症状性颅内动脉狭窄支架置入术后内皮祖细胞的数量及功能与再狭窄的相关性研究

四临床研究四

DOI:10.3760/cma.j.issn.2095?7041.2015.02.008

基金项目: 十二五”国家科技支撑计划课题(2011BAI08B02)

作者单位:252000山东省聊城市人民医院神经内科　聊城市脑血管病介入中心通信作者:苏江利,Email:sujiangli29@https://www.wendangku.net/doc/a48969536.html,

症状性颅内动脉狭窄支架置入术后内皮祖细胞的数量及功能与再狭窄的相关性研究

苏江利　亓立峰　张锐　曲怀谦

【摘要】　目的　探讨症状性动脉粥样硬化性颅内动脉狭窄(sICAS)患者颅内动脉支架置入术后内皮祖细胞(EPCs)数量二功能及血管内皮生长因子(VEGF)水平变化与术后颅内动脉再狭窄的关系三

方法　选择2008年1月 2012年10月聊城市人民医院神经内科因sICAS 行颅内动脉支架置入术的87例患者进行前瞻性研究三87例患者中,男48例,女39例;年龄48~81岁三均采用颅内动脉支架置入术治疗,术后1年行头颈CTA 检查,根据患者颅内动脉狭窄情况分为再狭窄组和无狭窄组,分别对两组患者术后1年外周血EPCs 的数量二黏附能力二迁移能力,以及VEGF 水平进行测定,并对结果进行对比分析三结果　87例sICAS 患者均成功行经皮血管内支架置入术三术后1年行头颈CTA 检查显示,无狭窄组64例,再狭窄组23例,其中14例患者再狭窄>50%三再狭窄组与无狭窄组比较,术后1年外周血中EPCs 数量分别为(36.5±4.8)个/mL二(65.6±6.7)个/mL,细胞黏附数量分别为(27.4±7.3)个/mL二(58.5±9.4)个/mL,迁移数量分别为(13.6±3.7)个/mL二(24.7±6.8)个/mL,VEGF 的水平(57.79±13.53)pg /mL二(94.36±17.57)pg /mL,差异均有统计学意义(t 值分别为19.110二14.376二7.425二9.051,P 值均<0.05)三结论　sICAS 患者采用颅内动脉支架置入术治疗后,EPCs 数量二黏附能力二迁移能力及VEGF 水平明显下降的患者,发生血管再狭窄的风险增加;术后检测EPCs二VEGF 水平对预测发生血管再狭窄的可能性和判断患者的远期预后可能有一定的临床价值三

【关键词】　颅内动脉疾病;　动脉粥样硬化;　动脉狭窄;　支架;　内皮祖细胞;　血管内皮生长因子

Study on the correlation between the number and function of endothelial progenitor cells and in?stent restenosis after stent?implantation for symptomatic intracranial atherosclerotic stenosis　Su Jiangli ,Qi Lifeng ,Zhang Rui ,Qu Huaiqian.Department of Neurology ,Liaocheng People′s Hospital ,Shandong 252000,China

Corresponding author :Su Jiangli ,Email :sujiangli29@https://www.wendangku.net/doc/a48969536.html,

【Abstract 】　Objective To explore the relationship of endothelium progenitor cells(EPCs)number and function,the level of vascular endothelial growth factor (VEGF)with in?stent restenosis after stent implantation for symptomatic intracranial atherosclerotic stenosis.Methods From Jan 2008to October 2012,a total of 87patients stent?implantation with symptomatic intracranial atherosclerotic stenosis (sICAS)were prospectively studied in Liaocheng People′s Hospital.In 87patients,there were 48males and 39females,the age was 48-81years.All the patients were divided into restenosis group and non?restenosis group according to the examining results of Cranial CTA 1year after percutaneous stent implantation.The EPCs number,adhesion and migration activities and the level of VEGF in the peripheral blood were tested and aralyzed in two groups.Results The 87patients with symptomatic intracranial atherosclerotic stenosis were successfully performed percutaneous intravascular stent implantation,23patients showed varying degrees of in?stent restenosis 1year after post?operatively,the restenosis rate of 14patients was more than 50%.The number of endothelial progenitor cells [(36.5±4.8)/mL vs (65.6±6.7)/mL],adhesion activities[(27.4±7.3)/mL vs (58.5±9.4)/mL],migration activities [(13.6±3.7)/mL vs (24.7±6.8)/mL]and level of VEGF[(57.79±13.53)pg /mL vs (94.36±17.57)pg /mL]were significantly lower in restenosis group than non?restenosis group (t =19.110,14.376,7.425,and 9.051,

