文档库 最新最全的文档下载
当前位置:文档库 › 土壤DNA提取方法汇总

土壤DNA提取方法汇总

土壤DNA提取方法汇总
土壤DNA提取方法汇总

碱液加热煮沸法(Direct Cellular Lysis/Protein Extraction Protocol for Soil)

1、称取3g(可根据实际情况,按比例增减土样的用量)新鲜土样(采集后放于-4℃保存,一周内用于DNA提取),装于50ml离心管中,然后向装有土壤样品离心管中加入37℃预热的10mlDNA提取液(100mmol/LTris[pH8.0],100mmol/L disodium EDTA,200mmol/L NaCl,2%[W/V] PVP,2%[W/V] CTAB,2%巯基乙醇[V/V],6mg/ml溶菌酶)(1 2)

2、漩涡振荡混匀,然后再37℃下水浴40min,水浴期间,每隔10分钟左右,混匀样品;

3、水浴结束后,加入10ml SDS buffer(100mmol/L Tris [pH 8.0],100mmol/L EDTA,200mmol/L NaCl,2%[W/V] SDS,160ug/ml的蛋白激酶K),65℃水浴1.5h,每隔20min上下颠倒混匀一次,注意不要剧烈的震荡,以免DNA断裂;

4、室温下,6000g离心10分钟,收集上清液;

5、按上述方法再将土样残渣抽提一次(重复2、3、4,提取液由10ml变为6ml),合并上清液;(以上步骤为细胞的裂解以及蛋白质、脂类以及腐植酸等杂质的去除)

6、在上清液中加入等体积的苯酚/氯仿/异戊醇(25:24:1)(去蛋白质以及直链淀粉),颠倒混匀放置10min,16000g 18℃离心20min,收集水相;

7、再加入等体积的氯仿/异戊醇(24:1),抽提一次,颠倒混匀放置10min,16000g 18℃离心20min,收集水相;

8、用加入0.6倍体积的预冷(-20℃)异丙醇和0.1倍体积的3M醋酸钠(pH5.2)室温沉淀1-2h(到有白色沉淀出现),16000g 25℃离心20min,弃上清液;

9、用75%乙醇漂洗2-3次,真空干燥或者是冷冻干燥,或者是室温自然干燥,加dd水或者是TE缓冲液重悬浮(体积为100-500ul,根据DNA的量决定),备用(或者是根据实验需要过DNA纯化柱)。

方法二液氮冻融法

1、称取3g(可根据实际情况,按比例减少土样的用量)新鲜土样(采集后放于-4℃保存,一周内用于DNA提取),装于50ml离心管中,然后向装有土壤样品离心管中加入65℃预热的提取液10ml(100mmol/LTris[pH8.0],100mmol/L disodium EDTA,200mmol/L NaCl,2%[W/V] PVP,2%[W/V] CTAB,2%巯基乙醇[V/V])(1 2);

2、漩涡震荡混匀,或者是250rpm混匀5min,然后在液氮和65℃水浴的条件下反复冻融3-5次;

3、冻融结束后,加入10ml SDS buffer(100mmol/L Tris [pH 8.0],100mmol/L EDTA,200mmol/L NaCl,2%[W/V] SDS,160ug/ml的蛋白激酶K),65℃水浴2.0 h,每隔20min上下颠倒混匀一次,注意不要剧烈的震荡,以免DNA断裂;

以下步骤同方法一

方法三液氮研磨法

1、称取3g(可根据实际情况,按比例减少土样的用量)新鲜土样(采集后放于-4℃保存,一周内用于DNA提取),放于盛有液氮的研钵中,研磨,研磨3-5次,直至土壤样品呈粉末状(液氮挥发的越慢,说明研磨的越充分);

2、将研磨好的土样装入50ml离心管中,然后向装有土壤样品离心管中加入65℃预热的提取液10ml(100mmol/LTris[pH8.0],100mmol/L disodium EDTA,200mmol/L NaCl,2%[W/V] PVP,2%[W/V] CTAB,2%巯基乙醇[V/V],160ug/ml的蛋白激酶K)(1 2),漩涡震荡混匀,或者是250rpm混匀5min;

3、然后加入10ml SDS buffer(100mmol/L Tris [pH 8.0],100mmol/L EDTA,200mmol/L NaCl,2%[W/V] SDS),65℃水浴2.0h,每隔20min上下颠倒混匀一次,注意不要剧烈的震荡,以

免DNA断裂;

以下步骤同方法一(每种方法做三个处理)

方法四冻融溶菌酶法

1、称取3g(可根据实际情况,按比例减少土样的用量)新鲜土样(采集后放于-4℃保存,一周内用于DNA提取),装于50ml离心管中,然后向装有土壤样品离心管中加入37℃预热的10mlDNA提取液(100mmol/LTris[pH8.0],100mmol/L disodium EDTA,200mmol/L NaCl,2%[W/V] PVP,2%[W/V] CTAB,2%巯基乙醇[V/V],6mg/ml溶菌酶,)(1 2),漩涡振荡混匀,然后再37℃下水浴40min,水浴期间,每隔10分钟左右,混匀样品,水浴结束后,将样品在液氮和65℃水浴的条件下反复冻融3-5次;

2、漩涡混匀样品,然后再在37℃下水浴30min,水浴期间,每隔10分钟左右,混匀样品;

3、水浴结束后,加入10ml SDS buffer(100mmol/L Tris [pH 8.0],100mmol/L EDTA,200mmol/L NaCl,2%[W/V] SDS,160ug/ml的蛋白激酶K),65℃水浴1.5h,期间上下颠倒混匀4次左右;以下方法同方法一

方法五液氮研磨溶菌酶法

1、称取3g(可根据实际情况,按比例减少土样的用量)新鲜土样(采集后放于-4℃保存,一周内用于DNA提取),放于盛有液氮的研钵中,研磨,研磨3-5次,直至土壤样品呈粉末状(液氮挥发的越慢,说明研磨的越充分);

2、将研磨好的土样装入50ml离心管中,然后向装有土壤样品离心管中加入10ml提取液(100mmol/LTris[pH8.0],100mmol/L disodium EDTA,200mmol/L NaCl,2%[W/V] PVP,2%[W/V] CTAB,2%巯基乙醇[V/V],6mg/ml溶菌酶)(1 2),漩涡震荡混匀,在37℃下水浴40分钟,水浴期间,每隔10分钟左右,混匀样品;

3、水浴结束后,加入10ml SDS buffer(100mmol/L Tris [pH 8.0],100mmol/L EDTA,200mmol/L NaCl,2%[W/V] SDS,160ug/ml的蛋白激酶K),65℃水浴1.5h,期间上下颠倒混匀4次左右;以下步骤同方法一

