6 细胞工程 第六章 植物原生质体培养和体细胞杂交
第六章植物原生质体培养和体细胞杂交
第一节原生质体的分离和培养
一、原生质体的分离
（一）材料来源
叶片、花瓣、果实组织、茎的髓部、子叶、下胚轴、茎叶、愈伤组织、悬浮组织
（二）分离方法
1、机械分离法
2、酶法分离
酶的种类及特点
（纤维素酶、半纤维素酶、果胶酶类、崩溃酶、蜗牛酶）酶液的配制（配比、浓度、渗透压、PH）
分离原生质体
（两步法、一步法）
二、原生质体的纯化和活力测定（一）原生质体的纯化
1.离心沉淀法
2.漂浮法
3.接口法
（二）原生质体活力的
测定
1.形态识别
2.染色识别
三、原生质体的培养
?（一）培养基
?碳源（葡萄糖、蔗糖）
?氮源（谷氨酰胺）
?生长物质（NAA /I AA / 2，4-D / BA）?钙镁
?渗透压
?pH
?（二）原生质体培养方法（优缺点）?液体浅层培养
?固体平板培养
?液-固双层培养
?饲喂层培养
?（三）植板密度
?（四）培养条件
（五）原生质体的发育和植株再生
1、细胞壁再生
（荧光增白剂）
2、细胞分裂和生长
3、植株再生
第二节体细胞杂交
一、植物体细胞杂交的概念
将植物不同种、属、甚至科间的原生质通过人工方法诱导融合，然后进行离体培养，使其再生杂种植株的技术。（一）植物原生质体融合技术的发展
1960、1970、1971、1972、1974、1978、1979、1987、1990、1995
（二）植物细胞杂交的类型
体细胞杂交、配子-体细胞杂交、配子间细胞杂交、微细胞杂交
原生质体融合的种类（对称融合/非对称融合）
?二、体细胞杂交技术
?（一）原生质体融合（体细胞杂交）?（二）杂种细胞选择需考虑6点?（三）原生质体融合的方法及过程?无机盐诱导融合
?PEG与高钙-高pH相结合的诱导融合?电融合技术
?（四）杂种细胞的筛选与鉴定
?1、互补选择
?白化互补选择法、营养缺陷性互补选择、抗性互补选择?代谢抑制选择
?2、机械分离杂种细胞法
?3、双荧光标记选择法
?（五）杂种植株的鉴定?1、形态学鉴定
?2、细胞学观察
?3、DNA内切图谱的分析?4、同工酶分析
作业
?1、影响原生质体培养的主要因素有哪些？
?2、为什么原生质体培养要在等渗培养基？
?3、原生质体培养的方法有哪些？各有何优缺点？
植物细胞工程--植物体细胞杂交真题
1、甘薯种植多年后易积累病毒而导致品种退化。目前生产上采用茎尖分生组织离体培养的方法快速繁殖脱毒的种苗，以保证该品种的品质和产量水平。这种通过分生组织离体培养获得种苗的过程不涉及细胞的( ) A．有丝分裂B．分化C．减数分裂D．全能性 正确答案：C 知识点：植物组织培养 分析与思考：植物组织培养利用的是细胞的全能性，是一种无性繁殖体系，整个过程中没有减数分裂，也没有两性生殖细胞的结合，故选C。 2、利用植物的茎、叶片等，在无菌条件下，培养在玻璃器皿中人工配制的培养基上，使它发育成完整的植株。这种技术可以用来培育植物新品种，也可以在较短时间内大量繁殖植物，还可以防止植物病毒的危害。下列关于这种技术的叙述，正确的是( ) ①这种技术利用了植物细胞的全能性②这种技术叫做组织培养，可以克隆生物体③这种技术是一种无性繁殖的方式④这种技术属于细胞工程的应用领域之一 A．①B．①②③C．①②D．①②③④ 正确答案：D 知识点：植物组织培养 分析与思考：组培利用的原理是细胞的全能性，也是一种无性繁殖体系，同时也属于植物细胞工程，故选D， 3、下列各项培育植物新品种的过程中，不经过愈伤组织阶段的是（） A．通过植物体细胞杂交培育白菜——甘蓝杂种植株 B．通过多倍体育种培育无子西瓜 C．通过单倍体育种培育优质小麦 D．通过基因工程培育抗虫棉 正确答案：B 知识点：植物细胞工程 分析与思考：组培是一项基本的生物技术，在各个领域都有应用，比如说植物体细胞杂交，单倍体育种，基因工程等等，但是在多倍体育种过程中不会使用到组培技术，故选B。 4、设计植物体细胞杂交实验时，如果期望获得性状优良的作物新品种，不需要考虑的是（）A．亲本细胞的生殖隔离问题 B．选择具有优良性状的亲本
植物体细胞杂交技术
植物体细胞杂交技术-标准化文件发布号：（9456-EUATWK-MWUB-WUNN-INNUL-DDQTY-KII
自学提纲 选修3 2.1.2植物体细胞杂交技术 年级： 49 班级：学科：生物（选修三）姓名：日期：2020-12-10 【导师寄语】天行健，君子以自强不息！ 【考纲要求】 1、理解植物体细胞杂交技术的流程 2、运用植物体细胞杂交技术解决一些问题 【学习目标】 知识 1、理解植物体细胞杂交技术的基本原理和过程 2、说出植物体细胞杂交的理论和实践意义能力 提高知识的迁移运用能力和设计能力 情感、态度价值观 树立热爱科学、勇于想象、敢于创新的意识 【重、难点】 植物体细胞杂交的操作流程 【知识梳理】 一、植物体细胞杂交技术的出现（阅读课本36页第一段内容，思考：） 1、番茄—马铃薯能否用传统育种方法来实现，为什么如何来解决这个问题 【巩固训练】 1、植物体细胞杂交技术的目的是为获得（） A. 融合的原生质体 B. 杂种植株 C. 杂种细胞 D. 愈伤组织 二、植物体细胞杂交技术（阅读课本36页第二段，思考）★★★ （一）体细胞融合过程 1、植物体细胞杂交遇到的第一个障碍是什么用什么方法解决 2、如何让原生质体融合具体有哪些方法 3、 2
3、细胞融合完成的标志是什么与哪种细胞器有关 （二）植物组织培养过程 流程：杂种细胞愈伤组织杂种植株 【探究】（再次阅读课本图2-5，思考） 1、植物体细胞杂交运用了哪些技术方法，涉及的生物学原理分别是什么？ 2、什么是原生质体和原生质层有何不同 3、 4、将一些A植物细胞和一些B植物细胞诱导融合（不考虑3个或3个以上细胞的融合），最终细胞的种类有哪些？ 【巩固训练】 2、下列关于原生质体的叙述中不正确的是（） A、组成原生质体的主要生命物质是蛋白质和核酸 B、原生质体包括细胞膜、液泡膜及两者之间的原生质 C、被去掉细胞壁的植物细胞是原生质体 D、原生质体可用于植物体细胞杂交 3、如图为“番茄﹣马铃薯”的培育过程示意图，有关叙述正确的是（） 3
