高温_淀粉酶菌的产酶条件_酶性质与环境应用研究

第27卷第4期

2007年4月

环　境　科　学　学　报　Acta Scientiae Circu m stantiae

Vol .27,No .4Ap r .,2007

基金项目:广东省科技攻关项目(No .2003A3040404)

Supported by the Science p r oject of Guangdong Pr ovince (No .2003A3040404)作者简介:王春铭(1975—),女,博士研究生;E 2mail:m irian88@https://www.wendangku.net/doc/a914997587.html,;3通讯作者(责任作者),E 2mail:leihengyi@https://www.wendangku.net/doc/a914997587.html, B i ography:WANG Chunm ing (1975—),fe male,Ph .D.candidate;3Correspond i n g author ,E 2mail:leihengyi@https://www.wendangku.net/doc/a914997587.html,

王春铭,雷恒毅,王国惠,等.2007.高温α2淀粉酶菌的产酶条件、酶性质与环境应用研究[J ].环境科学学报,27(4):600-607

W ang C M ,Lei H Y,W ang G H,et al .2007.Generating conditi ons and p r operties of the ther mo 2

α2a mylase fr om a strain and envir onmental app licati on of the strain[J ].Acta Scientiae Circum stantiae,27(4):600-607

高温α2淀粉酶菌的产酶条件、酶性质与环境应用研究

王春铭

1,2

,雷恒毅

1,3

,王国惠1,陈桂珠1,李丕学2,黄洁妍

1

1.中山大学环境科学与工程学院,广州510275

2.湛江市环境保护局,湛江524022

收稿日期:2006203223 修回日期:2006212201 录用日期:2006212229

摘要:从堆肥中筛选到一株能在55℃生长并分泌高温α2淀粉酶的菌株,经初步鉴定为地衣芽孢杆菌,命名为B acillus lichenifor m is Z D 28.在液体筛选培养基的碳源为乳糖、氮源为(NH 4)2S O 4,通气量为10%、pH 值及C /N 比分别为8和3/1、65℃的条件下,培养24h 的菌株产酶量最高.酶学性质研究表明,该酶最适pH 值为8,最适反应温度为95℃;95℃下保温60m in 后酶活仅损失4.8%;较低浓度Ca 2+存在下,该酶即可有很好的稳定性.污泥有机质降解实验表明,培养了22h 的菌株对污泥有机质降解能力最强;将高温α2淀粉酶活性增加2倍后(为2×104U ?mL -1),添加到经过不同处理的污泥中,其有机质降解率、脱氢酶增加率和S OUR 增加率平均增加17.1%、76.9%、27.3%;在污泥中添加011mmol ?L -1

CaCl 2后,其有机质降解率、脱氢酶增加率、S OUR 增加率平均增加7.1%、20.4%、3.4%.

关键词:高温α2淀粉酶;产酶条件;酶性质;环境应用

文章编号:025322468(2007)0420600208 中图分类号:X172 文献标识码:A

Genera ti n g cond iti on s and properti es of the ther m o 2α2am yl a se fro m a stra i n and

env i ronm en ta l appli ca ti on of the stra i n

WANG Chun m ing 1,2

,LE I Hengyi

1,3

,WANG Guohui 1,CHE N Guizhu 1,L I Peixue 2,HUANG J ieyan

1

1.The Envir onmental Science and Engineering I nstitute,Sun Yat 2sen University,Guangzhou 510275

2.Zhanjiang Envir onmental Pr otecti on Bureau,Zhanjiang 524022

Rece i ved 23March 2006; rece i ved in revised for m 1December 2006; accepted 29Dece mber 2006

Abstract:A ther mo 2

α2a mylase p r oducing strain was is olated fr om sewage munici pal sludge compost and p ri m arily identified as a kind of ther mophilic B acillus lichenifor m is Z D 28.A s lact ose and (NH 4)2S O 4were e mp l oyed its carbon and nitr ogen s ources,res pectively,its maxi m um enzy me p r oducti on of

the strain was observed at 24h for the incubati on conditi ons of medium pH of 8,ventilati on of 10%,fer mentati on te mperature of 65℃and C /N rati o of 3/1.The op ti m um reacti on conditi ons of the enzy me were deter m ined as 95℃and pH 8.0.The further experi m ents showed that the enzy me was considerable stability f or only 4.8%of its activity was l ost when treated at 95℃f or 60m in,moreover,it beca me more stable when l ow concentrati on of Ca 2+existed .The experi m ents of sludge organic matter degradati on showed that the strain incubated f or 22h possessed an op ti m al degradati on activity .Further more,the results showed that the re moval rate of organic matter,increase rate of dehydr ogenase and increase rate of S OUR f or double activity enzy me were 17.1%,76.9%,27.3%higher than those of the treat m ents with single activity enzy me .A t the same ti m e,the additi on of 0.1mmol ?L -1CaCl 2lead t o their increases of 7.1%,20.4%, 3.4%,res pectively .

Keywords:ther mo 2

α2a mylase;enzy me p r oducti on;enzy me p r operty;envir onmental app licati on 1　引言(I ntr oducti on )

耐高温α2淀粉酶通常是指最适反应温度为

90℃～95℃、能在90℃以上保持热稳定性的α2淀粉酶,其最适反应温度比解淀粉芽孢杆菌产生的中等耐热性α2淀粉酶高10℃～20℃.耐高温α2淀粉酶是

淀粉加工中有重要用途的一种酶(张树政等,

1984),被广泛应用于酿酒、食品、医药、纺织和环境治理等行业.在环境治理方面,有人将产淀粉酶嗜热脂肪芽孢杆菌应用在活性污泥的处理上.嗜热脂肪芽胞杆菌可以吸收活性污泥固相颗粒中的碳源营养物质,产生有酶蛋白加有机物、酶蛋白加有机

4期王春铭等:产高温α2淀粉酶菌的产酶条件、酶性质与环境应用研究

物加金属离子的全酶,如水解酶、各种脱氢酶、丙酮酸脱羟酶和细胞色素氧化酶.在65℃下往活性污泥中加入产淀粉酶菌,经产淀粉酶菌作用的污泥返回曝气池后会被分解,这是一种实现活性污泥法零排放的经济型措施.

微生物中许多种类都能产生淀粉酶,Buchanan 和Ta muri等人(1974)描述了数百种嗜热真菌和上千种细菌,仅B acillus属48个种中就有32个种能产生α2淀粉酶,但产生高温α2淀粉酶的菌种较少. Ca mpbell等首先从凝结芽孢杆菌(B acillus coagu lans)纯化出高温α2淀粉酶,接着又从枯草芽孢杆菌(B.subtilis)、嗜热芽孢杆菌(B. stearother m oph ilus)、地衣芽孢杆菌(B.lichenifor m is)等菌株中分离出该酶.卢涛等人(2002)在西藏自治区土样中分离到一株能向胞外分泌高温α2淀粉酶的凝结芽孢杆菌,该菌株经紫外线和亚硝基胍诱变后选育得到突变株B acillus coagulans LA28,该菌株产生的淀粉酶符合高温α2淀粉酶的行业标准要求.目前,工业化生产高温α2淀粉酶的菌株主要是解淀粉芽孢杆菌,常见的有地衣芽孢杆菌B acillus lichenifor m is,如Ter m anyl,其产生的α2淀粉酶在淀粉乳中能在110℃～115℃发生作用,比枯草芽孢杆菌α2淀粉酶的最适温度85℃～90℃高出20℃以上(姜锡瑞,1996;张力田,1998).

本文从堆肥中筛选到一株产耐高温α2淀粉酶的菌株B acillus lichenifor m is Z D28,通过研究其产酶条件、酶学性质,将该菌及其高温α2淀粉酶应用于市政污泥有机物降解试验,探索产高温α2淀粉酶菌在环境治理中的应用.

2　材料和方法(Materials and methods)

2.1　材料

2.1.1　泥样　菌种分离实验中的泥样采自广州大坦沙污水厂脱水污泥堆肥.污泥降解实验中的泥样采自广州大坦沙污水厂污泥浓缩池,污泥含水率为90%,全碳含量为29.6%,全氮含量为2.1%,C/N 比为14.1.

2.1.2　培养基　平板筛选培养基(卢涛等,2002; Malhotra et al.,2000):蛋白胨1%,牛肉膏0.5%,氯化钠0.5%,可溶性淀粉2%,琼脂2%,pH7.0.富集培养基:蛋白胨1%,牛肉膏0.5%,氯化钠015%,pH7.0.发酵培养基:黄豆粉0.5%,麸皮1%,可溶性淀粉0.25%,pH8.8.2.2　方法

2.2.1　菌株的分离纯化　先对菌种进行初筛,然后根据菌株所产生的酶活进行复筛.