方法六液氮研磨液氮冻融法

1、称取3g(可根据实际情况,按比例减少土样的用量)新鲜土样(采集后放于-4℃保存,一周内用于DNA提取),放于盛有液氮的研钵中,研磨,研磨3-5次,直至土壤样品呈粉末状(液氮挥发的越慢,说明研磨的越充分),然后将研磨的土样装于50ml离心管中,向装有土壤样品离心管中加入10ml提取液(100mmol/LTris[pH8.0],100mmol/L disodium EDTA,200mmol/L NaCl,2%[W/V] PVP,2%[W/V] CTAB,2%巯基乙醇[V/V])(1 2),漩涡震荡混匀,然后在液氮和65℃水浴的条件下反复冻融3-5次;

2、漩涡振荡混匀,然后再37℃下水浴40min,水浴期间,每隔10分钟左右,混匀样品;

3、水浴结束后,加入10ml SDS buffer(100mmol/L Tris [pH 8.0],100mmol/L EDTA,200mmol/L NaCl,2%[W/V] SDS,80ug/ml的蛋白激酶K),65℃水浴1.5h,期间上下颠倒混匀4次左右;

以下步骤同方法一

不同土壤DNA提取和纯化试剂盒及方法的比较学号

学校代码学号分类号密级 本科毕业论文 学院、系环境与资源学院 专业名称环境科学 年级2010级 学生姓名 指导教师 2014年5月

不同土壤DNA提取和纯化试剂盒及方法的比较 摘要 环境样品DNA的提取和纯化不仅是土壤微生物进行研究的前提条件,而且是环境宏基因组学中最关键的技术问题之一,DNA的产量和纯度对后续的一系列的分子生物学技术操作如:多聚酶链反应(PCR)扩增、核酸内切酶酶切消化、核酸分子杂交等等,都会产生很大的影响,所以后续试验有效进行,必须要先获得一定纯度、数量、有较好代表性和适当片段长度的DNA。本文针对三种典型的土壤类型(壤土、粘土和沙土),对目前应用比较广泛的三种不同的DNA 提取方法和四种不同的DNA 纯化方法的效果进行了比较。经过NanoDrop分光光度计和琼脂糖凝胶电泳对从三种典型土壤中提取和纯化的DNA的浓度和纯度进行检测,结果表明:Power Soil? DNA提取试剂盒和苯酚 - 氯仿抽提,异丙醇沉淀纯化方法的结合能提供满足环境组学研究的宏基因组测序要求的DNA。关键词:土壤微生物,DNA,提取,纯化

Comparison of DNA extraction and purification methods from different soils Abstract The extraction and purification of DNA from environmental samples is not only a prerequisite for microbial research, and is one of the environmental metagenomics most critical technical issues, the yield and purity of DNA on the subsequent series of molecular biology techniques operate such as: polymerase chain reaction (PCR) amplification,restriction enzyme digestion, the nucleic acid hybridization, etc. will have a huge impact, if follow-up tests effectively, you must first obtain a certain purity, quantity, better DNA fragments representative and appropriate length. In this paper, we have compared several different methods of DNA extraction and purification for three different soil, loam, sandy clay . After a NanoDrop spectrophotometer and by agarose gel electrophoresis and purified from the extract of the soil of three DNA concentration and purity, and the results showed that: Power Soil ? DNA extraction kit and phenol-chloroform extraction and isopropanol precipitation purification methods' combined provides the right DNA for the study of environmental groups metagenomic sequencing. Keywords:Microbial soil, DNA , Extraction, Purification

磁珠法土壤基因DNA提取试剂盒

磁珠法土壤基因组DNA提取试剂盒 MagBeads Soil DNA Extraction Kit [目录号】SMDE-5005、SMDE-5010 【运输条件】2~25 C; 【保存条件】磁珠分散液2~8 C;蛋白酶K -20 C;其它组分室温保存; 【试剂盒组成】 【注意事项】 1. 磁珠悬浮液严禁反复冻融和离心,以免磁珠受到损害,使用前务必充分混匀; 2. 使用前请检查裂解液1和裂解液2是否出现沉淀,如有沉淀请将试剂瓶置于65 C水浴中温热至 液体澄清; 3. 蛋白酶K长期不使用,请置于-20 C保存,融化后4C保存,并尽快使用; 【产品简介】 本试剂盒适用于从新鲜或冷冻的干燥土壤中提取基因组DNA。试剂盒采用独特的缓冲液

体系,在裂解液环境中基因组DNA与磁珠高效结合,经过清洗和洗脱等步骤之后,可去除土壤中的杂质与腐植酸,获得高质量基因组DNA产物,OD260/OD280比值一般在1.7~1.9之间, 可直接用于酶切、PCR、电泳、Southern Blot、分子标记等下游分子生物学实验。 【试剂盒说明】 【自备仪器、耗材和试剂】 手动普通版:涡旋混合仪、水浴锅或金属浴、EP管(2.0mL )、EP管配套用磁力架、异丙醇、无水乙醇、RNase A 溶液(100mg/mL,分散液:10mM Tris-HCl、1mM EDTA、pH值8.0)。 手动高通量版:涡旋混合仪、水浴锅或金属浴、48孔尖底板、48孔板配套专用磁力架、超强 磁板架48孔板专用硅胶盖、异丙醇、无水乙醇、RNase A溶液(100mg/mL,分散液:10mM Tris-HCl、1mM EDTA、pH 值8.0 )。 【手动普通版】 本操作方法在2.0mL EP管中进行操作。 1. 释放土壤微生物 称取100~500mg 土壤样本至2.0mL EP管中,依次加入1.0mL裂解液1和20卩蛋白酶K, 涡旋振荡1~3min,将土壤样本分散均匀,58 C温浴10min,期间每隔5min颠倒3次混匀内容物。 注:1)如需去除RNA,请额外加入5 RNase A溶液;2)干燥的土壤样本请研磨至均一细小颗粒,有助于微生物的高效释放。 2. 获得土壤基因组DNA粗液 室温、12000rpm将EP管离心5min,然后转移全部上清液至新的 2.0mL EP管中。加入 400卩裂解液2,颠倒混匀,再次室温、12000rpm将EP管离心5min。 3. 核酸结合 转移全部上清液至另一只2.0mLEP管,依次加入400卩屏丙醇和50卩磁珠悬浮液(提前摇晃均匀),涡旋振荡5min。 4. 磁性分离 将EP管置于磁力架上静置约20s至磁珠吸附完全,如EP管内盖有残留磁珠,可保持EP管

