关于CCD温度的重要性
——————————————————————————————————————————1. 关于CCD温度的重要性
通过活体光学成像技术的发展历史，可以知道－70度是胜任活体动物光学成像检测的最低温度要求。如果高于此温度，由于过高的暗电流和阅读噪音，将导致灵敏度不能满足实验的需要，给实验带来很大的不利。德国某公司活体成像系统的CCD由于制冷原理的限制，CCD的温度采用环境温度下多少度的表示方式，如NC320的温度是>-△60度，NC100的温度是>-△80度，按照实验室的通常温度25度计算，那分别是-35度和-60度，所以该公司的暗电流和阅读噪音是以-35度和-60度的值来表示。而那些对于信/噪比起关键作用的参数由于温度的限制而远远高于同类产品，导致该产品的灵敏度很低。
2. 关于小动物活体成像技术的起源与发展
活体动物体内光学成像主要采用生物发光与荧光两种技术。生物发光是用荧光素酶基因标记细胞或DNA，而荧光技术则采用荧光报告基团（GFP、RFP, Cy5及Cy7等）进行标记。该技术最初是由美国斯坦福大学的科学家采用了世界上最优秀的高性能CCD研发与生产制造商Roper scientific公司最新研发的背部薄化、背照射冷CCD，配合密闭性非常好的暗箱，使得直接监控活体生物体内的细胞活动和基因行为成为现实。科学家借此可以观测活体动物体内肿瘤的生长及转移、感染性疾病发展过程、特定基因的表达等生物学过程。所以说该技术是伴随着背部薄化、背照射冷CCD的产生而产生，并随着该CCD技术的发展而发展。由于具有更高量子效率CCD的问世，使活体动物体内光学成像技术具有越来越高的灵敏度，对肿瘤微小转移灶的检测灵敏度极高。在该技术诞生后的5、6年间，科学家借此取得了大量的科学成果，发表了几百篇文献资料，大部分都是应用以背部薄化、背照射冷CCD为核心部件的成像系统而得出的。活体动物光学成像技术的应用史，就是生物学家应用背部薄化、背照射冷CCD进行生物微弱发光检测的应用史。没有背部薄化、背照射冷CCD，就没有活体动物光学成像技术的诞生和发展。背部薄化、背照射冷CCD之所以促进活体动物光学成像技术的发展，主要是由于超低温的CCD芯片，CCD镜头温度越低，噪音越小，信噪比越好，灵敏度越高。正是由于背部薄化、背照射冷CCD对动物微弱发光的极高的灵敏度，才使得该项技术得到广泛的应用。由于卓越的背照射冷CCD技术的问世，科学家利用此技术进行了大量的研究，才使近年来产生了大量的高水平的应用活体成像技术进行肿瘤学、基因治疗、流行病学等研究的文献，极大的促进了生物医学在分子成像方面的发展。
3. 活体成像仪器与数码相机都使用CCD，二者对于CCD的性能有什么不同的要求？
用于活体成像技术的CCD与我们通常的数码相机同样都是使用的CCD，只不过由于要求不一样，所以性能和评价指标完全不一样。动物体内的发光信号到达体表，信号非常微弱，要检测这样的信号，需要CCD有许多特殊的性能。我们一般理解数码相机的好坏用分辨率指标，看得越清楚越好，而用于活体成像的CCD，看的是灵敏度。数码相机是讲究看的很清楚，焦距如何调节，暴光、快门，而活体成像是讲究灵敏度，能看到是最主要的。分辨率的提高是很容易实现的，一般的数码相机已经达到600万像素，价格也只有几千块钱，而用于活体成像的CCD是背部薄化、背照射冷CCD，那种CCD是目前已经知道的CCD当中，价格最昂贵的。活体成像系统之所以价格很昂贵，就是由于背部薄化、背照射冷CCD的制造成本很高，有很多专利技术。采用这种技术的公司有美国xenogen公司，美国roper公司的仪器。
4. 科学家在活体成像技术诞生之初是如何进行CCD的选择的？
