噬菌体
噬菌体展示技术的发展和应用
2013级食品科硕班姜晓坤 21313033
摘要：噬菌体展示技术是一项筛选技术，是将外源蛋白质或多肽的基因序列与噬菌体衣的壳蛋白基因融合，并在细胞表面表达展示的基因工程技术。其将表达型与其基因型联系在一起，能提供高效率的筛选系统。该技术目前已被广泛应用于生命科学的许多领域，如蛋白质相互作用、抗体和疫苗的研制、医学诊断和治疗、酶制剂研制、多肽药物的开发等，并在众多基础和应用研究领域产生深远的影响，显示出巨大的应用潜力，应用前景十分广泛。
关键字：噬菌体展示技术，基因工程技术，蛋白质相互作用，应用领域
The development and application of phage display technology
Abstract:The phage display technology is a screening technique.It is a genetic engineering technique that combines the gene sequence of exogenous protein or polypeptide with the specific gene of surface protein of the phage to express on the surface of recipient cell and it can screen the specific proteins or antibodies efficiently. This technique has unique advantages and great potentials in the many fields such as developments of antibodies,vaccine,drugs and enzymic preparations, medical diagnosis and treatment and research of protein interaction.
Keyword: Phage display technology, Genetic engineering technique, Protein interactions, Applications
微生物表面展示技术是利用基因工程手段把靶蛋白(外源肽段或蛋白质结构域)基因序列与特定的载体蛋白基因序列(又叫定位序列)融合并在微生物细胞表面表达展示的新型基因工程技术，被展示的多肽或蛋白质可以保持相对独立的空间结构和生物活性。其重要特征和优点是靶蛋白与其编码DNA处于同一个病毒或细胞中，可以通过序列测定确定DNA序列并进一步推导外源蛋白氨基酸组成，从而实现了基因型和表现型的统一。其中靶蛋白序列与载体蛋白序列的融合方式主要有N端融合、C端融合和插入融合[1]。噬菌体、细菌、杆状病毒、酵母菌等多种微生物均可运用于该展示技术[1]。
噬菌体表面展示技术是微生物表面展示技术中应用非常广泛的，该展示技术是最早发展起来的，历经20多年发展。其基本概念是将外源蛋白质或多肽的基因表达产物与噬菌体衣壳蛋白融合，并在其表面展示，同时将其遗传密码信息整合到个体噬菌体的基因组中[2]。
1.噬菌体展示技术介绍
1.1. 噬菌体
噬菌体(bacteriophage)是感染细菌、真菌、放线菌或螺旋体等微生物的细菌病毒的总称，因部分能引起宿主菌的裂解，故称为噬菌体，因其是以细菌为宿主的一类病毒，又称为细菌病毒。其广泛存在于自然界中，在绝大多数原核生物中都发现了相应的噬菌体。噬菌体是由F.W.Twort(1915年)和F.d.Herlle(1917年)分别发现的[3]。
噬菌体主要由蛋白质外壳和核酸组成，其基因组含有许多个基因，但所有已知的噬菌体都是细菌细胞中利用细菌的核糖体、蛋白质合成时所需的各种因子、各种氨基酸和能量产生系统来实现其自身的生长和增殖。一旦离开了宿主细胞，噬菌体既不能生长，也不能复制。
1.2. 噬菌体展示技术原理
噬菌体展示技术是将外源DNA通过基因工程技术克隆到适当的噬菌体载体上，使外源DNA片段对应的表达产物形成融合蛋白表达在噬菌体颗粒蛋白的表面，被展示的多肽或蛋白可保持相对独立的空间结构和生物活性。然后利用靶分子，采用适当的淘洗①方法洗去非特异结合的噬菌体，最终从噬菌体文库中筛选出能结合靶分子的目的噬菌体[4]。
2.噬菌体展示系统分类
目前，最常用的噬菌体表面展示系统主要有：单链丝状噬菌体展示系统、λ噬菌体展示系统、T4噬菌体展示系统和T7噬菌体展示系统[1]。
2.1. 单链丝状噬菌体表面展示技术
单链丝状噬菌体M13、f1、fd 等是单链DNA病毒[5]。运用于表面展示技术最常见的是M13噬菌体，其利用了M13噬菌体独特的生命周期及其所表达的几个噬菌体蛋白质[6]。
M13在感染大肠杆菌后，新合成的单链噬菌体DNA在穿过内膜时被包装为成熟的噬菌体颗粒。成熟的噬菌体在穿过宿主细胞壁时并不引起宿主细胞的裂解，因此M13噬菌体可被不断地产生，直到对细胞有害的产物大量积累以及细胞本身的废物累积过多而引起细胞死亡为止[6]。
M13不引起细胞裂解是其不同与其他噬菌体的特点。M13噬菌体只能融合较小的外源肽段，携带肽段太大会影响外壳的组装，使其失去感染力。但它的拷贝数多，因此该系统一般用于筛选亲和力较低的配体，其在疫苗开发上具有潜在的应用价值[7]。
2.2. λ噬菌体表面展示技术
λ噬菌体两端为不闭合的线形双链DNA[7]，其为是最早使用的克隆载体，此后它在分子克隆中始终起着重要的作用[6]。λ噬菌体展示系统是将外源肽或蛋白质与λ噬菌体的主要尾部蛋白PV或λ噬菌体头部组装的必需蛋白-D蛋白融合而被展示[8]。
λ噬菌体基因组在溶源性②生长过程中，通过位点专一重组整合入宿主DNA分子中，随宿主细胞DNA复制并转入子代。与丝状噬菌体相比，λ噬菌体是不必通过分泌途径，而是在宿主细胞内组装，可展示有活性的大分子蛋白(100 ku以上蛋白)及对宿主细胞有毒性的蛋白[7]，因此它可展示的肽或蛋白质范围较广[6]。
2.3. T4噬菌体表面展示技术
T4噬菌体的基因组为双链DNA[6]。T4噬菌体展示系统是将外源肽或蛋白质与T4噬菌体的小衣壳蛋白SOC的C端融合而被展示[9]。因此它表达的蛋白不需要复杂的蛋白纯化，避免因纯化引起的蛋白质变性和丢失，故T4可展示各种大小的多肽或蛋白质[5]，但由于其采用的是C端融合，这对研究蛋白质N端的功能不适合，而使它在蛋白质生物研究中的应用受到局限[7]。
①淘选:将展示文库作为流动相，而将与欲选择的重组基因产物有特异性亲和力的靶分子固定在固相载体上，洗去不能与固定相特异结合的组分，将特异结合的组分洗脱，再进一步扩增，进入下一轮淘选。如此反复淘选，即可将无用基因去掉而将有用的基因富集并分离。
②溶源性：温和噬菌体DNA具有整合入宿主菌染色质DNA中的特性，成为与宿主菌共生的原噬菌体，能随宿主菌的染色质同步复制而传给子代，这种特性称为溶源性。溶源菌受到某些条件的诱导(如紫外线照射等)，噬菌体DNA还可以从宿主菌染色质DNA中切出，最终形成噬菌体颗粒而裂解宿主菌。
2.4. T7噬菌体表面展示技术
T7噬菌体独特的10B衣壳蛋白区存在于噬菌体表面，所以被用作噬菌体展示。展示在T7噬菌体表面的多肽或蛋白质不需要通过细胞膜分泌出来，因而其表面展示多肽和蛋白的范围较广[7]。
3.噬菌体展示技术的优点和局限性
3.1. 噬菌体展示技术的优点
