对从中国四川泡菜中分离的乳酸菌进行识别和鉴定
对从中国四川泡菜中分离的乳酸菌进行识别和鉴定
泡菜是传统的发酵蔬菜产品,在中国的四川省很受欢迎。本文研究的目的是通过分析来自四川省6个不同地区的36个样品来调查主要物质乳酸菌在泡菜中的多样性(实验室)。这些样品的实验室计数的记录是从3.90到8.40cfu ml-1。使用MRS琼脂培养基，从这些样本中获得总共有185个假定的革兰氏阳性实验室和过氧化氢酶缺乏的属性,这些菌株被发现在物种水平生理测试上，16 s rRNA基因测序和PCR扩增鉴定。结果显示,所有的所分离的乳酸菌都准确地确定为肠球菌thailandicus(2株)、乳杆菌(16株),l .短(24株),l . paracasei(9株),l .杆菌(81株),l . pentosus(38株),l . sakei(8株),l . spicheri(1株)、乳酸明串珠菌(1株)和片球菌属ethanolidu-rans(5株)。四川泡菜的主要实验室l .杆菌，它是从大多数样本中分离的。结果还表明,来自四川省不同地区的实验室物种复杂成分,和这样一个资源丰富的实验室菌株为进一步的研究提供原始数据涉及益生菌菌株的选择。
关键词：识别;乳酸菌;泡菜;16 s rRNA基因序列
介绍：
泡菜,一种有点咸有点酸的发酵的蔬菜,四川人已经吃了数百年。由于制作简单和独特的风味,泡菜很受欢迎，经常作为四川主菜的配菜或者开胃菜。自制的泡菜都是基于高度依赖于原材料生存的微生物存在而自然发酵,。对于所需酸度和风味水平的不同,泡菜的制备过程是很重要的。通常许多蔬菜,如白菜、芹菜、辣椒和萝卜都是沉浸在6 - 8%的盐溶液而红辣椒,葱和大蒜在一个特殊的罐子里夏天至少5 - 7天(约20-27°C)
冬天长达12 - 16天(约°C)8 - 15日。
采收的蔬菜表面上有各种各样的微生物，虽然蔬菜表面乳酸菌的数量(实验室)通常是相对比较低的，在最后的发酵阶段，由于实验室厌氧和低盐的条件使其快速增长 (Han et al., 2007)。刚采摘的蔬菜表面所附着的微生物主要是革兰氏阴性腐生菌(Seo et al., 2010)。在自然发酵过程的初始阶段，实验室的数量是低的，使得硝酸盐还原细菌快速增长(Yan et al., 2008)。在中间阶段,肠杆菌科(大肠杆菌、肠杆菌属等)和芽孢杆菌是低盐和厌氧条件下，他们逐渐死亡。同时,实验室菌种快速增殖,产生酸,在厌氧条件下成为优势种和抑制肠杆菌科和芽孢杆菌的生长。发酵结束时,大量的实验室将会控制微生物，使泡菜发酵保持稳定(Karasu et al., 2010; Panagou and Katsaboxakis, 2006)。因此，它是值得实验室从泡菜中进行分离菌体使泡菜能都进行工业化生产。
这项研究报告是对来自中国四川省不同地区的36个样品品种进行分离和鉴定。185个菌株通过表型特征进行初步鉴定，并且进一步通过16sRNA测序和PCR扩增技术进行测定。
材料和方法
泡菜样品的收集，36个样本的泡菜收集来自四川省的六个不同的地区，泡菜在抽样时的温度范围从8.7°C 到16.4°C;平均温度为13.2°C(表1)，在采样现场泡菜汁的pH值测定应用校准便携式酸碱计(美国Extech pH100），室温下，泡菜汁的样品收集时间为15分钟,在冰上进行2 - 5 h运输和样品到达实验室后立即进行了微生物分析。
计数和隔离的实验室
稀释是1毫升的泡菜汁加9毫升生理盐水(0.9%氯化钠)。进一步连续稀释10倍，范围是10-5 到 10-9，在实验室进行处理和测定，使用布朗甲酚紫(BCP琼脂、Nissui制药、To-kyo、日本)厌氧30°C孵化 2天，平板在30°C用灭菌锅罐进行灭菌，(巴尔的摩生物实验室,GasPak 100厌氧系统,BD生物科学,火花,医学博士,美国)。菌落是从MRS培养基上随机地挑取，每个平板含有30-300个菌落，（Man Rogosa Sharpe 液体培养基，丙烯酰胺），并转移到5ml的MRS液体培养基中，选中平板上的菌落在MRS培养基上进行反复纯化，革兰氏阳性和过氧化氢阴性酶是从纯化的平板中提取，在-80°C，10%(w / v)脱脂牛奶进行冷冻储存。冻干
隔离进行长时间存储。实验室常规鉴别，进一步鉴定革兰氏阳性和过氧化氢阴性酶，是由使用以下物理方法进行分离:从精氨酸氨生产;二氧化碳是从倒杜伦管中的含有葡萄糖的MRS液体培养基中提取，
Table 1. General features of pickle samples from six different region of
Sichuan.
Sample Sampling Temperature
pH value LAB
Main material
number locatio
n (°C) (log cfu ml-1)
1 to 3 Chengdu
15.9±0.5 3.8±0.3 5.54±1.49
summer radish (15.5?16.4) (3.5?4.0) (4.15?7.11)
4 to 7 Chongzhou
13.1±0.5 3.4±0.2 6.95±0.71
celery, cowpea, cabbage, bamboo shoots (12.6?13.5) (3.2?3.5) (5.99?7.69)
8 to 19 Dayi 12.3±1.7 3.7±0.4 6.65±1.34
summer radish, celery, cowpea, cabbage,
Chinese
(8.7?15.1) (3.5?4.5) (3.90?8.17) cabbage
20 to 25 Pujiang
14.5±1.5 3.8±0.6 6.82±1.51
summer radish, celery, cowpea, cabbage,
bamboo
(11.5?15.3) (3.2?4.5) (4.89?8.26) shoots
26 to 34 Qionglai
13.2±1.3 3.5±0.4 6.26±1.09
summer radish, celery, cowpea, Chinese
cabbage,
(11.9?15.3) (3.0?4.2) (4.36?7.54) carrot
35 to 36 Xinjin
11.6±0.8 3.7±0.9 7.73±0.95
summer radish, cowpea, celery, cabbage,
capsicum
(11.0?12.2) (3.0?4.3) (7.05?8.40) frutescens
Average 13.2±1.7 3.6±0.4 6.58±1.25
分别在10°C,15°C,45°C和50°C的情况下在MRS液体培养基中生长5天，在pH值为
3.0,3.5,
4.0,4.5,
5.0,9.0和9.6的情况下在MRS液体培养基中生长3天，MRS培养基中的耐盐度为含有2.0% 3.0%,4.0%,
6.0%,6.5%,8.0%和10.0%氯化钠(w / v)，在分离菌种的温度下培养3天(Ko-zaki et al .,1992;Yu et al .,2011)。用一套商业工具通过D和L乳酸产生葡萄糖同分异构体的类型和数量来改变MRS培养基。(霍夫曼罗氏诊断,Mann-heim,德国)。
碳水化合物发酵试验由根据Jayne-Williams描述的方法(1975)。26种碳水化合物通过使用糖基与氯酚红汤作为指标进行了测试。不同糖被添加到基础培养基用来改变培养基,以最终浓度为0.5%(w / v)。碳水化合物发酵的结果检查是根据Bergey系统细菌学手册(Kandler Weiss,1986)中所提供的信息。
16 s rRNA基因测序和亲缘关系分析，总基因组的DNA是从5ML整夜培养的培养基中提取，温度设定为37°C，通过先前的方法(Yu et al .,2009)。纯化DNA浓度稀释到最后的100 ng /μl用来测定。16 s rRNA基因放大使用引物 (GCAGAGTTCTCGGAGTCACGAAGAGTTTGATCCTGGCT CAG) and 16S-RA (AGCGGATCACTTCA CACAGGAC TACGGCTACCTTGTTACGA) 由sun进行描述等等（2010）核苷酸1至21是16S-FA and 16S-RA 特定的测序引物，分别地，16 s rRNA的基因实验室在自动热循环被放大(ptc - 200;MJ研究,沃尔瑟姆,美国）每个样本包含13Taq缓冲区(Ta-KaRa Bio-Co。、志贺、日本)、1.5毫米MgCl2 0.2μM每个核苷酸,10 pmol每个引物,10 ng细菌的DNA模板和1.0 U前任TaqTM聚合酶(豆类Bio-Co)。反应条件如下:5分钟94°C,94°C 1分钟,1分钟58°C,72°C 2分钟,30个周期,然后10分钟。然后72度下反应10分钟，解决了反应产物在1.0%琼脂糖凝胶电泳,溴化乙锭染色可视化，PCR产品的重要性是分离于琼脂糖凝胶使用Huashun凝胶萃取设备(Huashun,中国)。纯化PCR碎片被相应的se-quencing用于测序引物。DNA测序是由上海Sangni生物科学公司。序列进行了分析和确定使用爆炸算法(https://www.wendangku.net/doc/af6199961.html,/blast;Altschul et
al .,1997),并提交NCBI(https://www.wendangku.net/doc/af6199961.html,)。共识se-quences都导入到大型软件4.0版本(https://www.wendangku.net/doc/af6199961.html,;田村et al .,2007),一个序列比对和phyloge-netic树创建基于neighbor-joining(NJ)方法。
l .杆菌组的辨别，为进一步班别菌株l .杆菌组,进行多重PCR测定recA基于基因的引物:paraF(5′
-GTCACAGGCATTACGAAAAC-3′),pentF(5′-CAGTGGCGCGGTTGATATC-3′),planF(5′
-CCGTTTATGCGGAACACCTA-3′),和上一页(5′-TCGGGATTACCAAACATCAC-3′)。PCR mix-ture和amplifi阳离子进行所述Torriani et al。(2001)。
结果
计数和分离的实验室
泡菜样品的pH值范围从3.2到4.5(表1)。实验室的可行样品的数量都显示在表1。实验室36种泡菜样品在BCP琼脂培养基不同cfu ml-1范围从3.90到8.40。从成都,Chongzhou,大邑,浦江,Qionglaia新津县地区实验室计数分别为5.54±1.49,6.95±0.71,6.65±1.34,6.82±1.51,6.26±1.09,1.09±7.73日志cfu ml-1,分别。革兰氏阳性和过氧化氢阴性细菌生长的MRS琼培养基被认为是假定的实验室,和185个假定实验室分离出36泡菜样品。
YU et al. Vol. 58
Table 2. Phenotypic characteristic of LAB isolated from natural fermented pickle in Sichuan Province, China.