respectively,all P values <0.05).Conclusions The risk of in?stent restenosis is increased in the patients which the migration ability of EPC,and the level of EPC and VEGF will decrease significantly 1year after postoperatively.It is helpful to judge the possibility of in?stent restenosis and certain clinical values for long?term prognosis of patients to detect the level of EPCs and VEGF.It may offer a new way for prevention of in?stent restenosis after stenting by changing the levels of EPCs and VEGF.

【Key words 】　Intracranial arterial diseases;　Atherosclerosis;　Arteriarctia;　Stents;　Endothelium progenitor cells;　Vascular endothelial growth factor

症状性动脉粥样硬化性颅内动脉狭窄

(symptomatic intracranial atherosclerotic stenosis,sICAS)是指由于动脉粥样硬化导致的颅内动脉狭窄,并在狭窄动脉供血区域发生过缺血性卒中或短暂脑缺血发作(transient ischemic attack,TIA )三sICAS 是脑卒中的重要病因[1],尤其在中国和亚洲人群中更为突出[2]三目前,sICAS 支架置入术在临床上已广泛应用并证实安全有效,但术后较高的支架内再狭窄率一直是临床面临的严峻问题[3-4]三本研究选择2008年1月 2012年10月在山东省聊城市人民医院神经内科因sICAS 行颅内动脉支架置入术患者87例进行前瞻性研究,探讨sICAS 患者颅内动脉支架置入术后再狭窄与内皮祖细胞(endothelial progenitor cells,EPCs)数量二功能及血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)水平的关系,以期为预防sICAS 支架置入术后再狭窄提供一条新的思路三1　资料与方法1.1　一般资料

本组87例,男48例,女39例;年龄48~81岁,

平均(69.5±11.3)岁三病例纳入标准:(1)符合

2011年中国缺血性脑血管病血管内介入诊疗指南[5]的sICAS 诊断标准;(2)经正规内科药物治疗无效二反复TIA 或有明显脑缺血;(3)严重颅内动脉狭窄>70%,且经血管造影证实是引起脑缺血的责任血管;(4)颅内动脉狭窄≤70%,给予内科药物保

守治疗者三病例排除标准:(1)病例资料不全者;(2)非动脉粥样硬化颅内动脉狭窄者,如动脉炎二先天性肌纤维发育不良二烟雾病二急性动脉夹层或其他

原因动脉狭窄等;(3)合并严重心脏瓣膜病二心房颤动二心脏附壁血栓二6周内心肌梗死二严重肺疾病者;(4)3个月内拟行大手术或颅内出血者,30d 内有重大手术史者,合并其他恶性疾病预计生存期小于1年者;(5)外周血管疾病二外伤二颅内动脉瘤二视网膜病二外科手术二炎症等影响EPCs二VEGF 的疾病患者三87例患者中,合并高血压35例二糖尿病27例二高脂血症30例三患者均行全脑血管造影检查,结果均提示颅内动脉血管重度狭窄(狭窄>70%),其中颈内动脉颅内段狭窄24例,大脑中动脉段狭窄18例,椎动脉颅内段狭窄33例,基底动脉狭窄12例三

87例患者严格按照脑血管病介入操作指南[5],操作过程见图1三均成功行经皮血管内支架置入术,术后行动脉血管造影检查显示残余狭窄率均<

10%三术后3d 常规给予低分子肝素钙5000u 皮下注射,12h 1次;双抗血小板治疗(阿司匹林100mg /d二氯比格雷75mg /d)6个月,6个月后改为单抗血小板治疗(阿司匹林100mg /d)三本研究方案经医院伦理委员会批准(批文号00915),并经受试者签署知情同意书三