植物体细胞杂交
植物体细胞杂交 植物体细胞杂交是在原生质体培养技术的基础上，借用动物细胞融合方法发展起来的一门新型生物技术。植物体细胞杂交的过程包括原生质体的制备，原生质体融合的诱导，杂种细胞的筛选和培养，以及杂种植株的再生与鉴定等环节。下面以烟草和大豆的体细胞杂交为例，简要介绍植物体细胞杂交的过程。 原生质体制备选取烟草植株上的幼嫩叶片和培养好的大豆细胞，用酶解法制备原生质体。烟草的原生质体呈绿色，大豆的无色，在显微镜下很容易区别开来。 原生质体融合取等量的烟草和大豆的原生质体混合后，加入聚乙二醇溶液。在显微镜下观察，可以看到原生质体相互粘集在一起。隔一段时间后，加入高钙、高pH的溶液，这时原生质体才开始融合。原生质体融合包括膜融合和核融合两个过程。诱导融合只能诱导细胞膜的融合，两个核的融合是在杂种细胞第一次有丝分裂时进行的。 杂种细胞的筛选和培养烟草与大豆的原生质体融合后，将原生质体转移到适当的培养基上培养，便原生质体再生出细胞壁。这时，在细胞混合物中，不仅有烟草—大豆杂种细胞，还有烟草细胞、大豆细胞、烟草—烟草细胞、大豆—大豆细胞。杂种细胞的筛选，可以用机械方法，也可以用生理学或遗传学的方法。以机械方法为例，根据两种亲本细胞在形态、色泽上的差异，将细胞分别接种在带有小格的培养皿中，每个小格中约放1～3个细胞。在显微镜下找出杂种细胞，并且标定位置。等杂种细胞分裂成细胞团时，转移到培养皿中，培养成愈伤组织。 杂种植株的再生与鉴定杂种植株的再生是指从愈伤组织培养出杂种植株的过程。由于烟草和大豆分别属于茄科和豆科，二者的原生质体融合后，至今只能长成杂种愈伤组织，还不能分化，因此谈不上杂种植株的再生和鉴定。对于能够再生出杂种植株的，如烟草—海岛烟草、白菜—甘蓝、胡萝卜—羊角芹等，长出的植株究竟是不是杂种，还需要经过鉴定才能确定下来。杂种植株的鉴定方法有形态学方法、生化方法(如电泳)、细胞学方法(如染色体组型分析)、分子生物学方法(如分子杂交)等。 人民教育出版社生物自然室，教师教学用书(生物选修全一册) 人民教育出版社
植物原生质体相关材料
植物原生质体相关材料 2013-9-2 From HZB 一、植物材料 研究表明，几乎从植物的所有部位都能得到原生质体，其中以叶片为多。根尖组织也是植物原生质体的重要来源，它可由各种植物的种子萌发后取得。花粉经特异酶处理也能得到原生质体，在单倍体遗传育种中有特殊的用途。 但是，要获得高质量的原生质体，则须选用生长旺盛、生命力强的组织作材料。材料的生理状况是原生质体质量的决定性因素之一。 1. 细胞悬浮培养物 在建立细胞悬浮培养物之前，需提前培养愈伤组织： 取用成熟种子胚、未成熟胚、幼穗、花药、胚芽鞘或幼叶，经无菌消毒后，在26℃黑暗条件下，在含2,4－D 2-4mg/L的MS固体培养基上，诱导愈伤组织，每隔2-4d转接一次。从中选出增殖较快而且呈颗粒状的愈伤组织，或经继代培养一次后，转移到液体培养基的100ml三角瓶中进行悬浮培养。具体方法是用旋转式振荡器，速度控制在80-120r/min，在25±1℃下暗培养。通常经悬浮培养3～4月后，悬浮培养细胞的大小变得较为一致，且细胞质变得较浓时，可用作分离原生质体。 2. 叶肉细胞 叶肉细胞是分离原生质体的最好的细胞材料，用叶片的薄壁组织作为材料来源，既要考虑植株的生长环境，又要考虑叶片的年龄及其生理状态对原生质体分离的影响。取生理状态适宜的叶片，有利于原生质体的细胞再生和细胞分裂。要获得良好的培养材料，下列外界因素是需要着重考虑的： （1）光强为3000-6000lx。 （2）温度为20-25℃培养。 （3）相对湿度在60％-80％左右。 植物的其他器官也可用于分离原生质体，如用花粉四分体和花粉壁细胞。 3. 植物材料的预处理 对原生质体材料进行预处理能提高原生质体的分裂频率；也可以逐步提高植物材料的渗透压，以适应培养基中的高渗环境。这些处理包括：暗处理、预培养、低温处理等。 例如，把豌豆的枝条取下后，在分离原生质体前，先让材料在黑暗中的一定湿度条件下放1～2d，这样得到的原生质体存活率高，并能继续分裂。在羽衣甘蓝叶肉组织原生质体分离和培养中，先去掉叶片的下表皮，再在诱导愈伤组织的培养基中预培养7d，然后再去壁；经预培养的叶片分离的原生质体高度液泡化，叶绿体也解体。龙胆试管苗的叶片只有用4CC低温处理后分离得到的原生质体才能分裂。但在很多情况下材料不必经过专门的预处理。 二、酶 1. 酶的种类 构成植物细胞壁的三个主要成分是：①纤维素，占细胞壁干重的25％至50％不等；②半纤维素，平均约占细胞壁干重的53％左右；③果胶质，一般占细胞壁的5％。分离原生质体最常用的酶有纤维素酶、半纤维素酶和果胶酶。 ZA3-867纤维酶是上海植物生理研究所从野生型绿色木霉同各菌种中提取制成的，粗制品是多种酶的复合物，含有纤维素酶（包括C1、CX、B一葡萄糖苷酶等）、果胶质、半纤维素酶等，分离细胞壁的效果较好。这种复合酶使用时不需加半纤维素酶和果胶酶等，就可以分离出植物原生质体。 日本产的Onozuka纤维素酶常和果胶酶结合使用，可先用果胶酶降解果胶，使分开细胞，再用纤维素酶处理降解细胞壁。即二步法降解。 2. 渗透稳定剂
植物原生质体培养方法