土壤DNA提取

1 试验材料 吉林省松江河镇人参栽培土壤。每份土壤样品经多点取样后充分混匀,用前过10 目筛,去除土壤中的须根、枯枝等杂物[2]。 1 . 2 仪器设备及药品 电子分析天平、恒温水浴锅、紫外凝胶成像系统、电泳槽、 电泳仪、高速冷冻离心机、微量加样器、PCR 仪等。 TENP 缓冲液(50 mmol/L Tris,20 mmol/L EDTA,100mmol/L Na Cl,1% PVP,pH 10.0)、CTAB 提取缓冲液(100mmol/L Tris,100 mmol/L EDTA,100 mmol/L Na3PO4,1.5mol/L Na Cl,1%CTAB,pH 8.0)、 SDS 提取缓冲液(100 mmol/LTris,50 mmol/L EDTA,50 mmol/L Na Cl,pH8.0,灭菌后加β-巯基乙醇至10 mmol/L)、 异丙醇、氯仿、异戊醇、无水乙醇、琼脂糖、EB、Taq DNA 聚合酶、d NTP、6×凝胶上样缓冲液、DNAMarker 等。 主要试剂有十二烷基硫酸钠(SDS)、乙二胺四乙酸(EDTA)、十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)、异硫氰酸胍,均为分析纯级。 1 .3 试验方法 1.3.1 土壤微生物的洗涤取土壤样品2g,置于50m L 灭菌的离心管中;加入10m L TENP 缓冲液[3]悬浮土样,磁力搅拌器搅拌15 min;10000r/min 离心5min,弃上清,重复洗涤多次至上清基本无色;最后将沉淀收集至1.5ml 离心管中。 1.3.2 DNA 的提取 1.3. 2.1 CTAB 法按照李钧敏[4]的方法略作改动。将沉淀重悬于500μl CTAB 提取缓冲液→65℃水浴2h→8000r/min,室温离心15 min,取上清→加入等体积氯仿:异戊醇(24∶1),12,000r/min 离心10 min,取上清→加入0.6 倍体积的异丙醇,4℃淀过夜→12000 r/min 4℃离心20min 收集DNA 沉淀→70%乙醇漂洗两次→干燥后将沉淀溶于100 μl p H 8.0 TE 缓冲液,备用。 1.3. 2.2 SDS 法按照焦晓丹[5]的方法略作改动。取沉淀,重悬于500μl SDS 提取缓冲液,轻轻混匀→向管中加入50μL 20%SDS 溶液,混匀,不可过于强烈震荡以防基因组DNA 断裂→65℃保温2h,每隔20min 轻轻摇匀1 次→加入与上清液等体积的氯仿和异戊醇(24∶1),混匀后12000r/min 离心10min,取上清→加入2 倍体积的无水乙醇,静止于室温下2h →以12000r/min 离心20min,收集DNA 沉淀→70%乙醇漂洗两次→干燥后将沉淀溶于100μl p H 8.0 TE 缓冲液,备用。

土壤总DNA的几种提取方法

土壤总DNA的几种提取方法 SDS 高盐法(方案1) 具体步骤: 称取1 g 土壤,放入研钵中,倒入适量的液氮,立即研磨;再倒入适量的液氮,研磨,重复3 次,使土壤颗粒研成粉末; 将13.5 ml 提取缓冲液(0.1 mol/L磷酸盐[pH = 8.0 ] ,0.1 mol/L EDTA [pH 8.0 ] ,0.1 mol/L Tris-HCl [pH 8.0 ] ,1.5 mol/L NaCl ,1.0 % CTAB) 和50μl 蛋白酶K(10 g/L ) 与5 g 土壤置于50 ml 的离心管中,放入37 ℃恒温摇床上,225 r·min - 1振荡30 min ; 加入1.5 ml20 % SDS ,轻轻混匀,65 ℃水浴加热2 h ,每隔15~30 min 轻轻摇匀1 次;5 000 r·min - 1离心10 min ,将上清液转入新的50 ml 离心管中;取4.5 ml 提取缓冲液加入原离心管,摇匀泥浆,加入0.5 ml 20 % SDS ,65 ℃水浴15 min ,用上述同样的离心速度离心10 min ,将上清液与原上清液合并;再重复此步骤1 次; 用与上清液等量的三氯甲烷于离心管中混匀,5000 r·min - 1离心20 min ;收集上清液,并加入0.6 倍体积的异丙醇,室温静置1 h ;25 ℃下12 000 r·min - 1离心20 min ,倒出上清液,干燥后加入500μl 去离子水,溶解粘附于离心管壁的DNA 及其杂质,并收集于1.5 ml 的微型离心管中. 变性剂加SDS 高盐法(方案2) 具体步骤: 取1 g 土样和等量的灭菌石英砂在研钵中混合,加入1 ml 变性剂(4 mol/L异硫青酸胍,10mmol/L Tris-HCl [pH 7.0 ] ,1 mmol/L EDTA[pH 8.0 ] ,0.5 % 2-巯基乙醇) ;液氮冰冻,研磨至溶解,重复3 次; 转入50 ml 离心管中,加入9 ml 提取缓冲液(0.1 mol/L磷酸钠[pH 7.0 ] , Tris-HCl [ pH 7.0 ] , 0.1 mol /L EDTA [ pH8.0 ] ,1.5 mol/L NaCl ,1 %CTAB ,2 %SDS) ;65 ℃水浴1 h ,每10 min 轻轻混匀1 次;5 000 r·min - 1 离心10 min ,取上清; 在原管中加入5 ml 提取缓冲液,混合后,65 ℃水浴10min ,离心,取上清,合入上述上清液;重复一次;加入等体积的氯仿混合,5 000 r·min - 1离心20 min ,取上清;加入0.6 倍体积的异丙醇,室温沉淀1 h ;20~25 ℃,12 000 r·min - 1离心20 min ,TE 溶解沉淀. SDS-酚氯仿抽提法(方案3) 称取1g土壤样品,加入1ml 0.1mol/l PH8.0 磷酸缓冲液,玻璃珠振荡1min。溶菌酶5mg,使终浓度为 2.5mg/ml,室温振荡15min,放置冰箱30min,加125ul 20%SDS振荡处理15min,离心,分装EP管,加酚(1:1体积),抽提1次,氯仿-异戊醇(1:1体积),抽提2次,加0.6体积异丙醇,室温放置1h,离心,70%乙醇清洗,200Ul TE 溶解。 冻融溶菌酶SDS裂解法(方案4) 取1g土壤样品,加如0.5ml灭菌的抽提缓冲液(100 mmol/L Tris-HCl , 100 mmol/L EDTA, 200 mmol/L NaCl, 1.0% PVP, 2.0%CTAB , PH8.0), 加玻