菌种的初筛:称取泥样1g于含有9mL无菌水及几粒无菌玻璃珠的小三角瓶内,振荡混匀后静置.取上清液0.1mL于筛选平板涂布均匀,置于55℃培养箱中培养24～48h.另取泥样10g放入90mL富集培养基中在55℃富集培养48h后,取培养液梯度稀释,用血球计数板进行计数;依据菌液浓度选取3个浓度梯度涂布筛选平板,于55℃培养箱中培养24～48h;观察筛选平板长出的菌落周围有无透明水解圈,取水解圈D(透明圈的直径)/d (菌落的直径)较大者于筛选平板上划线分离至纯种,编号并用斜面保存.

菌种的复筛:将初筛菌种进行活化,接种于发酵培养基(20mL)中,于55℃水浴摇床170r?m in-1条件下培养48～72h,采用兰值法测定酶活(胡学智等,1991).

2.2.2　高温α2淀粉酶酶活测定方法　粗酶液在90℃保温30m in后采用兰值法在70℃测定酶活.酶活力以淀粉与碘呈色反应(兰色)深度下降10%时所相当的被液化可溶性淀粉量(mg)表示.

2.2.3　菌种鉴定方法　参照《伯杰氏细菌系统分类手册》(第九版)(Holt et al.,1994)、《高温菌生物学》(和致中等,2001)、《芽孢杆菌属》(戈登等, 1973)及《常见细菌系统鉴定手册》(东秀珠等, 2001)等文献中的方法进行.

2.2.4　菌株的产酶条件　在产酶条件的研究过程中,考虑到接种量可能对实验结果造成的影响,因而都采用0.5%的接种量,以期实验所得数据尽可能准确.

不同碳源和氮源对产酶的影响:分别改变液体筛选培养基中碳源和氮源的种类,每100mL三角瓶装20mL液体筛选培养基,接种18h菌液0.1mL, 55℃、170r?m in-1条件下水浴培养48h后测定酶活力,从而确定产酶最佳碳源和最佳氮源.

生长曲线和产酶曲线:在500mL三角瓶内装100mL液体筛选培养基,接种0.5mL培养了18h的菌液,于55℃、170r?m in-1条件下水浴培养,从0h开始连续取样直至72h,每次取1.5mL,采用血球计数板计数和兰值法测定酶活.依据菌浓度、酶活与时间关系作图,从而得到生长曲线和产酶曲线.

pH值、通气量、温度对产酶的影响:250mL三角

106

环 境 科 学 学 报27卷

瓶装25mL液体筛选培养基,接种18h菌液0.1mL, 55℃、170r?m in-1条件下水浴培养.改变液体筛选培养基pH值,分别调节pH至4、5、6、7、8、9、10、11、12,培养48h后测定酶活力,确定最佳pH值.改变液体筛选培养基通气量,分别取10mL、15mL、20mL、25mL、30mL,培养48h后测定酶活力,确定最佳通气量;改变发酵温度,分别取45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃、75℃,培养48h后测定酶活力,确定最佳发酵温度.

培养基优化:选择乳糖作碳源,硫酸铵作氮源,配制成C/N比分别为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11的基础培养液,加入0.3%麦麸、0.15%黄豆粉, 65℃下,采用25%装液量,170r?m in-1条件下三角瓶发酵48h,测定上清液酶活力,从而确定培养基最佳C/N比.

2.2.5　酶学性质研究　从95℃下酶热稳定性、酶反应最适温度及pH值、金属离子对酶活性的影响等方面进行酶学性质研究.

95℃下酶热稳定性研究:95℃水浴条件下处理粗酶液,取不同处理时间的粗酶液测定酶活,计算残留酶活,从而得知95℃下酶热稳定性.

酶反应最适温度及pH值:取等量5mL酶液,分别在温度为45℃、55℃、65℃、75℃、85℃、95℃、105℃条件下测定酶活力,以确定酶反应最适温度.用不同pH值的缓冲液稀释酶液,以不同pH值缓冲液配制的1%可溶性淀粉为底物,测定酶活,以确定酶反应最适pH值.

金属离子对酶活性的影响:在反应体系中分别加入如下金属盐类,Ca2+、Mg2+、K+、Na+、Mn2+、Ba2+、Zn2+、Cu2+、Fe3+、Pb2+、Ag2+、Hg2+、Co2+、N i2+(加入量均为2mmol?L-1),以及金属螯合剂EDT A(加入量为0.1、0.5mmol?L-1).在95℃下测定酶活力,从而得知各种金属离子对酶活性的影响.

2.2.6　产高温α2淀粉酶菌对污泥有机质的降解实验　为考察菌株在环境治理中的应用,取含水率为90%的污泥浓缩池污泥进行发酵实验.由于市政污泥主要组分为生物残体及颗粒胶质微粒,因此,实验中主要考察了不同生长期的菌株对污泥有机质的降解情况.选取污泥降解前后有机质含量、表征微生物对污泥有机物氧化分解能力的脱氢酶,及表征微生物生物活性强度的比耗氧速率S OUR作为考察指标.在250mL三角瓶内装25mL污泥,通过添加尿素调节碳氮比至3/1,同时将pH值调到8.按接种量10%,在65℃、170r?m in-1条件下振荡培养,同时用无菌接种液作为空白对照,测定污泥降解前后有机质含量、脱氢酶活性及S OUR值,从而得知菌株对污泥有机质的降解能力.

污泥有机质的测定:污泥有机质采用直接灼烧法进行测定(曹颖霞等,1996),即将污泥在105℃烘干,研磨过筛(筛孔2mm),再烘至恒重.称取样品约5g置于瓷坩埚中放入马弗炉550℃灼烧至恒重,灼烧所损失的量为污泥有机质含量.

污泥中脱氢酶和α2淀粉酶的测定:污泥中酶液的提取(俞毓馨等,1990):取发酵完毕泥液20mL于4000r?m in-1条件下离心10m in,弃去上清液,然后用等量生理盐水充分搅拌,同样离心沉淀弃去上清液.如此反复2次.称取沉淀的污泥0.5g,加入40mL Tris缓冲液(pH=7.2),在室温下置1h并经常搅拌,再过滤后滤液即为酶液.将所得酶液采用改进TT C法进行污泥脱氢酶的测定(牛志卿, 1994),污泥α2淀粉酶活的测定按兰值法进行.

比耗氧速率S OUR的测定:称取2g～5g新鲜污泥样品,根据不同有机质含量加入定量的蒸馏水,在20℃下采用S witzerland产METT LER T OLE DO溶氧仪进行连续测定.污泥样品悬浮液在48h内的需氧量(间隔2h)可由下式计算(W illia m et al.,1995):

S OUR=

|S max|?V S

m?DS?VS

(1)

式中,S OUR为比耗氧速率(mg?g-1?h-1);|S

max

|为

最大耗氧速率(mg?L-1?h-1);V

S

为上清液容积(L);m 为污泥样品鲜重(g);DS为污泥样品的固体质量分数;VS为污泥样品的挥发性固体质量分数.

2.2.7　高温α2淀粉酶对不同处理市政污泥的处理效果　对市政污泥进行4种处理,第1种是在紫外线下照射15h灭菌;第2种是在紫外线下照射15h

灭菌后加入0.1mmol?L-1CaCl

2

;第3种是加入011mmol?L-1CaCl2,第4种为未作任何处理的空白对照泥样.在250mL三角瓶内装入25mL经不同处理的污泥浓缩池污泥,将pH值调到8,接入等量不同活性的高温α2淀粉酶,在65℃、170r?m in-1条件下,测定污泥中有机质含量、脱氢酶酶活及S OUR 值,从而得知不同条件下高温α2淀粉酶对市政污泥的处理效果.

3　实验结果(Results)

3.1　菌株的分离纯化

将堆肥中取得的泥样进行直接涂布和富集培

206

4期王春铭等:产高温α2淀粉酶菌的产酶条件、酶性质与环境应用研究养后稀释涂布,培养后得到约178个有水解圈的菌

株,挑选其中D /d 大的菌落15株点平板,筛选到8株进行摇　发酵实验.依据用兰值法测定的酶活,确定菌株Z D 28为出发菌株,酶活为1.3×104

U ?mL -1

.3.2　菌种鉴定结果

该菌平板培养菌落成圆形,不透明,白色;表面扩展,假根状,干燥;边缘多枝.液体静置培养表面

会形成白色树根状菌膜.镜检菌株为直杆状,链状排列,菌体两端为圆形,见图1.菌体大小为(0.5～0.8)μm ×(1.7～2.3)μm ,芽孢偏中生,孢囊不膨大,有运动性.生理生化特征鉴定结果见表1.