诚实的讲，斯坦福的科学家在这方面进行了很多探索和尝试，他们在2000年-2001年仪器研发之初写过很多文献，探讨这些问题。是关于仪器的设计的。那时科学发展的必经之路。我觉得那些探索和尝试是有说服力的，是科学的态度和精神，抓住了问题的本质。在该技术诞生之初，科学家就对此进行的探索，见如下文献：In vivo imaging of light-emitting probes Journal of Biomedical Optics 6(4), 432–440 October 2001 文中详细描述了活体动物光学成像技术对CCD的特殊要求。文中详细描述了应用在活体成像实验中的CCD的性能要求：背部薄化、背照射冷CCD。并指出了背部薄化、背照射冷CCD是用于活体成像技术的最合适的CCD的选择。活体生物发光成像技术随着背部薄化、背照射冷CCD技术的产生而产生，并随着该CCD技术的发展而发展。背照射、背部薄化冷CCD是经过探索得出的结论，灵敏度是最本质的需要，有过很多比较和尝试，最后才形成共识。
——————————————————————————————————————————5. 关于CCD的“背部薄化、背照射”与“冷”的确切含义是什么？
之所以叫冷CCD，是由于CCD的芯片温度下降到零下700C或1100C，可以降低噪音，提高检测的灵敏度。Cryogenic 的制冷技术可以使CCD的温度达到-700C到 -1100C，那样的温度可以使背照射冷CCD的暗电流减少到可忽略不计的水平。该CCD的2erms的电子噪音代表了最小的噪音底线，信号强度肯定会大于那样的噪音水平，使该CCD具有很高的信噪比，检测的特异性很强。
关于CCD的前照射与背照射的问题。前照射CCD，在光信号到达CCD芯片之间的光路上有多硅层和二氧化硅层，那将减少CCD的量子效率，造成光信号的衰减，降低灵敏度。背照射、背部薄化CCD则是在光信号到达CCD芯片之间的光路上去掉了多硅层和二氧化硅层，那大大提高了检测的效率，但是同时极大的增加了生产的成本。所以活体光学成像系统才有那令人费解的高昂的价格。但对于较强的荧光信号来说，不需要很灵敏的CCD就可以检测到，多硅层和二氧化硅层还可以起到保护芯片的作用。所以一般单纯检测荧光，一般用前照射的CCD，检测生物发光和荧光，则建议用背照射的CCD。在体外实验中，一般都是用前照射的CCD，可以说在生物学的大部分实验中所使用的都是前照射的CCD，背照射的CCD，只有在检测非常微弱的生发光信号时才有用武之地。下图是前照射CCD与背照射的CCD原理结构图。
6. 关于调节视野，是移动动物平台好，还是移动CCD相机好？
无论平台的上下移动还是CCD的移动都是为了实现视野的调节，是调节CCD相对于检测小鼠的距离。CCD 在温暖降低时，物理性质会变的很脆，移动不利于CCD的保护，故对用于活体成像的温度在-70度以上的CCD，通过移动动物平台的方法实现视野大小的转换是理想的选择。
7. 如何判断活体光学成像仪器的性能优劣？
活体生物发光成像技术最初是由美国斯坦福大学的科学家采用了背部薄化、背照射冷CCD，配合密闭性非常好的暗箱，使得直接监控活体生物体内的细胞活动和基因行为成为现实。之所以要求冷CCD，是因为降低温度可以降低暗电流和电子噪音，使背景噪音可以达到几乎忽略不计的水平；之所以要求背部薄化，是为了减少光源与CCD感光芯片之间的光路介质，提高量子效率，最大限度的捕捉光信号。活体生物发光成像系统的核心参数是CCD的温度、量子效率，其他的参数都是围绕这些参数而衍生出来的。所有的参数的优化都是为了实现一个目的：提高灵敏度，提高信噪比。CCD温度越低，暗电流和电子噪音越低，导致噪音越低，从而能够检测的最低信号越低。量子效率代表检测光子的效率，一般检测生物发光的CCD量子效率要求至少在检测波段是85%以上。以背部薄化、背照射冷CCD为核心组成的系统是唯一适合进行活体生物发光检测的仪器。