Groups a
Characteristics
1 2 3 4 5 6 7 8 9
Number of isolates 16 24 9 119 8 1 1 2 5 Shape R R R R R R C C C Gas from glucose - + - - - - + - - Lactic acid isomer b L DL L DL DL DL D L DL NH3 from arginine - + - - - + - + - Growth at pH value
3 0 0 0 0 0 0 0 0
0 c
3.5 0 0 6 89 0 0 0 0 3
4 1
5 24 9 119 4 1 1 0 5
4.5 16 24 9 119 5 1 1 0 5
5.0 16 24 9 119 5 1 1 2 5 9.0 0 0 9 110 5 1 1 2 0 9.6 0 0 0 0 0 1 0 2 0 Growth in NaCl (w/v)
2.0% 16 24 9 119 5 1 1 2 5
3.0% 16 24 9 119 5 1 1 2 5
4.0% 16 24 9 119 5 1 1 2 1 6.0% 16 10 9 119 5 1 1 2 0 6.5% 10 0 7 119 5 1 0 2 0 8.0% 3 0 0 89 5 0 0 0 0 10.0% 0 0 0 0 2 0 0 0 0 Growth at temperature
(°C)
10 14 24 9 119 0 1 0 0 1 15 16 24 9 119 5 1 1 2 5 45 0 0 3 92 5 0 1 2 5 50 0 0 0 0 0 0 0 0 0 Acid from
D-Arabinose 16 24 0 0 5 0 0 0 0 L-Arabinose 16 24 0 43 5 0 0 0 0 D-Cellobiose 16 0 9 119 5 0 1 2 5 Esculin 16 12 9 119 5 0 1 2 5 Galactose 16 24 9 119 5 0 1 2 5 Gluconate 16 24 9 119 5 0 0 2 0 D-Lactose 0 22 8 119 5 0 0 2 4 D-Mannitol 0 0 8 119 0 0 0 2 0 D-Mannose 16 0 9 119 5 0 1 2 5 D-Melezitose 0 0 8 113 0 0 0 0 0 D-Melibiose 0 24 0 119 5 0 1 0 0 D-Raffi nose 0 21 0 119 0 0 1 0 0 L-Rhamnose 0 0 0 13 0 0 0 0 4 Ribose 16 24 9 119 5 1 1 2 0 Salicin 16 0 9 119 5 0 1 2 5 D-Sorbitol 0 0 9 119 5 0 0 0 0 L-Sorbose 0 0 9 0 0 0 0 0 0
D-Sucrose 16 14 9 119 5 0 1 2 5 D-Trehalose 16 0 9 119 5 0 0 0 5 D-Xylose 0 24 0 38 0 1 1 0 0
All strains fermented D-glucose, D-fructose and D-maltose. No strains fermented inulin, starch, xylitol or glycogen.
a Groups 1 to 9 were identifi ed as Lactobacillus alimentarius, L. brevis, L. paracasei, L. plantarum, L. sakei, L. spicheri, Leuconos-toc lactis,Enterococcus thailandicus, and Pediococcus ethanolidurans, respectively.
b L:L-lacti
c acid, DL:DL-lactic acid, D:D-lacticacid. c Number of positive strains.
传统鉴定实验室
根据形态、生理和生化特性,185株被分成9组(表2)。所有分离的菌种在pH值5.0,15°C,2.0%,3.0%氯化钠进行生长，是15°C而不是50°C或pH值3.0,使他们能发酵葡萄糖、果糖和D-麦芽糖但不是菊粉,淀粉、木糖醇或糖原。十六个隔离组1被确定为l .硝化菌基于生理生化特性(路透社,1983)。他们生产L-乳酸,但不能从葡萄糖或氨精氨酸产生二氧化碳。大多数分离菌种生长良好,10°C,pH值4.0和4.5,6.0%和6.5%生理盐水,但只有3株可以生长在8.0%氯化钠。这些菌株可以利用D型和L型阿拉伯糖、核糖、半乳糖,甘露糖、七叶灵,水杨苷,纤维二糖,D蔗糖,D-海藻糖和葡萄糖酸。组2包括24杆状隔离,D乳酸产生,并可能产生二氧化碳从葡萄糖和NH3精氨酸。菌株可以增长10°C,pH值4.0和4.5,4.0%的氯化钠。除了10隔离未能增长6.0 - -10%氯化钠。大多数分离菌株可以发酵D型和L型、核糖D-木糖 ,半乳糖,七叶灵,D乳糖,D蜜二糖，D蔗糖 D-raffi糖,葡萄糖酸。这些菌株l . 由于其短小的特征。菌株3组达到产酸但不能产生二氧化碳和氨,生长良好,pH值
3.5,
4.0,4.5,9.0,4.0%,6.0%和6.5%氯化钠,在10°C。这些分离株能产生酸的糖除了D蜜糖D-乳酸,L-乳酸L-鼠李糖,D-raffi糖和D-木糖。考虑到所有的因素,这组被确定为2l .干酪乳杆菌组。一百一十九组隔离4被发现与l .植物乳杆菌密切相关。他们生产DL乳酸但不能从葡萄糖或氨精氨酸产生二氧化碳。多数能生长在3.5°C和45°C，ph为4.5、4、和6%、10、6.5%和8%的氯化钠中，。
。所有菌株可利用阿拉伯糖，阿拉伯糖、核糖、半乳糖、D-甘露糖、D-山梨醇、纤维二糖、D-乳糖、D-密二糖，、海藻糖、葡萄糖酸产酸产气。一株属于6组归类为L. spicheri基于自身的特性（meroth et al.，2004），其中包括生产乳酸，气由精氨酸而不是葡萄糖，这种菌株可以在10°C，pH值4，4.5，9和9.6，和4%，6%和6.5%的NaCl增长，但仅能发酵核糖、木糖。7组的菌株属于属leuconos TOC，产生乳酸和发酵葡萄糖产生气体，但不水解精氨酸。该菌株能生长在温度45度，pH 4，4.5和9，4%和6%的NaCl，利用核糖、木糖、半乳糖、D—
甘露糖、秦皮甲素、水杨酸、纤维二糖、D-密二糖、蔗糖和d-raffi鼻子。双球菌组8，iDEN 蒂菲为肠球菌属，产生乳酸而不能从葡萄糖产气。他们可以生长在45°C，PH值为4.5，9和9.6，在4%，6%和6.5%氯化钠。这些菌株能够利用半乳甘露糖、核糖、东星、秦皮甲素、水杨素、甘露醇、d-cello-biose，D-乳糖，蔗糖和葡萄糖。五球菌9组确定为戊糖片球菌属基于糖发酵试验。他们生产的乳酸，但不能产生气体从葡萄糖或精氨酸。大多数菌株生长良好，在45°C和pH值为3.5、4和4.5，只有一株可以在4%的NaCl在10的增长°他们可以利用半乳糖、D-甘露糖、鼠李糖、秦皮甲素、水杨酸、纤维二糖、D-乳糖、蔗糖和海藻糖。16S rRNA基因测序和系统发育分析
确认的物种，对所有菌株的16S rRNA基因的核苷酸序列进行了分析，在NCBI的BLAST程序确定（http://www.ncbi。NLM。NIH。gov /）。得到的序列（约1400 bp）沉积在GenBank 登录号分别为：分以下gu125423，gu125424，和gu125427?谷125609。系统进化树分析显示的16S rRNA基因序列之间的关系代表菌株及相关型菌株利用MEGA软件（图1）。1组应变imau80014是L.阿里mentarius DSM 20249t密切相关（m58804）具有99.7%的同源性20249t L.法典DSM（m58804）。应变imau80001组2和型菌株ATCC 14869t L. brevis（gu125423）聚为一个相似的99.8%组。3组应变imau80040放在副干酪乳杆菌JCM 8130t集群（d79212）具有100%的相似性。代表菌株imau80002和4组出现一样都与植物乳杆菌ATCC 14917t L. imau80005（aj965482）和L.戊糖乳杆菌JCM 1558t（d79211），和16S rRNA基因序列分析