湿地土壤微生物DNA提取及其脱腐技术

微生物学通报 AUG 20, 2010, 37(8): 1130?1137 Microbiology China ? 2010 by Institute of Microbiology, CAS tongbao@https://www.wendangku.net/doc/ac8557747.html, 基金项目:国家973计划前期研究专项项目(No. 2009CB125909) *通讯作者:Tel: 86-471-4991676; : ndzj@https://www.wendangku.net/doc/ac8557747.html, 收稿日期:2010-01-25; 接受日期:2010-05-24 摘 要: DNA 分子生物学技术的广泛应用, 为全面了解微生物群落提供了有力的工具。本文建立了一种新的从湿地土壤中提取微生物总DNA 的方法, 即氯化钙-SDS-酶法。在直接提取DNA 过程中采用氯化钙去除腐殖酸, DNA 提取缓冲液中不使用EDTA 螯合剂, 提取过程用时4 h 左右。与其他两种方法相比, 该方法高效去除湿地土壤腐殖酸, 纯度较高, 满足PCR 扩增, 为微生物生态学研究提供了一种高效的湿地土壤微生物总DNA 提取和纯化技术。 关键词: 湿地土壤, DNA 提取, 腐殖酸, PCR 扩增, 氯化钙-SDS-酶法 DNA Extraction and Removing Humic Substance from Wetland Soil LI Jing-Yu 1 ZHAO Ji 2* BIAN Yu 2 WU Lin-Hui 2 YU Jing-Li 2 (1. College of Life Sciences , Inner Mongolia University , Huhhot , Inner Monglia 010021, China ) (2. College of Environment & Resources , Inner Mongolia University , Huhhot , Inner Monglia 010021, China ) Abstract: DNA-based molecular biology techniques have widely been used as a powerful tool to un-derstand the microbial community. In this paper, a new method to extract microbial genomic DNA from wetland soil was established, namely Calcium Chloride-SDS-Enzymatic. Calcium chloride rather than EDTA chelating agent was used to remove humic acids in the process of direct DNA extraction. The extracting time is less than 4 hours. In comparing with other two methods, this method is more efficient in removing humic acids from wetland soil, and the purity of extracted DNA is higher which can be ap-plied to PCR amplification. It provides an efficient technology to extract and purify microbial genome DNA from soil for microbial ecological studies. Keywords: Wetland soil, DNA extraction, Humic acid, PCR amplification, Calcium chloride- SDS-enzymatic 从土壤和沉积物样品中提取微生物总DNA 是研究微生物多样性的前提和基础, 方法大致可以分为直接提取和间接提取两大类[1]。直接提取法获得DNA 的量较大, 但腐殖酸的存在会影响到下游的分 析[2]。为了获得纯度较高的微生物总DNA, 需要对其进行纯化处理。纯化处理的方法有硫酸铝捕获腐殖酸法[3]、PVPP 纯化法[4]、CTAB 法[5]、氯化铯密度梯度离心法[6]、交联葡聚糖和琼脂糖凝胶过滤树

实验室土壤DNA提取方法

改良CTAB-SDS法 1、称取1 g土壤样品,加1ml DNA提取液(0.1 mol/L Tris-Hcl;0.1 mol/L EDTA; 0.1 mol/L 磷酸钠;1.5 mol/L Nacl;1%CTAB;pH 8.0,将各种试剂按配置的体积数称量混合即可。),在漩涡震荡仪上混匀。 2、加入100ul溶菌酶温和37℃裂解30min,液氮冷冻10 min,65℃水浴10 min,反复冻融3次。 3、加入20% SDS缓冲液溶液100μl,65℃水浴2h,每20 min轻轻颠倒几次。8000 r/min离心10 min,取上清。 4、剩余残渣中再加500μl DNA提取液和100μl SDS 缓冲液,65℃水浴30 min,8000 r/min室温离心10 min,取上清,合并两次的上清液。 5、等体积的氛-氯仿-异戊醇(25:24:1)抽提2至3次(氯仿:异戊醇(24:1)抽提一次),静置10min,12000rpm,10min取上清。 6、加入0.1倍体积的NaAc和0.6倍体积的无水乙醇混匀,4℃沉淀过夜。 7、13000 r/min离心5 min,70%乙醇清洗2次,30μl ddH 2 O溶解。 8、提取粗DNA在0.6%(1%)的Agrose,70 V(100V)电压下电泳1.5 h(40min)。注意事项:这个千万不要4℃过夜啊,4℃过夜你会发现很多的絮状悬浮物,我之前犯过类似错误,这个是SDS和高浓度的盐在低温条件下析出来了。室温放置1-2h就好。 提取土壤微生物总DNA的纯度和浓度检测 对提取的土壤微生物总DNA进行琼脂糖凝胶电泳检测,同时采用紫外分光光度计分别测定提取土壤微生物总DNA稀释液在230 nm,260 nm,280 nm处的光 密度值。以OD 260/OD 280 (DNA/蛋白质),OD 260 /OD 230 (DNA/腐植酸)比值检测DNA纯 度。 DNA浓度=OD 260 值×50μg/ml×80×DNA 溶液体积/干土质量[68]

土壤基因组DNA提取试剂盒使用说明

土壤基因组DNA提取试剂盒使用说明 货号:D2600 规格:50T/100T 保存:室温(15℃-25℃)干燥保存,复检期12个月,2℃-8℃保存时间更长。 试剂盒内容:D2600-50T D2600-100T 溶液A25ml50ml 溶液B3ml6ml 溶液C5ml10ml 溶液D10ml20ml 漂洗液15ml15ml×2 洗脱液10ml20ml 吸附柱50个100个 收集管50个100个 PCR增强剂500ul1ml 说明书1份1份 注:试剂盒开封后溶液A、B、C、D需在2-8℃保存。PCR增强剂-20℃保存。 产品简介: 本试剂盒适合于从褐土、淤泥、火山灰等各种极端土壤环境中提取微生物DNA。对土壤中各种细菌、真菌有很好裂解效果,最大限度的保留了微生