图1　ZD 28菌株显微镜照片(×600)

Fig .1　M icr oscope graph of the bacillus (×600)

表1

生理生化特征

Table 1

The physi ol ogy and bi oche m istry character

测定指标index

Z D 28测定指标index

Z D 28测定指标index

Z D 28革兰氏染色gram stain +甘露醇mannit ol

+耐盐7%t olerance salt 7%+芽孢染色ger m stain +柠檬酸盐利用citrate usage +pH 5.7

+接触酶contact enzy me +丙酸盐利用p r op i onate usage +石蕊牛奶产碱

lit m us crea mery p r oduce alkali

+葡萄糖glucose +淀粉水解a myl ohydr olysis +卵黄反应yelk reacti on -阿拉伯糖arabinose

+酪素分解casein analyzing +55℃存活+V.P

+明胶液化gelatin liquefacti on +60℃存活+V.P pH 值 6.3～6.6

硝酸盐还原nitrate reducti on +65℃存活+木糖xyl ose

+

叠氮化钠s odium azide

-70℃存活

+

由以上特征检索文献,该菌株与模式菌地衣芽

孢杆菌吻合,但该菌株能在70℃下生长,且耐碱能力较强,这2个特征在地衣芽孢杆菌中是少有的.由于该菌株具有地衣芽孢杆菌特有的一个特征,即丙酸盐利用呈阳性,因此,可以初步确定该菌株为地衣芽孢杆菌,命名为B acillus lichen ifor m is Z D 28.

3.3　菌株的产酶条件

3.3.1　不同碳源和氮源对产酶的影响　分别改变

液体筛选培养基中碳源和氮源的种类,经培养后测

定酶活力,结果见表2和表3.实验结果显示,该菌以乳糖为碳源,(NH 4)2S O 4为氮源酶活性最强.

表2

不同碳源对酶活的影响

Table 2

D ifferent carbon s ources affecti on t o enzy me activity

碳源carbon s ources 酶活enzy me activity

/(×104U ?mL -1)

碳源carbon s ources 酶活enzy me activity /(×104U ?mL -1)

葡萄糖glucose 1.29可溶淀粉starch 0.88甘露醇mannit ol 1.24麦麸bran 0.38纤维素cellul ose 0.84酵母膏yeast extract

0.46蔗糖sucr ose 1.10乳糖lact ose 1.36甘油glycer ol

0.60

麦芽汁wort

1.12

表3

不同氮源对产酶的影响

Table 3

D ifferent nitr ogen s ource affecti on t o enzy me activity

氮源nitr ogen s ources

酶活enzy me activity

/(×104U ?mL -1)

氮源nitr ogen s ources

酶活enzy me activity

/(×104U ?mL -1)

(NH 4)2S O 4 1.66NH 4Cl 1.06Na NO 3

0.98K NO 3

0.96尿素urea 1.34黄豆粉bean fl our 1.57明胶gelatin

0.38

酪蛋白casein

1.45

306

环 境 科 学 学 报27卷

3.3.2　生长曲线和产酶曲线　依据酶活、菌浓度与

时间关系作图,结果见图2.可知产酶量在24h 达到

最大值,此后产酶量基本保持稳定.根据菌浓度可知,0～4h 为该菌生长延滞期,5～21h 为指数期,22h 菌数达到最大值,22～48h 为稳定期,48h 后为衰亡期

.

图2

产酶曲线及生长曲线

Fig .2

Enzy me p r oducti on curve and gr owth curve

图3各影响因素对酶活性的影响(a .初始pH 值对酶活性的影响,b .通气量对酶活性的影响,c .温度对酶活性的影响)

Fig .3　D ifferent affecti on fact ors t o enzy me activity (a .The initial

pH affecti on t o enzy me activity,b .The aerate value affecti on t o enzy me activity,c .Te mperature affecti on t o enzy me activity )

3.3.3　pH 值、通气量、温度对产酶的影响　分别改

变液体筛选培养基pH 值(图3a )、通气量(图3b )、

发酵温度(图3c ),经培养后测定酶活力,可知菌株在pH 值为8、通气量为25mL 、发酵温度为65℃条件

下所产酶活性最强.3.3.4　培养基优化　改变基础培养液的C /N 比,经培养后测定酶活力,结果如图4所示.由图可知,C /N 比在3/1时,酶活性最强

.

图4

碳氮比与酶活的关系

Fig .4

The relati onshi p bet w een carbon nitr ogen rati o and enzy me activity

3.4　酶学性质研究

3.4.1　95℃下酶热稳定性　95℃水浴条件下处理

粗酶液,结果见图5.图中显示该酶在95℃下处理

60m in 后酶活仅损失4.8%,符合国家行业标准QB /T2306297的要求

.

图5

95℃下酶的热稳定性

Fig .5

The enzy me ther mostability under 95

℃

图6温度与酶活的关系

Fig .6　The relati onshi p bet w een te mperature and enzy me activity

3.4.2　酶反应最适温度及pH 值　分别在不同温

度下测定酶活力,结果见图6,可知酶作用的最适温

度为95℃.在不同pH 值酶液中测定酶活,结果见图7.结果表明,酶作用最适pH 值为8,且在pH 为7～

406

4期王春铭等:产高温α2淀粉酶菌的产酶条件、酶性质与环境应用研究10的范围内酶活均较高.

3.4.3　金属离子对酶活性的影响　在反应体系中

加入某些金属盐类,在95℃下测定酶活力,

结果如

表4所示(以不加试剂的酶活力为100%计),Ca 2+

、Mg 2+

、K +

对酶活性有明显的激活作用;Na +

、Mn 2+

、Ba 2+

有轻微激活作用;Zn 2+

、Cu 2+

、Fe 3+

、Pb 2+

、Ag 2+

、Hg 2+

、Co 2+

、N i 2+

强烈抑制酶活性.金属螯合

剂EDT A 明显使酶失活.实验结果表明,该酶需要金属离子.

图7

pH 值与酶活的关系

Fig .7　The relati onshi p bet w een pH and enzy me activity

将CaCl 2按0.1mmol ?L -1

加入到发酵上清液中,在95℃加热60m in,冷却到室温,定容,调酶液pH 值到8,70℃条件下测定酶活,此时发酵液的酶活仅损失

5.7%,符合国家行业标准QB /T2306297的规定.

表4

金属离子对酶活性的影响

Table 4

The mental i on affecti on t o enzy me activity 化合物

相对酶活力

relative

activity 化合物

相对酶活力

relative

activity CaCl 2118.1%FeCl 3

4.5%MgCl 2112.9%Pb (NO 3)2 4.2%KCl 114.0%Ag 2S O 4 3.4%NaCl 102.6%HgCl 2 2.8%MnCl 2103.3%CoCl 2 2.1%BaCl 2101.8%N iS O 4

1.9%ZnCl 226.5%EDT A (0.1mmol ?L -1)17.0%CuS O 4

7.8%

EDT A (0.5mmol ?L -1)

3.5　产高温α2淀粉酶菌对污泥有机质的降解作用

取不同生长期的菌液进行污泥有机质降解实验,结果见表5.由表5可见,培养时间为22h 的菌

株对市政污泥有机质降解能力最强,其次是培养了

36h 的菌株,降解能力最差的是培养时间为52h 的菌株.其中添加培养时间为22h 菌株的泥样中,有机质降解率、脱氢酶增加率、比耗氧速率S OUR 增加率均高出不加菌泥样30%以上.