表明有99.9%的相似性属植物乳杆菌ATCC 14917t（aj965482）和99.8% L.戊糖乳杆菌JCM 1558t（d79211）。5组应变imau80073是L. sakei DSM 20017t密切相关（am371184）和他们共享99.8%的同源性。6组应变imau80039是L. spicheri LTH 5753t密切相关（aj534844）100%引导分析。7组和8组分imau80024 Leu应变imau80137。
链球菌和肠球菌（JCM 6123t ab023968）thailandicus KCTC 13134t（ef197994），和16S rRNA基因序列显示100%的相似性型菌株。9组应变imau80011接近片球菌ethanolidurans LMG 23354t（ay956789）和他们共享100%的同源性。基于
16S rRNA基因序列分析，177杆分离泡菜准确地分配给5种1组，即L. brevis（24株）、副干酪乳杆菌（9株），L.法典（16株），L. sakei（8株），L. spicheri（1株）和植物乳杆菌组（119株），这些结果是一致的表型特征的结果。此外，8球菌均为大肠thailandicus （2株），P.ethanolidurans（5株），和亮氨酸。链球菌（1株）；然而，这些菌株均难以确定的物种水平的表型特征。多重聚合酶链反应结果多重聚合酶链反应是用来区分密切的植物乳杆菌组相关的物种。对扩增产物的大小分别为318 bp的预期为植物乳杆菌，218 bp 和107 bp的L. L.戊糖乳杆菌paraplantarum。81株集团3型菌株植物乳杆菌ATCC 14917t 产生318 bp的产品，而38株和型菌株L.戊糖乳杆菌JCM 1558t产生218 bp的产品（图2）讨论
泡菜是使用传统的和古老的自然发酵法。这种独特的方法可以有效地保留有益微生物，传统微生物对泡菜生产的一个主要的角色，特别是独特的风味和FL的益生特性。在这项研究中，我们确定了组成实验室和描述的表型和基因型四川泡菜中的特性。从不同地区的泡菜样品中观察到的实验室中的可行计数的轻微变化四川省。泡菜平均数来自崇州、大邑、蒲江和邛崃的样品低于新津的样品，略高于成都的样品，和四川泡菜汁实验室平均值6.58±1.25 CFU mL-1的日志。因为原料和泡菜温度在六个地区不同（表1），所以我们认为实验室的这种差异计数可能与蔬菜的种类有关，泡菜的来源和温度。一百八十个网络实验室被隔离泡菜样品，所有菌株分为9根据生理特性，营养需求和生长的常规方法组条件。然而，基因型分析表明所有这些菌株被确定为10种。根据生理特性，在7组，8株9是确定属于肠球菌属（2株），属明串珠菌（1株）和属片球菌（5株），和16S rRNA基因序列分析表明，代表菌株形成一个良好定义的集群类型株在系统进化树。此外，4组菌株确定为属于植物乳杆菌组（119菌株）的表型特征的基础上，他们16S rRNA基因序列显示99.8%的相似性植物乳杆菌、戊糖乳杆菌L.。ennahar等人。（2003）报道称，植物乳杆菌和L.戊糖乳杆菌有很类似的16S rRNA 基因序列相差只有2英国石油。在本研究中，应用多重聚合酶链反应技术对这2种植物进行了鉴别显示81株从4组确定为L.植物乳杆菌、戊糖乳杆菌，38株L.。传统的表型特征往往会产生变量为密切相关的实验室鉴定结果（柳田稔et al.，2007）；因此表型特征和分子生物学技术相结合，准确地在物种水平鉴定实验室。不同样本间的分离分布在表3。的主要菌株。植物乳杆菌（43.8%）是从所有采样分离网站和大多数样品，和L.戊糖乳杆菌（20.5%），L.群（13%）和L（8.6%）是从法典的采样点分离。其他物种隔离与相对较低的频率，包括副干酪乳杆菌，L. sakei，L. spicheri，P. ethanolidurans thailandicus，E.，亮氨酸。链球菌。短乳杆菌和植物乳杆菌，有据报道，参与许多乳酸发酵蔬菜食品，包括泡菜、黄瓜（Randazzo et al.，2004）。肠膜明串珠菌、植物乳杆菌是最常见的韩国泡菜中分离细菌（李、李，2010）。塔芒等人。（2005）报告说，该专业乳酸发酵实验室的代表印度蔬菜产品被确定为L.短、植物乳杆菌、戊糖片球菌球菌和P，P亮氨酸。黄花倒水莲。公园等。（2009）使用的是培养独立的技术证明，几个实验室物种，如亮氨酸。菌，属短，P.球菌和植物乳杆菌，有助于复杂的泡菜发酵过程。燕等。（2008）指出植物乳杆菌（43.6%）、（19.1%）、亮氨酸戊糖乳杆菌L.。肠膜明串珠菌（11%），L. brevis（7.3%）是中国泡菜的主要种类。与我们的结果相似，植物乳杆菌、戊糖乳杆菌和L. L.短通常处于不同的发酵蔬菜。清酒乳杆菌通常是从发酵的蔬菜和肉分离（andrighetto等人。2001；基姆和春2005）；多功能性可以部分解释它在不利的条件下生存和发展的能力条件，如低温、高盐浓度、pH 值、乙醇和低水活性（sorvig等人2005）。乳酸菌spicheri通常是分离的酸面团（meroth
et al.，2004），和发酵蔬菜中是很罕见的。只有一个菌株被分离四川市成都泡菜的研究。链球菌从未在自然发酵泡菜的报道，可能是由于其复杂的营养需求，以及较弱的适应泡菜环境。然而，我们分离了一个小这些菌株的量在这项研究中。泡菜制品中微生物成分的复杂程度呈现不同的区域。我们与世隔绝新津市三种蒲江市室内植物种类，四个品种在成都市，171泡菜中乳酸菌的2012个特性崇州市七种，邛崃市，和大邑市八种。实验室的存在这种变异的菌株是不令人惊讶的，因为其他因素可能会导致变异的菌株，如样品数量，不同的生产方法，和原材料。九和十二个样本分别从崇州和大邑地区，因此，从这些地区分离到更多的物种。此外，环境温度和区域差异也会导致一些变异株。总之，本文报告参与泡菜样品识别微生物的研究。L.法典，L.短植物乳杆菌在四川主导实验室物种泡菜。其他物种，包括大肠thailandicus，副干酪乳杆菌，L. sakei，L. spicheri，植物乳杆菌，亮氨酸。链球菌体育ethanolidurans，被确定在较低的频率。物种分布取决于制造过程，以及在具体生态地区泡菜产品在哪里制造。这项研究提供的原始数据和实验室为进一步研究提供了应变资源。
乳酸菌在泡菜生产中的应用
乳酸菌在泡菜生产中的应用 作者：杨春哲， 冉艳红 作者单位：杨春哲(山东省酿酒葡萄科学研究所,济南,250100)， 冉艳红(华南理工大学食品与生物工程学院) 刊名： 中国食物与营养 英文刊名：FOOD AND NUTRITION IN CHINA 年，卷(期)：2003(1) 被引用次数：18次 引证文献(18条) 1.王琳琳.郑一敏.胥秀英.傅善权.李杰.周慧.曾品涛肠膜明串珠菌的最适发酵培养基筛选[期刊论文]-重庆理工大学学报（自然科学版） 2010(9) 2.盛海圆.郭艳萍.常艳.张明传统泡菜中乳酸菌多样性的分析[期刊论文]-中国微生态学杂志 2010(7) 3.陈飞平微生物发酵对蔬菜腌制品品质的影响[期刊论文]-中国食物与营养 2009(9) 4.刘永娜.燕平梅.李锐绵白糖对发酵白菜中微生物区系的影响[期刊论文]-中国调味品 2009(4) 5.罗凤莲.欧阳建勋.夏延斌.王燕发酵辣椒中主要风味物质的研究进展[期刊论文]-食品工业科技 2009(7) 6.吴海波.张兰威.黄艳玲不同地域发酵蔬菜分离的乳酸菌抑菌效果及降亚硝酸盐能力的研究[期刊论文]-食品工业科技 2009(2) 7.李锐.燕平梅.刘永娜不同贮藏条件下白菜中亚硝酸盐含量的研究[期刊论文]-食品工程 2008(4) 8.胡书芳.王雁萍乳酸菌在泡菜生产中的应用[期刊论文]-安徽农业科学 2008(21) 9.姜彬.陈一.冯志彪黄瓜在纯菌接种恒温发酵过程中的化学成分变化[期刊论文]-食品工业科技 2008(12) 10.孙锦婷.陈一.姜彬.张艳梅.高晨晨发酵过程中蔬菜化学成分的变化研究[期刊论文]-食品工程 2007(2) 11.田永峰.吴天祥.胡晓瑜.赵飞乳酸菌在酿造和食品工业上的应用[期刊论文]-酿酒科技 2007(4) 12.蔡永峰.熊涛.岳国海.李绩.张贵林直投式生物法快速生产泡菜工艺条件的研究[期刊论文]-食品与发酵工业2006(6) 13.杨荣玲.肖更生.吴晓玉.刘学铭我国蔬菜发酵加工研究进展[期刊论文]-保鲜与加工 2006(2) 14.吴祖芳.刘璞.翁佩芳榨菜加工中乳酸菌技术的应用及研究进展[期刊论文]-食品与发酵工业 2005(8) 15.张坤生.刘晨.任云霞复配型防腐剂延长巴氏杀菌鸡肉香肠货架期的研究[期刊论文]-食品科学 2005(8) 16.刘哲君.王海伟.霍建伟.周锐.姜莹.丁玉萍肠膜明串珠菌,植物乳杆菌,短乳杆菌的最适培养基的筛选[期刊论文]-佳木斯大学学报（自然科学版） 2005(4) 17.乳酸菌在果蔬及谷物制品中的应用[期刊论文]-现代食品科技 2005(4) 18.张岩.肖更生.陈卫东.张友胜发酵蔬菜的研究进展[期刊论文]-现代食品科技 2005(1) 本文链接：https://www.wendangku.net/doc/af6199961.html,/Periodical_zgswyyy200301011.aspx