物DNA的多态性。 本试剂盒采用我公司特有的腐殖质吸附材料,可高效专一的去除各种腐殖质成分而丝毫不会影响DNA的产率,纯度较酚、氯仿抽提法提高数倍。使用本试剂盒提取的DNA产量大、完整性好,可直接用于各种常规操作,包括酶切、PCR、文库构建、Southern杂交等实验。 操作步骤: 使用前请先在漂洗液中加入无水乙醇,加入体积请参照瓶体上的标签。所有离心步骤均为使用台式离心机在室温下离心。 1、称取土壤样本0.1-0.5g,在液氮中充分研磨成细粉末,加入450ul溶液A震荡混匀。 *也可直接称取样本0.1-0.5g于离心管(建议使用2ml圆底管),加入450ul溶液A剧烈震荡混匀1-2min至没有固体块。使用液氮研磨效果最佳。 2、加入50ul溶液B充分颠倒混匀(不要剧烈震荡),65℃水浴6min,每2min充分颠倒混匀一次。 3、加入100ul溶液C充分颠倒混匀(不要剧烈震荡),12000rpm离心10min。 4、将上清转移到新的离心管,12000rpm离心2min。 5、在吸附柱中加入200ul溶液D,将离心后的上清加入到带有溶液D 的吸附柱中,用移液器吹吸几次混匀,12000rpm离心1min。 6、将收集管中的滤出液混匀后重新吸入吸附柱(必须),12000rpm离心1min。

PowerSoil 试剂盒提取土壤DNA

PowerSoil 试剂盒提取土壤DNA 1、加入0.25g 土壤样品到一个PowerBead Tubes中。 2、轻轻涡旋混匀。 3、检测Solution C1。若出现沉淀,60℃水浴至全溶解。 4、加入60μl Solution C1,上下颠倒数次混匀。 5、把PowerBead Tubes固定在涡旋仪适配器上,最大转速(3200rpm,若涡旋仪达不到此速度,可适当延长5~10min)涡旋连续振荡10min。 6、室温10000g离心30s。 7、转移上清至一个干净的2ml Collection Tube(试剂盒提供)中。 8、加入250μl Solution C2到上清中,涡旋混匀5s。4℃孵育5min。 9、室温10000g离心1min。 10、避开沉淀小珠,转移上清≤600μl 到一个新的收集管(2ml Collection Tube)中。 11、加入200μl Solution C3到上清中,涡旋混匀。4℃孵育5min。 12、室温10000g离心1min。 13、避开沉淀小珠,转移上清≤750μl到一个新的收集管中。 14、Solution C4 使用前先摇匀。加入1200μl Solution C4到上清中,涡旋混匀5s。 15、加载约675μl 上清到Spin Filter 中,室温10000g离心1min。弃去滤液,继续加载675μl 上清,室温10000g离心1min。重复直至过滤完所有上清。(每个样品共需加载3 次。) 16、加500μl Solution C5到Spin Filter 中,室温10000g离心30s。 17、弃去上清 18、室温10000g 离心1min。 19、小心转移Spin filter 到2ml Collection Tube 中,尽量避免Solution C5 污染。 20、加入100μl Solution C6到白色滤膜中心。 21、室温10000g 离心30s。 22、弃去Spin Filter。此时收集管中的DNA 可直接用于下游实验,无需进一步纯化。DNA 冷冻保存(-20℃~-80℃)。

土壤DNA提取的解决专家

土壤DNA提取的解决专家简介 土壤样品含有大量的微生物,其中绝大部分的微生物都是无法直接培养进行繁殖和研究。从土壤样品中提取DNA是研究土壤微生物最为有效的方法。目前从土壤样品中提取微生物DNA的方法主要有直接法和间接法。直接法是指把土壤样品放在裂解液中,经过有效的破壁方法使微生物的DNA全部释放到裂解液中,然后再进行分离提取,如Zhou的方法。间接法是指将土壤放在一种的缓冲液中,如Buffer PBS等,把微生物从土壤中分离出来,然后再进行DNA的提取。间接法可大大降低土壤中腐殖酸,重金属盐对DNA 提取带来的影响,但是这种方法会丢失许多微生物,得到的DNA 并非土壤样品中的全基因组(宏基因组),目前已经很少研究者会采用这种方法。从土壤样品中直接提取DNA可最大可能性地获得全基因组,但是这种方法却面临以下几个问题: 1.腐殖酸的污染。土壤中,特别是森林,草地土壤含有非常丰 富的腐殖酸。腐殖酸是一系列的有机物分子,部分分腐殖酸同核酸分子非常类似,在纯化过程中非常难于去除。微量的腐殖酸污染都会导致下游应用,如PCR,酶切的失败。 2.裂解方法。土壤样品中含有各种微生物,如细菌和真菌等。 革兰氏阳性细菌和真菌都含有非常厚的细菌壁,让这些微生物的细胞壁有效破裂是提取高产量宏基因组DNA的关键。由于土壤样品的复杂性,使用酶法(如溶菌酶,破壁酶,蜗牛酶)或液氮研磨都不可行,因为土壤中含有各种金属离子或抑制因子导致消化酶的活性失活,或土壤中的沙粒等会导致液氮研磨很难进行。 3.DNA得率难于控制。土壤样品或因肥沃,或因贫瘠,或因含 水量丰富,或因干枯,或因取样的深浅度,都会造成微生物数量和品种发生剧烈改变。在一个小范围的土壤样品DNA含量往往会差别成千上百倍。此外,某些土壤中含有的化学成分,如重金属盐,粘土物质都会造成DNA得率降低。 Magen公司的HiPure Soil DNA Kit采用硅胶柱纯化技术,是专门为土壤DNA提取为设计的。该试剂盒采用玻璃珠研磨法和热激化学破壁法,可不需特殊的珠磨仪,在涡旋仪就可进行,适合于广大的研究室。试剂盒中Absorber Reagent是Magen公司独家开发的腐殖酸吸附剂,能高效去除各种腐殖酸的污染。此外还采用无醇的硅胶柱纯化方式,可高效去除土壤中各种可溶性金属盐,以及其它可溶性的抑制因子。该试剂盒已经成功地提取如下土壤(部分是客户反馈):自然保护区森林的土壤(长达30-40年森林土壤,表层有30-50cm落叶层),红树林土壤,草地,耕地,海底泥,污泥,矿石区泥土,有机物污染的泥土,池塘泥,垃圾泥,空调管道堆积物等。实验方法 为表明该试剂盒的优势性,我们选择以下不同组织样品进行DNA 提取实验,每个样品重复3次。 ●森林类样品:自然保护区森林土壤(广东黑石顶自然保护区) 和海南岛红树林保护区 ●矿石区样品:矿石区水底土壤(湿)和矿石区地表土壤(干) ●耕地样品:稻田土壤,菜地土壤 ●有机物污染地表样品:污水沟衍泥和生活垃圾堆放区 操作方法(按HiPure Soil DNA Kit试剂盒进行)简单描述以下:1.取0.5g土壤到2ml匀浆管中。加入0.9ml Buffer SOL/SDS, 高速涡旋5-10分钟裂解细菌或真菌。 2.70o C水浴10分钟进一步裂解细菌。 3.加入0.3ml Buffer PS涡旋混匀; 4.加入0.3ml Absorber Solution,涡旋混匀。 5.13,000xg离心5分钟。 6.取上清。加入结合液混匀后上柱。 7.洗涤柱子三次。 8.加入适当量的Elution Buffer洗脱即可。 实验结果 1.DNA电泳结果 取10 ul 纯化的基因组DNA上样于0.8%琼脂糖凝胶,80V电泳30分钟,结果如下。 0.5g森林类土壤样品 (前两个自然保护区森林土壤,后两个为红树林土壤) 0.5g耕地类土壤样品 A: 水稻田土壤 , B: 玉米土壤 A: 生活垃圾堆放地 , B: 污水沟底泥

