p38MAPK信号转导通路在肠道病毒71型感染中的作用机制的实验研究

硕士学位论文

论文题目p38MAPK信号转导通路在肠道病毒71型

感染中的作用机制的实验研究

研究生姓名彭宏君

指导教师姓名史伟峰

专业名称临床检验诊断学

研究方向微生物和免疫

论文提交日期2014年3月

p38MAPK信号转导通路在肠道病毒71型

感染中的作用机制的实验研究

中文摘要

目的：探讨肠道病毒71型（EV71）体外感染人树突状细胞（DCs）后启动免疫应答反应的机制，研究p38MAPK信号通路在EV71感染中的作用，为寻找新的药物作用靶位奠定实验基础。

方法：人横纹肌肉瘤（RD）细胞扩增EV71并测定病毒滴度。健康成人外周血单核细胞诱导衍生获得DCs，流式细胞仪检测DCs表面分子的表达；混合淋巴细胞反应（MLR）检测病毒感染后的DCs对初始T细胞的刺激活性；PCR芯片分析DCs 感染EV712h和8h后CD分子、细胞因子及p38MAPK信号通路相关分子基因差异表达；Luminex液相芯片技术检测培养细胞上清液中细胞因子的含量；Western blot 法检测p38MAPK、c-Fos、c-Jun等信号通路关键分子的蛋白表达水平和磷酸化水平，以及p38MAPK信号通路抑制剂（SB203580）对EV71/VP1表达水平的影响。

结果：流式细胞仪检测结果显示DCs高表达特异性分子标志CD83、CD80、CD86和HLA-DR，肿瘤坏死因子-α（TNF-α）刺激的DCs具有诱导初始T淋巴细胞增殖的能力；PCR芯片显示EV71感染2h和8h后p38MAPK信号通路分子相关基因表达发生明显变化，部分基因上调2.02-5.57倍；加入抑制剂SB203580后DCs分泌白细胞介素（IL）-1α、IL-6、IL-12、TNF-α的水平明显下降（P<0.05，α=0.05）；EV71感染激活p38MAPK信号通路。与加毒组相比，SB203580可明显下调p38MAPK激酶的磷酸化水平（P<0.05，α=0.05），转录因子c-Fos、c-Jun的蛋白磷酸化水平也明显受抑（P<0.01，α=0.01）。与对照组相比，感染组细胞病毒蛋白VP1的表达量明显升高，加入SB203580后，VP1表达水平下降（P<0.05，α=0.05）。

结论：EV71感染能增加DCs活力，延长其存活时间，促使其活化并分泌细胞因子，启动宿主细胞相应的免疫应答；DCs中p38MAPK信号通路的激活参与了EV71的复制过程。

关键词：p38MAPK；信号通路；肠道病毒71型；树突状细胞

作者：彭宏君

指导老师：史伟峰

The Experimental Study of t he Effect and Mechanism of p38MAPK Signaling Transduction Pathway on

Enterovirus71Infection

Abstract

Objective:To investigate the mechanism of immune responses in enterovirus71 (EV71)-infected human dendritic cells(DCs)in vitro,and clarify the effect of p38 mitogen-activated protein kinase(MAPK)signaling pathway in EV71infection,which lays the experimental foundation for searching new drug targets.

Methods:EV71was propagated and titrated on rhabdomyosarcoma(RD)cells.Peripheral blood mononuclear cells from the healthy adult peripheral blood were induced into immature DCs by culturing in medium containing cytokines.The markers expressed on DCs surface were analyzed by flow cytometry,and the stimulation of navie T-cell with EV71-infected DCs was examined by mixed-lymphocyte reaction(MLR).PCR array was also employed to detect the differential gene expressions of CD molecules,cytokines and p38MAPK signaling pathway molecules in EV71-infected DCs at2h and8h postinfection. The cytokines in culture supernatants were measured by Luminex liquichip.In addition, the total or phosphorylated proteins of p38,c-Fos and c-Jun in DCs were detected by Western blot,and further analyze the effect of p38MAPK inhibitor(SB203580)on the expression of EV71/VP1.