植物原生质体培养方法 1 植物原生质体培养的简史 植物细胞原生质体, 在植物学上指植物细胞通过质壁分离后, 可以和细胞壁分开的那部分细胞物质。原生质体分离纯化后, 须在适当的培养基上应用适当的培养方法, 才能再生细胞壁, 并启动细胞持续分裂, 直至形成细胞团、长成愈伤组织或胚状体、分化和发育成苗, 最终再生完整植株。其中, 选择合适的培养方法始终是原生质体培养中最基础也是最关键的一环。 植物原生质体培养方法起源于植物单细胞培养方法。早在1902 年,Haberlant 通过实验就预言: 体外培养单个细胞可通过其分裂得到培养组织。直到1954 年, 植物单细胞培养才获得成功。M uir 将培养的万寿菊及烟草悬浮细胞植入到长有愈伤组织的培养基上而得到了它们的单细胞克隆, 并建立了看护培养的方法。悬滴培养由De Ropp1954 年开创, 1960 年Jones 等完善了这一技术, 并建立了微室培养的方法。同年, Cock ing 应用酶法分离原生质获得了成功, 从而在实验条件下很容易获得大量的原生质体。随着多种适用于原生质体分离的商品酶的出现, 原生质体的培养方法也得到了不断的改进, 现在常用的液体浅层培养、双层培养法、琼脂糖包埋法、琼脂岛培养法以及使用条件培养基或饲喂培养等技术, 使原生质体培养获得了极大的成功。 2 原生质体培养方法 2. 1 液体培养法 2. 1. 1 液体浅层培养(L iquid th in culture) 这是目前较常用的原生质体培养方法, 一般适用于容易分裂的原生质体, 将含有原生质体的培养液在培养皿底部铺一薄层, 封口进行培养。这种方法操作简单, 对原生质体损伤较小, 且易于添加新鲜培养物。用这种方法, J.T rmeouillaax 等成功地培养长春花冠瘿组织的激素自养型的原生质体单细胞克隆; H isato Kunitake 等也在改良的M S 培养基上培育了Eustom a g rend if lorum (龙胆科, 原产美国) 原生质体再生植株。但这种方法也常使原生质体分布不均匀, 发育的原生质体之间产生粘连而影响其进一步的生长和发育, 尤其是难以定点观察单个原生质体的命运。王吉吉之等认为液体浅层培养在培养过程中, 应经常轻轻晃动培养基, 以增强通气, 促进愈伤组织形成。 2. 1. 2 微滴培养(D rop let culture) 微滴培养是由液体浅层培养发展起来的一种方法, 它克服了后者局部密度过高和原生质体粘聚的缺点。此方法是将0. 1m l 或更少的原生质体悬浮液用滴管滴于培养皿底部, 封口后进行培养。为避免微滴蒸发, 可将培养器皿置于湿润的环境中, 或在微滴上覆盖矿物油。此法适用于融合体及单个原生质体培养, 尤其适用于较多组合的实验。为了比较黄瓜两个品系在不同的植板密度以及在不同的激素水平下原生质体生长情况, Z. K. Punja 等选用了此方法获得很好的效果; 同样, S. V essabutr 等培养百脉根时也比较了不同预处理、不同酶液组合对原生质体培养的影响。 2. 2 固体培养—— 琼脂糖平板法(A grose beadmethed) 固体培养作为凝固剂的物质可以是琼脂、琼脂糖或Gellan gum , 近来很多实验证明, 琼脂糖尤其是低熔点的琼脂糖是一种良好的培养基凝固剂, 并且具有促进原生质体细胞分裂的作用。琼脂糖平板法是将原生质体纯化后悬浮在液体培养基中, 然后与热融并冷却到45℃的琼脂糖按一定比例混合, 轻轻摇动使原生质体均匀分布, 凝固后封口培养。由于原生质体彼此分开并固定了位置, 就避免了细胞间有害代谢产物的影响, 既便于定点观察, 又有利于追踪原生质体再生细胞的发育过程。Z. K. Punja 等证明琼脂平板法比微滴培养及液体浅层培养具有更高的植板率; 甘霖等也得出同样结论。但此种方法对操作技术要求比较严格, 尤其是温度一定要适宜; 添加低渗透压的培养基和转移再生愈伤组织也比较繁琐, 而且培养的原生质体极易褐变死亡。 2. 3 液体2固体结合培养 2. 3. 1 双层培养法(A grose2liquid doublelayer) 这种方法即在培养皿的底部先铺一薄层含或不含原生质体或细胞的固体培养基,
植物组织培养 第十章 原生质体培养
第十章原生质体培养 ?教学目的与要求： ?深入了解植物细胞结构功能与细胞全能性表达的关系，掌握原生质体的分离以 及培养过程中渗透压和激素的调控原理与技术。 第一节、原生质体研究概况 一、原生质体的概念 ?原生质体(p r o t o p l a s t)：指除去细胞壁的细胞或是说一个被质膜所包围的裸露 细胞。 二、原生质体研究进展 ?据统计，目前已有49个科，146个属的320多种植物经原生质体培养得到了再 生植株（1993）。其趋势仍以农作物和经济作物为主，但从一年生向多年生、草本向木本、高等植物向低等植物扩展。 三、原生质体研究的意义 ?1、除去了细胞壁为植物细胞之间的融合扫平了障碍，同时叶为制造新杂种开辟 了道路。2、原生质体可摄入外源D N A，细胞器、细菌或病毒颗粒，这些特性与植物全能性相结合为高等植物的遗传饰变打下基础。3、获得细胞无性系和选育突变体的优良起始材料。 第二节、原生质体的制备 1、用于分离原生质体的材料准备 ?无菌试管苗叶片 ?上胚轴和子叶 ?培养细胞 2、酶处理 ?原生质体分离常用的商品酶 ?纤维素酶类 ?果胶酶类 ?半纤维素酶 酶溶剂及其渗透压 ?酶溶剂：原生质体培养基或特殊配制。 ?渗透压调节剂：葡萄糖、甘露醇、山梨醇等。 ?酶浓度及酶解时间 ?酶解时间 ?酶浓度酶解温度 3、原生质体的收集和纯化 ?飘浮法：常用的飘浮剂有蔗糖、P e r c o l l、F i c o l l。 ?P e r c o l l是一种包有乙烯吡咯烷酮的硅胶颗粒。渗透压很低(<20m o s m／k g H2O), 粘度也很小，可形成高达1.3g／m l密度，采用预先形成的密度梯度时可在低离心力(200～1000g)于数分至数十分钟内达到满意的细胞分离结果。由于P e r c o l l 扩散常数低，所形成的梯度十分稳定。此外，P e r c o l l不穿透生物膜，对细胞无毒害，因此广泛用于分离细胞、亚细胞成分、细菌及病毒，还可将受损细胞及其碎片与完好的活细胞分离。