噬菌体展示技术具有表面展示技术的基本优点，而且技术发展相对成熟，其最关键的优势在于：第一，淘选的高效率使得在极低的存在水平下，挑选到高亲和力噬菌体成为可能；第二，所挑选到的噬菌体可在微量存在的情况下，通过感染细菌得到富集；第三，展示的多肽或蛋白质与其包含在噬菌体内部的基因密码的链接，使得结合肽或蛋白质的序列分析既快速又简便。该技术最大优点是直接将表达型与其基因型联系在一起，再利用其配体的特异性亲和力，将所感兴趣的蛋白质或多肽挑选出来[2]。由此建立的噬菌体文库的滴度可达到106~1012[6]。它实现了基因型和表型的转换，建立了基因型和表现型之间的对应关系，提供了高效率的筛选系统，因而将会在众多基础和应用研究领域产生深远的影响[2]。
3.2. 噬菌体展示技术的局限性
噬菌体展示技术也存在一定的局限性，由于噬菌体载体自身的限制，使得该展示系统存在着很大缺点，其主要表现在：在噬菌体展示过程中必须经过细菌转化、噬菌体包装，有的展示系统还要经过跨膜分泌过程，这大大限制了所建库的容量和分子多样性；不是所有序列都能在噬菌体中得到良好表达，有些蛋白质功能的实现需要折叠、转运、膜插入和络合，导致在体内筛选时需要外加选择压力；噬菌体展示文库一旦建成，很难再进行有效的体外突变和重组，进而限制了文库中分子遗传的多样性；由于噬菌体展示系统依赖于细胞内基因的表达，故一些对细胞有毒性的分子很难得到有效表达和展示。比如，外源蛋白的插入可能影响噬菌体的装配而失去感染力；多肽或蛋白质与噬菌体外壳蛋白融合表达时存在不可预测的偏差性等[1]，所以而近年来酵母和杆状病毒表面展示系统发展起来的，表明表面展示技术已跨入真核蛋白的行列[1]。
4.噬菌体展示技术的发展和应用
1985年噬菌体展示技术由Smith[10]建立。随着噬菌体展示技术自身建库、筛选方法等方面的进一步改进和完善，目前已被广泛应用于生命科学的许多领域，特别是噬菌体表面展示技术在蛋白质相互作用方面的成功应用，为筛选新的结合蛋白提供了一种简单、有效的手段，还为功能基因组学的研究提供了一个新的方法。噬菌体表面展示技术在许多研究领域一直被寄予厚望，经过20多年的研究和发展，已在抗体和疫苗的研制、医学诊断和治疗、多肽药物的开发、蛋白质相互作用的研究等领域得到了广泛的应用，并显示了良好的应用前景[7]。
4.1. 蛋白质间相互作用研究
在研究蛋白质间相互作用的传统方式是通过理化方法降解或人工方法合成一些抗原肽段来完成的，过程必须先确定蛋白质的氨基酸序列才能合成相应的肽，而在实际研究中许多蛋白质的序列并不清楚。此外，合成肽链仅能模拟蛋白质的线性表位，而不能模拟其全部空间表位，这会使许多构像型表位缺失，所以实践中上述方法存在不足之处[11]。
噬菌体表面展示技术因为可以保持被多肽或蛋白质相对独立的空间结构和生物学活性，
所以微生物表面展示技术在研究蛋白的生物学功能、蛋白间相互作用等方面具有巨大潜力[1]。JohnW. Kehoe等运用丝状噬菌体展示筛选特异识别的scFv片段，为了解酪氨酸硫化在
蛋白质间相互作用上提供了更可行的方法[12]。
4.2. 抗体和疫苗制备
由于噬菌体抗体库能够模拟天然抗体库，得到机体正常状态下不易产生的自身抗体，抗体工程菌比杂交瘤细胞更适应于大规模工业化生产等优势，噬菌体展示技术已被广泛地运用于抗体的制备。如获得了乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、戊型肝炎病毒等肝炎病毒的各种抗原的人源化scFv[13]、抗肝癌抗病毒白介素6(VIL-6)单链抗体MA V[14]、抗HIV-1侵入的抑制因子[15]。
在疫苗的设计方面，由于表达的抗原充分地展示在微生物的表面，所以在免疫递呈方面可能更为有效。与传统的质粒DNA疫苗相比，利用噬菌体展示技术研制基因工程疫苗具有独特的优势：噬菌体传递的DNA疫苗诱生的抗体应答持续时间更长，滴度更高；噬菌体有强的免疫原性，是天然的免疫佐剂；噬菌体疫苗在对核酸酶的稳定性方面的优势明显，而且噬菌体疫苗能够直接靶向抗原提呈细胞，使用比质粒DNA疫苗低得多的剂量就能诱发很好的免疫效果。刘梅等人在苏云金芽孢杆菌表面展示高致病性禽流感的主要保护性抗原-血凝素HA1蛋白，检测证明具有免疫原性[16]。
噬菌体展示技术作为一种新型技术为疫苗和抗体的研制提供了一种简单、安全、有效的方法。
4.3.信息传递研究
利用噬菌体展示多肽库，发现了一些受体，如凝血致活酶、黑皮质素受体、CD80和一个Hantaviral受体；受体的配体，如血管促生素、α-bungarotoxin，和一些大蛋白分子中的折叠区域，如SH2、SH3和WW区域。从多肽库中可分离到天然激素相似的、与受体结合的高亲和力的多肽，因此用完整细胞可以从多肽库中找到受体的高选择性配体。在不知道任何有关的受体和配体信息的情况下，用完整细胞和组织或动物，可筛选到特异与靶组织结合的多肽和蛋白。
4.4. 医学的诊断与治疗
人们利用一些在病毒的噬菌体抗体库上筛选出的抗体作为诊断探针，诊断出了不少病毒，如：丙型肝炎病毒、单纯疱疹病毒、狂犬病病毒、痘苗病毒等[17]。
利用噬菌体展示还可以识别与疾病相关联的蛋白，这些蛋白往往出现在病变的组织或细胞中。如一种特殊蛋白U1-70K，这种蛋白是全身性红斑狼疮病的诊断标志，并发现它的抗原表位可以打破自身抗原的免疫耐受，引起细胞凋亡[18]。
噬菌体表面展示技术同样可以运用到肿瘤的诊断与治疗。肿瘤细胞或肿瘤血管内皮细胞会表达一些正常组织所没有的特异性抗原，利用噬菌体展示文库可以筛选得到这些特异性抗原的模拟表位，从而为肿瘤的进一步研究奠定基础[7]。
4.5. 其他应用
目前噬菌体展示技术的研究进展非常迅速，随着噬菌体表面展示技术的发展，其应用范围也越来越广，除上述提及的几个方面，还有酶制剂制备，多肽药物[7]等，并对这些领域产生了深远的影响。有人将噬菌体展示介导免疫PCR成功地将噬菌体表面展示技术和PCR技术结合起来，提高了检测灵敏度[19]。也有研究者提出将微生物表面展示技术筛选与无机物有识别作用的多肽，这可以使我们进一步理解生物矿化过程[20]。
5.结论
噬菌体展示技术是将外源蛋白或多肽的DNA序列插入到噬菌体外壳蛋白结构基因的适当位置，使外源基因随外壳蛋白的表达而表达，同时,外源蛋白随噬菌体的重新组装而展示到噬菌体表面的生物技术。其最大优点是直接将表达型与其基因型联系在一起，能提供高效率的筛选系统，因而在众多基础和应用研究领域产生深远的影响，应用前景十分广泛。其已在蛋白质相互作用、抗体和疫苗的研制、医学诊断和治疗、酶制剂研制、多肽药物的开发等领域充分应用。近年来，也出现将噬菌体表面展示技术运用于工业与环保，将其与免疫PCR 技术结合等方面研究应用。
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噬菌体的分类
病原微生物名词解释与解答题 噬菌体的分类:毒性噬菌体温和噬菌体 沙门菌肠热证胃肠炎败血症病 毒复制T：吸附穿入脱壳生物合成装配与释放 乙肝颗粒：大小球形颗粒管型颗粒 梅毒分期硬性下疳全身和皮肤黏膜出现梅毒疹皮肤黏膜溃疡性坏死和内脏器官肉芽肿样变（梅毒骝） 细菌的致病性物质:毒素（外神经毒素细胞毒素肠毒素内） 霍乱弧菌致病因子：霍乱肠毒素鞭毛菌毛及其他毒力因子内毒素 细胞壁保护细菌物质交换决定抗原性与致病性染色性药物敏感性有关 真菌培养基沙保弱(G 蛋白胨） 病毒培养法细胞培养鸡胚接种动物接种 AIDS性接触血源性母婴垂直 IMVIC：I吲哚M甲基红VP C枸橼酸盐 病毒自然条件入侵机体呼吸道消化道皮肤黏膜 病毒抗原变异类型抗原漂移抗原性转变 细菌生繁条件水碳源氮源无机盐生长因子（有些）温度：37℃ pH：7.2～7.6 气体：对O2要求(专性需氧菌、微需氧菌、兼专性厌氧菌）对CO2求： 5~10% CO2 渗透压 革兰染色初染媒染脱色复染将细菌涂片标本固定，初染加结晶紫，约一分钟，水洗。滴加碘液媒染，约一分钟，水洗，形成结晶紫—碘复合物，成深紫色。用95 ％酒精脱色，30 秒钟，用水冲净酒精。用稀释复红复染1 分钟，水洗。镜检干燥后，置油镜观察．革兰氏阴性菌呈红色，革兰氏阳性菌呈紫色。 链球菌所致脓疾病：化脓性感染（淋巴管炎淋巴结炎蜂窝组织炎痈等局部皮肤和皮下组织感染）毒素性疾病（猩红热）超敏反应性疾病（风湿病急性肾小球肾炎）