Results:DCs highly expressed specific molecules by flow cytometry,such as CD83,CD80, CD86and HLA-DR.Furthermore,DCs stimulated by tumor necrosis factor(TNF)-αmay induce navie T-cell proliferation.PCR array revealed that the gene expressions of p38 MAPK signaling pathway associated molecules were significantly up-regulated by2.02to 5.57-fold at2h and8h postinfection.The production of IL-1α,IL-6,IL-12and TNF-αwas distinctly reduced by the addition of the inhibitor SB203580(P<0.05,α=0.05).EV71

infection effectively activated p38MAPK signaling https://www.wendangku.net/doc/ae11597099.html,pared with EV71 infection groups,the phosphorylation of p38MAPK protein was markedly decreased by SB203580(P<0.05,α=0.05),while transcription factors c-Fos and c-Jun were significantly suppressed(P<0.01,α=0.01).Compared with control group,the expression of VP1in EV71infection was remarkably elevated.However,the inhibitor SB203580remarkably decrease the level of EV71/VP1(P<0.05,α=0.05).

Conclusion:It indicates that EV71infection not only can increase the viability,survival time and activation of DCs,but also can significantly increase releases of cytokines in DCs,which initiate immune response in host cells.Meanwhile,p38MAPK signaling pathway is required for EV71replication in DCs.

Key words:p38MAPK;signaling pathway;enterovirus71;dendritic cells

Written by:Hongjun Peng

Supervised by:Weifeng Shi

目录

引言 (1)

第一部分病毒感染、扩增及滴度的测定 (4)

1材料 (4)

2方法 (5)

3结果 (7)

4讨论 (9)

第二部分肠道病毒71型体外感染人树突状细胞后启动免疫应答反应的研究 (10)

1材料 (10)

2方法 (11)

3结果 (14)

4讨论 (18)

第三部分P38MAPK信号通路在EV71感染中的作用机制的实验研究 (20)

1材料 (20)

2方法 (22)

3结果 (26)

4讨论 (33)

参考文献 (35)

结论与展望 (38)

综述 (39)

参考文献 (47)

攻读硕士学位期间公开发表的学术论文 (52)

中英文对照缩略词表 (53)

致谢 (55)

引言

HFMD是由肠道病毒感染引起的一种急性传染病，主要通过密切接触或消化道传播，多发生于10岁以下的婴幼儿，以手、足、口腔等部位皮肤粘膜的皮疹、疱疹、溃疡为典型表现，个别患者可引起心肌炎、肺水肿、无菌性脑膜脑炎等严重并发症[1]。引起HFMD的病毒有20多种，如：EV71、柯萨奇病毒A组4、5、9、10、16型等和B组2、5型等、人类肠道致细胞病变孤儿病毒及其他肠道病毒，其中以EV71和柯萨奇病毒A16最为常见[2]。EV71引起的HFMD一般症状较重，部分患者可伴有无菌性脑脊髓膜炎、脑炎、心肌炎和脑麻痹后遗症等[3]。

EV71为单股正链RNA病毒，属于小RNA病毒科肠道病毒属成员，归属于人类肠道病毒A[4]。1974年Schmidt等人首次报道从美国加利福尼亚暴发的表现为神经系统症状疾病（1969～1973年）的患者中分离到EV71，随后，世界上许多国家相继报道了EV71在不同地区的流行情况[5]。迄今为止，EV71感染已在全球引起3次大范围的暴发与流行。近年来，EV71的流行在亚太地区呈上升趋势，1975年保加利亚大流行，共有705名患儿感染，死亡44例；1997年马来西亚大流行感染2628人，死亡30多人；1998年，台湾地区暴发EV71的大流行，约有12万以上的人被感染，死亡78人[6]。2011年1～11月我国累计报告HFMD病例1496048例，其中重症病例17775例，死亡467人[7]。目前针对病毒感染的防治主要有抗病毒化学合成药物及外源性细胞因子等，但临床应用效果仍不理想。