植物原生质体培养
原生质体的培养 1. 原生质体的分离与纯化 原生质体培养的意义 (1)再生植株由原生质体再生生成植株，不论在进行有关细胞生物学或生物合成和代谢的实验研究上，还是在组织培养实践中，都有一定的优点：①可利用均一的分化细胞群体； ②因无细胞壁，试剂对细胞作用更为直接，其反应能直接测量，以使反应产物能较快的分离出来；③在理论和实践中，可极大节省空间，如在一个三角瓶就能培养210个细胞，但在大田种植需要4亩地；④可缩短实验周期，如悬浮培养时仅需1～2个小时。 原生质体培养可在遗传学方面进行基因互补，不亲和性，连锁群和基因鉴定，分析基因的激活和失活水平的研究。在研究分化问题时，用一个均一的原生质体群体可以筛选数以千计的不同。营养和激素条件，探索诱导单细胞的分化条件等。 (2)用于远缘体细胞融合，进行体细胞杂交。这是一种新的远缘杂交方法，为人们提供新的育种方法。两个亲缘关系较远的植株用一般杂交方法是不容易成功的，而用细胞融合的方法却成为可能。首先，两个原生质体融合形成异核体，异核体再再生细胞壁，进行有丝分裂，发生核融合，产生杂种细胞，由此可培养新的杂种。 一、原生质体(protoplast)的分离 （一）材料来源 原生质体是通过质壁分离与细胞壁分开的部分，是能存活的植物细胞的最小单位。自从1960年用酶法制备大量植物原生质体首次获得成功以来，原生质体培养成为生物技术最重要的进展之一。通过大量的试验表明，没有细胞壁的原生质体仍然具有"全能性"，可以经过离体培养得到再生植株。原生质体的分离研究较早，1892年Klereker首先用机械的方法分离得到了原生质体，但数量少且易受损伤。1960年，英国植物生理学家Cocking首先用酶解法从番茄幼苗的根分离原生质体获得成功。他使用一种由疣孢漆斑菌培养物制备的高浓度的纤维素酶溶液降解细胞壁。然而，直至1960年纤维素酶和离析酶成为商品酶投入市场以后，植物原生质体研究才成为一个热门的领域。至今从植物体的几乎每一部分都可分离得到原生质体。并且能从烟草、胡萝、矮牵牛、茄子、番茄等70种植物的原生质体再生成完整的植株。此外，原生质体融合，体细胞杂交的技术也得到广泛的应用。 （二）分离方法 1.机械分离法 1982年，Klercker第一次用机械方法从Stratiots aloides中获得原生质体.他们的做法是首先使细胞发生质壁分离,然后切开细胞壁释放出原生质体. 2.酶法分离 (1)酶的种类及特点 构成植物细胞壁的三个主要成分是： ①纤维素酶类：占细胞壁干重的25％至50％不等。 ②半纤维素酶类：平均约占细胞壁干重的53％左右。 ③果胶酶类：一般占细胞壁的5％。分离原生质体最常用的酶有纤维素酶、半纤维素 酶和果胶酶。
实验一植物原生质体的分离和培养一教学目标 了解植物原生质
实验一植物原生质体的分离和培养 一．教学目标：了解植物原生质体作为细胞工程研究的重要意义，了解原生质体活性鉴定的原理。掌握分离和培养原生质体的技术、方法和原理。掌握细胞活性的检测方法。掌握细胞计数的原理和方法。二．重点：掌握分离和培养原生质体的技术、方法和原理。掌握细胞活性的检测方法。掌握细胞计数的原理和方法。 三．难点：分离和培养原生质体的技术。 四．授课方式与教学方法：讲解原理、实验操作示范或具体指导。 五．教学内容: 实验原理 植物原生质体(protoplast)是除去细胞壁后为原生质所包围的“裸露细胞”,是开展基础研究的理想材料。其中,酶解法分离原生质体是一个常用的技术,其原理是植物细胞壁主要由纤维素、半纤维素和果胶质组成,因而使用纤维素酶、半纤维素酶和果胶酶能降解细胞壁成分,除去细胞壁,即可得到原生质体。由于原生质体内部与外界环境之间仅隔一层薄薄的细胞膜,必须保持在渗透压平衡的溶液中才能保持其完整性, 使原生质体分离后不致膨胀破裂，渗透剂常用甘露醇或蔗糖，酶液还应含一定Ca2+来稳定原生质膜。其次,还应当考虑取材、酶的种类和纯度、酶液的渗透压、酶解时间及温度等因素对分离原生质体的影响。将原生质体接种在培养基上进行培养，细胞壁再生，细胞分裂和再生植株。 测定原生质体的活性有多种方法。荧光素双醋酸酯(FDA)染色是常用的一种方法,FAD 本身无荧光,无极性,可透过完整的原生质膜。一旦进入原生质体后,由于受到酯酶分解而产生具有荧光的极性物质荧光素。它不能自由出入原生质膜,因此有活力的细胞能产生荧光,无活力的原生质体不能分解FAD无荧光产生。 细胞计数一般用血细胞计数极，按白细胞计数法进行计数。 从理论上讲，植物体的任何一部分都可以通过酶解作用去除细胞壁而得到原生质体。但在实际操作中，只有幼嫩的组织才能完成去壁的过程。所以，为了制备健康的原生质体，
《植物体细胞杂交》教学设计
《植物体细胞杂交》教学设计 一、概述 人教版高中生物教材《现代生物科技专题（选修3）》中“植物体细胞杂交”，虽然考纲不做要求，但是，是发展探究能力，提高科学素养的良好素材。该内容主要涉及植物体细胞杂交技术的过程和应用。体细胞克隆羊多利的问世，不仅给克隆技术带来重大突破，也使更多的人开始关注细胞工程技术。近几十年来，细胞工程技术获得突飞猛进的发展，许多成果已渗入到我们的日常生产和生活中。通过本专题的学习，学生可以了解细胞工程的原理、应用及其发展前景。为了激发学生的学习兴趣，教学方法主要采用探究式教学，结合学生的合作式学习，通过层层设疑，提出问题并解决问题。 二、教学目标 1.知识与技能。简述植物体细胞杂交技术及其应用。 2.过程与方法。通过复习旧知识引出新知识，能够深入理解知识的内在联系，掌握知识迁移的学习方法；通过合作学习、探究学习，掌握植物体细胞杂交技术的流程和应用。