腐乳中乳酸菌的分离与鉴定_王夫杰
腐乳中乳酸菌的分离与鉴定 王夫杰1,鲁绯1*,渠岩2,张建1,黄持都1 (1.北京市食品酿造研究所,北京 100050;2.中国农业大学食品科学与营养工程学院,北京 100083) 摘要:文章主要对青方、白方和红方腐乳中的乳酸菌进行了分离鉴定。从青方和白方腐乳中分别分离到乳酸菌7株和5株,红方中没有分离到乳酸菌。鉴定结果表明,白方中4株为鼠李糖乳杆菌,1株清酒乳杆菌;青方中有1株为植物乳杆菌,1株干酪乳杆菌,3株鼠李糖乳杆菌,2株清酒乳杆菌。最后,对不同菌株的耐盐性和耐酒精性进行了测试。 关键词:腐乳;乳酸菌;分离;鉴定 中图分类号:T S264.25 文献标识码:B 文章编号:1000-9973(2010)07-0098-04 Separation an d identification of lactic acid bacteria isolated from Su fu WANG Fu jie1,LU Fei1*,QU Yan2,ZH ANG Jian1,H UANG Chi du1 (1.Beijing Foo d Brew ing Institute,Beijing100050,China; 2.Fo od Science and Nutr itional Engineering Co lleg e of China A gricultural U niv ersity,Beijing100083,China) Abstract:The lactic acid bacteria in gr ey Sufu、w hite Sufu and red Sufu w er e separated and identify. Seven str ains w ere isolated from gr ey Sufu,five strains w ere iso lated fr om w hite Sufu,no o ne w as i solated fr om red Sufu.The identification show ed that four str ains w ere Lactobacillus rhamnose and one w as Lactobacillus sake in white Sufu.In grey Sufu,three str ains w ere Lacto bacillus rham nose, tw o strains were Lactobacillus sake,the tw o other w ere Lactobacillus plantar um and Lactobacillus ca sei respectiv ely.At last,the salt and alco ho l tolerance of different strains w er e tested. Key words:Sufu;lactic acid bacteria;separ ation;identificatio n 乳酸菌的应用历史非常悠久,4000年前古人已有酸奶饮用的历史。随着现代微生物学的发展,食品级乳酸菌的优良特性已引起食品微生物界的关注,乳酸菌已广泛应用于乳制品、肉制品、果蔬制品、软饮料等食品。乳酸菌在酿造工业中的应用受到越来越多的关注。 腐乳是中国独创的调味品,在世界发酵食品中独树一帜,它既可单独食用,也可用来烹调风味独特的菜肴,被称为 中国奶酪 。商品腐乳中含有高水平的适度耐盐菌,其主导耐盐微生物是耐盐乳酸菌,它在腐乳的腌制和后酵过程中起着非常重要的作用,一定数量的乳酸菌在后酵过程中对腐乳风味物质的形成具有积极意义[1-5]。 乳酸菌是潜在地加快腐乳成熟和改进风味的协同菌株。研究表明,从特定食品中分离出的乳酸菌是该食品进行乳酸发酵的最佳出发菌株,因为它们比其它来源的乳酸菌具有更强的竞争力[6-8]。本文对青方、白方和红方腐乳中的乳酸菌进行了分离纯化和鉴定,旨在揭示腐乳中乳酸菌的群系分布特征,对腐乳发酵中风味乳酸菌的研究和开发提供依据,对乳酸菌应用于腐乳生产、改善腐乳风味的研究提供基础。 1 材料与方法 1.1 样品 收稿日期:2010-03-27 *通讯作者 基金项目:北京市优秀人才培养资助(20081D010*******);北京市自然科学基金(6093022)作者简介:王夫杰(1980-),女,硕士,研究方向为生物技术与发酵工程; 鲁绯,女,副教授,食品科学与工程博士。 98
自然发酵泡菜中乳酸菌的分离鉴定
作者简介:巨晓英(1985-),女,天津大学农学院在读研究生。 E 2mail:hanye@tju .edu .cn 通讯作者:韩烨 收稿日期:2008-06-03 第24卷第5期2008年9 月Vol .24,No .5Sep .2008 自然发酵泡菜中乳酸菌的分离鉴定 Iso l a ti o n and i den ti fi ca ti o n o f l ac ti c ac i d bac te ri a from na tu ra l fe r m en ta ti o n p i ckl e s 巨晓英 JU X iao 2ying 韩 烨 HAN Ye 周志江 ZHOU Zhi 2jiang (天津大学农业与生物工程学院,天津 300072) (School of A griculture and B ioengineering,Tianjin U niversity,Tianjin,300072,China ) 摘要:从多种自制泡菜中分离到了31株乳酸菌,经过形态特 征,培养特征和生化特征鉴定,其中16株为戊糖片球菌。本试验结果表明戊糖片球菌在泡菜的发酵过程中起重要的作用,可能是引起泡菜发酵的优势菌种。关键词:泡菜;乳酸菌;分离;鉴定 Abstract:Total 31strains of lactic acid bacteria were is olated fr om home 2made p ickles .The mor phol ogical,bi ochem ical and gr owth characteristics were deter m ined that 16strains of the m bel ong t o Pedi ococcus pent osa 2ceus .The result indicated that P .pent osaceus p layed i m portant r ole dur 2ing the fer mentati on of p ickles,and they were possibly the dom inant strains of p ickles . Keywords:Pickles;Lactic acid bacteria;Is olati on;I dentificati on 泡菜是以白菜、萝卜、黄瓜、甜椒等新鲜蔬菜为原料,添加食盐、水和调味料,利用蔬菜自身附着的微生物或添加人工培养的乳酸菌发酵剂,在厌氧环境下进行乳酸发酵而制成的酸性食品。泡菜不但味美爽口,而且具有丰富的营养,含有V A 、V B1、V B2、V C 、Ca 、Fe 、胡萝卜素、辣椒素、纤维素和蛋白质等多种丰富的营养成分,在中国很多地区都备受青睐。 泡菜生产主要依靠乳酸菌的发酵作用。一般自然发酵的泡菜是以异型乳酸菌启动发酵,产生有机酸、过氧化氢和细菌素等物质,抑制其它杂菌的生长,同时产生乙醇、乙醛、甘露醇等风味物质,对泡菜特有风味的形成起决定性作用;之后同型乳酸菌逐渐成为优势菌,进一步降低环境pH 值和抑制有害杂菌[1]。 中国是传统的泡菜生产国,泡菜种类繁多,国内在这方面已经做了大量的工作,分离筛选出了许多生产性能优良的菌种,如植物乳杆菌、肠膜明串珠菌、干酪乳杆菌、弯曲乳杆 菌、短乳杆菌、嗜酸乳杆菌等[2～6]。