表5

菌株对污泥有机质的降解作用

Table 5

The mudding organic matter degradati on of the strain

泥样

sa mp les

菌株培养时间

incubati on ti m e /h

降解前有机质含量

organic matter bef ore degradati on

降解后有机质含量

organic matter after degradati on 有机质降解率

organic matter removal rati o 降解前脱氢酶活性dehydr o 2

genase bef ore degradati on /(A 485n m )

降解后脱氢酶活性dehydr o 2

genase after degradati on /(A 485n m )脱氢酶增加率

dehydr o 2genase increase rati o 降解前S OUR 值S OUR before degradati on /(mg ?g -1?h -1)降解后S OUR 值

S OUR after degradati on /(mg ?g -1

?h -1)

S OUR

增加率S OUR

increase rati o

加菌泥样

sa mp les

with inoculated

3

36.5%32.0%0.9456.7% 3.712.1%1031.2%41.9% 1.1083.3% 4.021.2%2224.8%

53.8% 1.45

141.7% 4.6

39.4%3653.7%

28.7%46.6%0.60 1.23105.0% 3.3

4.227.3%4833.5%37.6% 1.0676.7% 3.918.2%52

39.6%

26.3%

0.88

46.7%

3.6

9.1%

不加菌泥样

Sa mp le without inoculated

41.0%

23.6%

0.80

33.3%

3.5

6.1%

3.6　不同条件下高温α2淀粉酶对市政污泥的处理

效果

对市政污泥进行4种处理,在不同条件下测定污泥中有机质含量、脱氢酶酶活及S OUR 值,结果见表6.由表6可见,处理效果由好到差的泥样依次为3#>4#>2#>1#

.污泥经紫外线处理后S OUR 值明显

比未经处理的低;污泥中高温α2淀粉酶活性增加2倍后,污泥有机质降解率、脱氢酶增加率和S OUR 增加率平均增加17.1%、76.9%、27.3%.在污泥中添加0.1mmol ?L -1

CaCl 2后,污泥有机质降解率、脱氢酶增加率、S OUR 增加率平均增加7.1%、20.4%、3.4%.

506

环 境 科 学 学 报27卷

表6不同条件下高温α2淀粉酶对污泥的处理结果

Table6The treat m ent results of ther moα2a mylase under different conditi ons

高温α2

淀粉酶活性α2a mylase

activity/ (U?mL-1)泥样

samp les

降解前有

机质含量

organic

matter

bef ore

degradati on

降解后有

机质含量

organic

matter

after

degradati on

有机质

降解率

organic

matter

removal

rati o

降解前脱

氢酶活性

dehydr o2

genase

bef ore

degradati on

/(A485n m)

降解后脱

氢酶活性

dehydr o2

genase

after

degradati on

/(A485n m)

脱氢酶

增加率

dehydr o2

genase

increase

rati o

降解前

S OUR值

S OUR before

degradati on/

(mg?g-1

?h-1)

降解后

S OUR值

S OUR after

degradati on/

(mg?g-1

?h-1)

S OUR

增加率

S OUR

increase rati o

1×1041#52.5%36.5%30.5%0.550.7740.0%0.8 1.025.0% 2#53.6%33.5%37.5%0.560.8653.6% 1.0 1.330.0%

3#53.2%29.6%44.4%0.65 1.1069.2% 3.4 4.532.4%

4#52.3%32.3%38.2%0.64 1.0157.8% 3.3 4.330.3% 2×1041#52.5%28.1%46.5%0.55 1.0998.2%0.8 1.137.5% 2#53.6%25.0%53.4%0.56 1.31133.9% 1.0 1.440.0%

3#53.2%19.3%63.7%0.65 1.68158.5% 3.4 6.076.5%

4#52.3%23.3%55.4%0.64 1.52137.5% 3.3 5.772.7%

注:1#代表经紫外线处理的污泥;2#代表经紫外线处理后加0.1mmol?L-1CaCl

2的污泥;3#代表加入0.1mmol?L-1CaCl

2

的污泥;4#为空白

对照泥样.Note:1#is the ultravi olet radiated sludge,2#is the ultravi olet radiated sludge added0.1mmol?L-1CaCl2,3#is the sludge added0.1 mmol?L-1CaCl2,4#is the sludge without any treat m ent.

4　讨论(D iscussi on)

4.1　菌体最佳收获时期

对于B acillus lichenifor m is Z D28而言,5～21h为其生长指数期,这期间菌种代谢活力最强,生长速率最快;22～48h为生长稳定期,是收获菌体的最佳时期.污泥降解实验表明,培养22h后菌株对市政污泥有机质降解能力最强,此时可将菌体收集后制成菌剂.

4.2　高温α2淀粉酶的应用前景

污泥经紫外线灭菌并添加了活性为2×104 U?mL-1的高温α2淀粉酶后,有机质降解率达4615%,可见高温α2淀粉酶能在污泥中发挥作用.自然条件下,具有丰富微生物菌群的市政污泥在加入高温α2淀粉酶后有机质降解率达63.7%,比前者增加了17.2%.这是因为微生物菌群各菌种之间相互协同作用,生成抗氧化物质,形成复杂而稳定的生态系统,增强了微生物吸收利用有机物的能力,提高了污泥有机质降解率.

由于钙离子对耐高温α2淀粉酶热稳定性的维持是必需的,许多耐高温α2淀粉酶通常都需要在有钙离子存在的条件下才能在高温下发挥作用.实验表明,添加浓度为0.1mmol?L-1的CaCl

2

可使污泥有机质降解率最高增加8.3%,可有效地促进酶反应,酶活符合国家行业标准QB/T2306297的规定,具有很好的开发利用潜力.4.3　产高温α2淀粉酶菌的环境应用探讨

目前高温α2淀粉酶主要应用在食品加工和纺织生产方面,环境治理方面则应用较少.金敏等人(2005)将产淀粉酶、蛋白酶、纤维素酶的菌株和硝酸细菌及亚硝酸细菌组成强化微生物制剂处理生活污水,出水水质达到《生活杂用水水质标准》(G B/T18920-2002).此外,有人采用“耐温酶溶解(S-TE)法”处理活性污泥法剩余污泥,污泥经气浮浓缩法含水率降至30%,浓缩污泥被排入污泥集泥池,此时嫁接和时续投加嗜热脂肪芽胞杆菌,利用其所产生的淀粉酶对浓缩污泥进行溶解;在集泥池鼓进由燃煤热风炉供给的大于60℃的热空气给浓缩污泥加温,创造适合嗜热脂肪芽胞杆菌生存新陈代谢的良好环境,污泥经菌种产生的淀粉酶溶解后返回曝气池被分解,实现活性污泥法剩余污泥零排放.由此可见,菌种B acillus lichenifor m is Z D28应用到实际工程上时,还应结合污泥的各种理化性质及各种运行条件进行调试,以达到最佳的环境治理效果.

5　结论(Conclusi ons)

1)从广州大坦沙污水厂脱水污泥堆肥的泥样中筛选到一株能在55℃生长并分泌高温α2淀粉酶的菌株,经初步鉴定该菌株为地衣芽孢杆菌,命名为B acillus lichenifor m is Z D28.

2)该菌产酶的最佳碳源为乳糖,最佳氮源为(NH

4

)

2

S O4;该菌产酶量在24h达到最大值,此后产

606

4期王春铭等:产高温α2淀粉酶菌的产酶条件、酶性质与环境应用研究

酶量基本保持稳定.0～4h为该菌生长延滞期,5～21h为生长指数期,22～48h为生长稳定期,48h后为生长衰亡期;该菌在pH值为8,通气量为25mL,温度为65℃,C/N为3/1的条件下酶活性最强.

3)该菌所产高温α2淀粉酶的最适温度为95℃,最适pH值为8;95℃下该酶的热稳定性很好,达到QB/T2306-97的要求;Ca2+、Mg2+、K+对酶活性有明显激活作用;Na+、Mn2+、Ba2+有轻微激活作用; Zn2+、Cu2+、Fe3+、Pb2+、Ag2+、Hg2+、Co2+、N i2+强烈抑制酶活性;金属螯合剂E DT A明显使酶失活.较低浓度的钙离子存在,该酶即可有很好的稳定性.

4)培养时间为22h的菌株降解污泥有机质的能力最强.

5)对市政污泥进行4种处理,当污泥中高温α2淀粉酶活性增加2倍后(为2×104U?mL-1),污泥有机质降解率、脱氢酶增加率和S OUR增加率平均增加17.1%、76.9%、27.3%.在污泥中添加011mmol?L-1CaCl2后,污泥有机质降解率、脱氢酶增加率、S OUR增加率平均增加7.1%、20.4%、3.4%.

责任作者简介:雷恒毅,男,教授,博导.主要研究方向为水污染控制技术及固废资源化技术.E2mail:leihengyi@https://www.wendangku.net/doc/a914997587.html,.