狂犬病：管理传染源（捕杀野犬多犬预防接种对咬过人的猫犬隔离观察7·10发病处死取脑组织检查病毒抗原和內基小体）伤口处理和注射抗体（用3%·5%肥皂水0.1%苯扎溴铵或清水洗再用75%乙醇或碘酒注射高效价抗狂犬病毒血清于伤口周围与底部）预防接种（咬后和接触病毒危险的人及早接种疫苗） 真原核差异：无典型细胞结构核质无核膜核仁仅核糖体DNA RNA 细菌生长曲线分期定义将一定量的细菌接种于合适的培养基和T 过程有规律数目对数纵T横的曲线a迟缓期（最初准备代谢活跃V大储蓄E 中间代谢产物不繁殖1-4h 对数期（最快先短暂的加速期后对数期活细菌快增细菌形态染色性生理活性典型）稳定期（繁殖减慢死活相等活细菌保持稳定典型小改变代谢产物产生）衰退期（更慢死大于活典型大改变生理活动停滞出现衰退形菌体自溶） 内外毒素差异1（来源阳及部分阴分泌于菌体外或菌体自溶阴细胞壁裂解释放）2化学成分（蛋白质脂多糖）3稳定性（不稳定60死160 2-4h死）3抗原性（强产抗毒素经甲醛脱毒成类毒素4毒性作用强选择性毒害较弱引起发热休克DIC） 病毒感染类型隐性感染（无明显症状获得免疫力显性感染感染靶细胞大量增殖造成细胞结构域功能损伤急性感染持续性感染（慢性感染潜伏感染慢病毒感染） 微生物是存在于自然界的一群体形微小、结构简单、肉眼直接看不见，必须借助于光学显微镜或电子显微镜放大数百倍、数千倍，甚至数万倍才能观察到的微小生物 消毒消除和杀灭物体上或环境中的病原微生物及其它有害因子，但不一定能杀死全部非病原微生物的方法 灭菌杀死物体上所有微生物的方法，包括杀死芽胞 无菌操作防治病原微生物进入人体或其他物品上的方法 热原质是细菌合成的一种注入人体或动物体内能引起发热反应的物质，产生它的dad是阴，其细胞壁的脂多糖是热原质 正常菌群正常下人动物体表及呼吸道消化道泌尿生殖道德微生物种类数量稳定与机体平衡 致病菌少数正常菌在条件下致病 病原菌：少数微生物引起人动植物具有致病性
噬菌体简介
噬菌体 一、生物学特性 噬菌体（Phage）属于非细胞型微生物，是侵染细菌、放线菌等细胞型微生物的病毒。它们个体微小，通常仅能在电子显微镜下观察到；结构简单，多数噬菌体仅由蛋白质和核酸两种成分组成，蛋白质构成的衣壳包裹着核酸。在自然界单独存在的噬菌体不表现出生命规象，但具有潜在的生命力。噬菌体从吸附至宿主细胞上的一瞬间，就开始了自己的生命过程。根据噬菌体与宿主的关系，可将其分为烈性噬菌体与温和噬菌体。烈性噬菌体通过吸附、侵人、生物合成、装配与释放等步骤使宿主细胞裂解死亡；而温和噬菌体侵染宿主后，则将其核酸整合在宿主基因组上，并以原噬菌体状态存在，宿主则转为溶原性菌株；但有时也有机率较少的温和噬菌体与烈性噬菌体一样，引起宿主细胞的裂解死亡。温和噬菌体对溶原状态和裂解途径的选择，取决于感染细胞内的一些宿主基因产物和噬菌体基因产物活性之间的平衡。[1] 噬菌体广泛分布于自然界是与其宿主的广泛分布分不开的。迄今为止，几乎没有一群细菌尚未发现其相应的噬菌体，只有那些我们了解的还很肽浅的细菌才尚未见其相应噬菌体的报导。[2] 根据大小、形态结构特征，可以把噬菌体分为3种类型，一是蝌蚪状不可收缩尾的噬菌体，其头部为二十面体，直径约110 -120nm，尾部长220-230 nm,尾宽13-15 nm,无尾鞘、基板、尾丁、尾兹等结构。二是蝌蚪状可收缩尾的噬菌体，其头部为三十面体，约70nm x 110 nm，尾部长约120 -130 nm,尾宽约18-22nm，有尾鞘、基板、尾丁、尾兹等结构，该噬菌体似有包膜。三是短尾噬菌体，其头部为二十面体，大小为20 nm，尾部长约2-3 nm。 [3]
噬菌体制剂的研究现状及发展前景
噬菌体制剂的研究现状及发展前景 作者：赵庆友，朱瑞良* （山东农业大学动物科技学院山东泰安 271018） 来源：中国兽药杂志2010-7期 南宁兽药科技网（南网）https://www.wendangku.net/doc/a36589491.html,上传2010-9-1 摘要：噬菌体制剂是利用噬菌体溶解细胞的特性而用于治疗动物的病原菌的临床感染。早 在20世纪初，噬菌体治疗就取得了积极的治疗效果。目前传统抗生素治疗动物细菌感染时 易产生耐药性，而噬菌体制剂则表现出许多突出的优越性。本文从噬菌体的生物学特性，噬 菌体制剂的作用机制，以及噬菌体制剂的发展状况和应用前景等方面进行了论述。 关键词：噬菌体；制剂；应用；现状；前景。 Recent Advances And Prospects In Bacteriophage Therapy ZHAO Qing-you, ZHU Rui-liang* (College of Animal Science & Veterinary Medicine, Shandong Agricultural University, Tai’an, 271018) Abstract: Phage therapy is to treat bacterial clinical infections of animals with bacteriolysis. In the 1920’s, Phage therapy had had efficiency in clinical treatment. Many creatural experiments and clinical treatments indicate that phage therapy is a potential alternative method for treatment and prevention of bacteria disease. This method comes along, quite opportunely to counter the resistance problem of the antibiotics. From the biological characteristics,the therapy mechanism,the development status and the application prospects, the systemic discussion of bacteriophage in this review. Key words: Bacteriophage ; biological agents; application; current situation; prospects 英国细菌学家和内科医生Frederick Twort 和法裔加拿大细菌学家Flix D’Herelle 分别在1915年和1917年独立发现了噬菌体，不久之后就用来治疗感染性疾病。d`Herelle 最早从来自痢疾的临床样本研究中观察到噬菌体滴度的增加正好伴随着病人的康复过程。他 将噬菌体称为“外源性免疫因子”[1]。1934年美国科学家报道了利用噬菌体疗法治疗肠球菌 感染的成功率可达80%【2】。但随着抗生素的成功推广应用，二次世界大战之后美国和西欧的 大多数国家都终止了噬菌体制剂的研制。近年来细菌耐药性问题不断突现，用抗生素治疗细 菌感染面临巨大的挑战，一些科学家和临床工作者开始重视噬菌体制剂的研制。 1 噬菌体的生物学特征 噬菌体(Bacteriophage, phage)是以细菌为宿主的一类病毒，所以又称为细菌病毒，它