但也是由于我国泡菜的多样性,各种泡菜中具体存在何种乳酸菌仍然不清楚。本试验从多种自制泡菜中分离到了31株乳酸菌,其中有16株为戊糖片球菌,占乳酸菌总数的50%以上,在某种程度上说明了戊糖片球菌是泡菜发酵的重要菌种,为科学腌制泡菜提供了理论依据,也丰富了泡菜工业化生产的菌种来源。 1 材料与方法 1.1 材料 黄瓜、青椒、胡萝卜、白菜、水、碘盐。 1.2 试剂 乳糖、蔗糖、甘露醇、D (+)2木糖、山梨醇等:天津市科密欧化学试剂开发中心分析纯药品; 蛋白胨、酵母膏、D (+)2麦芽糖等:北京奥博星生物技术有限公司生化试剂。 1.3 仪器与设备 CX21FS1电子显微镜:日本O ly mpus 公司;7230G 可见分光光度计:上海精密科学有限公司;PHS 23B W 精密pH 计:上海理达仪器厂。1.4 菌种和培养基 本试验以枯草芽孢杆菌、大肠杆菌和植物乳杆菌作为试验对照菌。所用培养基主要有MRS 培养基、TGE 培养基、葡萄糖发酵培养基及碳水化合物发酵管[7]等。 1.5 泡菜制作 (1)冲盐卤:先将水煮沸,每100g 水加盐6g 溶化,冷 却后备用。 (2)原料预处理:先将黄瓜、青椒、白菜、胡萝卜等蔬菜 剔除粗老部分,切成条状或块状后,用清水洗净、晾晒3～ 5h,保证菜面无水。 (3)泡制:将晾干的菜与调料(辣椒、葱、姜)混合,平均 每100g 新鲜蔬菜中,加入葱6g,辣椒3.5g,姜3g 。将调好的蔬菜装入烧杯中,加盐水并压实,用3层干净的塑料袋装 9 2
乳酸菌菌种分离筛选方法
乳酸菌菌种的分离筛选方法 乳酸细菌是一类能利用发酵糖产生大量乳酸的细菌通称。为兼性厌氧菌，杆状或球状，革兰氏阳性菌，无芽孢，不运动。营养要求高，需要提供丰富的肽类氨基酸维生素。在琼脂表面或内层形成较小的白色或淡黄色的菌落。 通常用作为有益微生物的菌种有乳酸乳杆菌、干酪乳杆菌、植物乳杆菌、嗜酸乳杆菌、粪肠球菌、乳酸片球菌、双歧杆菌、屎肠球菌、戊糖片球菌等。 乳杆菌常用MRS琼脂作半选择培养基。当乳杆菌仅是复杂区系中的部分菌类 时，SL培养基常用作为选择性培养基。对于芽孢乳杆菌常用GYP培养基，链球菌有TYC培养基、MS培养基。M17培养基被用作乳球菌的分离培养基。 嗜酸乳杆菌属于乳杆菌属的一个种。其特性为：杆菌，两端圆，不运动，无 鞭毛。粪肠球菌为革兰氏阳性，圆形或椭圆形。 乳酸片球菌细胞呈球状，直径0.6~1.0μm，在直角两个平面交替形成四联状， 一般细胞成对生，单生者罕见，不成链状排列。革兰氏阳性，不运动，兼性厌氧。在MRS培养基上菌落小，呈白色。沿洋菜穿刺线的生长物呈丝状。 乳酸菌在一般琼脂培养基上形成微小菌落，不易观察，所以分离时先富集培养并选择合适的培养基。分离培养基一般添加西红柿、酵母膏、吐温-80等物质，也常常加入醋酸盐，因醋酸盐能抑制部分细菌生长，对乳酸菌无害。 培养基中添加碳酸钙，乳酸溶解培养基中的碳酸钙形成透明圈，作为分离鉴别的依据，通过对生成的乳酸量进行性能鉴定。 乳酸菌生长繁殖时需要多种氨基酸，维生素及微氧，一般菌落比较小。分离培养基一般可添加西红柿酵母膏油酸吐温等物质，均具有促进生长作用。也常常 添加醋酸盐抑制有些细菌的生长，对乳酸菌无害。 一.筛选方法： 1.溶钙圈法： 利用一些产酸类细菌在含CaCO3的培养基上产生CaCO3溶解圈，从而筛选出这些产酸类细菌，可用于乳酸菌的筛选。 其中培养基中加入CaCO3的作用是：①鉴别能产生酸的细菌；②中和产生的酸， 以维持培养基的PH。 筛选过程：样品预处理→梯度稀释至10-6→选择合适的稀释度涂布→37℃培养
泡菜中乳酸菌的应用
泡菜中乳酸菌的应用 张佳洁-153******** 摘要：泡菜是许多人常常食用的食品，其酸爽可口的口感受到人们的喜爱，而造就泡菜口感的重要角色就是微生物——乳酸菌。乳酸菌在泡菜中的作用程度会直接影响到泡菜的风味。本文主要探讨乳酸菌在泡菜中的作用原理、作用方式与应用优缺点。 一、技术名称：泡菜中乳酸菌的应用 乳酸菌指发酵糖类主要产物为乳酸的一类无芽孢、革兰氏染色阳性细菌的总称，为原核生物，能利用可发酵碳水化合物产生大量乳酸。这类细菌在自然界分布极为广泛，广泛存在于畜、禽肠道、许多食品、物料及少数临床样品中。因此，也被人们用于泡菜制作之中。 二、乳酸菌在泡菜中的作用原理 泡菜生产其实是利用食盐的高渗透作用，以乳酸菌为主的微生物发酵过程。 乳酸菌常附着于蔬菜上，与植物关系密切，虽经洗涤也不会被除去。在泡菜制作过程中，乳酸菌利用的养料主要是蔬菜的可溶性物质和部分泡渍物浸出物。在密封的泡菜罐中，氧气含量较低。乳酸菌在酶的作用下分解养料，转化为二氧化碳等物质，消耗氧气，随后产生乳酸，同时抑制了一些腐败菌或致病菌的生长，保证了泡菜的品质和风味。 因为乳酸菌及其代谢产物中既不具备分解纤维素的酶系统，又不具备水解蛋白质的酶系，因此泡菜发酵过程中既不会破坏植物细胞组织，又不会分
解蛋白质、氨基酸，使泡菜能够保持新鲜。 三、乳酸菌的应用 除去在泡菜中的应用，乳酸菌在乳制品的制作中也有着巨大作用，主要产品有酸奶、奶油和干酪，同时在植物蛋白饮料、肉制品生产、食品防腐及保鲜中也有应用。 四、乳酸菌食品的优缺点 泡菜发酵产生的大量乳酸菌被人体吸收后，能促进胃蛋白酶的分泌，抑制人体消化道内有害菌的繁殖，使肠道内微生物分布正常化。但是，乳酸菌食品中，泡菜存在亚硝酸盐含量高的问题，乳酸菌饮料为了满足乳酸菌的生长需要，会加入大量的糖分，它们对人体健康都有一些影响。 五、小结 自古以来，以乳酸菌为代表的微生物在食品制作中为人类作出了巨大的贡献，然而其中的科学原理直到上个世纪才被人们了解与利用。对微生物更加深入的研究，一定会给人们的食谱增添更多的美味。
乳酸菌的分离与初步鉴定
学院：漓江学院年级专业：09生物技术 组员：吴汉川200913007005 杨隆荷200913007006 李翠200913007007 王志远200913007008 乳酸菌的分离及初步鉴定 一、实验目的 1了解和掌握放线菌的菌种特性和分离方法 2初步掌握军中筛选方法设计 3掌握平菌种的选育 二、实验原理 乳酸菌是指以糖为原料，属于真细菌纲真细菌目中的乳酸细菌科。乳酸细菌科根据细胞呈球状或呈杆状，又分成乳酸杆菌族和链球菌族。 在BCG 牛乳培养基琼脂平板上，乳酸菌菌落大约1-3 mm，圆形隆起，表面光 的溶滑或稍粗糙，呈乳白色、灰白色或暗黄色；在产酸菌落周围还能产生CaCO 3 解圈。乳酸菌革兰氏染色呈阳性，涂片镜检细胞杆状或链球状。 乳酸杆菌呈杆状，成单杆、双杆或长丝状；乳酸杆菌，呈球状，成对或短链或长链状。乳酸菌革兰氏染色后呈蓝紫色。 平板涂布法平板涂布法是将样品经稀释之后，其中的微生物充分分散成单个细胞，取一定量的稀释液接种到平板上，经过培养，由每个单个细胞生长繁殖而形成肉眼可见的菌落，即一个但菌落代表原样品中的一个单细胞。 生理盐水：称取9g氯化钠，溶解在少量蒸馏水中，稀释到1000毫升。 四、实验器材与试剂 含乳酸菌的酸奶、结晶紫、卢哥氏碘液、95%乙醇、蕃红溶液、灭菌CaCO3粉末、NaCl； BCG牛乳培养基：(A)溶液：脱脂乳粉100g，水500mL，加入1.6%溴甲酚绿(B.C.G)乙醇溶液1mL，80℃灭菌20min。(B)溶液：酵母膏10g，水500mL，琼脂20g, pH6.8, 121℃湿热灭菌20min。以无菌操作趁热将(A)、(B)溶液混合均匀后倒平板。 1000ml烧瓶一个, 无菌培养皿9个, 500ml容量三角瓶2个，25ml无菌移液管1只，20ml无菌试管7只，1ml无菌移液管6只，培养基分装器一个，玻棒2根, 无菌涂布器3只，酒精灯一盏，接种环一个，天平，牛角匙，漏斗，漏斗架，载玻片，盖玻片，pH试纸若干，液体石蜡，棉塞，吸管，牛皮纸，线绳、标签等。 五、实验步骤 1.菌悬液的配制 取1洁净三角瓶，盛以225ml生理盐水；7只洁净试管，各盛9ml的生理盐水；加塞包扎于在103kPa 121℃高压蒸汽灭菌20Min，得到无菌生理盐水。
乳酸菌的提取和鉴定