一种土壤微生物总DNA的高效提取方法

土 壤 (Soils), 2004, 36 (6): 662~666   一种土壤微生物总DNA的高效提取方法① 黄婷婷1 曹 慧1 王兴祥2 崔中利1, 2*  (1 南京农业大学农业部环境微生物工程重点开放实验室南京210095; 2 中国科学院南京土壤研究所南京210008) 摘 要 获得高浓度、大片段、多样性程度高的土壤微生物总DNA 是研究土壤微生物群落结构的分子生态学基础。本文采用间接法(菌体细胞回收法)提取红壤地区两种土壤类型的土壤微生物总DNA,定量计算其回收率,并与直接法(细胞原位裂解法)比较了提取效率和纯度。结果表明:红壤地区2种土壤每克干土的总DNA 提取量,间接法约为0.34和0.53μg/g干土,直接法约为13.62和24.32μg/g干土;间接法的提取效率低于直接法,但所得DNA片段较大,且Sau 3AⅠ酶切和16 S rDNA通用引物PCR扩增结果显示,间接法比直接法更能有效地去除土壤中的某些抑制剂,所得总DNA的纯度更高,有利于后续操作。 关键词土壤微生物;总DNA提取;细胞回收;粗DNA纯化 中图分类号 S154 土壤微生物生态系统极为复杂,在很大程度上还是未知的。土壤微生物不仅是土壤中物质循环的驱动力,其代谢物也是植物的营养成分,其活动能直接影响到土壤的物理、化学性质[1, 2]。可以说,土壤微生物生态系统是一个巨大的、潜在的科研和经济价值远未得到开发的微生物资源库。目前可在实验室培养的微生物还不到自然界中微生物总数的1%,还有相当多的菌种因为无法人工培养而未被人类所认识[3]。随着分子生物学技术的发展,PCR的指纹技术、DNA文库、FISH、Microarray等技术被广泛应用于土壤微生物群落结构以及基因资源的开发利用,丰富拓展了人们对土壤中不可培养微生物的认识[4, 5]。 分子生物学技术研究土壤微生物群落结构的实质是用土壤微生物DNA的不均一性来反映土壤微生物的种群结构特征。因此,获得高浓度、大片段、多样性程度高、具有代表性的土壤微生物总DNA 是研究土壤微生物群落结构的分子生态学基础。由于土壤样品中含有较多的腐质酸和粘粒等抑制物质,这些物质可对内切酶消化、PCR扩增、杂交等后续操作产生强烈的影响[6, 7],因而提取与纯化土壤微生物总DNA在研究中尤为重要[8, 9]。 已报道的从土壤样品中提取DNA的方法有很多种,主要可分为直接法和间接法两类。直接法是直接对样品进行裂解,然后从裂解物中获得DNA;而间接法则是先从土壤中回收细胞再提取DNA。和直接法相比,间接法获得的DNA分子量更大,纯度更高,但不可避免的,该法得到的DNA产率有所降低。由于人们普遍认为较高的DNA得率更能代表大部分的土著微生物种群和遗传多样性[10],目前进行基因文库构建时大多仍采用直接法提取土壤总DNA。但最近研究显示,直接法包含的高DNA 得率并不一定代表了种群的丰富度,并且序列的代表性也受到所采取的不同提取方法的影响,且有研究发现由直接法建立的基因文库中还包含了大量真核生物的基因片段。由于真核生物基因增加基因文库的大小但其遗传信息并不能在原核宿主载体中表达,因此间接法为构建更高质量的基因文库提供了条件[11]。本文采用间接提取法对两种植被条件下红壤的总DNA进行提取,并与直接提取法比较了提取和纯化的效率,为红壤地区微生物群落结构多样性分析以及功能性基因的获得奠定了基础。 1 材料与方法  1.1 研究区域概况与土壤样品采集  研究区域位于江西省鹰潭市余江县。该区域具有中亚热带温暖湿润的季风气候,年均温为17.8℃,年均降雨量为1785 mm,且主要集中在4~6月;地 ①国家自然科学基金项目(40371069),中国博士后科学基金项目(2003033495)和中国科学院创新项目( KZCX3-SW-417)资助。*通讯作者(czl@https://www.wendangku.net/doc/ac8557747.html,)

土壤dna提取试剂盒

土壤dna提取试剂盒 土壤的成分包括矿物质、粘土等无机物、植物及植物的遗体、腐殖物质等土壤有机物以及在土壤中存在的微生物。 从土壤中提取的DNA,是微生物、动植物遗体等的总DNA,同时,腐殖物质的性质与DNA很相似,DNA提取过程中会将腐殖等物质一起纯化,采用传统的DNA提取方法来除去腐殖物质等抑制因子是十分困难的。而这些腐殖物质会抑制聚合酶链式反应(PCR)及限制性酶切等。因而,从土壤中提取DNA,腐殖物质等抑制因子的除去干净是重中之重。广州捷倍斯生物科技有限公司根据腐殖物质等特点,发明了高效的腐殖酸吸附剂,再与硅胶柱纯化的技术结合,开发出了高效土壤DNA提取试剂盒(SoilDNAKit),已为广大客户所采用,完全能够替代价格昂贵的进口产品。 土壤样品加入悬浮缓冲液BufferC1,并加入玻璃珠与专利的腐殖酸吸附剂BufferC2,涡旋使土壤充分重悬,腐殖物质充分释放,让吸附剂有效吸附腐殖酸。再加入高效的裂解液BufferC3并涡旋在玻璃珠的摩擦作用下,裂解土壤中的所有生物包括G+细菌、酵母菌、真菌、藻类、线虫甚至真细菌的孢子、芽孢、动植物遗体等,游离DNA。之后,再加入沉淀剂BufferC4,离心沉淀除去土壤残渣、吸附有腐殖酸的吸附剂、多糖多酚、绝大部分的色素等,获得清亮的、含有DNA的上清,上清加入异丙醇沉淀获得DNA粗品。粗品中加入ddH2O溶解后,再加入BufferC5离心进一步除去腐殖酸等杂质,获得上清,往上清加入乙醇后转移到硅胶纯化柱中过柱吸附DNA,