2020年病毒的分类与命名.pdf
病毒的命名过去不够统一，有些病毒是以宿主、病理特点、致病症状、病毒颗粒形态进行命名，有些病毒是以地名和人名进行命名，还有些病毒是以字母和数字命名。病毒的分类系统也不一致，动物病毒分类等级设立科、属、种；而植物病毒分为组、亚组、种。为了力求分类和命名的统一，1992年Martelli首先提出了植物病毒的科、属、种分类原则，1993年8月在英国格拉斯哥召开的第9届国际病毒大会上，国际病毒分类委员会(ICTV)采纳了这一分类原则，并且新设立了一些植物病毒的科、属［1］，1995年在ICTV 所公布的病毒分类和命名第六次报告中，植物病毒分类已不再采用组、亚组，而统一使用科、属、种分类系统［2］。病毒的分类系统也开始逐渐向更高级的分类等级发展，1991年ICTV在病毒分类和命名第五次报告中首次公布了比科更为高级的分类等级，单分子负链RNA病毒目(Mononegavirales)［3］，最近ICTV 又先后增设了套病毒目(Nidovirales)［4］和有尾噬菌体目(Caudovirales)［5］。除此以外，1996年8月ICTV在第10届国际病毒大会上还对原有的病毒分类和命名规则作了进一步的修订，提出了38条新的病毒命名规则［6］。最近据Mayo等报道，ICTV又批准了43条新的病毒分类和命名规则，同时对病毒目、科、属和种名的书写也作了专门的规范［7］。 1 病毒命名规则 1.1 病毒种的定义和命名病毒“种”是指构成一个复制谱系(replicating lineage)、占据一个特定小生境(ecological niche)、具有多个分类特征的病毒。这就是说病毒种的分类和命名不是单纯由某一个分类特征、而是由多原则分类特征决定的，包括病毒的基因组组成，病毒颗粒形态结构、生理生化特性和血清学性质等；而病毒种的一个复制谱系则强调了病毒种的系统进化特性，即现今所有的病毒种可能起源于共同的病毒祖先；病毒种所占有的小生境是指某种病毒的特定生物学特性、地理分布、宿主范围、媒介的嗜亲性、致病机理等［8］。 病毒种的命名由几个有实际意义的词组成，但不是单独以宿主名加“virus”构成，当ICTV下属委员会不能肯定一个新的病毒种的分类地位时，新的病毒种可以作为暂定种列在适宜的属和科中；在不考虑病毒属和科的情况下，病毒种名与病毒株一起，均应有明确的含义；如果数字和字母已经用于某一特定病毒种的命名，其数字、字母或其组合可作为病毒种的形容词，现在已知的细菌病毒种名就是由数字和字母组成的，这些细菌病毒通常没有太大的表型上的差异，而且感染相同或相似的宿主；植物病毒种的命名，一般是由宿主名加症状名和“virus”构成。 1.2 病毒属的命名病毒属是一群具有某些共同特征的种。其属名的词尾为“virus”，但在设立一个新的病毒属时必需有一个同时被承认的代表种(type species)。 1.3 病毒科的命名病毒科是一群具有某些共同特征的属。科名的词尾为“viridae”，“科”下面可以设立或不设立亚科。亚科名的词尾为“virinae”。
噬菌体展示总结技术
噬菌体展示总结技术 各位读友大家好，此文档由网络收集而来，欢迎您下载，谢谢篇一：噬菌体展示技术 噬菌体展示技术 关键词：噬菌体展示组装融合蛋白2008-07-21 00:00 来源：互联网点击次数：3662 噬菌体展示技术是将外源蛋白或多肽的DNA序列插入到噬菌体外壳蛋白结构基因的适当位置，使外源基因随外壳蛋白的表达而表达，同时,外源蛋白随噬菌体的重新组装而展示到噬菌体表面的生物技术。到目前为止，人们已开发出了单链丝状噬菌体展示系统、λ噬菌体展示系统、T4噬菌体展示系统等数种噬菌体展示系统。本文主要概述了噬菌体展示技术的基本原理、噬菌体展示系统研究以及技术特点等，并跟踪了目前该领域的最新研究进展和发展前景。 关键词：噬菌体展示；组装；融和
蛋白 1985年，Smith G P[1]第一次将外源基因插入丝状噬菌体f1的基因Ⅲ，使目的基因编码的多肽以融合蛋白的形式展示在噬菌体表面，从而创建了噬菌体展示技术。该技术的主要特点是将特定分子的基因型和表型统一在同一病毒颗粒内，即在噬菌体表面展示特定蛋白质，而在噬菌体核心DNA中则含有该蛋白的结构基因。 另外，这项技术把基因表达产物与亲和筛选结合起来，可以利用适当的靶蛋白将目的蛋白或多肽挑选出来。近年来，随着噬菌体展示技术的日益完善，该技术在众多基础和应用研究领域产生的影响已日渐明显。 一、噬菌体展示技术的原理 噬菌体展示技术是将多肽或蛋白质的编码基因或目的基因片段克隆入噬菌体外壳蛋白结构基因的适当位置，在阅读框正确且不影响其他外壳蛋白正常功能的情况下，使外源多肽或蛋白与外壳
蛋白融合表达，融合蛋白随子代噬菌体的重新组装而展示在噬菌体表面。思想汇报专题被展示的多肽或蛋白可以保持相对独立的空间结构和生物活性，以利于靶分子的识别和结合。肽库与固相上的靶蛋白分子经过一定时间孵育后，洗去未结合的游离噬菌体，然后以竞争受体或酸洗脱下与靶分子结合吸附的噬菌体，洗脱的噬菌体感染宿主细胞后经繁殖扩增，进行下一轮洗脱，经过3轮～5轮的“吸附-洗脱-扩增”后，与靶分子特异结合的噬菌体得到高度富集 [2]。所得的噬菌体制剂可用来做进一步富集有期望结合特性的目标噬菌体。 二、噬菌体展示系统 单链丝状噬菌体展示系统 （1）PⅢ展示系统。 丝状噬菌体是单链DNA病毒，PⅢ是病毒的次要外壳蛋白，位于病毒颗粒的尾端，是噬菌体感染大肠埃希菌所必须的。每个病毒颗粒都有3个～5个拷贝
乳杆菌噬菌体的分离鉴定及生物学特性分析
乳杆菌噬菌体的分离鉴定及生物学特性分析乳杆菌作为公认的安全级微生物,具有促消化、抗菌、增强免疫力等多种益生功能,广泛应用于食品工业、医药工程和畜牧业,其中植物乳杆菌、干酪乳杆菌和戊糖乳杆菌较为常用。在发酵工程中,噬菌体的污染可造成不可忽视的后果,严重影响产品品质,甚至导致发酵失败。 本研究通过噬菌体富集法从酸菜中分离出两株烈性乳杆菌噬菌体,分别命名为LpeD和Lpa804,并对这两株噬菌体进行了生物学特性的鉴定。通过电镜观察,噬菌体LpeD和Lpa804均具有典型的二十面体头部和非收缩性尾部,均属于尾噬菌体目、长尾噬菌体科。 根据宿主范围测定结果,噬菌体Lpa804可感染植物乳杆菌(L.plantarum PA106和L.plantarum SC),而噬菌体LpeD可感染戊糖乳杆菌(L.pentosus KLDS1.0413)和植物乳杆菌(L.plantarumKLDSl.0344)。一步生长曲线的测定结果显示,噬菌体LpeD的潜伏期为15min,裂解期为90min,裂解量为194PFU/cell;噬菌体Lpa804的潜伏期为30min,裂解期为105 min,裂解量为221 PFU/cell。 理化因素对噬菌体的影响结果表明,噬菌体LpeD和Lpa804均对热敏感,LpeD 在56℃作用2 min全部失活,Lpa804在63℃作用2 min全部失活。噬菌体LpeD 和Lpa804在pH 4-12的环境中较为稳定,显示了较强的酸碱耐受性。 紫外线照射并不能使噬菌体LpeD和Lpa804完全灭活,二者在紫外线照射20 min后均仍有部分噬菌体颗粒存活。噬菌体LpeD和Lpa804对乙醇和异丙醇较敏感,35%乙醇作用10 min可使LpeD全部失活,25%乙醇作用10 min可使Lpa804 全部失活。 35%异丙醇作用10 min可使LpeD全部失活,25%异丙醇作用10 min可使