3.情感态度与价值观。通过植物体细胞杂交技术过程的学习，讨论细胞工程技术的社会意义，认同细胞学基础理论研究与技术开发之间的关系，关注细胞工程的研究发展和应用前景。 三、学情分析 细胞工程是建立在对细胞结构、功能、生理等研究基础上的新技术，在必修模块《分子与细胞》中，学生已学过动植物细胞的结构和功能、细胞的分化和全能性；在必修模块《遗传和进化》中，学生已学过生物变异在育种上的应用；这些都是学习本专题的知识基础。更主要的是刚学过的植物组织的培养为植物体细胞杂交技术奠定了基础。 四、教学方法 本节课采用探究式教学，教师通过创设一种良好的情景，启发学生提出问题，利用学生已有的知识和其他交叉学科的思想，通过合理的想象，分析问题，解决问题。 五、教学过程 1.创设情境，激情导课 【教师活动】教师通过幻灯片放映日本博览会上的一棵枝叶覆盖面积达14平方米，果实数量达13000只的番茄树以及马铃薯的地下块茎。提出问题：通过
植物原生质体融合方法的研究进展
龙源期刊网 https://www.wendangku.net/doc/af9288284.html, 植物原生质体融合方法的研究进展 作者：李琦 来源：《种子科技》2018年第06期 摘要：原生质体融合（protoplast fusion）是指通过物理或化学方法使两个细胞的原生质体进行融合，经培养获得具有双亲全部或部分遗传物质后代的方法。应用植物原生质体融合技术，可以克服远缘杂交不亲和的障碍，打破物种之间的生殖隔离，扩大杂交亲本范围，实现基因在物种间的转移和遗传重组，培育新品种和创造新物种。主要就植物原生质体融合的方法进行了阐述。 关键词：植物原生质体；融合方法；研究进展 文章编号： 1005-2690（2018）06-0038-02 中图分类号： Q943 文献标志码： A 原生质体是组成细胞的一个形态结构单位，原生质体是指被去掉了细胞壁后的被细胞膜包围的“裸露细胞”，是开展基础研究的主要材料。1960年英国科学家Cocking第一次用酶法大量制备原生质体，Cocking采用的方法是在番茄幼苗的根组织中加入可降解细胞壁的等渗酶液，在一定条件下培养一段时间后，发现大部分细胞的细胞壁被降解，从而制备出大量有活力的原生质体。 1 原生质体融合的目的及意义 原生质体融合技术可克服不同原生质体间的排斥力，使两种不同种属的原生质体间发生膜融合、胞质融合和核融合，进而形成具有含两种遗传物质的杂交细胞，克服远缘杂交的不亲和性和子代不育等障碍。另外，可转移优良的生物性状，实现基因重组，而改良现有品种。目前原生质体融合所改良的目标性状包括抗冻、抗干旱、抗病毒、抗虫、耐高盐等，还可按照人们预先的期望创造出新物种。 2 原生质体的融合方法 2.1 自发融合 在酶解细胞壁形成原生质体的过程中，相邻的原生质体会因细胞间胞间连丝的扩展和粘连而彼此融合形成同核体（homokaryon）。每个同核体内可包含两个或多个核，这种类型原生质体的融合被称作为自发融合。多核融合体常出现在植物幼嫩叶片或分裂旺盛的培养细胞制备的原生质体中。如在玉米胚乳愈伤组织细胞和玉米胚悬浮细胞原生质体中，大约有50%是多核融合体。 2.2 高pH-高Ca2+法
高中生物《植物体细胞杂交技术》优质课教案、教学设计
植物体细胞杂交的教学设计 一、教材分析和学情分析： “植物体细胞杂交技术”是人教版高中生物选修三专题二细胞工程第一节的内容，之前学生学习了基因工程，本节是细胞水平技术的开启篇，主要包括植物组织培养技术和植物体细胞杂交技术，由于此前学生已经学习了植物组织培养技术的相关知识，并且对植物细胞工程有了一定的了解，为本节课的学习打下了一定的基础，所以本节课的重难点就是植物体细胞杂交技术。 经过必修课的学习，学生已经具备了一定的细胞学基础，再加上基因工程相关知识，为新知识的学习奠定了良好的认知基础。选修3 主要以现代生物前沿科学—生物工程为主，对于学生来说比较陌生，但在生活中却经常听说过的一些事例，例如，转基因克隆羊、试管婴儿等。所以在这册书的学习中，教师应该将理论知识与实际生活相联系，激发学生的学习兴趣，将抽象复杂的知识及实验技术与日常生活融合在一起，传授给学生。 二、核心素养： 1、生命观念：简述植物体细胞杂交技术的概念及原理。 2、科学探究：掌握植物体细胞杂交技术的基本流程。 3、社会责任：认同植物体细胞杂交技术的现实意义。 三、教学过程： 视频导入：播放一段英国Thompson & Morgan 公司的园艺主管保罗·汉索(Paul Hansord)，通过长达15 年的反复试验培育出的一株“一藤双生”植物——番茄薯，即番茄-马铃薯。（播放视频，激发学生的求知欲和学习兴趣。） 紧接着设问请同学们充分合理的发挥想象力，怎样才能培育出这种地上结番茄、地下长马铃薯的作物？（学生自由想象，可能会提出，用基因工程、嫁接、杂交育种。这是老师不要急于评判对错，而是给予适当的肯定和鼓励）。 紧接着提出以下两个问题，让学生思考和回答。 问题一：超级作物番茄-马铃薯之所以能地上结番茄和地下长马铃薯，从根本上来说是因为它同时具有？
第7章 原生质体的培养