除去杂质。再加入漂洗液BufferWB离心进一步除去蛋白质、腐殖酸等杂质,加入漂洗液DNAWashBuffer除去盐分等。干燥柱子后加入灭菌去离子水后,离心获得高纯的DNA。

土壤微生物DNA提取

原理简介: 独特的结合液/蛋白酶K迅速裂解细胞和灭活细胞内核酸梅,然后基因组DNA在高速离序盐状态下选择性吸附于离心柱内硅基质膜,再通过一系列快速的漂洗——离心的步骤,抑制物去除液和漂洗液将细胞代谢物,蛋白等杂质去除,最后低盐的洗脱缓冲液讲纯净基因组DNA从硅基质膜上洗脱。 注意事项: 1.所有的离心步骤均在室温完成,使用转速可以达到13,000 rmp的传统台式离心机,如 Eppendorf 5415C 或者类似离心机。 2.开始实验前将需要的水浴先预热到70℃备用。 3.对于革兰氏阳性菌,需要自备lysozyme,或者lysostaphin。 4.结合液CB和抑制物去除液IR中含有刺激性化合物,操作时要戴乳胶手套,避免沾染皮 肤,眼睛和衣服。若沾染皮肤、眼睛时,要用大量清水或者生理盐水冲洗。 操作步骤: 1.取0.5—2毫升培养基菌液(最多不超过2*109个细胞),10,000rmp,离心30秒,弃上 清液,收集菌体,尽可能的洗净上清。 2.加入200μl缓冲液RB重悬洗涤细胞,10,000rmp,离心30秒,弃上清后讲细胞震荡 或者吹打重悬于200μl缓冲液RB中。 3.加入200μl结合液CB,;立刻剧烈颠倒轻摇充分混匀,再加入20μl蛋白酶K(20mg/ml) 溶液,充分混匀,70℃放置10分钟。 4.冷却后加入100μl异丙醇,剧烈颠倒轻摇充分混匀,此时可能会出现絮状沉淀。 5.讲上一步所得溶液和絮状沉淀都加入到一个吸附柱AC中,(吸附柱放入收集管中)10, 000rmp离心30秒,倒掉收集试管中的废液。 6.加入500μl抑制物去除液IR,12,000rmp离心30秒,弃废液。 7.加入700μl漂洗液WB,12,000rmp离心30秒,弃掉废液。 8.加入500μl漂洗液WB,12,000rmp离心30秒,弃掉废液。 9.将吸附柱AC放回空收集管中,13,000rmp离心2分钟,尽量出去漂洗液,以免漂洗液 中残留乙醇抑制下游反应。 10.取出吸附柱AC,放入一个干净的离心管中,在吸附膜的中间部位加100μl洗脱缓冲液 EB(洗脱缓冲液事先在65—70℃水浴中预热),室温放置3—5分钟,12,000rmp离心1分钟。将得到的溶液重新加入离心吸附柱中,室温放置2分钟,12,000rmp离心1分钟。 11.DNA可以存放在2—8℃,如果要长时间存放,可以放置在—20℃。

FastDNA SPIN Kit for Soil土壤DNA快速提取试剂盒提取步骤

Fast DNA? SPIN Kit for Soil土壤DNA快速提取试剂盒提取步骤(没有FastPrep?仪器的情况下) (1)称取0.3 g~0.4 g样品加入Lysing Matrix E Tube 中。(注意:需保证加完样品及所需溶液后,管中应留出不少于200 μL空间) (2)加入978 μL SPB,加入122 μL MT Buffer。 (3)盖紧Lysing Matrix E Tube的盖子,将离心管置于涡旋混合仪上,对管内物质进行震荡破碎均质化,时间设定为40 s~50 s。(注意:时间不可过长,有可能打断基因组DNA片段降低提取质量)从各个角度都可以震荡一下,不要光是底部。 (4)在8000 r/min转速下离心15 min,有利于去除体积较大或具有复杂细胞壁结构的样品碎屑。 (5)将上清液用大口枪头吸出转入1.5 mL的微离心管中,加入250 μL PPS,手持离心管晃动10次以混匀。 (6)在8000 r/min下离心5 min,用大口枪头将上清液转移至5 mL离心管中。 (7)摇匀Binding Matrix后,吸取1.0 mL加入上一步离心管中。 (8)将离心管上下颠倒2 min后,静置3 min,使DNA附着于Bingding Matrix 上,并等待二氧化硅基质沉淀。(这一步根据沉淀情况时间可以适当延长)(9)小心移除600 μL上清液,避免吸出沉淀物。 (10)将剩余的上清液与沉淀物重新混匀,吸取约600 μL混合液移入SPIN Filter中,8000 r/min下离心1 min。 (11)倒掉收集管中的液体,重复上一步操作直至5 mL离心管中的液体吸尽。 (12)加入已制备好的SEWS-M溶液500 μL,用小枪头小心混匀后,8000 r/min 下离心1 min后,弃去收集管中的液体。 (13)为更好的去除杂离子,重复第12步,更换为1.5 mL离心管。 (14)在8000 r/min下离心2 min,去除残留的SEWS-M溶液,然后更换为干净的1.5 mL离心管。(若发现残余溶液较多,可重复此步骤)(15)在室温下,将SPIN Filter风干5 min。(时间可以更久一些) (16)往SPIN Filter加入80 μL DES溶液,用小枪头小心使之与Binding Matrix 混匀,65℃水浴15 min(有利于DNA的溶出)。8000 r/min下离心2 min,可得到约50 μL的DNA溶液。再加入80 μL DES溶液重复第16步操作,一共可得到约100 μL的DNA溶液。 (17)弃去SPIN Filter,将提取好的DNA存于-20℃冰箱保存。