EV71病毒颗粒为直径24～30nm的二十面体立体对称球形结构，无包膜和突起，核心为一条长约7.4kb的正链RNA。病毒基因组为7408个核苷酸，其5'端共价结合一个约23个氨基酸的基本蛋白VPg，其与病毒RNA合成和装配有关；3'端带有约50个核苷酸的polyA尾，与病毒的感染性有关[8-9]。病毒只有一个开放读码框，编码2194个氨基酸，组成多聚蛋白；该多聚蛋白可被进一步水解成P1、P2、P3三个前体蛋白，P1前体蛋白编码VP1、VP2、VP3和VP4四种病毒结构蛋白，如图1所示[10]。VP1蛋白暴露于病毒表面，是病毒中和的主要决定因素，决定病毒抗原性。EV71感染时VP1大量合成，VP1蛋白在病毒表面形成的峡谷样结构与宿主细胞表面受体分子特异性结合，病毒空间构象改变，脱去衣壳，基因组RNA进入胞质进行复制，并翻译出

多聚蛋白，经酶切后形成病毒结构蛋白和功能蛋白[11]。

图1肠道病毒基因组结构和多聚蛋白的后续裂解示意图

VP1基因具有与病毒血清型完全对应的遗传多样性，其不仅可作为肠道病毒属内不同血清型分类的依据，并可作为小RNA病毒科内不同属的分类参考；目前基于VP1核苷酸序列的差异，可将EV71分为A、B、C三个基因型，A型仅包括原型株BrCr-CA-70；B型和C型又可进一步分为B1、B2、B3、B4、B5以及C1、C2、C3、C4和C5亚型[12-13]。本实验采用的病毒株为EV71原型株，即美国EV71BrCr，属于A型。由于EV71致病机制和免疫应答机制尚未阐明，各病毒疫苗尚在研究阶段，全球尚未批准使用EV71疫苗。因此，明确EV71的分子致病及免疫应答机制、开发有效的抗病毒药物、制备有效疫苗进行预防等问题需要重点关注。

DCs是目前已知的体内功能最强的抗原提呈细胞（APC），能够摄取、加工处理和提呈抗原，启动适应性免疫应答；它分布于机体所有器官的组织、体液循环和淋巴器官中，是机体防御系统的“哨兵”；当病毒通过皮肤、粘膜或者直接通过血液进入机体，在感染早期就会遭遇到DCs[14]。DCs可以被许多种不同的病毒感染，同时具有强大的摄取坏死、凋亡病毒感染细胞能力，在淋巴结激活病毒抗原特异的淋巴细胞中，被认为是参与T细胞活化最主要的APC。DCs最大的特点是能够显著刺激初始T 细胞增殖，是机体适应性T细胞免疫应答的始动者[15]。DCs根据表面标志及分泌的细胞因子主要分为髓系DCs(mDCs)和淋巴系DCs（pDCs）两大类，能选择性诱导Th0向Th1和Th2方向分化，从而调控T淋巴细胞免疫应答的类型，发挥免疫调节作用[16]。已有的研究表明，人类未成熟的DCs能够促进多种病毒复制，如单纯疱疹病毒（HSV）能够有效感染未成熟DCs，但不能感染单核细胞和成熟的DCs[17]；EV71既能感染单核细胞和成熟DCs也能感染未成熟DCs，但是前者产生的病毒量远远低于后者[18]。

因此，我们分离健康成人外周血中的单核细胞，加入重组人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（rhGM-CSF）和重组人白细胞介素-4（rhIL-4）诱导培养，获得未成熟DCs，采用EV71（MOI=5）感染DCs并进一步探讨细胞经病毒感染后启动免疫应答反应，为深入研究EV71的致病机制及宿主免疫应答提供理论依据。

丝裂原活化蛋白激酶（MAPKs）家族的信号通路是将细胞外信号传递至细胞核，引起基因表达改变的重要信号通路，对细胞增殖、分化、凋亡、坏死具有重要调控作用[19]。按其功能主要分为两类：一类是细胞外信号调节激酶（ERK）信号通路，主要功能是促进细胞增殖与分化（抑凋亡作用）；另一类是c-Jun氨基末端激酶/应激活化蛋白激酶（JNK/SAPK）信号通路和p38MAPK信号通路，主要功能是促进细胞凋亡与死亡，而宿主细胞凋亡在病毒感染发病过程中起着至关重要的作用[20]。MAPKs激酶，尤其是JNK/SAPK和p38MAPK往往参与病毒介导的细胞凋亡[21]。研究证实，EV71在体内和体外都会导致宿主细胞的凋亡。