噬菌体抗体淘筛方法
这两个文库来自于单个人的V H和Vκ的基本结构，具有和那些已知结构的抗原结合位点的侧链多样性，并且在成熟的体系中中具有很高的多样性。由这个框架来编码的标准结构是目前人抗体技术体系中最普通的。在能够形成抗原结合表面的前提下重链的CDR3设计的尽可能短。这两个文库都可以在未知筛选的克隆的序列的情况下进行筛选和免疫亲和力成熟。这两个文库是噬菌粒/单链片段可变区格式的，并且都经过与蛋白A和蛋白L的结合筛选，所以未筛选的克隆的大多数都是具有功能的。 TomlinsonI构建在plT2载体（(HIS myc 标签），多样化的侧链主要是来自于原始体系中多样性的位点（一共18个残基，H50, H52, H52a, H53, H55, H56, H58, H95, H96, H97, H98, L50, L53, L91, L92, L93, L94 and L96）此文库经过筛选后与体细胞突变的多样性的共同作用使其成熟。 我们保证上述信息在没有另外通知之前是严格可信的。 使用此文库之前请认真阅读以下材料 确认收到以上材料 2. 确认收到的文库未溶解，且使用之前-70摄氏度保存。 3. 参照方案G制备KM13 4. 在使用文库前清仔细阅读这个方案：在含有100 μg/ml氨苄青霉素和1 %葡萄糖的TYE平板上将对 照划线培养，置于培养箱37℃过夜培养，挑单菌落置于摇床，接种在5ml含有100 μg/ml氨苄青霉素和1 %葡萄糖的2倍TY培养基内，37℃过夜培养。分别制备阳性和阴性的噬菌体对照（第一天到第十天过夜用500微升）。用阳性对照和阴性对照产生的噬菌体按照1：100的比例混合，进行一轮的筛选，用100 μg/ml的遍在蛋白在PBS中包被。通过单克隆噬菌体ELISA检验遍在蛋白的富集程度（经过第一轮筛选后应该超过50%） 5. 尽可能的用专用的移液管和一次性的手套，由于噬菌体会非特异的吸附到其他的塑料上，建议使用 聚丙烯管。 6. 为提高感染效率，大肠杆菌应该在37℃培养至对数生长期（600nm的OD值应该在0.4） (1)、从一个小型的培养板上转移一个细菌克隆至5ml的2倍TY培养基（不加抗生素和葡萄糖），37℃ 震荡过夜培养 (2)、次日稀释100倍至新鲜的2倍TY培养基内，震荡培养至培养至对数生长期600nm的OD值应该在 0.4。（1.5-2小时） 7. 所有的离心，除了在微型离心机中操作的之外，都是在4℃下进行。 8.两个文库最好是同时使用，以保证筛选得到最多的抗原结合克隆。 In advance 准备好用到的仪器和试剂（详见方案后注解），确保有足够的用于细菌增殖的培养基（大的生物分析的培养皿在使用前进行灭菌和干燥处理） 在实验之前仔细阅读这个方案，以便安排你的时间同时进行操作 Steps Procedure Day 1 (5 hrs) A1-A6 Grow libraries I and J and make phage B1-B3 Make secondary stock of libraries 第一天A1-A6 增殖文库I和J，并且制备噬菌体 B1和B3 制作文库的第二原种 Day 2 (6 hrs) A7-A12 Grow libraries I and J and make phage (cont.)
第四章 噬菌体
一、选择题 A 型题 1. C 2.B 3.C 4.D 5.A 6.B 7.C 8.D X 型题 1.ABCD 2.BCE 3.ABCDE 二、填空题 1.DNA 基因 2.毒性温和 3.复制吸附穿入生物合成成熟与释放 三、名词解释 1.噬菌体是一类侵袭细菌、真菌或其他微生物的病毒。根据噬菌体侵入细胞后，是否增值并裂解细菌，可分为毒性噬菌体和温和噬菌体。 2.毒性噬菌体是能在敏感菌中增值并能使之裂解的噬菌体。 3.温和噬菌体是指感染细菌后可将其基因组与宿主菌染色体整合，不增值产生子代噬菌体，但随细菌DNA的复制而复制，也不裂解细菌。 4.前噬菌体是指整合在细菌染色体上的噬菌体基因组。 5.溶源性细菌是带有前噬菌体的细菌。 四、问答题 1. 噬菌体是一类侵袭细菌、真菌、放线菌、支原体、螺旋体等微生物的病毒，属于肺细胞型微生物。具有以下这些主要的生物学特性。 （1）体积微小，可以通过细菌滤器;结构简单，没有完整的细胞结构，仅由核酸（DNA或RNA)和蛋白质组成。 （2）是一种专性活细胞内寄生的微生物。 （3）以复制方式进行增值。 （4）有严格的宿主特异性，只寄居在易感宿主菌体内。 2. 根据与宿主菌的相互关系，可将噬菌体分成两种类型：毒性噬菌体和温和噬菌体。前者能在宿主菌细胞内复制增值，产生许多子代噬菌体，并最终裂解细菌；后者感染宿主菌后，将其基因组整合于宿主菌中，随细菌基因组的复制而复制，并随细菌的分裂将噬菌体基因传给子代细菌，在细菌体内不产生子代噬菌体，不引起宿主菌的裂解。整合在细菌基因组中的噬菌体成为前噬菌体。带有前噬菌体的细菌成为溶源性细菌。
毒性噬菌体的细菌作用具有高度的的特性，即一种噬菌体只能裂解一种和它相应的菌，故可用于未知细菌的鉴定于分型，这对流行病学的调查、追查传染源等具有重要的意义。 某些前噬菌体可导致溶源性细菌的基因型和性状发生改变，这称为溶源性转换。许多细菌毒素产生、抗原结构和血清型别都与溶源性转换有关。此外，温和噬菌体还是遗传物质转运的工具。 第4章噬菌体
人源性天然噬菌体展示库的构建
人源性天然噬菌体展示文库的构建及鉴定 年四季黄黎王栩邬于川袁青(四川省泸州医学院基础医学院,泸州646000) 中国图书分类号R392. 11 文献标识码A 文章编号1000 484X( 2010) 06 0544 04 [摘要] 目的:构建人源性天然噬菌体展示文库并对文库进行鉴定。方法: 从未经主动免疫健康志愿者的外周血淋巴 细胞中提取总RNA, 反转录合成cDNA, 用直接PCR 及半巢式PCR 扩增人抗体重链( VH)及轻链( V 和V ) 可变区基因。采用改 进的重叠延伸PCR 法将VH 基因和VL( V 和V) 基因连接成人单链抗体( scFv) 基因, 并将scFv 文库基因克隆到噬菌体载体 pCANTAB5E中, 电转化E . coli TG1, 构建单链抗体文库。结果: 采用直接PCR 和半巢式PCR 扩增得到42 条VH 基因片段, 16 条V 基因片段, 18条V基因片段。混合的VH 和VL 等摩尔比连接后, 产生的单链抗体文库基因大小为750 bp 左右; 转化后构 建了文库容量为1. 35 108 的单链抗体文库。BstN !酶切分析文库中的单链抗体基因结果显示,酶切得到的scFv 指纹图谱均 不相同。结论:构建的抗体文库多样性好, 可用于多种人源性单链抗体的筛选。 [关键词] 单链抗体;噬菌体抗体文库; 重叠延伸PCR Construction and identification of nonimmunized human phage display library NIAN Si Ji , HU ANG Li , WANG Xu , WU Y uChuan, YU AN Qing. School o f BasicMedical Sciences, Luzhou Medical Col lege, Luzhou 646000, China [Abstract] Objective:To develop non immunized human phage display library.Methods:The total RNA of lymphocyte cells from pe ripheral blood of healthy voluntee was isolated and cDNA was synthesized, and the genes of heavy variable chain ( VH) and light variable chain ( V and V ) were amplified by direct PCR and half nested PCR. By overlapping extension PCR, the genes of VH and VL( V and V) were linked. The linked genes of single chain Fv fragment ( scFv) were ligated with the vector pCANTAB 5E and then cloned into TG1 for the scFv library construction. Results:By direct PCR and half nested PCR, 42 VH fragments, 16 V and 18 Vfragmen ts were obtained. The size of linked scFv library genes was 750 bp and the volume of constructed scFv library was 1. 35 10 8 . The results of BstN ! analysis of scFv genes from the phage library showed that fingerprint map of the selected scFvs was different. Conclusion:The developed phage library is diversity and can be used for selecting humanized scFv. [Key words] Sin gle chain Fv fragment; Phage antibod y library; Overlapping extension PCR 目前单克隆抗体( mAb) 作为治疗性抗体发展 迅速,主要用于免疫治疗肿瘤、免疫性疾病、器官移 植、感染性疾病及心血管疾病等。但单克隆抗体的 临床应用仍然受到一定的限制, 主要障碍是诱导产 生的人抗鼠抗体( HAHA) 反应、肿瘤渗入量低及半
第八讲 单链噬菌体载体及噬菌粒载体
第八讲单链噬菌体载体及噬菌粒载体 吴乃虎 中国科学院遗传与发育生物学研究所
第八讲单链噬菌体载体及噬菌粒载体 一、单链噬菌体的一般生物学 1．单链噬菌体的优越性 2．M13噬菌体的生物学特性 二、M13克隆体系 1．M13克隆体系 2．M13克隆体系 -半乳糖苷酶的显色反应原理 3．M13载体系列的发展 4．M13载体系列的优点 三、噬菌体展示载体 1．噬菌体展示载体的构建原理 2．噬菌体展示载体 3．噬菌体表面展示文库 4．应用噬菌体展示载体分离有关蛋白质的实例 四、噬菌粒载体
1．M13噬菌体载体克隆的若干难点2．噬菌粒 3．若干常用的噬菌粒载体4．pBluescript噬菌粒载体5．pUC118和pUC119噬菌粒载体
第八讲单链噬菌体载体 一、单链噬菌体一般生物学 大肠杆菌丝状单链DNA噬菌体有M13噬菌体、f1噬菌体及fd 噬菌体，它们均含有分子量约为6400个核苷酸的单链闭环DNA分子。 1．单链DNA phage的优越性 A．具有双链的复制型DNA(RF DNA)，可如质粒质粒一样进行遗传操作；RF DNA：Replication Form DNA。 B．RF DNA和ssDNA均可感染感受态的寄主细胞——形成phaque或colony。 C．不受包装的限制。因为单链DNA phage的大小是受其DNA 多寡制约的。 D．可容易地测出外源DNA的插入取向。 E．可产生大量的含有外源DNA的单链DNA分子，这种单链DNA分子有如下用途(作为模板)： *1用作双脱氧链终止法进行DNA测序
*2制备单链的放射性标记的杂交用DNA探针 *3利用寡核苷酸进行定点突变 2．M13 phage的生物学特性 A．M13 phage同f1 phage亲缘关系十分密切，例如： ①基因组组织形式相同； ②病毒颗粒大小、形状相近； ③DNA同源性高达98%以上。 B．在M13 phage颗粒中只有(+)链DNA，感染具F性须的大肠杆菌菌株，因此M13噬菌体是雄性E.coli特有的；M13噬菌体的(+)链DNA，又称为感染性单链DNA。 C．复制型双链DNA(RF DNA=Replication Form DNA) 感染过程：当感染的M13 phage颗粒穿过性须时，其外层主要 衣壳蛋白质脱落，M13 DNA及附着其上的Gene Ⅲ 蛋白进E.coli细胞内， ↓ 感染性单链DNA(正链DNA)在细菌胞内酶的作用 下转变为双链DNA，称复制型DNA。通过 结构进 行几轮复制。
第4章 噬菌体(习题)
第4章噬菌体 一、选择题 A型题 1．用来测量噬菌体大小的单位是: A.cm B.mm C.μm D. dm E. nm 2．下列微生物中，不受噬菌体侵袭的是: A．真菌B．细菌C．支原体D．立克次体E．螺旋体 3．关于噬菌体的叙述，下列哪项是正确的? A．可用细菌滤器除去B．对理化因素的抵抗力比一般细菌弱 C．具有严格的宿主特异性D．含DNA和RNA E．能在无生命的人工培养基上生长 4. 噬菌体的本质是： A.细菌 B.病毒 C.支原体 D.衣原体 E.立克次体 5. 能与宿主菌染色体整合的噬菌体基因组称: A. 前噬菌体 B.溶原性噬菌体 C.温和噬菌体 D.毒性噬菌体 E.以上都不是 6. 既有溶原期又有裂解期的噬菌体是: A.毒性噬菌体 B. 温和噬菌体 C. 前噬菌体 D. β噬菌体 E. λ噬菌体 7.噬菌体感染的特异性取决于: A. 其核酸组成与宿主菌是否相符B．噬菌体的形态 C．噬菌体蛋白与宿主菌表面受体分子结构的互补性D．细菌的种类E．噬菌体的核酸类型 8．毒性噬菌体感染细菌后导致细菌: A．快速繁殖B．停止繁殖C．基因突变D．裂解E．产生毒素 X型题 1．噬菌体的特点是: A.非细胞型微生物 B.严格活细胞内寄生 C.以细菌、真菌、螺旋体及放线菌等为宿主
D.可通过滤菌器 E.对人致病 2．下列细菌中，产生毒素与噬菌体有关的是: A．大肠杆菌B．白喉棒状杆菌C．金黄色葡萄球菌 D．破伤风梭菌E．肉毒梭菌 3．噬菌体的应用包括: A．分子生物学研究的重要工具B．细菌的鉴定和分型 C．检测标本中的未知细菌D．用于治疗某些局部感染性疾病 E．用于追踪传染源 二、填空题 1．噬菌体可以作为的载体，把某些带到宿主细胞中与DNA整合，引起后者发生变异。 2．根据噬菌体侵人菌细胞后，是否增殖并裂解细菌，可以分为噬菌体和噬菌体。 3．毒性噬菌体以方式进行增殖，增殖过程包括、、和4个阶段。 三、名词解释 1．噬菌体（bacteriophage，phage) 2．毒性噬菌体(virulent phage) 3．温和噬菌体(temperate phage) 4．前噬菌体(prophage) 5．溶原性细菌(lysogenic bacterium) 四、问答题 1.简述噬菌体的主要生物学特性。 2.噬菌体与宿主菌的相互关系怎样?各有何医学意义?