第7章原生质体的培养和体细胞杂交（3学时） 目的要求： (1)了解原生质体培养的意义 (2)掌握原生质体分离的大致步骤 (3)掌握原生质体培养的方法 (4)掌握原生质体融合的方凑 第一节原生质体的分离与纯化 原生质体培养的意义 (1)再生植株由原生质体再生生成植株，不论在进行有关细胞生物学或生物合成和代谢的实验研究上，还是在组织培养实践中，都有一定的优点：①可利用均一的分化细胞群体； ②因无细胞壁，试剂对细胞作用更为直接，其反应能直接测量，以使反应产物能较快的分离出来；③在理论和实践中，可极大节省空间，如在一个三角瓶就能培养210个细胞，但在大田种植需要4亩地；④可缩短实验周期，如悬浮培养时仅需1～2个小时。 原生质体培养可在遗传学方面进行基因互补，不亲和性，连锁群和基因鉴定，分析基因的激活和失活水平的研究。在研究分化问题时，用一个均一的原生质体群体可以筛选数以千计的不同。营养和激素条件，探索诱导单细胞的分化条件等。 (2)用于远缘体细胞融合，进行体细胞杂交。这是一种新的远缘杂交方法，为人们提供新的育种方法。两个亲缘关系较远的植株用一般杂交方法是不容易成功的，而用细胞融合的方法却成为可能。首先，两个原生质体融合形成异核体，异核体再再生细胞壁，进行有丝分裂，发生核融合，产生杂种细胞，由此可培养新的杂种。 一、原生质体(protoplast)的分离 （一）材料来源 原生质体是通过质壁分离与细胞壁分开的部分，是能存活的植物细胞的最小单位。自从1960年用酶法制备大量植物原生质体首次获得成功以来，原生质体培养成为生物技术最重要的进展之一。通过大量的试验表明，没有细胞壁的原生质体仍然具有"全能性"，可以经过离体培养得到再生植株。原生质体的分离研究较早，1892年Klereker首先用机械的方法分离得到了原生质体，但数量少且易受损伤。1960年，英国植物生理学家Cocking首先用酶解法从番茄幼苗的根分离原生质体获得成功。他使用一种由疣孢漆斑菌培养物制备的高浓度的纤维素酶溶液降解细胞壁。然而，直至1960年纤维素酶和离析酶成为商品酶投入市场以后，植物原生质体研究才成为一个热门的领域。至今从植物体的几乎每一部分都可分离得到
植物原生质体提取培养1
实验原理： 植物原生质体是除去细胞壁后为原生质所包围的“裸露细胞”，是开展基础研究的理想材料。其中酶解法分离原生质体是一个常用的技术，其原理是植物细胞壁主要由纤维素、半纤维素和果胶质组成，因而使用纤维素酶、半纤维素酶和果胶酶能降解细胞壁成分，除去细胞壁。 许多化学、物理学和生物学方法可诱导原主质体融合，现在被广泛采用并证明行之有效的融合方法是聚乙二醇(PEG)法。高Ca高pH法和电融合法： PEG作为一种高分子化合物，20～50％的浓度能对原生质体产生瞬间冲击效应，原生质体很快发生收缩与粘连，随后用高Ca高pH法进行清洗．使原生质体融合得以完成。 PEG诱导融合的机理：PEG由于含有醚键而具负极性，与水、蛋白质和碳水化合物等一些正极化基团能形成氢键，当PEG分子足够长时，可阼为邻近原生质表面之间的分子桥而使之粘连。PEG也能连接Ca2+等阳离子，Ca2+可在一些负极化基团和PEG之间形成桥，因而促进粘连。在洗涤过程中，连接在原生质体膜上的PEG分子可被洗脱．这样将引起电荷的紊乱和再分布．从而引起原生质体融合：高Ca高pH由于增加了质膜的流动性，因而也大大提高了融合频率，洗涤时的渗透压冲击对融合也可能起作用。原生质体分离纯化或融合后，在适当的培养基上应用合适的培养方法，能够再生细胞壁，并启动细胞持续分裂，直至形成细胞团，长成愈伤组织或胚状体，再分化发育成苗。其中，选择合适的培养基及培养方法是原生质体培养中最基础也是最关键的环节。 [实验内容] 1．原生质体分离2．原生质体融合3．原生质体及融合体的培养 材料用品： 三角瓶、离心管、烧杯、200目滤网、解剖刀、长、短镊子、培养皿、滤纸、0.2μm滤膜、滤器、培养瓶（注：以上用品要进行高压灭菌）、台式离心机、高压灭菌锅、倒置显微镜、超静工作台 温度25±2℃，光照度1000Lx,光照14～16h/d 的条件下培养。培养时间约1周。 实验步骤： 1．溶液及培养基的配制 (1)酶液(2)PEG融合液(3)13％CPW洗液 1％纤维素酶 1％果胶酶 0.7mol/L甘露醇 0.7mmol/LKH2PO4 10mmol/LCaCl2·2H2O pH6.8—7.040% PEG (MW 1500-6000) 0.3 mol/L葡萄糖 3.5mmol/L CaCl2·2H2O 0.7mm0l/L KH2PO4 27．2 mg／L KH2PO4 101.0 mg／L KNO3 1480．0 mg／L CaCl2·2H2O 246．0 mg／L MgSO4 0．16 mg／L KI 0．025 mg／L CuSO4 13％ W／V甘露醇 pH 6.0 (4)20％蔗糖溶液
实验一植物原生质体的分离和培养一教学目标 了解植物原生质
实验一植物原生质体的分离和培养一教学目标了解 植物原生质 The following text is amended on 12 November 2020.
实验一植物原生质体的分离和培养 一．教学目标：了解植物原生质体作为细胞工程研究的重要意义，了解原生质体活性鉴定的原理。掌握分离和培养原生质体的技术、方法和原理。掌握细胞活性的检测方法。掌握细胞计数的原理和方法。二．重点：掌握分离和培养原生质体的技术、方法和原理。掌握细胞活性的检测方法。掌握细胞计数的原理和方法。 三．难点：分离和培养原生质体的技术。 四．授课方式与教学方法：讲解原理、实验操作示范或具体指导。 五．教学内容: 实验原理 植物原生质体(protoplast)是除去细胞壁后为原生质所包围的“裸露细胞”,是开展基础研究的理想材料。其中,酶解法分离原生质体是一个常用的技术,其原理是植物细胞壁主要由纤维素、半纤维素和果胶质组成,因而使用纤维素酶、半纤维素酶和果胶酶能降解细胞壁成分,除去细胞壁,即可得到原生质体。由于原生质体内部与外界环境之间仅隔一层薄薄的细胞膜,必须保持在渗透压平衡的溶液中才能保持其完整性, 使原生质体分离后不致膨胀破裂，渗透剂常用甘露醇或蔗糖，酶液还应含一定Ca2+来稳定原生质膜。其次,还应当考虑取材、酶的种类和纯度、酶液的渗透压、酶解时间及温度等因素对分离原生质体的影响。将原生质体接种在培养基上进行培养，细胞壁再生，细胞分裂和再生植株。 测定原生质体的活性有多种方法。荧光素双醋酸酯(FDA)染色是常用的一种方法,FAD 本身无荧光,无极性,可透过完整的原生质膜。一旦进入原生质体后,由于受到酯酶分解而产生具有荧光的极性物质荧光素。它不能自由出入原生质膜,因此有活力的细胞能产生荧光,无活力的原生质体不能分解FAD无荧光产生。 细胞计数一般用血细胞计数极，按白细胞计数法进行计数。 从理论上讲，植物体的任何一部分都可以通过酶解作用去除细胞壁而得到原生质体。但在实际操作中，只有幼嫩的组织才能完成去壁的过程。所以，为了制备健康的原生质体，一般选用根尖、茎尖、嫩叶及对数生长期的愈伤组织为材料，一旦细胞具有木质化或次生加厚的外壁，则不能被酶降解。因此，取材成为实验成功与否的首要问题。花期短的花瓣，由于其组织鲜嫩，又具有色素标记，是该实验中较好的材料。 实验方法 1．把叶片(或花期短的花瓣)洗净，把表面水吸干。（2人一组）