1.2　分组

术后1年,87例患者根据头颈CTA 检查结果分为再狭窄组和无狭窄组,

对支架置入后颅内动脉狭

图1　患者男,68岁,因反复短暂性脑缺血发作行右侧大脑中动脉支架置入术　1A　术前大脑中动脉血管造影显示:右侧大脑中动脉重度狭窄(箭)　1B　术中大脑中动脉血管造影显示在微导丝导引下Wingspan 支架输送到位(箭)　1C　支架释放后血管造影显示支架释放位置及贴壁良好(箭)　1D　术后大脑中动脉血管造影显示血管血流通畅,残存狭窄率<5%(箭)

窄>20%者定义为再狭窄三再狭窄组23例,男12例,女11例;年龄48~79岁,平均(70.5±9.2)岁;其中14例再狭窄患者狭窄>50%三无狭窄组64例,男36例,女28例;年龄51~81岁,平均(67.6±13.6)岁三术前两组患者性别二吸烟二年龄二饮酒二糖尿病二高血压二高脂血症比例以及年龄二BMI 水平,差异均无统计学意义(P值均>0.05),具有可比性三见表1三

1.3　主要试剂二仪器设备

流式细胞仪(德国美天旎),PE?CD133二APC?CD34二FITC?KDR抗体以及VEGF ELISA检测试剂盒(美国R&D公司)三

1.4　主要观测指标及方法

1.4.1　流式细胞仪检测外周血EPCs数量　抽取患者晨起空腹肘静脉血2mL,置于乙二胺四乙酸(elhylene diamine tetraacetic acid,EDTA)?K2抗凝管中,充分抗凝三取抗凝后静脉血50μL,置入流式管中,每管中均加入PE?CD133二APC?CD34以及FITC?KDR抗体各10μL,避光孵育30min,再加入红细胞裂解液1mL,静置10min,室温下离心5min (离心半径20cm,2500r/min)三弃上清液后,加入0.01mol/L磷酸盐缓冲液(phosphate buffer solution, PBS)1mL,混匀后再次离心5min(离心半径20cm, 2500r/min),然后加入0.01mol/L PBS200μL三通过流式细胞仪测定CD34二CD133及KDR抗体的表达情况,流式细胞仪设定好程序后自动计数阳性细胞的数量三

1.4.2　EPCs黏附能力测定　即检查EPCs贴壁细胞数量三抽取晨起空腹静脉血20mL置于EDTA?K2抗凝管中,轻轻摇匀以充分抗凝,加入PBS缓冲液(1∶1),混匀,缓慢加入到人淋巴细胞分离液表面,室温下离心30min(离心半径20cm, 2500r/min)后静置10min,吸取中间白膜层,PBS 反复冲洗二吹打混匀,再离心10min(离心半径20cm,1500r/min),同法离心2次,得到EPCs细胞三加入内皮细胞培养基(endothelial cell medium, EGM)悬浮细胞,计数并调整细胞浓度,将细胞以1×106/mL接种于4μg/cm2的人纤维连接蛋白(Human fibronectin,HFN)包被的50mL培养瓶中,在37℃二5%CO2饱和湿度培养箱中培养,每隔3d 换1次培养液三EPCs培养10d后,用0.1%胰蛋白酶消化二搜集贴壁细胞,置于离心管中离心5min

(离心半径20cm,1000r/min),弃上清液,并调整细胞浓度为5×104/mL,然后接种在HFN包被的24孔培养板中,每孔500μL×12孔三在37℃二5% CO2饱和湿度培养箱中培养30min,PBS洗去未贴壁的细胞三在200倍显微镜下观察,每孔随机选择3个视野,取12孔贴壁细胞数的平均值最为最终结果三

1.4.3　EPCs迁移能力测定　采用Transwell实验检测EPCs的迁移能力三EPCs培养10d,用0.1%胰蛋白酶消化搜集贴壁细胞,加EGM?2培养液制成细胞悬液,调整细胞浓度为4×105/mL,将50μL含2×104个EPCs细胞加入Transwell上室,下室加入含有VEGF(50ng/mL)的培养液200μL,共6个复孔三培养24h后,除去滤膜上面未移动的细胞,甲醇固定,进行Giemsa染色30min三在200倍显微镜下观察,每孔随机选3个视野,计数每个视野迁移到下层的细胞数量,以6孔的平均值最为最终结果三1.4.4　VEGF测定　患者空腹抽取肘静脉血约3mL,并置于构椽酸钠抗凝管中备用三抽血后立即轻轻颠倒混匀,防止血小板黏附和聚集,注意切勿用力震荡,以防产生气泡及造成标本溶血三采用ELISA法测定VEGF的数量,严格按VEGF ELISA 检测试剂盒说明规范操作三