本课题拟应用p38MAPK特异性抑制剂SB203580阻断细胞信号通路，观察通路蛋白分子活性变化及病毒复制指标VP1蛋白在DCs中的表达变化，进一步探讨DCs 中p38MAPK信号通路活化在EV71复制中的作用，为寻找药物作用靶位奠定实验基础。

第一部分病毒感染、扩增及滴度的测定

1材料

1.1细胞株和病毒株

（1）细胞株RD细胞由中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心提供；（2）病毒株EV71病毒株GDV083（BrCr）购自中国典型培养物保藏中心。

1.2主要试剂和材料

DMEM/HIGH GLUCOSE培养基美国Hyclone公司

特级胎牛血清（FBS）美国Gibco公司

Trypsin EDTA1×美国Mediatech公司

10×PBS(PH7.2-7.4)生化试剂北京索莱宝科技有限公司

二甲基亚砜（DMSO）美国Amresco公司

细胞培养瓶、培养板、离心管、冻存管美国Corning公司

1.3主要的仪器设备

超净工作台苏州安泰空气技术有限公司

液氮生物容器成都金凤液氮容器有限公司

超低温保存箱青岛海尔特种电器有限公司

摩尔实验室超纯水器（细胞型）上海摩勒科学仪器有限公司

电热恒温水浴锅上海一恒科学仪器有限公司

低速离心机安徽中科中佳科学仪器有限公司CO2培养箱上海一恒科学仪器有限公司

倒置荧光显微镜德国Leica公司

1.4主要溶液的配制

（1）每100ml含20%FBS的DMEM培养基：20ml FBS+80ml DMEM培养基

（2）每100ml含10%FBS的DMEM培养基：10ml FBS+90ml DMEM培养基

（3）每100ml0.25%胰蛋白酶：25ml胰蛋白酶+75ml PBS（1×）

（4）每100ml冻存液：10ml DMSO+20ml FBS+70ml DMEM培养基

（5）每100ml维持液：2ml FBS+98ml DMEM培养基

2方法

2.1RD细胞复苏

（1）采用75％乙醇消毒液擦拭提前经紫外线照射30min的超净工作台台面，在超净工作台中按次序摆放好消毒过的枪头、离心管、培养瓶等；

（2）根据细胞冻存记录按标签找到所需细胞的编号，从液氮生物容器中取出细胞，同时核对管外编号；

（3）迅速将冻存管投入到已经预热的37℃电热恒温水浴锅中迅速且剧烈的晃动冻存管，使管中的液体在1min内迅速融解；

（4）用酒精棉球擦拭冻存管的外壁，放入超净工作台内；

（5）将冻存管中的细胞冻存液取出，移入到离心管中，加培养基至10ml，用移液枪轻轻吹打混匀，1500r/min，离心10min；

（6）弃去上清液，向离心管内加入5ml含20%FBS的DMEM培养基，吹打制成细胞悬液并移至25cm2培养瓶内；

（7）将培养瓶置于37℃、5％CO2的培养箱内培养，24h后换液，继续培养至细胞长满时进行细胞传代。

2.2细胞的传代培养（以下操作以25cm2的细胞培养瓶培养的RD细胞为例）（1）待细胞生长融合度达90%时，倒掉瓶内旧培养基，用1×PBS轻轻洗涤两次，去除死细胞和残留血清；

（2）向25cm2培养瓶内加入lml四倍稀释后的胰酶消化，轻摇培养瓶，使消化液流经所有细胞的表面，倒掉消化液，再加入1ml新的消化液，置于37℃培养箱内1min；（3）在倒置荧光显微镜下观察，当细胞胞质回缩，胞间间隙增大时，加入三倍于胰

酶量的含有血清的培养基终止消化；

（4）用移液器吸取培养液，反复多次轻轻吹打瓶壁，制备细胞悬液。吹打的部位应均匀，可按从上到下，从左到右的顺序进行，保证瓶底各个部位的细胞都能被吹到，此外吹打时不能用力过猛，尽量不出现气泡，以免损伤细胞；