酸奶中乳酸菌的筛选试验 一、实验目的：熟悉从酸奶中分离和纯化乳酸菌的一般方法 二、实验原理： 市场销售的酸奶主要含乳酸菌，乳酸菌的主要作用是把牛奶中乳糖发酵成乳酸，此外酸奶中还含有其他球菌，利用它产酸等性质可以分离乳酸菌，分离培养基一般添加蛋白胨、酵母膏提供氮源、维生素、生长因子；葡萄糖为可发酵糖类；磷酸氢二钾为酸碱缓冲剂；柠檬酸铵、硫酸镁、硫酸锰、亚硫酸铁、吐温-80和乙酸钠为培养各种乳酸菌提供生长因子，其成分还能抑制某些杂菌；琼脂是培养基的凝固剂。、也常常加入醋酸盐，因醋酸盐能抑制部分细菌生长，对乳酸菌无害。培养基中添加碳酸钙，乳酸溶解培养基中的碳酸钙形成透明圈，作为分离鉴别的依据。 .筛选方法：.溶钙圈法：利用一些产酸类细菌在含CaCO3 的培养基上产生CaCO3 溶解圈，从而筛选出这些产酸类细菌，可用于乳酸菌的筛选。其中培养基中加入CaCO3 的作用是：①鉴别能产生酸的细菌；②中和产生的酸，以维持培养基的PH、更利于乳酸菌的生长和分离 三、实验药品及仪器 牛肉膏、蛋白胨、酵母膏、葡萄糖、乳糖、吐温-80、柠檬酸二铵、CaCO3 、K2HPO4 NaAc·3H2O、MgSO4·7H2O、MnSO4·H2O、琼脂、结晶紫染色液、碘液、95%乙醇、石蜡、蒸馏水。 仪器：超净工作台、电子显微镜、接种环、恒温培养箱、接
种环、培养皿、涂布环、高压锅、试管、微波炉、电子天平、离心机 四培养基类型 ①改良MRS 培养基（乳酸菌分离培养基）：牛肉膏10g，蛋白胨10g，酵母膏5g，葡萄糖20g，吐温-80 1.0ml（它是一种很好的乳化剂和分散剂也就是说它的作用就是是培养基的营养成分更加的均匀就是对营养成分的再一次优化），K 2HPO4 2g，NaAc·3H2O 5g，柠檬酸二铵2g，MgSO4·7H2O 0.58g，MnSO4·H2O 0.25g，补蒸馏水至1000ml（固体培养基中加琼脂 1.5%-2%），调pH 至6.4±0.2，121℃高压灭菌15min ②改良MC 培养基（乳酸菌选择培养基）：牛肉膏5g，蛋白胨5g，酵母膏5g，葡萄糖20g，乳糖20g，CaCO3 10g，琼脂20g，中性红0.05g（指示剂），最终pH6.5±0.2，补蒸馏水至1000ml，121℃高压灭菌15min。 配制方法：1把除CaCO3以外的成分称量溶解后.调PH至6.2～6.4； 2.称取20g CaCO3加入到100mL蒸馏水中，制成CaCO3乳浊液； 3.将培养基和CaCO3乳浊液分开灭菌； 4.倒平板前，待培养基融化冷却后，平板上加入一定量的CaCO3乳浊液，晾干了以后再接种。 五、实验流程 1、吸取酸奶1ml 2、10 倍梯度稀释平板涂布（改良MC Medium） 3、厌氧培养（28℃培养48h）待形成菌落 4、挑取溶钙圈较大的单菌落→ 观察、记录菌落形态与特征 5、Improved MC Medium 划线分离纯化 6、选取溶钙圈较大的单菌落进行G+染色 7、革兰氏阳性菌（G+菌）→ 记录菌株细胞形态
乳酸菌得分离、纯化与鉴定
乳酸菌得分离、纯化与鉴定 第一部分:乳酸菌得分离、纯化 一、实验器材: 1、实验药品新鲜乳酸饮料(市售)、脱脂奶粉、蔗糖、1、6%溴甲酚绿乙醇溶液(溴甲酚绿、无水乙醇)、酵母膏、琼脂、革兰氏染液(结晶紫染液、卢戈氏碘液、95%乙醇、沙黄)、75%乙醇、香柏油、1mol/L NaOH、1mol/L HCl、碳酸钙; 0、4gNaOH固体、4、2ml浓HCL(分析纯) 、20gCaCO3固体、酵母膏20g 、琼脂30g 香柏油、脱脂奶粉100g 、蔗糖10g; 2、仪器与设备高压蒸汽灭菌锅、光学显微镜、培养箱、pH试纸、酸乳瓶、培养皿(φ9或φ12)、试管、300ml三角瓶(带玻珠)、移液管、天平、500ml锥形瓶、250ml锥形瓶、250ml烧杯。 二、实验步骤: 1、培养基配制(BCG牛乳培养基): (A)溶液:取脱脂乳粉100g,水500ml,加入1、6%溴甲酚氯乙醇溶液1ml,混合均匀后分装入三角瓶于高压蒸汽灭菌锅80℃灭菌20 min;(1、6%溴甲苯酚绿(BCG)乙醇溶液用1、6g溴甲酚绿加入20ml无水乙醇中,再加水至100ml制成) (B)溶液:酵母膏10g,水500ml,CaCO3 10g,琼脂20g,加热溶解,用精密pH试纸调节pH到6、8,分装入三角瓶后在103kPa 121℃高压蒸汽灭菌20Min。 以无菌操作趁热将(A)(B)溶液均匀混合。 2、药品配制 2、1 结晶紫:结晶紫乙醇饱与液(结晶紫2g溶于20ml 95%乙醇中)20ml,1%草酸氨水溶液80ml。将两液混匀,放置24小时后过滤即可。 2、2 卢哥氏碘液:碘1g,碘化钾2g,蒸馏水300ml。先将碘化钾溶于少量蒸馏水中,然后加入碘使之完全溶解,再加入蒸馏水300ml即成。 2、3 蕃红溶液:番红2、5g,95%乙醇100ml,溶解后存于密闭得棕色瓶中。用时取20ml与80ml蒸馏水混匀即可。 2、4 0、1%得吕氏美蓝染液:A液:美蓝0、3g,95%乙醇300ml;B液:0、01% KOH 100ml。混合A与B液即成,按1:100稀释即可。 2、4 生理盐水:称取9g氯化钠,溶解在少量蒸馏水中,稀释到1000毫升。 3、菌悬液得配制
乳酸菌菌种的分离筛选方法
乳酸菌菌种的分离筛选方法乳酸细菌是一类能利用发酵糖产生大量乳酸的细菌通称。为兼性厌氧菌，杆状或球状，革兰氏阳性菌，无芽孢，不运动。营养要求高，需要提供丰富的肽类氨基酸维生素。在琼脂表面或内层形成较小的白色或淡黄色的菌落。 通常用作为有益微生物的菌种有乳酸乳杆菌、干酪乳杆菌、植物乳杆菌、嗜酸乳杆菌、粪肠球菌、乳酸片球菌、双歧杆菌、屎肠球菌、戊糖片球菌等。 乳杆菌常用MRS琼脂作半选择培养基。当乳杆菌仅是复杂区系中的部分菌类 时，SL培养基常用作为选择性培养基。对于芽孢乳杆菌常用GYP培养基，链球菌有TYC培养基、MS培养基。M17培养基被用作乳球菌的分离培养基。 嗜酸乳杆菌属于乳杆菌属的一个种。其特性为：杆菌，两端圆，不运动，无 鞭毛。粪肠球菌为革兰氏阳性，圆形或椭圆形。 乳酸片球菌细胞呈球状，直径0.6~1.0μm，在直角两个平面交替形成四联状，一般细胞成对生，单生者罕见，不成链状排列。革兰氏阳性，不运动，兼性厌氧。在MRS培养基上菌落小，呈白色。沿洋菜穿刺线的生长物呈丝状。 乳酸菌在一般琼脂培养基上形成微小菌落，不易观察，所以分离时先富集培养并选择合适的培养基。分离培养基一般添加西红柿、酵母膏、吐温-80等物质，也常常加入醋酸盐，因醋酸盐能抑制部分细菌生长，对乳酸菌无害。 培养基中添加碳酸钙，乳酸溶解培养基中的碳酸钙形成透明圈，作为分离鉴别的依据，通过对生成的乳酸量进行性能鉴定。 乳酸菌生长繁殖时需要多种氨基酸，维生素及微氧，一般菌落比较小。分离培养基一般可添加西红柿酵母膏油酸吐温等物质，均具有促进生长作用。也常常添加醋酸盐抑制有些细菌的生长，对乳酸菌无害。 一.筛选方法： 1.溶钙圈法： 利用一些产酸类细菌在含CaCO3的培养基上产生CaCO3溶解圈，从而筛选出这些产酸类细菌，可用于乳酸菌的筛选。 其中培养基中加入CaCO3的作用是：①鉴别能产生酸的细菌；②中和产生的酸，以维持培养基的PH。 筛选过程：样品预处理→梯度稀释至10-6→选择合适的稀释度涂布→37℃培养
乳酸菌发酵泡菜的方法及亚硝酸盐变化的研究
乳酸菌发酵泡菜的方法及亚硝酸盐变化的研究 摘要：使用平板划线法分离乳酸菌，然后进行微生物培养，并将其接种于所要的腌制的泡菜中,厌氧环境下对其处理进行无氧发酵，待泡菜腌制成熟后，比较两组泡菜的口感以及腌制所用时间，同时，对两组泡菜中的亚硝，并进行检测 关键词：泡菜乳酸菌亚硝酸盐的检测平板划线法 A、立论依据 （一）研究目的与意义 韩国泡菜专家介绍道：泡菜富含人体所需的维生素、矿物质、植化物及大量活性乳酸菌等营养型和功能型成分，被认为是天然的健康食品。因此，提纯乳酸菌发酵泡菜的前景毋庸置疑。另外，蔬菜里含有大量的硝酸盐在某些细菌的作用下会还原成亚硝酸盐。所以，研究亚硝酸盐在泡菜腌制过程中的变化也就具有重要的意义。本实验要研究的目的可概括为以下三点：接种纯种乳酸菌改善泡菜口感；在腌制泡菜时直接接种乳酸菌来缩短成熟时间；降低泡菜中亚硝酸盐的含量。 B、研究方案 （一）研究目标、研究内容和拟解决的关键问题 实验研究乳酸菌发酵泡菜的方法及亚硝酸盐含量的变化可概括分为以下三项：接种纯种乳酸菌改善泡菜口感；在腌制泡菜时直接接种乳酸菌来缩短成熟时间；降低泡菜中亚硝酸盐的含量。 本实验，将酸菜水中分离纯化的乳酸菌进行培养后，直接接种到所要腌制的泡菜中，通过对照实验，比较实验组与对照组中泡菜的口感以及泡菜成熟所需要的腌制时间，并对两组的泡菜进行亚硝酸盐含量的测定。 在腌制泡菜的过程中，直接加入纯种的乳酸菌，是否可以有效地缩短泡菜的制作时间、降低亚硝酸盐的含量，以及确定最适加入菌量成为本实验所要解决的关键问题。 （二）拟采取的研究方法、技术路线、实验方案及可行性分析 通过平板划线法分离纯化酸菜水中的乳酸菌，鉴别后对乳酸菌进行培养，并将其接种于所要腌制的泡菜（实验组）中,厌氧环境下对两组（实验组与对照组）泡菜进行发酵，待泡菜腌制成熟后，比较两组泡菜的口感以及腌制所用时间，同时，对两组泡菜中的亚硝量进行测较。酸盐试比含样品处理液制备流程图： 一、乳酸菌的分离纯化