(完整word版)植物体细胞杂交技术
自学提纲 选修3 2.1.2植物体细胞杂交技术 年级：49 班级：学科：生物（选修三）姓名：日期：2020-5-3【导师寄语】天行健，君子以自强不息！ 【考纲要求】 1、理解植物体细胞杂交技术的流程 2、运用植物体细胞杂交技术解决一些问题 【学习目标】 知识 1、理解植物体细胞杂交技术的基本原理和过程 2、说出植物体细胞杂交的理论和实践意义能力 提高知识的迁移运用能力和设计能力 情感、态度价值观 树立热爱科学、勇于想象、敢于创新的意识 【重、难点】 植物体细胞杂交的操作流程 【知识梳理】 一、植物体细胞杂交技术的出现（阅读课本36页第一段内容，思考：） 1、番茄—马铃薯能否用传统育种方法来实现，为什么？如何来解决这个问题？ 【巩固训练】 1、植物体细胞杂交技术的目的是为获得（） A. 融合的原生质体 B. 杂种植株 C. 杂种细胞 D. 愈伤组织 二、植物体细胞杂交技术（阅读课本36页第二段，思考）★★★ （一）体细胞融合过程 1、植物体细胞杂交遇到的第一个障碍是什么？用什么方法解决？ 2、如何让原生质体融合？具体有哪些方法？ 3、细胞融合完成的标志是什么？与哪种细胞器有关？ （二）植物组织培养过程 流程：杂种细胞愈伤组织杂种植株
【探究】（再次阅读课本图2-5，思考） 1、植物体细胞杂交运用了哪些技术方法，涉及的生物学原理分别是什么？ 2、什么是原生质体？和原生质层有何不同？ 3、将一些A植物细胞和一些B植物细胞诱导融合（不考虑3个或3个以上细胞的融合），最终细胞的种类有哪些？ 【巩固训练】 2、下列关于原生质体的叙述中不正确的是（） A、组成原生质体的主要生命物质是蛋白质和核酸 B、原生质体包括细胞膜、液泡膜及两者之间的原生质 C、被去掉细胞壁的植物细胞是原生质体 D、原生质体可用于植物体细胞杂交 3、如图为“番茄﹣马铃薯”的培育过程示意图，有关叙述正确的是（） A．获得a、b细胞需要胰蛋白酶和果胶酶 B．诱导a、b细胞融合的化学试剂一般用秋水仙素 C．a、b细胞融合为c细胞的原理是生物膜具有流动性 D．d、e、f过程表示植物的组织培养过程，e、f分别为脱分化和再分化 三、植物体细胞杂交的结果和意义（阅读课本37页，思考） 1、植物体细胞杂交技术的意义是什么？ 2、从结果上看杂种植株在遗传上有何特点？从杂种植株的染色体组成上看属于何种变异？ 【巩固训练】 4、下面关于植物体细胞杂交的说法，不正确的是（） A. 杂交的细胞来自不同的物种 B. 打破了物种间的生殖隔离 C. 克服了远缘杂交的障碍 D. 一定能产生人们希望的杂交种 【异想天开】牛细胞与植物体细胞杂交，得到绿色的小奶牛，晒晒太阳就能产牛奶。这种想法能实现吗？
植物体细胞杂交技术知识归纳及试题分析
植物体细胞杂交技术知识归纳及试题分析 黄柏丽（河北省滦平县第一中学 068250）一、知识归纳：
二、试题分析 1．下图为“番茄—马铃薯”的培育过程示意图，有关叙述正确的是( ) A．获得a、b细胞需要胰蛋白酶和果胶酶 B．诱导a、b细胞融合的化学试剂一般用秋水仙素 C．a、b细胞融合为c细胞的原理是生物膜具有流动性 D．d、e、f过程表示植物的组织培养过程，e、f分别为脱分化和再分化 【解析】植物体细胞在杂交之前，须先利用纤维素酶和果胶酶处理体细胞，去除细胞壁，获得有活力的原生质体，故A项错误；诱导a、b细胞融合的化学试剂一般用聚乙二醇（PEG），B项错；a、b细胞融合为c细胞应用的原理是细胞膜的流动性，C项正确；图中d、e、f过程表示植物组织培养过程，d、e分别为脱分化和再分化，D项错误；答案选择C. 2、如图是“白菜——甘蓝”杂种植株的培育过程。下列说法正确的是（） A、图示“白菜—甘蓝”植株不能结籽 B、植物愈伤组织的代谢方式是自养需氧 C、杂种细胞形成杂种植物幼苗过程的细胞分裂方式是减数分裂，遗传物质发生改变 D、“白菜—甘蓝”杂种植株具有的性状是基因选择性表达的结果 【解析】如图所示：有同源染色体，减数分裂正常，可以结籽。愈伤组织的代谢是异养需氧型，因为愈伤组织没有叶绿体，不能进行光合作用。上述过程中包含着有丝分裂和细胞分化等过程，没有减数分裂过程。“白菜—甘蓝”杂种植株并不能表达白菜和甘蓝的所有性状，因为是基因选择性表达的结果。故，只有D项是正确的。 3．关于番茄—马铃薯杂种植株，下列叙述不正确的是( ) A．若番茄细胞内有m条染色体，马铃薯细胞含n条染色体，则“番茄—马铃薯”细胞内含(m＋n)条染色体 B．过程②结束后需要淘汰自身融合的细胞
实验九 植物原生质体的分离和培养