（5）将吹打后的细胞置于倒置显微镜下观察，当发现原贴壁细胞均已悬浮于培养液中，成片的细胞已分散成小的细胞团或单个细胞时即可终止吹打；

（6）收集细胞于离心管中，1000r/min，离心5min，弃去上清液；

（7）加入新的培养基重悬，分装至3小瓶，置于37℃，含5%的CO2培养箱中继续培养。

2.2.33细胞冻存

（1）选择处于对数生长期的细胞收集于离心管中，1000r/min，离心5min；

（2）弃去上清液，加入冻存液1ml，用吸管轻轻吹打使细胞均匀，将上述细胞装于专用冻存管中，封口保存。在冻存管上标记好细胞名称和冻存日期，作好登记（日期、细胞种类及代次、冻存支数）。细胞浓度在3×106～1×107/ml之间；

（3）降温方法：先将冻存管置于4℃冰箱中预冷30min，然后移至冰箱冷冻室（-20℃）内60min，再移至-70℃冰箱过夜，第二天将冻存的细胞迅速移至液氮生物容器中保存。

2.4病毒感染扩增

（1）待细胞生长融合度达90%时，倒掉瓶内旧培养基，用1×PBS轻轻洗涤两次，以去除死细胞和残留血清；

（2）取1ml病毒原液加入细胞培养瓶内并使其覆盖瓶底细胞，置37℃、5%CO2培养箱中孵育1.5h，使病毒吸附到细胞上。在此期间不要移动细胞培养板，并保证病毒液能完全覆盖细胞；

（3）弃去病毒感染液，再加入2ml维持液，培养至24h开始观察细胞病变效应（CPE）；（4）待CPE明显时，用枪头将细胞冲洗下来，收集细胞液，用于后续试验。

2.5病毒滴度测定

（1）取对数生长期的RD细胞，调整细胞浓度为1.5×105个/ml，制备10ml细胞悬

液；

（2）取一块无菌96孔板，每孔加细胞悬液100μl，置37℃、5%CO2环境下培养；（3）待细胞长到约80%孔底面积时，加病毒；

（4）将EV71连续10倍递次稀释为10-1～10-8，将各稀释度的病毒接种于RD细胞中，每孔50μl，于37℃吸附1.5h后弃上清；

（5）每孔加入无血清DMEM培养基100μl，混匀，然后弃去，重复此步骤3次；（6）每孔加入含有2%FBS的DMEM培养基100μl，于37℃、5%CO2的条件下继续培养，设正常细胞对照；

（7）逐日观察病毒致细胞病变，记录病变程度，待细胞病变不再继续(约4～5d)，判定结果，细胞病变率达50%及以上的培养孔为病变孔，细胞病变率小于50%者为非病变孔；

（8）根据Reed-Muench法计算病毒半数组织感染剂量（TCID50）。

3结果

3.1病毒感染扩增

倒置显微镜下观察，RD细胞贴壁生长，细胞边界清楚，形态呈相对规则的梭形（图1-1A）；EV71病毒在细胞中的繁殖和复制引起细胞形态的改变，病毒感染初期，细胞的形态由梭形逐渐转变成圆形(图1-1B)；在病毒感染后期，细胞核出现明显的固缩现象，最后发展为细胞脱落，出现明显的CPE（图1-1C）。

注：A:正常RD细胞形态；B病毒感染初期RD细胞形态；C：病毒感染后期RD细胞形态。

图1-1EV71感染RD细胞前后形态变化（×200）

Fig1-1The morphology of RD cells were observed and photographed under inverted

microscopy before and after EV71infection（×200）

由于RD细胞是肠道病毒的敏感细胞，当接种病毒后，能观察到明显的病变效应：细胞变圆，从细胞壁脱落并形成噬斑，且这种病变效应出现病毒浓度梯度效应。收集病毒感染液，做二次感染，同样观察到24h开始出现病变效应，48h观察到明显的CPE。待CPE达+++～++++时（0～25%的细胞出现病变记录为“+”；25%～50%的细胞出现病变记录为“++”；50%～75%的细胞出现病变记录为“+++”；75%～100%的细胞出现病变记录为“++++”），收集病变细胞液，-70℃条件下保存，由此得到病毒液。

