等植物一般在0.8－0.84之间，当植物受到胁迫（Stress）时，Fv/Fm显著下降。 ΦPS II = Yield = (Fm’-Fs)/Fm’ = ΔF/Fm’= qP·Fv’/Fm’: 任一光照状态下PS II的实际量子产量（实际光合能力、实际光合效率）

不需暗适应，不需测定Fo’，适合野外调查。 Y(NPQ)=1-Y(II)-1/(NPQ+1+qL(Fm/Fo-1))：调节性能量耗散，PS II 处调节性能量耗散的量子产量。若Y(NPQ)较高，一方面表明植物接受的光强过剩，另一方面则说明植物仍可以通过调节（如将过剩光能耗散为热）来保护自身。Y（NPQ）是光保护的重要指标。 Y(NO)=1/(NPQ+1+qL(Fm/Fo-1))：非调节性能量耗散 PS II处非调节性能量耗散的量子产量。若Y(NO)较高，则表明光化学能量转换和保护性的调节机制（如热耗散）不足以将植物吸收的光能完全消耗掉。也就是说，入射光强超过了植物能接受的程度。这时，植物可能已经受到损伤，或者（尽管还未受到损伤）继续照光的话植物将要受到损伤。Y（NO）是光损伤的重要指标。 P：光合速率，即相对电子传递速率rETR Pm: 最大光合速率，即最大相对电子传递速率rETRmax α：初始斜率，反映了光能的利用效率 β：光抑制参数 Ik=Pm/α：半饱和光强，反映了样品对强光的耐受能力。