结合态淀粉合成酶(Granule-bound starch synthase,GBSS)试剂盒说明书

货号：QS3405-25 规格：25管/24样

结合态淀粉合成酶

（Granule-bound starch synthase，GBSS）试剂盒说明书

紫外分光光度法

正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定

测定意义：

GBSS（EC 2.4.1.21）以束缚态存在于淀粉体中，催化淀粉链的加长反应，主要负责直链淀粉的合成。

测定原理：

GBSS催化ADPG与淀粉引物(葡聚糖)反应,将葡萄糖分子转移到淀粉引物上，同时生成ADP；进一步通过反应体系中添加的丙酮酸激酶、己糖激酶和6-磷酸葡萄糖脱氢酶依次催化NADP+还原为NADPH，其中NADPH生成量与前一步反应生成的ADP数量呈正比，通过340nm下测定NADPH 的增加量，可以计算GBSS活性。

自备实验用品及仪器：

紫外分光光度计、水浴锅、台式离心机、移液器、1 mL石英比色皿、研钵、冰和蒸馏水。

试剂的组成和配制：

提取液：液体60mL×1瓶，4℃保存；

液体一：7mL×1瓶，4℃保存；

液体二：4mL×1瓶，4℃保存；

液体三：8mL×1瓶，4℃保存；

粉剂一：1支，4℃保存；

粉剂二：1支，4℃保存；

粉剂三：1支，-20℃保存；

粉剂四：1支，4℃保存；

粉剂五：1支，4℃保存；

粉剂六：1支，-20℃保存；

粉剂七：1支，-20℃保存；

粉剂八：1支，4℃保存；

粉剂九：1支，4℃保存；

粉剂十：1支，-20℃保存；

试剂一：液体×1支，-20℃保存；临用前加入250μL蒸馏水，充分溶解备用；用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融。

试剂二：粉剂×1支，-20℃保存；临用前加入250μL蒸馏水，充分溶解备用；用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融。

反应液Ⅰ的配制：临用前取液体一、粉剂一、粉剂二和粉剂三各一支，依次把粉剂一、粉剂二和粉剂三转移到液体一中混合溶解；用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融。

反应液Ⅱ的配制：临用前取液体二、粉剂四、粉剂五、粉剂六和粉剂七各一支，依次把粉剂四、粉剂五、粉剂六和粉剂七转移到液体二中混合溶解；用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融。

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反应液Ⅲ的配制：临用前取液体三、粉剂八、粉剂九和粉剂十各一支，依次把粉剂八、粉剂九和粉剂十转移到液体三中混合溶解；用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融。

粗酶液制备：

称取0.1~0.2g组织（建议称取约0.1g组织），加入1mL提取液，冰浴中匀浆。10000g ，4℃离心10min，弃上清，在沉淀中加入1mL提取液充分混匀，置冰上待测。

测定步骤：

1、分光光度计预热30min以上，调节波长至340nm，蒸馏水调零。

2

，冰浴冷却

，

ΔA=A2-A1。

注意：反应液Ⅰ如有沉淀，加入之前要使之充分溶解混匀。

GBSS活性计算：

1、按样本蛋白浓度计算：

单位的定义：每mg组织蛋白每分钟催化产生1nmol NADPH定义为一个酶活力单位。

GBSS（nmol/min/mg prot）＝[ΔA×V反总÷（ε×d）×109]÷(Cpr×V样) ÷T×稀释倍数=522×ΔA÷Cpr

此法需要自行测定样本蛋白质浓度。

2、按照样本鲜重计算

单位的定义：每g组织每分钟催化产生1nmol NADPH定义为一个酶活力单位。

GBSS活性（nmol/min/g 鲜重）=[ΔA×V反总÷（ε×d）×109]÷（V样÷V样总×W）÷T×稀释倍数=522×ΔA÷W

V 反总：反应体系总体积，5.7×10-4 L；ε：NADPH摩尔消光系数，6.22×103 L / mol /cm；d：比色皿光径，1cm；V样：加入样本体积，0.15 mL；V样总：加入提取液体积，1 mL；T：反应时间，2 min；稀释倍数：1.71；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量。

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