高中生物比浊计、光电比色计和分光光度计的比较和考题应用

选修释疑】比浊计、光电比色计和分光光度计的比较和考题应用

原创：徐文新浙江生物

浙科版必修3教材酵母菌数量的计数用到了比浊法或比色法，比浊法是怎么样的一种方法？选修1亚硝酸盐的测定中用到了光电比色法，那么比浊计、光电比色计和分光光度计有什么区别呢？

先看一道刚刚考过的高三入学试题：

已知氨和纳氏试剂反应生成淡红色络合物，用光程为1cm的比色杯在570nm 处测定光密度值，若光密度值偏低，应选择

（A.增大光程，光波长不变 B.增大光程，光波长增加

C.减小光程，光波长不变

D.减小光程，光波长不变）

你会选择哪个答案？为什么呢？什么是光程？为什么这个实验是570nm而不是550nm？一系列的问题困扰着了许多老师和同学。

让我们把这个测定方法的“前世今生”理一理。解析看下面，答案见文章最后。首先比浊计、光电比色计和分光光度计原理原理是相同的，实验方法也相似。通常，比色计或分光光度计都可用于比浊分析。也有专门用于比浊分析的仪器，即浊度计或比浊计。

一、比浊法简单介绍

比浊法又称浊度测定法。为测量透过悬浮质点介质的光强度来确定悬浮物质浓度的方法，这是一种光散射测量技术。

免疫比浊法，散射比浊法，光扫描比浊法，乳胶比浊法，光电比浊法，微生物比浊法等十余类。

在水质监测和管理过程中，比浊法常用于测量饮用水、工业用水、废水的透明度；也用于测量空气及其他各种气体中悬浮固体的含量，是空气和水污染研究的一种工具。在酿造工业中，比浊法常用于各种饮料澄清过程的控制和过滤过程的监控。

二、光电比浊计数法原理

细菌菌体是不透光的，光束通过细菌悬液，将会由于被散射或被吸收而降低其透过量。细菌悬液的浓度同光密度成正比，同透光度成反比，而光密度或透光度可以借光电池精确测出。所以可用光电比浊计来测定细菌相对数目。可先用血球计数板计数，再将菌悬液分别稀释调整为每毫升含不同的菌数，通过分光光度计分别测定其光密度（尽量控制光密度值在0.1-0.65之间，以得到较高精确度）。然后以光密度（OD）作纵坐标，以每毫升不同菌数为横坐标绘制标准曲线。再将待测菌悬液适当稀释，同法进行比浊测定，根据所测光密度值就可以从标准曲线上查得每毫升的细菌数。此法简便、迅速，可以节省许多稀释平板计数法的时间，便于在生产实践中控制细胞的数目。但颜色太深的样品或在样品中还含有其他物质的悬液，不能用此法测定。

三、光电比色计比分光光度计要落后

光电比色法是在光电比色计上测量一系列标准溶液的吸光度，将吸光度对浓度作图，绘制工作曲线，然后根据待测组分溶液的吸光度在工作曲线上查得其浓度或含量。与目视比色法相比，光电比色法消除了主观误差，提高了测量准确度，而且可以通过选择滤光片来消除干扰，从而提高了选择性。但光电比色计采用钨灯光源和滤光片，只适用于可见光谱区和只能得到一定波长范围的复合光，而不是单色光束，还有其他一些局限，使它无论在测量的准确度、灵敏度和应用范围上都不如紫外-可见分光光度计。20 世纪30～60年代，是比色法发展的旺盛时期，此后就逐渐为分光光度法所代替。

四、分光光度技术

有色溶液对光线有选择性的吸收作用，不同物质由于其分子结构不同，对不同波长线的吸收能力也不同，因此，每种物质都具有其特异的吸收光谱。有些无色溶液，光虽对可见光无吸收作光光度技术吸收用，但所含物质可以吸收特定波长的紫外线或红外线。分光谱来鉴定物质性质及含量的技术，其理论依据是(分光光度法)主要是指利用物质特有的Lambert和Beer定律。分光光度法是比色法的发展。比色法只限于在可见光区，分光光度法则可以扩展到紫外光区和红外光区。比色法用的单色光是来自滤光片，谱带宽度从40－120nm，精度不高，分光光度法则要求近于真正单色光，其光谱带宽最大不超过3－5nm，在紫外区可到1nm以下，来自棱镜或光栅，具有较高的精度。

五、物理原理简单介绍

六、几个重要问题分析

1、入射光波长的选择

选择被测物质的最大吸收波长作为入射光波长。这样，灵敏度较高，偏离朗伯-比耳定律的程度减小。当有干扰物质存在时，应根据“吸收最大、干扰最小”的原则选择入射光波长。

请注意：光程就是指溶液的厚度，通俗地说，比色杯的光程指的是单色光线通过的路程（光程）。1厘米比色杯是指入射光通过该比色杯溶液的路程（光程）是1厘米。改变比色杯规格就能改变OD值，前面题目中说OD值偏小，所以要增大光程。

那么，能不能改变波长来调节呢？

通过滤光片的选择，可以决定哪种波长比较合适。滤光片的选择应该与待测溶液的颜色呈“互补色”。因为互补色能够最大限度的被溶液吸收。测样品时该用哪个波长,取决于你要测定的东西的光谱特性, 细菌个体用600, 化学显色物质可能会用到450, 550等等。我们看下面

一幅图：

应选用lmax处或肩峰处测定，此时干扰组分、溶剂等不吸收或有很弱的吸收。

可见，选择什么的波长并不是随机的，也不是任意可以改变的。

2、如何控制适当的吸光度范围：

一般应控制标准溶液和被测试液的吸光度在0.15－0.8范围内，可以从以下两方面来考虑：

①控制溶液的浓度；

②选择不同厚度的吸收池。

3、对照组一定是蒸馏水吗？如何选择适当的参比溶液

参比溶液是用来调节仪器工作零点的，若参比溶液选得不适当，则对测量读数准确度的影响较大。

①纯溶剂空白：当试液、试剂、显色剂均在测定波长处无吸收时，可用蒸馏水作参比液，称纯溶剂空白。

②试液空白：试剂和显色剂均无色时，而被测溶液中其他离子有色时，应采用不加显色剂的试液溶液作参比液，称试液空白。

③试剂空白：试剂和显色剂均有颜色时，可将一份试液加入适当掩蔽剂，将被测组分掩蔽起来，使之不再与显色剂作用，然后把显色剂、试剂均按试液测定方法加入，以此做参比溶液，称试剂空白。

总结：

比色杯

用光程为1cm的比色杯在570nm处测定光密度值，若光密度值偏低，应选择（A.增大光程，光波长不变 B.增大光程，光波长增加

C.减小光程，光波长不变

D.减小光程，光波长不变）

答案：A