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706

微生物综合试验——产淀粉酶细菌菌株的筛选和培育

产淀粉酶细菌菌株的筛选和选育 邢大鹏 （合肥工业大学生物与食品工程学院2008级食品科学与工程专业08-1班） 摘要：从合肥工业大学校园内的土壤中筛选到一株产淀粉酶的细菌菌株。形态及生理生化特征测定结果表明，菌株与芽孢杆菌属(Bacillaceae)中的枯草芽孢杆菌(BacillussubtilisCohn)种的特征基本一致。然后利用划线分离法和富集培养制备一定量的枯草芽孢杆菌，最后利用DNS法测定其产酶活力。 关键词：淀粉酶，产酶，细菌，枯草芽孢杆菌 Amylase production screening and selection of bacteria strains Xing Dapeng Abstract: From the Hefei University of Technology campus in the A strain of soil amylase producing bacteria strains. Morphological, physiological and biochemical characteristics of test showed that, strains and Bacillus (Bacillaceae) in Bacillus subtilis (BacillussubtilisCohn) basically the same kinds of characteristics. Then use the train crossed separation and enrichment of preparation of certain bacillus subtilis, finally, using the DNS method for determining the enzyme production vigor. Key words: amylase, enzyme production, bacteria,Bacillus,stubtilis. 芽孢杆菌是人类发现最早的细菌之一。早在1835年，Ehrenberg所描述的“Vibriosubtilis”即是现在大家熟悉的“枯草芽孢杆菌”，它是由Cohn于1872年正式命名的，现作为芽孢杆菌属(Bacillaceae)的模式菌株[1]。从生物学特性来讲，枯草芽孢杆菌具有典型的芽孢杆菌特征，其细胞呈直杆状，大小(0.8-1.2)μm×(1.5-4.0)μm，单个，革兰氏染色阳性，着色均匀，可产荚膜，运动(周生鞭毛)；芽孢中生或近中生，小于或等于细胞宽，呈椭圆至圆柱状；菌落粗糙，不透明，扩张，污白色或微带黄色；能液化明胶，胨化牛奶，还原硝酸盐，水解淀粉，为典型好氧菌[2]。 1997年，Kunst F.等人首先完成了枯草芽孢杆菌的完整基因组序列测定，并将结果发表在《Nature》杂志上[3]。

产淀粉酶枯草芽孢杆菌

“生物制药技术实训”课程研究报告 项目一：产淀粉酶枯草芽孢杆菌 一实验原理 枯草芽孢杆菌的多数中都能产生大量的淀粉酶，较易得到分离。由于芽孢具有较强的抗热能力，分离纯化时可采用热处理的方法，高温加热处理，杀死样品中所有不含芽孢的菌类，在培养过程中使芽孢杆菌得到很好的富集。利用该菌产淀粉酶的特性，选择以淀粉为碳源的分离培养基，菌体分泌的淀粉酶会使菌落周围的淀粉水解，滴加碘液即可在菌落周围出现清晰的透明圈。根据透明圈的直径（C）与菌落直径（H）之比（C/H）可初步鉴定酶活力的高低，即比值越大酶活力越高，进而筛选出优良的生产用菌。 二材料 灭过菌的种子培养基无菌生理盐水（杀了菌的生理盐水，盐浓度0.9％）培养基配方：蛋白胨10g，酵母浸膏5g，NaCl10g，水1L，淀粉，1. 8%的琼脂PH7.2-7.4，121℃灭菌20min（各量取其三分之一）。 三操作步骤 1.包平板 2.配生理盐水 3.根据培养基配方配置培养基，并取出45ml用于液体培养基，其余作为固体培养基 4.取1，2，3中配成的平板，生理盐水，大型三角瓶在121℃中灭菌20min

5．称取土壤10g与 90mL无菌水中，振荡20分，使土壤中菌体或孢子均匀分散，取其悬浮液于80℃下保持10min,以杀死非芽孢的菌体。取5ml悬浮液接入到装有45 ml种子培养基的三角瓶内，（于37℃、200 r/min摇床中）培养20 h 6.灭完菌后倒平板，自然冷却凝固后放入恒温培养箱中静致一夜，观察其是否染菌 7.将用于做梯度试验的试管8个，每个加9ml蒸馏水，移液管8个，塞棉花拿去灭菌121℃，20min 8. 取培养后的菌液，用无菌生理盐水适当稀释，取一定量涂布于平板，做梯度试验分别标记为100，10-1，10-2，10-3，10-4，10-5，10-6，10-7，10-8，10-9，10-10。 9.将标记的的试管，移取1ml与培养基中涂布并进行标记，于37℃，培养20h 10.将灭菌好的平板拿出，进行无菌划线，在培养基中观察到10-8，10-9，10-10，有单一菌落，而10-6，10-7并不明显，．对10-8，10-9，10-10的培养基中的菌落加碘液进行观察，发现有透明圈。

土样中淀粉降解细菌的筛选综述

土样中淀粉降解细菌的筛选（设计性实验） 一、实验目的 1.掌握土壤样品中微生物菌种分离和筛选技术的实验设计方案。 2.掌握富集、平板稀释涂布法、分离筛选产淀粉酶菌株的基本原理。 3.初步掌握从土壤样品中分离筛选产淀粉酶菌株的基本技术。 二、实验原理 在自然条件下，产淀粉酶的细菌和其它各种细菌混杂生活在土壤中，要想分离出来必须建立相应的“筛子”。淀粉酶能使淀粉分解成葡萄糖，而淀粉与碘液发生反应形成蓝色化合物。葡萄糖不与碘液发生反应形成蓝色化合物，结果可使淀粉酶产生菌周围形成透明圈，从而筛选出淀粉酶产生菌。 微生物酶产生菌的筛选具体分为增殖培养、初筛和复筛过程。增殖培养是通过控制培养基的营养成分和/或培养条件使样品中的目的菌得以大量繁殖,而非目的菌的生长受到抑制或繁殖减缓,从而提高样品中目的菌的数量和比例。初筛是对所得的纯种进行检测。由于淀粉酶是胞外酶，在分离培养基中加适量可溶淀粉通过平板透明圈法来检测淀粉酶产生菌。筛选透明圈比值大的菌株接种到培养基中进行培养，再进行复筛。复筛的目的是淘汰底产菌。 三、实验材料 1、培养基：蛋白胨， NaCl，可溶性淀粉，琼脂，蒸馏水。 2、玻璃仪器: 培养皿10副，试管10支，三角瓶 6个，移液管 10支（1mL7支,10mL 3支），100mL量筒2个,玻璃棒，玻璃珠。 3、其它：酒精灯，硅胶塞,包装绳，包装纸,PH试纸，接种环，电子天平，称量纸,高压蒸汽灭菌锅，摇床，角匙，记号笔等。 四、方法与步骤 1、土壤样品: 食品厂、粮食加工厂、饭店等日常接触淀粉较多的肥沃土壤。 2、培养基的制备 (1)液体培养基：称取蛋白胨1.0 g、NaCl 0.5 g、可溶性淀粉0.2 g溶于装有100 mL蒸馏水的三角瓶中，调pH为7.2至7.4，分装为2个三角瓶,50mL/个,包扎，121℃高压蒸汽灭菌20分钟。 (2)固体淀粉培养基：称取蛋白胨1.5g， NaCl 0.75g，可溶性淀粉0.3g ，溶于

枯草芽孢杆菌产淀粉酶试验要点

枯草芽孢杆菌产α-淀粉酶发酵试验 化学与生命科学学院 摘要：以枯草芽孢杆菌（BacilusSubtilisBF—7658）为实验菌株，通过种子扩大培养，选出生长力旺盛的菌株进行液体摇瓶发酵。通过测定不同发酵时间生产的酶活，来初步估计发酵最佳时期和终点。 关键词：枯草芽孢杆菌，α-淀粉酶，液体摇瓶发酵，酶活 淀粉酶是能够分解淀粉糖苷键的一类酶的总称，包括α-淀粉酶、β-淀粉酶、糖化酶和异淀粉酶。芽孢杆菌主要用来产生α-淀粉酶和异淀粉酶，其中α-淀粉酶又称淀粉1，4-糊精酶，能够切开淀粉链内部的α-1，4-糖苷键，将淀粉水解为麦芽糖、含有6 个葡萄糖单位的寡糖和带有支链的寡糖；而异淀粉酶又称淀粉α-1，6-葡萄糖苷酶、分枝酶，此酶作用于支链淀粉分子分枝点处的α-1，6-糖苷键，将支链淀粉的整个侧链切下变成直链淀粉。通过发酵实验，我们可以以酶活为依据，初步估计发酵的最佳时期和发酵终点。 实验材料和方法 一、实验材料： （一）实验菌株：以枯草芽孢杆菌（BacilusSubtilisBF—7658） （二）培养基： 1、种子培养液 葡萄糖 1% Tryptone(胰蛋白胨)：1%, Yeast Extract(酵母提取物)：0.5%, NaCl(氯化钠)：1% 调pH7.2 若配置固体培养基，则再加入1.5% 琼脂。 2、产淀粉酶发酵培养液 玉米粉 2 .0 % 黄豆饼粉1 .5% CaCl 2 0 .02 % MgSO4 0 .02% NaCl 0 .25% K2HPO4 0 .2% 柠檬酸钠0 .2% 硫酸铵0 .075% Na2HPO4 0 .2 % 调节pH 值7 .0