乳酸菌在泡菜生产中的应用
乳酸菌在泡菜生产中的应用 胡书芳,王雁萍3 (郑州大学河南省离子束生物工程重点实验室,河南郑州450052) 摘要 乳酸菌在泡菜发酵过程中起主要作用,其发酵性能直接影响泡菜品质。主要从乳酸菌发酵泡菜机理、乳酸菌发酵泡菜的意义、乳酸菌的分离鉴定进行阐述。关键词 乳酸菌;泡菜;分离鉴定中图分类号 T S201.3 文献标识码 A 文章编号 0517-6611(2008)21-09275-02R esearch of Lactob acillus in S auerkraut P roduction HU Shu 2fang et al (Provincial K ey Lab oratory of I on Beam Bio 2engineering ,Z hengzh ou University ,Z hengzh ou ,H enan 450052)Abstract Lactobacillus played an im portant role in sauerkraut ferm enting ,which affected directly the quality of sauerkraut.Ferm enting m echanism ,the im portance of lactobacillus ferm entation and the is olation and identification of lactobacillus were studied.K ey w ords Lactobacillus ;Sauerkraut ;Is olation and identification 基金项目 国家“973”课题(2004C B7719604)资助。 作者简介 胡书芳(1983-),男,河南平顶山人,硕士研究生,研究方 向:微生物与发酵工程。3通讯作者。 收稿日期 2008205212 泡菜是一种传统而独特的发酵蔬菜制品,主要由乳酸菌发酵而成。乳酸菌是一类能利用可发酵糖产生大量乳酸的细菌的通称。近年来随着人们对乳酸菌、乳酸生物功能和保健功能认识的提高,泡菜被越来越多的人们所喜爱。最新研究成果表明,韩国泡菜具有维持人体消化道健康、减肥、抗肿瘤、抗病毒、预防食物中毒、预防心脑血管疾病、防止皮肤老化、抗皱美容等多种保健和医疗功能[1]。然而,在泡菜生产中存在着发酵时间长、亚硝酸盐含量高等问题。这一直阻碍着泡菜产业的发展。乳酸菌是泡菜中起主要作用的菌群。它的发酵性能直接关系到泡菜品质。因此,科研人员和生产者都把研究菌株特性和筛选优良的发酵剂作为提高泡菜品质的主要方法。 1 乳酸菌发酵泡菜的机理及过程 泡菜生产是利用以乳酸菌为主的微生物发酵过程。乳酸菌发酵蔬菜之所以能使蔬菜保持新鲜,是因为乳酸菌及其代谢产物中既不具备分解纤维素的酶系统,又不具备水解蛋白质的酶系,因此蔬菜发酵过程中既不会破坏植物细胞组织,又不会分解蛋白质、氨基酸,既能保鲜,又能增强产品风味[2]。此外,乳酸菌可以发酵食物中碳水化合物,分泌乳酸菌素,产生有机酸等酸性物质、酒精和二氧化碳等,抑制一些腐败菌或致病菌的生长,改善食品的品质和风味;同时,经过发酵,乳酸菌可以增加食品的可消化性,并产生一些维生素、抗氧化剂 [3] 。 泡菜中乳酸量直接关系到泡菜质量,所以乳酸菌对于提高泡菜的营养价值极为重要。泡菜的乳酸发酵一般可分为微酸、酸化和过酸3个阶段。在泡制初期,乳酸菌与其他附生微生物共生,但在厌氧环境中乳酸菌占优势,并因产酸使泡渍液呈微酸性而抑制了腐败微生物的生长。在泡制中期,乳酸菌含量猛增达到酸化阶段。在泡制后期,当乳酸菌继续富集直至反馈抑制乳酸菌生长时,即进入过酸阶段[4]。在过酸阶段,由于乳酸菌等微生物几乎进入休眠期,可有效保持产品的货架期,但由于酸度过高,口感较差。在酸化阶段产品风味好,此时为最佳食用期。 2 乳酸菌发酵泡菜的意义 2.1 提高蔬菜制品的营养价值 乳酸菌不具备分解纤维素 和蛋白质的酶系统,所以不会破坏植物细胞组织,也不会降低蔬菜原来的营养价值。相反,乳酸菌的代谢产物中含多种氨基酸、维生素等,提高了泡菜的营养价值。 2.2 改善蔬菜制品的风味 乳酸菌通过同型或异型发酵, 产生乳酸、醋酸、丁酸等有机酸,赋予泡菜制品酸味。同时,在发酵过程中还可产生少量的22庚酮、22壬酮和酯类物质,可赋予爽口的口感和清香宜人的香味。 2.3 防止腐败,延长保质期 乳酸菌发酵可为泡菜提供的 酸性环境,抑制一些腐败菌的生长。同时,乳酸菌细胞还能产生许多抗菌的活性物质,如乳链球菌肽、乳杆菌素、嗜酸菌素、细菌素,从而提高产品的保存性。E laine 等试验表明,从甘蓝、番茄上分离得到的乳酸菌可产生抑制鲜黄色葡萄球菌的细菌素。可见,不论是乳酸菌菌体还是其代谢产物,都可有效防止食品腐败。特别是乳链球菌素(Nisin ),对革兰氏阳性菌具有广谱的抑制作用,可将其作为天然的生物防腐添加剂添加到食品中去[5]。 2.4 提高蔬菜制品的医疗保健作用 在泡菜发酵过程中, 能产生大量的乳酸菌。经试验发现,刚腌制的韩国泡菜中乳酸菌含量只有1万个/m l 左右,但经过低温发酵后乳酸菌含量增加到6300万个/m l 。泡菜发酵产生的大量乳酸菌被人体吸收后,能促进胃蛋白酶的分泌,抑制人体消化道内有害菌的繁殖,使肠道内微生物分布正常化。泡菜中乳酸菌和其他微生物能抑制消化道病菌,使肠内微生物的分布趋于正常化,有助于对食物的消化、吸收。在发酵过程中乳酸菌产生大量的乳酸使环境pH 值降低,有利于NO 2还原成NO ,从而降低亚硝酸盐的残留。 3 目前对乳酸菌研究的主要内容 3.1 分离方法 菌株分离的大致程序为:发酵泡菜汁液→ 稀释→MRS 培养基上涂平板→挑起单菌落染色、镜检→挑选革兰氏阳性→反复在培养基上纯化筛选→单菌落菌株→低温保存。 3.2 鉴定方法 用于细菌分类的特征有形态特征、生理生 化特征、营养学特征、化学特性,基因型等[6]。但目前对乳酸菌的鉴定研究主要集中在形态学鉴定、生理生化试验、分子生物学试验。形态学鉴定较为粗略,只能作为初步鉴定的依 安徽农业科学,Journal of Anhui Agri.Sci.2008,36(21):9275-9276,9327 责任编辑 刘月娟 责任校对 卢瑶
乳酸菌的分离、纯化与鉴定
乳酸菌的分离、纯化与鉴定 第一部分：乳酸菌的分离、纯化 一、实验器材： 1. 实验药品新鲜乳酸饮料（市售）、脱脂奶粉、蔗糖、1.6%溴甲酚绿乙醇溶液（溴甲酚绿、无水乙醇）、酵母膏、琼脂、革兰氏染液（结晶紫染液、卢戈氏碘液、 95%L 醇、沙黄）、15/乙醇、香柏油、1mol/L NaOH、1mol/L HCI、碳酸钙；0.4gNaOH固体、4.2ml浓HCL（分析纯）、20gCaCO3固体、酵母膏20g、琼脂30g 香柏油、脱脂奶粉100g、蔗糖10g ； 2. 仪器与设备高压蒸汽灭菌锅、光学显微镜、培养箱、 pH试纸、酸乳瓶、培养皿（?9或? 12）、试管、300ml三角瓶（带玻珠）、移液管、天平、500ml 锥形瓶、250ml 锥形瓶、250ml烧杯。 二、实验步骤： 1. 培养基配制（BCG牛乳培养基）： （A）溶液：取脱脂乳粉100g,水500ml,加入1.6%溴甲酚氯乙醇溶液1ml, 混合均匀后分装入三角瓶于高压蒸汽灭菌锅 80C灭菌20 min ; （1.6%溴甲苯酚绿（BCG 乙醇溶液用1.6g溴甲酚绿加入20ml无水乙醇中，再加水至100ml制成）（B）溶液：酵母膏10g，水500ml, CaCO3 10g琼脂20g,加热溶解，用精密pH 试纸调节pH到6.8，分装入三角瓶后在103kPa 121 T高压蒸汽灭菌 20Mi n。 以无菌操作趁热将（A）（B）溶液均匀混合。 2. 药品配制 2.1结晶紫：结晶紫乙醇饱和液（结晶紫 2g溶于20ml 95%^醇中）20ml, 1%莊酸氨水溶液80ml。将两液混匀，放置24小时后过滤即可。 2.2卢哥氏碘液：碘1g,碘化钾2g,蒸馏水300ml。先将碘化钾溶于少量蒸馏水中，然后加入碘使之完全溶解，再加入蒸馏水300ml即成。 2.3蕃红溶液：番红2.5g , 95%^醇100ml，溶解后存于密闭的棕色瓶中。用时取20ml 与80ml蒸馏水混匀即可。 2.4 0.1%的吕氏美蓝染液：A液：美蓝0.3g ,95%^醇300ml; B液：0.01% K0H100ml。混合A和B液即成，按1： 100稀释即可。 2.4生理盐水：称取9g氯化钠，溶解在少量蒸馏水中，稀释到 1000毫升。