土壤DNA提取试剂盒说明书

土壤基因组DNA提取及PCR报告 一、步骤 试剂盒22℃--25℃储存使用前:用无水乙醇稀释SPW Wash Buffer 1、0.5g【500ml】玻璃珠加入15ml离心管中(15ml离心管可以更好的涡旋、悬浮),加0.5g【0.4—0.5g】土样,加1ml Buffer SLX Mlus 【裂解菌体】,最高速度涡旋3-5 min; 2、加100ul Buffer DS,涡旋混匀; 3、70℃水浴10 min,并短暂涡旋;(对于难提取样品可以在90℃水浴) 4、3000rpm 室温【25℃】离心3min,转移800ul上清液于一新的2ml离心管中,加入270ul Buffer SP2,涡旋混匀; 5、冰浴5 min,4℃,13000xg 离心5 min; 6、小心转移上清液于一新的2ml离心管,加0.7体积【约600—900ul】的异丙醇,反复颠倒离心管20-30次以混合,(若样品DNA含量低,可以放置于-20℃1h ); 7、13000xg 4℃离心10min,获得沉淀DNA; 8、小心去除上清液,将离心管在吸水纸上倒置1min; 9、加200ul Elution Buffer,涡旋10s,溶解DNA,【预热EB,保存60℃,15min水浴】; 10、加100ul HTR Reagent,涡旋10s混匀;(HTR Reagent使用前要摇匀,吸取时将枪头剪大一点儿); 11、室温静置2min后13000xg 室温离心2min;

12、取上清液于新2ml离心管中(若上清液有黑色则重复步骤 10-12); 13、加上清液的等体积【300—350ul】XP2 Buffer并涡旋混匀; 14、将HiBind DNA柱置于2ml 收集管中,将上一步样品转移到柱中,10000xg 室温离心1min,弃流液,保留收集管; 15、将柱移入上一步中的收集管,加入300ul XP2 Buffer,10000xg 离心1min,弃流液、收集管; 16、将柱移入新2ml离心管中,加入700ul SPW Wash Buffer(用无水乙醇稀释过的)洗涤,10000xg 离心1min,弃流液保留收集管; 17、重复16步; 18、弃流液,将柱插入空收集管中,13000xg 室温离心2min,空甩干燥柱子;(是为了除去乙醇,乙醇对后续操作有影响) 19、将柱移入干净1.5ml 离心管,将50ul Elution Buffer 直接加入HiBind matrix 中心,65℃水浴10-15min,室温放置3—5min; 20、13000xg 离心1min 以洗脱DNA 21、加入30-100ul Elution Buffer,重复19-20步 22、检测

土壤DNA提取方法汇总

碱液加热煮沸法(Direct Cellular Lysis/Protein Extraction Protocol for Soil) 1、称取3g(可根据实际情况,按比例增减土样的用量)新鲜土样(采集后放于-4℃保存,一周内用于DNA提取),装于50ml离心管中,然后向装有土壤样品离心管中加入37℃预热的10mlDNA提取液(100mmol/LTris[pH8.0],100mmol/L disodium EDTA,200mmol/L NaCl,2%[W/V] PVP,2%[W/V] CTAB,2%巯基乙醇[V/V],6mg/ml溶菌酶)(1 2) 2、漩涡振荡混匀,然后再37℃下水浴40min,水浴期间,每隔10分钟左右,混匀样品; 3、水浴结束后,加入10ml SDS buffer(100mmol/L Tris [pH 8.0],100mmol/L EDTA,200mmol/L NaCl,2%[W/V] SDS,160ug/ml的蛋白激酶K),65℃水浴1.5h,每隔20min上下颠倒混匀一次,注意不要剧烈的震荡,以免DNA断裂; 4、室温下,6000g离心10分钟,收集上清液; 5、按上述方法再将土样残渣抽提一次(重复2、3、4,提取液由10ml变为6ml),合并上清液;(以上步骤为细胞的裂解以及蛋白质、脂类以及腐植酸等杂质的去除) 6、在上清液中加入等体积的苯酚/氯仿/异戊醇(25:24:1)(去蛋白质以及直链淀粉),颠倒混匀放置10min,16000g 18℃离心20min,收集水相; 7、再加入等体积的氯仿/异戊醇(24:1),抽提一次,颠倒混匀放置10min,16000g 18℃离心20min,收集水相; 8、用加入0.6倍体积的预冷(-20℃)异丙醇和0.1倍体积的3M醋酸钠(pH5.2)室温沉淀1-2h(到有白色沉淀出现),16000g 25℃离心20min,弃上清液; 9、用75%乙醇漂洗2-3次,真空干燥或者是冷冻干燥,或者是室温自然干燥,加dd水或者是TE缓冲液重悬浮(体积为100-500ul,根据DNA的量决定),备用(或者是根据实验需要过DNA纯化柱)。 方法二液氮冻融法 1、称取3g(可根据实际情况,按比例减少土样的用量)新鲜土样(采集后放于-4℃保存,一周内用于DNA提取),装于50ml离心管中,然后向装有土壤样品离心管中加入65℃预热的提取液10ml(100mmol/LTris[pH8.0],100mmol/L disodium EDTA,200mmol/L NaCl,2%[W/V] PVP,2%[W/V] CTAB,2%巯基乙醇[V/V])(1 2); 2、漩涡震荡混匀,或者是250rpm混匀5min,然后在液氮和65℃水浴的条件下反复冻融3-5次; 3、冻融结束后,加入10ml SDS buffer(100mmol/L Tris [pH 8.0],100mmol/L EDTA,200mmol/L NaCl,2%[W/V] SDS,160ug/ml的蛋白激酶K),65℃水浴2.0 h,每隔20min上下颠倒混匀一次,注意不要剧烈的震荡,以免DNA断裂; 以下步骤同方法一 方法三液氮研磨法 1、称取3g(可根据实际情况,按比例减少土样的用量)新鲜土样(采集后放于-4℃保存,一周内用于DNA提取),放于盛有液氮的研钵中,研磨,研磨3-5次,直至土壤样品呈粉末状(液氮挥发的越慢,说明研磨的越充分); 2、将研磨好的土样装入50ml离心管中,然后向装有土壤样品离心管中加入65℃预热的提取液10ml(100mmol/LTris[pH8.0],100mmol/L disodium EDTA,200mmol/L NaCl,2%[W/V] PVP,2%[W/V] CTAB,2%巯基乙醇[V/V],160ug/ml的蛋白激酶K)(1 2),漩涡震荡混匀,或者是250rpm混匀5min; 3、然后加入10ml SDS buffer(100mmol/L Tris [pH 8.0],100mmol/L EDTA,200mmol/L NaCl,2%[W/V] SDS),65℃水浴2.0h,每隔20min上下颠倒混匀一次,注意不要剧烈的震荡,以

相关文档
相关文档 最新文档