噬菌体治疗细菌性疾病的研究进展
《专业外语》课程论文
噬菌体治疗细菌性疾病的研究进展 摘要噬菌体在被发现之初已经被尝试用于治疗细菌性疾病，后来由于抗生素的出现使之渐渐淡化出人们的眼球，但是对于现今很多细菌都对抗生素有很强的耐药性甚至出现了具有多重耐药性的超级细菌，使得重新重视起噬菌体治疗细菌性疾病的作用。本文主要综述了噬菌体对于治疗细菌性疾病的早期研究和最新进展。 关键词噬菌体裂解酶细菌性疾病 细菌性感染是感染性疾病中比较常见的类型，如果缺乏及时有效的治疗，严重的话可以导致很高死亡率[1]。例如每年由弯曲杆菌、沙门氏菌、O157大肠杆菌和单核细胞增多利斯特菌引起的食源性疾病就给人类带来巨大的经济损失和生命威胁。 在19世纪初Herelle发现噬菌体（bacteriophage，phage）[2,3]后，人们就曾经尝试采用噬菌体治疗细菌感染。但自抗生素的出现后人们就渐渐的淡化噬菌体的研究而大量的进行有关抗生素的研究，进而大量使用抗生素作为治疗细菌感染的有效途径，在前期抗生素的确有非常好的治疗效果，然而随着抗生素使用的泛滥，细菌的耐药性问题日益加剧，新抗生素研发的速度远远低于耐药菌产生的速度。由于新型抗生素的发现越来越困难，噬菌体治疗重新得到人们的重视，并且取得了一些不错的研究成果。 1 噬菌体及裂解酶的概况 噬菌体( Bacteriophage，简称phage)又叫细菌病毒，是一种可以侵入细菌细胞内，通过酶的用破坏细胞壁，使细菌裂解从而将其杀灭的病毒。噬菌体分为烈性噬菌体和温和性噬菌体，前者可在敏感宿主菌内增殖并使之裂解，亦称为毒性噬菌体（virulent phage）。 噬菌体裂解酶( Lysin或Endolysin)是双链DNA噬菌体所特有的、在病毒复制晚期合成的一类胞壁质水解酶。多数噬菌体具有编码3种细胞壁水解酶的基因，分别为裂解酶、酰胺酶和内肽酶，其中酰胺酶是国内外研究比较多的一种裂解酶。裂解酶的高亲和性与种属特异性的细胞壁糖基有关，而后者常常是细菌存活的必要成分。因此，细菌很难产生对裂解酶的抗性。 2 噬菌体的研究历史回顾 人们曾尝试用噬菌体治疗痢疾、手术伤口的皮肤感染,采用口服、局部外用、滴眼耳鼻等多种给药途径，治疗效果较好[4]。Bruynoghe和Maisin于1921年率先用噬菌体制剂治疗皮肤葡萄球菌感染[5]。1934年美国科学家就报道了噬菌体疗法抗肠球菌感染的成功率可达80%。近期各国研究者进行的动物试验及临床应用结果表明, 噬菌体治疗的效果是值得肯定的并且其效果受使用剂量和用药时间的限制较小。Smith等[6]用噬菌体治疗感染了大肠埃希氏菌的小鼠模型,结果发现给予1次后，小鼠体内的大肠埃希氏菌数量即下降，小鼠全部存活下来。在随后的研究，Smith发现利用专一性噬菌体可治疗由大肠埃希氏菌引起的猪、牛和羊的腹泻，所有经噬菌体治疗的动物都存活下来。所以噬菌体不失为一种安全性和治疗性都较好的药物。2002年, Bisw as采用耐万古霉素的肠道球菌对老鼠进行感染, 45m in后腹腔内注射一定剂量的噬菌体。保护力达到100%。即使在老鼠处于濒死状态的时候才注射噬菌体, 其保护力仍有50%。而没有进行噬菌体治疗的老鼠48h后几乎全部死亡。Bull等[7] 也证明, 即使是在小鼠感染后8h才使用噬菌体对其治疗仍不影响治愈率, 但使用抗生素治疗的小鼠成活率却大大降低。同时，大量的人体试验也证明了噬菌体治疗的安全性。2005年，
M13 kO7 Help phage
辅助噬菌体株的制备 M13K07辅助噬菌体由M13衍生而来，gII上带有Met40IIe突变，并在M13复制起始点处插入有P15A复制起始点和来自Tn903的卡那霉素抗性基因Kana R。M13K07能在噬菌粒DNA缺失时复制，当野生型M13或f1复制起点存在时，单链噬菌体被优先包装并分泌到培养基中，从而容易获得用于诱发突变或测序的单链噬菌粒DNA。 保存条件 1X PBS和50%甘油。-20°C保存。 辅助噬菌体株的制备 准备： 1. 需要3 ml新鲜辅助噬菌体株（109 pfu/ml）来完成噬菌体展示文库的筛选实验。 2. 从辅助噬菌体工作储备板上用黄色灭菌枪头挑一个单个分散的含辅助噬菌体噬菌斑的琼脂块，接种到3～4 ml处于对数期的TG1培养物中，37℃摇床培养2 h。转接到250 ml 2×YT培养基液体培养基(1L摇瓶)中，继续培养1h，然后加入50 mg/ml卡那霉素水溶液，至终浓度50～70 ug/ml，继续培养8～16 h或过夜。注：时间少于1个月的新鲜噬菌斑才可以保证实验结果。 3. 将过夜的250 mL细菌培养物，3300X g离心30 min。 4. 用PEG沉淀噬菌体颗粒：加入1/5体积(100ml)的20 % PEG / 2.5 M NaCl，充分混匀，冰浴30～60 min。 5. (Optional)10800 X g离心10min，弃上清，沉淀重新悬浮于30 mL水和6 mL PEG / NaCl 中，冰浴30～60 min。 6. 10800 X g离心10min，弃上清，沉淀重新悬浮于10 mL LB中，11600 X g离心10min，去除沉淀。 7. 将上清转入一新标记好的管子，0.45um膜过滤除菌。存于4度（最长1年）。 8. 测定M13KO7辅助噬菌体株的滴度。注：含单链质粒DNA的颗粒滴度通常每ml细菌培养物大于5X1010pfu。在M13KO7扩增的过程中，对丢失p15A和Tn903转座子的噬菌体基因组有选择作用。因此不要连续传代噬菌体。用直接从单个噬菌斑来源的M13KO7株来进行后续的超感染实验。
肠出血性大肠埃希菌O157噬菌体的生物学特性
［文章编号］ １６７１－５８７Ⅹ（２０１２）０１－００７９－ ０５［收稿日期］ ２０１１－０７－ １３［基金项目］ 吉林省计划经济委员会科研基金资助课题（２００９ ６３３）［作者简介］ 刘 悦（１９７８－）女，吉林省四平市人，在读医学硕士，主要从事噬菌体的生物学研究。［通信作者］ 孙延波（Ｔｅｌ：０４３１－８５６１９５７４，Ｅ－ｍａｉｌ：ｓｕｎｙｂ＠ｊｌｕ．ｅｄｕ．ｃｎ）肠出血性大肠埃希菌Ｏ１５７噬菌体的生物学特性 刘 悦１，李菁华１，史红艳１，温剑平２，孙延波１ （１．吉林大学白求恩医学院病原生物学系，吉林长春１３００２１； ２．吉林大学白求恩医学院分子生物学系，吉林长春１３００２１ ）［摘 要］ 目的：分离并鉴定肠出血性大肠埃希菌Ｏ１５７噬菌体，对其生物学特性进行研究，为开发抗肠出血性大肠埃希菌Ｏ１５７的生物制剂提供实验依据。方法：以肠出血性大肠埃希菌Ｏ１５７为宿主菌，采用噬斑法从环境污水中分离出针对肠出血性大肠埃希菌Ｏ１５７的噬菌体。噬菌体经超滤浓缩后，电镜观察其大小和形态；将宿主菌和噬菌体以不同的比例混合，测定噬菌体的最佳感染复数并观察其一步生长曲线；利用ＳＤＳ－Ｐ ＡＧＥ分析噬菌体的结构蛋白和非结构蛋白；提取噬菌体基因组，进行酶切电泳分析。结果：电镜显示噬菌体的头部呈球形、直径４０ｎｍ，噬菌体的尾部长约８０ｎｍ。噬菌体的最佳感染复数为１０－２，即当宿主菌和噬菌体之间的比例为 １∶１００时裂解效率最高。一步生长曲线示噬菌体在裂解宿主菌时，潜伏期约为１０ｍｉｎ，爆发期约为３０ｍｉｎ ，裂解量为１３０。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ凝胶电泳呈现１３种蛋白，相对分子质量为１６ ０００～２２ ０００。琼脂糖凝胶电泳显示噬菌体基因组大小约２３ ０００ｂｐ 。结论：成功分离并鉴定一株针对肠出血性大肠埃希菌Ｏ１５７的噬菌体，是一种裂解性强、特异性高的毒性噬菌体，肠出血性大肠埃希菌Ｏ１５７噬菌体属于有尾病毒目，管尾噬菌体科。 ［关键词］ 肠出血性大肠杆菌Ｏ１５７；噬菌体；最佳感染复数 ［中图分类号］ Ｒ３４２ ［ 文献标志码］ ＡＢｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ ｏｆ ｅｎｔｅｒｏｈｅｍｏｒｒｈａｇ ｉｃ Ｅ．ｃｏｌｉＯ１５７－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅｓ ｉｓｏｌａｔｅｄ ｆｒｏｍ ｒａｗ ｓｅｗａｇ ｅＬＩＵ Ｙｕｅ１，ＬＩ Ｊｉｎｇ－ｈｕａ１，ＳＨＩ Ｈｏｎｇ－ｙａｎ１，ＷＥＮ Ｊｉａｎ－ｐｉｎｇ２，Ｓ ＵＮ Ｙａｎ－ｂｏ１（１．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｐａｔｈｏｇｅｎｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｎｏｒｍａｎ Ｂｅｔｈｕｎｅ Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｊｉｌｉｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ，Ｃｈａｎｇｃｈｕｎ １３００２１，Ｃｈｉｎａ；２．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｎｏｒｍａｎ Ｂｅｔｈｕｎｅ Ｃｏｌｌｅｇ ｅ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｊｉｌｉｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｃｈａｎｇ ｃｈｕｎ １３００２１，Ｃｈｉｎａ）Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｏｂｊ ｅｃｔｉｖｅ Ｔｏ ｉｓｏｌａｔｅ ｅｎｔｅｒｏｈｅｍｏｒｒｈａｇｉｃ Ｅ．ｃｏｌｉ Ｏ１５７ｐｈａｇｅｓ ｆｒｏｍ ｒａｗ ｓｅｗａｇｅ ａｎｄ ｔｏ ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅ ｔｈｅｂｉｏｌｏｇ ｉｃａｌ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ ｏｆ ｉｓｏｌａｔｅｄ ｐｈａｇｅｓ ａｎｄ ｔｏ ｐｒｏｖｉｄｅ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ｂａｓｉｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ａ ｂｉｏｌｏｇｉｃ ａｇｅｎｔａｇａｉｎｓｔ ｅｎｔｅｒｏｈｅｍｏｒｒｈａｇｉｃ Ｅ．ｃｏｌｉ Ｏ１５７．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅｓ ｗｅｒｅ ｉｓｏｌａｔｅｄ ｆｒｏｍ ｒａｗ ｓｅｗａｇ ｅ ａｎｄ ｗｅｒｅｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ ｂｙ ｐｌａｑｕｅ ｍｅｔｈｏｄｓ ｕｓｉｎｇ ｅｎｔｅｒｏｈｅｍｏｒｒｈａｇｉｃ Ｅ．ｃｏｌｉ Ｏ１５７ａｓ ｈｏｓｔ ｃｅｌｌｓ．Ａｆｔｅｒ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｈａｇｅｓ ｗｉｔｈｕｌｔｒａｆｉｔｒａｔｉｏｎ，ｔｈｅ ｓｉｚｅ ａｎｄ ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ ｏｆ ｐｈａｇｅｓ ｗｅｒｅ ｅｘａｍｉｎｅｄ ｂｙ ｅｌｅｃｔｒｏｎ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ，ａｎｄ ｔｈｅ ｍｕｌｔｉｐｌｉｃｉｔｙ ｏｆｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｇｒｏｗｔｈ ｃｕｒｖｅ ｏｆ ｐｈａｇｅｓ ｗｅｒｅ ｃａｒｒｉｅｄ ｏｕｔ ｂｙ ｍｅａｎ ｏｆ ｈｏｓｔ ｂａｃｔｅｒｉａ ａｎｄ ｐｈａｇｅｓ ｍｉｘｔｕｒｅ ｉｎ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｐｏｒｔｉｏｎｓ．Ｔｈｅ ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ａｎｄ ｎｏｎｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ ｐｈａｇｅｓ ｗｅｒｅ ａｎａｌｙｚｅｄ ｂｙ ＳＤＳ－ＰＡＧＥ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ．Ｔｈｅｅｘｔｒａｃｔｅｄ ｇｅｎｏｍｅｓ ｏｆ ｐｈａｇｅｓ ｗｅｒｅ ｄｉｇｅｓｔｅｄ ｗｉｔｈ ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ ｅｎｚｙｍｅｓ．Ｒｅｓｕｌｔｓ Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｏｆ ｅｌｅｃｔｒｏｎ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐ ｅｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｈｅａｄ ｏｆ ｐｈａｇｅｓ ｅｘｈｉｂｉｔｅｄ ａ ｓｐｈｅｒｉｃａｌ ｆｏｒｍ，４０ｎｍ ｉｎ ｄｉａｍｅｔｅｒ ａｎｄ ｔｈｅｓｅ ｐｈａｇ ｅｓ ｈａｄ ａ ｔａｉｌ，ａｂｏｕｔ８０ｎｍ ｉｎ ｌｅｎｇｔｈ．Ｔｈｅ ｍｕｌｔｉｐｌｉｃｉｔｙ ｏｆ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｐｈａｇｅｓ ｗａｓ １０－２，ｔｈａｔ ｗａｓ，ｗｈｅｎ ｔｈｅ ｒａｔｉｏ ｏｆ ｈｏｓｔ ｂａｃｔｅｒｉａ ｔｏｐｈａｇｅｓ ｂｅｉｎｇ １∶１００，ｔｈｅ ｍｏｓｔ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｌｙｓｉｓ．Ｔｈｅ ｇｒｏｗｔｈ ｃｕｒｖｅ ｏｆ ｐｈａｇｅｓ ｒｅｖｅａｌｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｉｎｃｕｂａｔｉｏｎ ｗａｓ １０ｍｉｎ，ｔｈｅ ｏｕｔｂｒｅａｋ ｏｆ ｔｈｅ ｔｉｍｅ ｗａｓ ３０ｍｉｎ ａｎｄ ｔｈｅ ｌｙｓｉｓ ａｍｏｕｎｔ ｗａｓ １３０．ＳＤＳ－ＰＡＧＥ ａｎａｌｙ ｓｉｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ １３ｋｉｎｄｓ ｏｆ９ ７第３８卷 第１期 ２０１２年１月吉 林 大 学 学 报 （医 学 版）Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｊｉｌｉｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（Ｍｅｄｉｃｉｎｅ Ｅｄｉｔｉｏｎ）Ｖｏｌ．３８Ｎｏ．１ Ｊａｎ．２０１２