3.2病毒滴度测定

（1）用倒置显微镜逐日观察CPE，记录病变程度。按公式计算出该病毒液的TCID50（表1-1）。

表1-1EV71各稀释度的CPE数

Table1-1The CPE numbers in different EV71dilutions

病毒稀释度接种孔数CPE+CPE_累积CPE+累积CPE_CPE+%百分比（%）10-188051051/51100%

10-288043043/43100%

10-388035035/35100%

10-488027027/27100%

10-587119119/2095%

10-685312412/1675%

10-7835797/1643.75%

10-88264154/1921%

10-98262212/238.70%

10-108080290/290

（2）由表看出，能使50%细胞孔出现病变的病毒稀释度在10-6～10-7之间，其中距离比例按Reed-Muench公式计算：

距离比例=（高于50%的百分数-50%）/（高于50%的百分数-低于50%的百分数）=（75%-50%）/（75%-43.75%）

=0.8

LogTCID50=︱高于50%的病毒稀释度的对数︱+距离比例×︱稀释度对数之间的差︱=︱(－6)+0.8×(－1)︱

=6.8

TCID50=106.8/0.1ml

=107.8

=6.3×107

(3)TCID50与PFU、MOI之间的换算关系：

PFU=0.7×TCID50

=0.7×6.3×107

=4.4×107

MOI=PFU/cells

4讨论

EV71能在RD细胞培养中有效复制扩增，并引起典型的细胞病变，因此，通常采用RD细胞扩增EV71。

细胞病变是特定的病毒与细胞之间相互作用的结果，培养基成分、培养温度以及病毒感染时细胞的“年龄”和代谢强度等因素都会对细胞病变的产生及其严重程度造成影响。但是，组织培养细胞内细胞病变的出现，一般可认为是病毒增殖的确切证据。虽然接种物内的非特异性毒性物质也可能引起细胞病变，但是这种非特异性细胞病变在继续传代时消失；由病毒引起的细胞病变，则因病毒对细胞培养物的适应，细胞病变在传代过程中不仅产生时间可能提早，而且病变的严重程度也会增高。细胞病变通常在低倍显微镜下观察，一般每天检查1～2次，诸如细胞的皱缩、细胞浆的颗粒变性以及细胞的变性脱落等都可在不染色的情况下观察到。

在测定病毒滴度的过程中，要求培养瓶中的细胞单层均匀生长，形态和状态良好。在计算每一排中出现CPE的孔数时，只要有一些细胞出现CPE即为阳性，如果无法确定，可与阴性对照比较。如果阴性对照中无任何CPE且细胞生长良好，最低稀释度100%阳性，最高稀释度100%阴性，则本测试有效。为了减少观察的主观性对实验结果的影响，可采取同一培养板由多名技术员独立计数病变孔数或对同一批病毒多次检测其滴度。

第二部分肠道病毒71型体外感染人树突状细胞后

启动免疫应答反应的研究

1材料

1.1外周血

外周血取自苏州大学附属第三医院肿瘤生物诊疗中心，经血细胞分离机分离获得单个核细胞。

1.2主要试剂和材料

淋巴细胞分离液（1.077g/ml）美国Signalway Antibody公司

改良型RPMI1640培养基美国Hyclone公司

rhGM-CSF海南通用同盟药业有限公司

rhIL-4美国PeproTech公司

rhTNF-α美国PeproTech公司

美国Beckman Coulter公司

PE标记的鼠抗人IgG1阴性对照、CD80、

CD83、CD86、HLA-DR、FITC标记的鼠

抗人IgG1阴性对照和CD3抗体

Trizol美国Invitrogen公司

氯仿上海申玻化工有限公司

异丙醇江苏强盛功能化学公司

无水乙醇江苏强盛功能化学公司

SYBR MasterMix（CTB103）常州楚天生物科技有限公司

反转录试剂盒（CTB101）常州楚天生物科技有限公司

引物美国Maxim Biotech公司

PCR芯片常州楚天生物科技有限公司

WST-1细胞增殖及细胞毒性检测试剂盒碧云天生物技术研究所

Human Cytokines/Chemokines Panel德国默克密理博公司