实验六十淀粉酶产生菌株的筛选

实验六十淀粉酶产生菌株的筛选 实验项目性质：设计性 所涉及的知识点：无菌技术、富集培养、纯种分离、淀粉酶性质、酶活测定 计划学时：8学时 一、实验目的 1．掌握从环境中采集样品并从中分离纯化某种微生物的完整操作步骤。 2．巩固以前所学的微生物学实验技术。 3．掌握产酶微生物筛选的方法。 二、实验原理 α-淀粉酶是一种液化型淀粉酶，它的产生菌芽孢杆菌，广泛分布于自然界，尤其是在含有淀粉类物质的土壤等样品中。从自然界筛选菌种的具体做法，大致可以分成以下四个步骤：采样、增殖培养、纯种分离和性能测定。 1、采样：即采集含菌的样品 采集含菌样品前应调查研究一下自己打算筛选的微生物在哪些地方分布最多，然后才可着手做各项具体工作。在土壤中几乎各种微生物都可以找到，因而土壤可说是微生物的大本营。在土壤中，数量最多的当推细菌，其次是放线菌，第三霉菌，酵母菌最少。除土壤以外，其他各类物体上都有相应的占优势生长的微生物。例如枯枝、烂叶、腐土和朽木中纤维素分解菌较多，厨房土壤、面粉加工厂和菜园土壤中淀粉的分解菌较多，果实、蜜饯表面酵母菌较多；蔬菜牛奶中乳酸菌较多，油田、炼油厂附近的土壤中石油分解菌较多等。 2、增殖培养（又称丰富培养） 增殖培养就是在所采集的土壤等含菌样品中加入某些物质，并创造一些有利于待分离微生物生长的其他条件，使能分解利用这类物质的微生物大量繁殖，从而便于我们从其中分离到这类微生物。因此，增殖培养事实上是选择性培养基的一种实际应用。 3、纯种分离 在生产实践中，一般都应用纯种微生物进行生产。通过上述的增殖培养只能说我们要分离的微生物从数量上的劣势转变为优势，从而提高了筛选的效率，但是要得到纯种微生物就必须进行纯种分离。纯种分离的方法很多，主要有：平板划线分离法、稀释分离法、单孢子或单细胞分离法、菌丝尖端切割法等。 4、性能测定 分离得到纯种这只是选种工作的第一步。所分得的纯种是否具有生产上所要求的性能，还必须要进行性能测定后才能决定取舍。性能测定的方法分初筛和复筛两种。 初筛一般在培养皿上根据选择性培养基的原理进行。例如要测定淀粉酶的活力可以把斜面上各个菌株一一点种在含有淀粉的培养基表面，经过培养后测定透明圈与菌落直径的比值大小来衡量淀粉酶活力的高低。 复筛是在初筛的基础上做比较精细的测定。一般是将微生物培养在三角瓶中作摇瓶培养，然后对培养液进行分析测定。在摇瓶培养中，微生物得到充分的空气，在培养液中分布均匀，因此和发酵罐的条件比较接近，这样，测得的结果更具有实际的意义。 三、实验用品 1．器材 （1）小铁铲和无菌纸或袋。

从土壤中分离产淀粉酶的芽孢杆菌实验方案解析

土壤中产淀粉酶芽胞杆菌的筛选及其淀粉酶活力的测定设计性实验方案 一、综述： 淀粉酶是淀粉降解酶。它们广泛存在于微生物、植物和动物体中。它们将淀粉及相关的聚合物分解为带有具体淀粉分解酶特征的产品。淀粉酶广泛存在于动植物和微生物中,是最早用于工业生产并且迄今仍是用途最广、产量最大的酶制剂产品之一。淀粉酶种类繁多,特点各异,可应用于造纸、印染、酿造、果汁和食品加工、医药、洗涤剂、工业副产品及废料的处理、青贮饲料及微生态制剂]等多种领域。在酿造发酵工业如酒精生产、啤酒制造、发酵原料液化及糖化工艺过程中均有重要价值,如添加淀粉酶分布非常广泛，是人们经常研 【】究的一种酶。从纺织工业到废水处理，这些酶都有不同规模的应用1。 常见产淀粉酶的主要为芽孢杆菌属。其中的常见产淀粉酶的芽孢杆菌菌种有：地衣芽 【】【】孢杆菌、枯草芽孢杆菌、蜡样芽孢杆菌和纳豆芽孢杆菌2、凝结芽孢3。由于芽孢杆菌属 是一类好氧或兼性厌氧、产生抗逆性内生抱子的杆状细菌，许多为腐生菌，主要分布于土壤【】和植物体表面及水体中4。所以此次实验从土壤中分离产淀粉酶的芽孢杆菌。 二、实验目的要求 1．了解生物分离提纯的原理和方法技术 2．掌握从土壤中筛选产淀粉酶菌株的原理和方法 3.掌握微生物摇瓶培养方法及淀粉酶活力测定的原理和方法 4.培养学生的综合应用微生物实验方法的能力 5.培养学生自行设计实验流程、综合分析问题解决问题和判断实验结果的能力。 三、实验原理 自然界中，土壤是微生物生活最适宜的环境。土壤具有微生物进行生长繁殖和生命活动中所需的各种条件。 土壤中微生物的数量因土壤类型、季节、土层深度与层次等不同而异。一般地说，在土壤表面，由于日光照射及干燥等因素的影响，微生物不易生存，离地表10 cm～30 cm的 【】土层中菌数最多，随土层加深，菌的数量减少5。 从混杂微生物群体中获得只含有某一种或某一株微生物的过程称为微生物分离与纯化。平板分离法普遍用于微生物的分离与纯化。其基本原理是选择适合与待分离微生物的生长条件，如营养成分、酸碱度、温度和氧等要求，或加入某种抑制剂造成只利于该微生物生长，而抑制其他微生物生长的环境，从而淘汰一些不需要的微生物。