实验九植物原生质体的分离和培养 实验目的 掌握植物原生质体分离和培养的基本方法，并对培养的结果进行初步观察。 实验原理 原生质体是除去细胞壁的裸露细胞。在适宜的培养条件下，分离的原生质体能合成新壁，进行细胞分裂，并再生成完整植株。 植物的幼嫩叶片、子叶、下胚轴、未成熟果肉、花粉四b咻、培养的愈伤组织和悬浮培养细胞均可作为分离原生体的材料来源。 分离愿生厦籀萨采用酶解法。其原理是根据由纤维素酶、罘胶酶和半纤维素酶配制而成的溶液对细胞壁成分的降解作用，而使原生质体释放出来。原生质体的产率和活力与材料来源、生理状态、酶液的组麟，以及原生质体收集方法有关。酶液通常需要保持较高的渗透压，以使原生质体在分离前细胞处于质壁分离状态，分离之后不致膨胀破裂。渗透剂常用甘露醇，山梨醇，葡萄糖或蔗糖。酶液中还应含一定量的钙离子，来稳定原生质膜。游离出来的原生质体可用过筛一低速离心法收集，用蔗糖漂浮法纯既，然后进行培养。 实验用品 一、材料 1.烟草幼苗的叶片、或向日葵无菌苗的叶片、子叶或下胚轴等。 2.胡萝卜根切片诱导的松软愈伤组织。 二、器材 超净工作台、台式离心机或手摇离心机、倒置显微镜、普通显微镜、培养室、灭菌锅、血细胞计数板、石蜡膜带等。 细菌过滤器和0·45μm的滤膜、300目不锈钢网筛及配套的小烧杯、解剖刀、尖头镊子、注射器(5、10m1)和12号长针头、带皮头的刻度移液管(5、10ml，上部管口加棉塞)、培养皿(直径6cm)或扁平培养瓶(50m1)、大培养皿、吸水纸等、使用前需经过灭菌。 三、试剂 1. 70％酒精。 2. 0.1％升汞水溶液，并滴入少许TWeen 80。 3. 灭菌蒸馏水。 4. 0.16mo／L和0.20mo／L CaCl2·2H2O溶液，并加有0.1％MES（2-N-吗啉已烷磺酸）， PH5.8~6.2。 5. 20％和12％蔗糖溶液，pH PH5.8~ 6.2。 6. 酶液A 纤维素酶(cellulase，Onozuka R-10 2％ 果胶酶(13ectinase，Serva) 1 % (若用国产EA3-867纤维索酶，则果胶酶可省去。) 甘露醇0.6 mol／L CaCl2·2H2O 0.05 mol／L MES 0.1％ pH 5．8～6．2 7．酶液B 纤维素酶(Onozuka R-10) 2％
植物细胞工程的基本技术学案
专题2细胞工程 植物细胞工程的基本技术 寄语：用最少的悔恨面对过去。用最少的浪费面对现在。用最多的梦面对未来。【学习目标】1. 简述植物组织培养和植物体细胞杂交技术。 2. 列举植物细胞工程的实际应用。 3. 尝试进行植物组织培养。 【课题重点】1.植物组织培养的原理和过程 2.植物体细胞杂交的原则 【课题难点】植物组织培养的实验 【学习过程】 一、细胞工程 1．概念：应用和的原理和方法，通过或上的操作，按照人的意愿来改变细胞内的或获得的一门综合科学技术。 2．分类：根据操作对象不同，可分为、。 二、植物细胞的全能性（1，2可回顾必修1相关内容） 1、植物细胞的基本结构包括、、、。 2、植物细胞主要的增殖方式是，细胞分化是指，实质是 _____。 3、细胞脱分化是指。 4、全能性是指，表现为全能性的原因是。 5．在理论上，生物的任何一个细胞都具有，但在生物的生长发育过程中，细胞并不表现，而是分化成各种。这是因为特定的时间和空间条件下，细胞中的基因会有地表达出各种，分化形成不同的细胞，从而构成生物体的不同。 三、植物组织培养技术 1．原理：植物细胞具有，具有某种生物全部遗传信息的任何一个细胞，都具有发育成的潜能。 2．过程 离体植物的 _ 组织幼根和芽或胚状体完整植株。 3．细胞脱分化：已的细胞经过诱导后，失去其特有的而转变成未分化细胞的过程。 4．植物组织培养：在和的条件下，将的植物器官、组织、细胞，培养在人工配制的培养基上，给予适宜的培养条件，诱导其产生、丛芽，最终形成完整植株。 四、胡萝卜的组织培养 1、实验原理
生物体细胞一般都是由受精卵经过有丝分裂形成的，因而都含有该生物的全套的遗传信息，都具有发育成完整个体的潜能。因此，植物体的根、茎、叶细胞都具有 ，在一定的营养和激素条件下，可以脱分化形成 。将愈伤组织转接到含有不同激素成分的培养基上，就可以诱导其再分化生成胚状体或丛芽，进而发育成 。 2、实验步骤 ①．将 用自来水充分洗净，削去外皮，并切成段。用酒精棉球擦手 。 ②．在超净工作台(或接种箱)上将胡萝卜段用酒精溶液消毒30s 后，立即用 清洗2～3次，再用 处理30min 后，立即用无菌水清洗2～3次。 ③．用 的滤纸吸去胡萝卜段表面的水分。然后，在 瓷砖上，用无菌的解剖刀将胡萝卜段切成1 cm 厚的横切片，再选取有 的部位，切取1 cm 。左右的小块。 ④．将 接种到培养基上，用锡箔纸封盖瓶口，并用橡皮筋扎紧。然后，在培养瓶上贴上标签，写明材料名称、接种日期和小组号。 ⑤．将接种后的胡萝卜组织块，放在 恒温避光条件下培养。4d 后，检查培养材料的污染情况；14d 后，观察愈伤组织的生长状况。然后，在恒温箱中继续避光培养。在培养过程中，注意定期观察和记录愈伤组织的生长情况。 ⑥．培养一段时间后，将生长良好的 转接到分化培养基上，培养一段时间后，胡萝卜的愈伤组织就可以诱导出 。然后将试管苗移栽到大田，培养成 。 五、植物体细胞杂交技术 1．概念：不同种植物的 ，在一定条件下融合成 ，并把杂种细胞培育成新的 的技术。 2．过程 离体的细胞果胶酶 纤维素酶 ???→?不同细胞原生质体???→?人工诱导原生质体融合 →杂种细胞→杂种植株。 3．植物体细胞杂交步骤： (1)去掉细胞壁，分离出有活力的原生质体，目前最常用的去细胞壁的方法是酶解法，也就是在温和条件下用纤维素酶、果胶酶去除植物细胞的细胞壁。 (2)不同植物体细胞原生质体融合，必须通过物理法和化学法来诱导融合。物理方法有：离心、振动、电激等促使原生质体融合。化学法是用聚乙二醇(PEG)作为诱导剂来诱导融合。融合后再生出细胞壁。 (3)用植物组织培养方法进行培育，可得到杂种植株。 【习题巩固A 级】 1．以下不． 能说明细胞全能性的实验是( ) A ．玉米花粉粒培育出植株 B ．转入贮存蛋白基因的向日葵细胞培育出植株