1.5　统计学方法

应用SPSS13.0统计学软件对数据进行统计分析三近似服从正态分布的计量资料以?x±s表示,组间比较采用t检验,计数资料采用χ2检验三以P< 0.05为差异有统计学意义三

2　结果

2组间术后1年各项检测指标比较,再狭窄组外周血中EPCs数量二EPCs黏附能力二EPCs迁移能力及VEGF表达水平均明显低于无狭窄组,差异均有统计学意义(P值均<0.01)三见表2三

3　讨论

脑血管病严重危害人类健康,且发病率逐年上升三sICAS是引起脑卒中的主要原因三颅内支架置

表1　2组患者术前一般资料对比

组别例数性别(男/女)

年龄

(岁,?x±s)体质量指数

(kg/m2,?x±s)吸烟

[例(%)]饮酒

[例(%)]糖尿病

[例(%)]高血压

[例(%)]高脂血症

[例(%)]

再狭窄组2312/1170.5±9.224.23±2.536(26.1)7(30.4)5(21.7)8(34.8)7(30.4)无狭窄组6436/2867.6±13.624.12±3.1216(25.0)18(28.1)16(25.0)19(29.7)15(23.4)统计值-χ2=0.114t=0.946t=0.152χ2=0.011χ2=0.044χ2=0.098χ2=0.205χ2=0.438 P值->0.05>0.05>0.05>0.05>0.05>0.05>0.05>0.05

表2　2组患者支架置入术后1年各项检测指标比较

组别例数

外周血EPCs

数量(个/mL)

贴壁EPCs

数量(个/mL)

迁移EPCs

数量(个/mL)

VEGF

(pg/mL)

再狭窄组2336.5±4.827.4±7.313.6±3.757.79±13.53无狭窄组6465.6±6.758.5±9.424.7±6.894.36±17.57 t值-19.11014.3767.4259.051 P值-<0.01<0.01<0.01<0.01 注:EPCs:内皮祖细胞;VEGF:血管内皮生长因子

入的安全性目前存在争议三国外多中心研究显示,血管内支架置入治疗颅内动脉狭窄的安全二有效[6]三国内早在2002年即有颅内动脉狭窄的血管成形术报道,之后的研究也认为使用球囊扩张支架置入治疗颅内动脉狭窄是安全的[7]三

血管内支架置入术后再狭窄是临床研究的一个重要课题三2013年底,颅内支架置入术与积极药物干预治疗颅内动脉狭窄预防脑卒中试验发布了最终数据,结果提示在平均随访了32.4个月后,支架组1年和3年主要观察终点事件的发生率分别为19.7%和23.0%[3]三避免及预防支架置入术后再狭窄尤为重要三本课题组既往的研究证实,炎症及内皮损伤与支架置入术后再狭窄密切相关[8-10],而内皮修复功能在支架置入术后再狭窄的临床研究较少三有研究表明,外周血中EPCs数量下降与心血管疾病的发生发展密切相关[11]三最近的研究显示,外周血中EPCs数量与支架内再狭窄呈负相关[12-13]三EPCs是一类来源于骨髓并能增殖分化为成熟血管内皮细胞的前体细胞,属于成体干细胞三EPCs不仅在胚胎期参与血管发生,在出生后还可从骨髓动员进入外周血,并通过迁移二归巢分化为血管内皮细胞三同时,Dong等[14]研究显示,EPCs还具有促进新生血管生成,修复损伤血管,促进人工血管内皮化以及抑制新生血管内膜过度增生等作用三表面标志物鉴定是确定EPCs的重要方法三CD34二CD133二KDR是目前用于鉴定EPCs的主要表面标志物三VEGF作为一种趋化因子,可以诱导内皮细胞的迁移二增殖二黏附以及血管形成等病理生理过程,是参与病理二生理性血管发生以及血管新生等过程重要细胞因子之一三VEGF可以加快EPCs迁移归巢到血管损伤部位并调节损伤内皮组织的修复[15]三