枯草杆菌生产_淀粉酶的研究

１０ 科技创新导报　Ｓｃｉｅｎｃｅ　ａｎｄ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　Ｉｎｎｏｖａｔｉｏｎ　Ｈｅｒａｌｄ ２０１０ ＮＯ．２９ Ｓｃｉｅｎｃｅ　ａｎｄ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　Ｉｎｎｏｖａｔｉｏｎ　Ｈｅｒａｌｄ 研　究　报　告 科技创新导报α－淀粉酶是在淀粉加工、食品工业、医药工业、发酵工业及酿造、制糖和纺织工业上应用广泛的酶种，也是目前国内外应用最广、产量最大的酶种之一。α－淀粉酶一般可由微生物发酵产生，也可由植物和动物提取。 目前，工业生产上都以微生物发酵法为主进行大规模生产α－淀粉酶。我国从１９６５年开始应用枯草芽孢杆菌（Ｂｃａｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＢＦ－７６５８生产α－淀粉酶，当时仅无锡酶制厂独家生产，年产量为１０．２２吨。现在国内生产酶制剂的厂家己发展到上千个，其中约有４０％～５０％的工厂生产α－淀粉酶。总产量上万吨。 近年来，国外生产耐热α－淀粉酶发展较快，己从嗜热真菌、高温放线菌、特别是从嗜热细菌（嗜热脂肪芽孢杆菌Ｂ．ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓｔ和地衣芽孢杆菌Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｕｓ等）中分离得到了耐高温的α－淀粉酶菌种。但就国内而言，虽己开展了耐高温α－淀粉酶的研究工作，目前仍以枯草杆菌菌株生产α－淀粉酶为主。 本文就枯草杆菌在淀粉培养基上产 α－淀粉酶做一下研究，其对在以玉米（淀粉含量为７０％～７５％）或大米（淀粉含量为８０％～８５％）主要原料的发酵酿酒过程，具有实际的指导意义。 １　材料和方法 １．１实验材料 １．１．１菌种 枯草芽孢杆菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ）为实验室保藏菌种。 １．１．２种子培养基 马铃薯固体（及液体）培养基（简称ＰＤＡ，马铃薯２００ｇ、蔗糖２０ｇ、琼脂１５ｇ、水１０００ｍｌ、ＰＨ自然，马铃薯去皮，切成块煮沸３０ｍｉｎ，然后用纱布过滤，再加糖及琼脂，溶化后补足水至１０００ｍｌ。１２１℃灭菌３０ｍｉｎ） １．１．３发酵培养基 淀粉液体培养基（可溶性淀粉、蒸馏水、ｐＨ自然。１２１℃灭菌３０ｍｉｎ） １．２实验方法 １．２．１菌种激活　枯草芽孢杆菌在马铃薯固体培养基（简称ＰＤＡ）上３７℃培养１２ｈ后使用 １．２．２液体种子的制备　１００ｍＬ三角瓶装５０ｍＬ马铃薯液体培养基（起始ＰＨ为自然ＰＨ），灭菌后接激活菌种悬液１．５ｍＬ，培养３６ｈ。 １．２．３发酵培养 在各淀粉液态培养基中加１．５ｍＬ液体种子，用电热恒温振荡培养箱培养枯草芽孢杆菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｕｂｔｉｌｉｓ）。 １．２．４分析方法 酶活力测定，根据国家标准局发布的方法进行①。即１ｍＬ酶液于６０℃，ＰＨ４．８条件下，１小时液化１ｇ可溶性淀粉为１个活力单位。［①国家标准局颁布，ＧＢ８２７５－８７，１９８８－０２－０１实施］ ２ 实验结果与讨论 （１）培养温度对菌体生长和产酶的影响在不同温度下用电热恒温振荡培养箱（天津产ＳＨ６０００Ａ型）在２３℃至４４℃范围内培养枯草芽孢杆菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｕｂｔｉｌｉｓ），３６ｈ后测定α－淀粉酶活力。结果示于表１。菌体生长和产酶的最适温度均在３７℃。温度高于４４℃菌体生长和酶活力迅速下降。 （２）培养基对菌体生长和产酶的影响，同在最适温度３７℃下，相同的接种量、相同的种龄的枯草杆菌，比较不同比例的淀粉液体培养基产α－淀粉酶，结果见表２测定产α－淀粉酶的最适培养基为：淀粉∶水＝７５∶１００。 （３）培养时间对产酶的影响，在最适温度３７℃下，相同的接种量，淀粉与水的比例为：７５∶１００时１（最适产α－淀粉酶的淀粉液体培养基），测定枯草杆菌产α－淀粉酶最适培养时间为３６ｈ。 ３　结论 α－淀粉酶是产量在，用途广的酶制剂 品种之一，我国目前枯草杆菌α－淀粉酶是主要品种之一，在行业应用具有重要价值。本实验采用枯草杆菌在淀粉液态培养基上产α－淀粉酶，其研究结果对以玉米或大米为主要原料的发酵造酒具有指导意义。１）在２３℃至４４℃范围内，振荡培养，起始ＰＨ为自然ＰＨ，产α－淀粉酶最适培养条件：培养温度３７℃。２）在温度３７℃下，用淀粉液体培养基发酵，当淀粉与水的比例为７５∶１００时，产α－淀粉酶酶活力最高。３）在最适温度３７℃，淀粉与水的比例为７５∶１００（即产酶最高的淀粉液体培养基）时，最佳培养时间为１２ｈ，此时α－淀粉酶活力最高。 参考文献 ［１］沈萍，范秀容，李广武．微生物学实验． 北京：高等教育出版社，２０００．［２］臧明玺，姜延程，李廷生．发酵助剂提高 枯草杆菌α－淀粉酶的活性研究．郑州粮食学院学报，１９９７． ［３］钟穗生等．枯草杆菌α－淀粉酶的活性 研究．太原工业大学学报，１９９７． 枯草杆菌生产α－淀粉酶的研究 哈申吐力古尔 （内蒙古通辽职业学院 通辽 ０２８０４５） 摘　要：以枯草杆菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｕｂｔｉｌｉｓ ＢＦ７６５８）为实验菌株，以淀粉为主要原料，采用液态培养基摇瓶发酵，生产α－淀粉酶。结果表明：①在２３℃至４４℃内，培养基起始ＰＨ为自然ＰＨ，产酶最适培养温度为：３７℃②枯草杆菌在淀粉液态培养基中３７℃，振荡培养，其产酶最适淀粉水组成为：淀粉∶水＝７５∶１００；③在最适温度３７℃下，淀粉∶水＝７５∶１００时，最适培养时间为３６ｈ。关键词：α－淀粉酶 枯草杆菌 淀粉液体培养基中图分类号：Ｒ３１３文献标识 码：Ａ 文章编号：１６７４－０９８Ｘ（２０１０）１０（ｂ）－００１０－０１ 表１　不同温度下所测糖度值 表２　不同培养基对枯草杆菌产α－淀粉酶的影响

实验一 淀粉酶产生菌的筛选

实验一淀粉酶产生菌的筛选 一、实验要求： 1、写出完整的分离纯化淀粉酶产生菌的实验步骤； 2、写出分离培养基及其相关试剂所需的量、仪器、器皿所需的量； 3、掌握从土壤分离酵母菌的方法和技术，从样品中分离出所需菌株； 4、学习并掌握平板倾注法和斜面接种技术，了解培养淀粉酶产生菌的培养 条件和培养时间。 二、实验原理：用梯度稀释法来分离淀粉酶产生菌 三、实验材料： 1.培养皿、移液管、刮铲、显微镜等, 2.可选取厨房土壤、面粉加工厂和菜园土壤 ; 3.培养基与试剂 :牛肉膏、蛋白胨、NaCl 、可溶性淀粉、蒸馏水、琼脂粉。 四、实验步骤： 1、选定采土点后，铲去表土层2-3cm，取3-10cm深层土壤5g，装入灭过 菌的牛皮纸袋内，封好袋口，并记录取样地点、环境及日期。土样采集后应及时分离，凡不能立即分离的样品，应保存在低温、干燥条件下，尽量减少其中菌相的变化。 2、培养基的配置，(1) 分离培养基采用牛肉膏蛋白胨固体培养基加0.2%可溶性淀 粉 即牛肉膏3g、蛋白胨10g、NaCl 5g、可溶性淀粉2g溶于1000mL蒸馏水中再加入15g琼脂粉 pH调至7.2 121℃灭菌15min 待冷却至50℃左右时 于超净工作台倒平板。注: 先将可溶性淀粉加少量蒸馏水调成糊状 再加到溶化好的培养基中 调匀; (2) 分离培养基液体培养基采用牛肉膏蛋白胨固体培养基加0.2%可溶性淀粉,即牛肉膏3g、蛋白胨10g、NaCl 5g、可溶性淀粉2g溶于1000mL蒸馏水中 pH调至7.2,121℃灭菌15min。 3、取所采的土样5g加入到三角瓶中,加入无菌水45mL,30℃摇床振荡30min制成土 壤悬液 ,此时的稀释度为10-1。另取7支试管 分别记作10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8共8个梯度 每支试管内加入9mL无菌水。用无菌移液管从三角瓶中吸取1mL土壤悬液加入到10-2试管中混匀, 再从此试管中吸取1mL加入到10-2试管中, 依此类推直至10-7试管。分别从10-6、10-7、10-8三个稀释度的试管中吸取100uL悬液, 均匀涂布于分离培养基平板上, 于27℃培养1-2天，等长出菌落后, 将检测试剂卢戈氏碘液加入到平板中, 菌落周围形成水解圈的菌株即是产淀粉酶的菌株, 因淀粉遇碘变蓝色 ,如菌落周围有无色圈说明该菌能分解淀粉。将水解圈直径与菌落直径之比较大菌株,即产酶能力较强的菌株的进行编号。 4、纯化; 将保存的菌株用接种环沾取少量培养物至平板上, 并进行2-3次划线分离, 挑取单菌落至平板上, 培养后观察菌苔生长情况并镜检验证为纯培养。将纯化后产酶能力较强菌株保存至斜面培养基中培养.