乳酸菌在泡菜加工中的应用与研究进展(张馨月)
乳酸菌在泡菜加工中的应用及研究进展 摘要：本文论述了乳酸菌在泡菜加工中的作用和泡菜加工中存在的问题及研究前景。指出 了乳酸菌在泡菜的发酵、防腐保鲜、亚硝酸盐控制等方面发挥的重要作用，并提出了这几 个方面有关乳酸菌的研究方向。 关键词：乳酸菌；泡菜；发酵；前景； The roles and research status of the lactic acid bacteria in the Abstract：The roles of the lactic acid bacteria, problems and prospects in the processing of pickle were discussed in this article. At the same time, it pointed out the importance of the lactic acid bacteria in the fermentation of pickle, preservation, and the control of nitrite. Key words: the lactic acid bacteria; pickle; fermentation; prospect; 泡菜是我国传统发酵食品的典型代表之一，历史悠久，制作工艺可以追溯到2000多年前[1]。泡菜是新鲜蔬菜经过适当处理后，将其浸入5%~10%的盐水中，通过蔬菜中天然存在的乳酸菌、醋酸菌和酵母菌等有益微生物的大量繁殖和发酵而产生的一类发酵食品[2]。其酸鲜纯正、嫩脆芳香、清爽可口，且具有开胃、助消化、抗肿瘤、抗病毒、抗衰老、预防心脑血管疾病等保健和医疗功能[3]。“世界泡菜看中国，中国泡菜看四川”，四川泡菜产量销量居全国第一，每年以15%的速度增长。2009年，全四川省的泡菜产量120万吨，产值90亿[4]。虽然改革开放后，泡菜行业迅猛发展，但是目前，泡菜的加工工艺和产品质量控制等方面仍以传统加工工艺为主，泡菜在发酵过程中仍存在一些问题，如半成品变色、蔬菜营养成分流失、亚硝酸盐含量超标、保质期不能满足市场需求等。 乳酸菌是以糖类为原料，发酵能产生大量乳酸的一类细菌的统称[5]，具有重要的生物学特性和生理学作用。并且乳酸菌是发酵工业常用的菌种，可利用原料中的可溶性成分，不仅可产生大量乳酸，也可以合成叶酸等B族维生素，产生有机酸提高钙、磷、铁的利用率，促进铁和VD的吸收[6],即有防腐作用，又可改善泡菜风味。因此，将乳酸菌技术用于传统泡菜工业化生产具有重大意义，这对实现农业可持续发展也有现实意义。
乳酸菌与四川泡菜
乳酸菌与四川泡菜 摘要乳酸菌的分离、筛选、鉴定及保存方，乳酸菌在泡菜生产中作用机理及其影响因素、泡菜乳酸菌的应用效果．以及泡菜生产的发展前景。 关键词泡菜乳酸菌乳酸发酵 正文 酸泡菜是世界性大众蔬菜发酵制品，其主要发酵菌群是乳酸菌。而四川泡菜以其独有的高品质闻名于世。既是佐餐佳肴，又是川菜必不可少的烹调佐料。地处人杰地灵、物华天宝川西平原腹地的成都，温暖潮湿，四季分明的气候条件既有利于乳酸发酵，又有利于四季蔬菜常青，蔬菜资源极为丰富。但是在四川发酵型泡菜几乎都采用野生菌，相当数量的企业采用非发酵型拌制菜工艺。在制作工艺方面，粗加工多，深加工、精加工少。且采用的乳酸菌多为用于酸奶、乳酸等产品的专有菌种，因其在泡菜制作基质特定环境中适应性差，生长繁殖困难，酿制出的菜品无发酵泡菜独有的品位而受到制约。 乳酸菌是一类既古老又新颖重要的细菌。其古老是源于早在公元前3世纪我们的祖先就用它来制作泡菜和腌菜，其新颖是由于无菌动物学、悉生生物学、厌氧技术和其他高新技术的发展，又发现了一些新的类群，它们是人和动物体内必不可少的具有重要生理功能的双岐乳酸菌群。泡菜生产是利用食盐的高渗透压作用，以乳酸发酵为主的微生物发酵过程。因此除了原料中的食盐作为纯物理学的非生命活动外，乳酸发酵则是微生物极复杂的生命代谢活动的结果。乳酸发酵的优劣以及乳酸在泡菜中的积累将直接关系到泡菜的质量，同时乳酸菌对于提泡菜的营养价值极为有利，这是因为乳酸菌既不具备分解纤维素的酶系统，也不具备水解蛋白质的酶系。因此既不会破坏植物细胞组织，又不会分解蛋白质和氨酸，既有保鲜功能，又可增强产品风味。乳酸菌常附着于蔬菜上，与植物关系密切虽经洗涤也不被除去，在泡菜制作过程中，乳酸菌利用的养科主要是蔬菜的可溶性物质和部分泡渍液浸出物。但是蔬菜附生微生物中还有酵母菌、丁酸菌、大肠杆菌和一些霉菌，所以利用野生菌酿制泡菜，常带来生产周期长、卫生条件差、品质量不稳定等弊端为使乳酸菌迅速生长繁殖，应根据乳酸菌的生理特性创造最佳生长条件。首先，在泡渍液中加入适量糖类物质使其获得足够的碳源和能源。其次，使泡渍液尽量充满发酵容器，出口加盖水封层刨造厌氧条件，既满足乳酸菌厌氧发酵的要求，又抑制好氧细菌和霉菌的生长。发酵中期由于乳酸菌生长并产酸，可抑制虽属厌氧菌但需要中性或碱性条件才能生长的丁酸菌和其它腐败细菌。泡渍液中的食盐也抑制了不耐盐的微生物污染。此外乳酸菌为中温微生物，在中温条件下发酵也抑制了高温和低温微生物的干挠。泡菜的乳酸发酵一般可分为微酸、酸化和过酸三个阶段。泡制初期，乳酸菌与其它附生微生物共生。但在厌氧环境中乳酸菌占优势，并因产酸使泡渍液呈微酸性抑制了腐败微生物的生长。在泡制中期乳酸菌大量繁殖乳酸含量猛增达到酸化阶段。在泡制后期当乳酸量继续富集直至反馈抑制乳酸菌生长时，即进入过酸化阶段。在过酸阶段，因为乳酸菌等微生物几乎进入休眠期，可有效保持产品的货架期。但由于酸度过高口感较差。在酸化阶段产品风味最好，为最佳食用期。通常情况下成品菜的pH值控制在3.0乳酸控制在1％左右效果最佳。 一、自然发酵酸菜汁中乳酸茵的分离、筛选、鉴定及保存方 1、乳酸菌的分离与筛选的试验程序自然发酵酸菜汁液一稀释一培养一挑起单菌落染色、镜检一挑选革兰氏阳性球菌单菌落一Ⅲ号培养基一挑选溶钙圈大的球菌反复在Ⅲ号培养基上几次纯化筛选一单菌落优良菌株一试管穿刺低温保存。 2、乳酸菌的鉴定用光学显微镜、放大镜进行乳酸菌的形态特征鉴定。生理生化特征鉴定： 产乳酸定性试验——乳酸纸层析法o-“、过氧化氢酶(接触酶)反应、明胶水解反应、明胶水 解反应、硫化氢反应01、乳酸菌发酵营养型试验、、耐盐、酸、温度试验。 3、乳酸菌的保存“1采用定期移植低温保藏法。培养基配方：葡萄糖1％、蛋白胨0．2％、
乳酸菌的分离纯化与鉴定
乳酸菌的分离、纯化与鉴定 第一部分:乳酸菌的分离、纯化 一、实验器材: 1、实验药品新鲜乳酸饮料(市售)、脱脂奶粉、蔗糖、1、6%溴甲酚绿乙醇溶液(溴甲酚绿、无水乙醇)、酵母膏、琼脂、革兰氏染液(结晶紫染液、卢戈氏碘液、95%乙醇、沙黄)、75%乙醇、香柏油、1mol/L NaOH、1mol/L HCl、碳酸钙; 0、4gNaOH固体、4、2ml浓HCL(分析纯) 、20gCaCO3固体、酵母膏20g 、琼脂30g 香柏油、脱脂奶粉100g 、蔗糖10g; 2、仪器与设备高压蒸汽灭菌锅、光学显微镜、培养箱、pH试纸、酸乳瓶、培养皿(φ9或φ12)、试管、300ml三角瓶(带玻珠)、移液管、天平、500ml锥形瓶、250ml锥形瓶、250ml烧杯。 二、实验步骤: 1、培养基配制(BCG牛乳培养基): (A)溶液:取脱脂乳粉100g,水500ml,加入1、6%溴甲酚氯乙醇溶液1ml,混合均匀后分装入三角瓶于高压蒸汽灭菌锅80℃灭菌20 min;(1、6%溴甲苯酚绿(BCG)乙醇溶液用1、6g溴甲酚绿加入20ml无水乙醇中,再加水至100ml制成) (B)溶液:酵母膏10g,水500ml,CaCO3 10g,琼脂20g,加热溶解,用精密pH试纸调节pH到6、8,分装入三角瓶后在103kPa 121℃高压蒸汽灭菌20Min。 以无菌操作趁热将(A)(B)溶液均匀混合。 2、药品配制 2、1 结晶紫:结晶紫乙醇饱与液(结晶紫2g溶于20ml 95%乙醇中)20ml,1%草酸氨水溶液80ml。将两液混匀,放置24小时后过滤即可。 2、2 卢哥氏碘液:碘1g,碘化钾2g,蒸馏水300ml。先将碘化钾溶于少量蒸馏水中,然后加入碘使之完全溶解,再加入蒸馏水300ml即成。 2、3 蕃红溶液:番红2、5g,95%乙醇100ml,溶解后存于密闭的棕色瓶中。用时取20ml与80ml蒸馏水混匀即可。 2、4 0、1%的吕氏美蓝染液:A液:美蓝0、3g,95%乙醇300ml;B液:0、01% KOH 100ml。混合A与B液即成,按1:100稀释即可。