血管内支架置入早期内皮损伤,内皮修复功能增强,炎性分子及内皮修复因子均升高,不能确切显示血管再狭窄的原因三本研究选择检测支架置入术后患者的EPCs数量二功能及VEGF水平,结果显示,再狭窄患者外周血EPCs的黏附及迁移能力均较无狭窄组降低,提示EPCs功能的降低三这也间接地反映了在血管再狭窄的发生与发展过程中,EPCs的动员二归巢至血管损伤部位的能力受损,导致其参与修复损伤内皮的能力不足,可能会激发内皮损伤进行性加重,进而促使再狭窄的形成三因此,本研究结果提示,EPCs的水平可以作为血管再狭窄的一个重要的监测指标,提示修复因素在血管狭窄的发生过程中发挥重要作用三本研究结果显示,再狭窄组患者VEGF水平的降低,也是血管内皮修复功能低下及狭窄形成与发展的重要原因三

由于条件所限,本研究具有一定的局限性,样本量偏小,且没有讨论影响再狭窄的炎性因子与内皮损伤的相关性三另外,近年来,CTA应用到sICAS的评估中,在以DSA为金标准对照时,CTA对颅内动脉狭窄/闭塞的诊断敏感度和特异度可以分别达到

97.1%和99.5%[16],但仍具有一定的偏差,不能完全替代DSA三在今后的研究中,应扩大样本量,以血管造影评价术后再狭窄,进一步进行深入研究三总之,外周血中EPCs数量的减少及能力的降低二VEGF水平的降低二血管修复能力的下降是血管狭窄发生的一个危险因素三检测sICAS患者血管内支架置入术后EPCs二VEGF水平,有利于判断血管再狭窄的可能,对患者的远期预后的预测有一定的临床价值;提高支架置入术后患者外周血中的EPCs二VEGF水平及功能,可能成为一种延缓病变发展的有效的治疗新手段三

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(收稿日期:2014?07?17)

(本文编辑:刘宏莉)

四消息四

第六届国际创伤骨科高峰论坛通知

由中华创伤骨科杂志二中国医师协会骨科医师分会创伤骨科工作委员会二中国香港骨科医学会二中国澳门骨科学会二中华骨科交流学会(中国台湾)主办,南方医科大学南方医院二第四军医大学国际骨科教育学院二中华骨科网二骨科在线联合承办, AsiaClub协办的 第六届国际创伤骨科高峰论坛”将于2015年5月29-31日(周五二六二日)在广州白云国际会议中心举行三在诸多专家二同道的支持下,自2005年以来,国际创伤骨科高峰论坛已成功举办了5届,业已成为国内乃至亚太地区颇具影响的骨科学术盛会三延续历届会议之特色二秉承往届办会之宗旨,第六届国际创伤骨科高峰论坛将邀请国内外知名专家学者交流二传播国际创伤骨科学界的新理念二新技术,加强国内外的沟通与合作,以共同推动我国创伤骨科事业的发展三本届论坛的主题是创伤骨科创新与发展,采用大师讲坛和专题论坛的形式三大师讲坛将邀请裴国献二张英泽二王满宜二曾炳芳二姜保国二唐佩福二DavidRing(美国)二GregoryDellaRocca(美国)二曹旭(美国)二Nayagam(英国)二QiYin(英国)二RichardBuckley(加拿大)二StuartMilesGold(美国)等国内外著名骨科专家进行讲演三专题论坛包括:肢体功能重建与骨折并发症二骨科转化医学与数学骨科二骨盆与髋臼骨折二髋部骨折二膝关节损伤二足踝部损伤二肩肘关节损伤二脊柱脊髓损伤二腕部损伤等三会议结束后正式代表将获得国家级继续医学教育Ⅰ类学分8分三

会议征文要求:论文未曾公开发表,含有结构式摘要,注明联系人及方式,仅接受Email方式投稿,Email:chinjot@aliyun. com(邮件主题请注明 第六届国际创伤骨科高峰论坛征文”),征文截止日期:2015年4月10日三会议优秀稿件还将推荐在‘中华创伤骨科杂志“发表三请在线注册二预定房间:https://www.wendangku.net/doc/a48969536.html,三

联系人:广州市广州大道北1838号　南方医院‘中华创伤骨科杂志“编辑部　聂兰英(135********)二张宁(135********)二张以芳(159********),邮编:510515,电话:020-********,Email:chinjot@https://www.wendangku.net/doc/a48969536.html,三