产淀粉酶菌株筛选综述

微生物与转基因技术 摘要微生物目前已是生物技术领域主要的模式生物之一，微生物可以为转基因技术提供工具酶、基因载体；微生物本身也常作为目的基因的受体细胞。通过转基因的方式，可以将人类所需要的基因转移到特定物种上，从而表达出人类想要的性状。本文综述了转基因微生物在食品、农业、医药以及环境保护、传统工业改造等领域研究与应用的国内外现状。在食品生产领域，转基目微生物主要用于食品用群制剂的生产，如凝乳酶．淀粉酶，蛋白酶等，转基因酵母也应用于啤酒的生产．在农业生产领域，转基因微生物主要用于微生物农药、微生物肥料和饲料酶制剂的生产．在医药生产领域，转基因微生物主要用于兽用和人用疫苗的生产，以及利用转基因镟生物生产某些药物。此外，转基因微生物在环境保护，传统工业的改造、印染业，以及新能薄开发等方面也有应用，本文也同样大致介绍了一些目前国内外关于微生物转基因方面的前沿研究。 关键词微生物转基因，DNA重组技术，目的基因，基因载体 1引言 转基因技术的理论基础来源于进化论衍生来的分子生物学。基因片段[1]的来源可以是提取 特定生物体基因组中所需要的目的基因，也可以是人工合成指定序列的基因片段。基因片段被转入特定生物中，与其本身的基因组进行重组，再从重组体中进行数代的人工选育，从而获得具有稳定表现特定的遗传性状的个体。该技术可以使重组生物增加人们所期望的新性状，培育出新品种。1980年代以来，现代生物技术迅速发展，在医药、农业、食品、化工、环境和能源等领域发挥了巨大的经济效益和社会效益。自1982年美国FDA批准了世界上第一例基因工程药物重组人胰岛素的正式生产以来，以基因工程药物为主的各种基因工程产品陆续实现商品化生产。其中，转基因微生物是基因工程产品的重要组成部分，在农业生产、食品加工、医药生产以及环境保护等领域得到了广泛的应用。 2微生物与转基因技术 1.微生物与转基因工具酶 转基因技术中，需要一些基本的工具酶，如对供体生物的DNA进行切割以获得目的基因的限制性核酸内切酶、DNA聚合酶类、DNA连接酶、核酸外切酶、反转录酶等。 DNA聚合酶类包括DNA聚合酶Ⅰ、KlenowDNA聚合酶、T4DNA聚合酶、T7DNA聚合酶、耐热DNA聚合酶等。耐热DNA聚合酶是一类在高温下具有聚合活性的DNA聚合的，来自于嗜高温的细菌，方要应用于PCR反应中，具体种类有产自嗜热水生菌的TaqDNA聚合酶、VentDNA聚合酶、PwoDNA聚合酶、TthDNA聚合酶和PfuDNA聚合酶，其中Taq DNA聚合酶，使DNA的体外复制变得异常简便和常规化，大大加快了生物工程、基因组等分子生物学研究的进程，年销售利润达到上亿美元。 依赖于DNA的RNA聚合酶包括SP6噬菌体RNA聚合酶、T4噬菌体RNA聚合酶或T7噬菌体RNA聚合酶，这类酶无需引物，但识别DNA上特异性位点（启动列），合成RNA。 核酸酶S1，来源于米曲霉，具有3’->5’外切核酸酶活性，能特异性降解单链DNA或RNA 的核酸酶，基因工程中用于黏性末端的平切。 核酸酶BAL31，来源于交替单胞菌BAL31，对单链DNA和RNA具有类似核酸酶S1的催化活性，能同时从3’-端和5’-端降解双链DNA并使其缩短大约25%长度，催化反应需要Ca2+。基因工程中用于缩短DNA和构建嵌套缺失体也应用于限制酶图谱制作等。 2.微生物与转基因载体

产淀粉酶的芽孢杆菌的分离和筛选(1)

从土壤中分离和筛选产淀粉酶活性的芽孢杆菌及部分鉴定 试验 一、实验目的 1、通过本实验的学习，学习掌握从环境中分离产淀粉酶菌株以及菌株初步鉴定的方法； 2、巩固微生物分离纯化、细菌生理生化鉴定,对所学习过的微生物学实验方法进行综合技能训练； 3、培养综合利用微生物学、生物化学等相关知识，自行设计、实施并判断实验结果的能力。 4、根据所学知识自主设计实验方案，在实验方案通过审核后组织实施，最终要求获得产淀粉酶的菌株。 二、实验原理 1、土壤中含有各种微生物，其中产淀粉酶的芽孢杆菌含量在不同土壤中含量也不同，因此实验前进行预埋工作，能使土壤中产淀粉酶的细菌含量增加。待实验前取样即可。 2、在只用淀粉充当碳源的选择培养基中，只有能产生淀粉酶利用淀粉的菌体能成为优势菌种。在淀粉选择培养基中，产淀粉酶的菌种可以得到富集及分离。 3、芽孢是菌体生长到一定阶段形成的一种抗逆性很强的休眠体结构，芽孢最主要的特点就是抗性强，对高温、紫外线、干燥、电离辐射和很多有毒的化学物质都有很强的抗性。它帮助菌体度过不良环境，在适宜的条件下可以重新转变成为营养态细胞。细菌富集一段时间后，生长环境不利，会产生芽孢，再在80-90℃温度下杀死菌体，可使芽孢得到富集。 4、芽孢杆菌属的共同特征是：革兰氏阳性；接触酶阳性；水解淀粉；VP试验阳性；不产生吲哚；苯甲氨酸不脱氨；分解酪素；不分解酪氨酸；不产生二羟丙酮；营养体的最高生长温度大约从25℃到75℃以上；最低生长温度大约5℃到45℃；生长最低pH值，从—8到2左右；耐盐范围从低于2%的NaCl到25%NaCl；营养

明胶（22℃）7天内液化1厘米或1厘米以上。枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌在糖发酵试验用阿拉伯糖，木糖和甘露糖代替葡萄糖可产酸；作为营养生长的最低限培养基是无维生素的，但含有葡萄糖、柠檬酸盐和一个氨态盐作为唯一的碳源和氮源。 5、在含有淀粉的鉴别培养基的平板上，具有产淀粉酶能力的芽孢杆菌，水解淀粉生成小分子糊精和葡萄糖，在淀粉平板上菌落周围出现水解圈，但肉眼不易分辨，滴加碘液，未水解的淀粉呈蓝色，水解圈无色。 二、实验材料 1、土壤样品 实验前三天在距土壤表层5-8厘米左右处填埋馒头，实验前一天用塑料袋在预埋处取样 2、药品 可溶性淀粉、蛋白胨、Nacl、牛肉膏、琼脂粉、碘、碘化钾、磷酸氢二钠、柠檬酸、盐酸 3、试剂： （1）配制稀碘液： 原碘液：称取碘和碘化钾，用少量水使碘完全溶解，定容至500ml，贮存于棕色瓶中。 稀碘液：吸取原碘液，加入碘化钾用水溶解定容至500ml，贮存于棕色瓶中。 （2）可溶性淀粉溶液：称取2.00g可溶性淀粉于烧杯中，用少量水调成浆糊状，边搅拌边缓慢加入70ml沸水中，然后用水冲洗装淀粉的烧杯，洗液倒入其中，搅拌加热至完全透明，冷却定容至100ml。（溶液现配现用） （3）磷酸缓冲液（pH=）：称取45.23g磷酸氢二钠和8.07g柠檬酸，用水溶解并定容到1000ml，用pH计校正后使用

产淀粉酶芽孢杆菌分离与酶活力测定

产淀粉酶芽孢杆菌的分离、纯化并发酵测定淀粉酶活力杨敏仪，罗桂莲，关婷婷，黄真梅，肖维兴，梁妃法 注明：蓝色字体是已修改的 一、实验目的 1、掌握分离鉴定产淀粉酶微生物的方法； 2、掌握测定酶活力的方法； 3、培养自行设计、实施实验的能力。 二、实验原理 1、土壤中含有各种微生物，其中产淀粉酶的枯草芽孢杆菌含量在不同土壤中含量也不同，因此实验前进行预埋工作，能使土壤中产淀粉酶的细菌含量增加。待实验前取样即可。 2、在只用淀粉充当碳源的选择培养基中，只有能产生淀粉酶利用淀粉的菌体能成为优势菌种。在淀粉选择培养基中，产淀粉酶的菌种可以得到富集及分离。 3、菌体可经革兰氏染色后在显微镜下被判断出是否为枯草芽孢杆菌。 4、在含有淀粉的鉴别培养基上的平板上，具有产淀粉酶能力的枯草芽孢杆菌，水解淀粉生成小分子糊精和葡萄糖，在淀粉平板上菌落周围出现水解圈，但肉眼不易分辨，滴加碘液，未水解的淀粉呈蓝色，水解圈无色。 三、实验材料 1、土壤样品 湛师弘志苑后面的花圃，实验前一周在距土壤表层5—8厘米左右处填埋馒头，实验前一天用塑料袋在预埋处取样。 2、培养基 淀粉培养基：可溶性淀粉1%，蛋白胨1%，葡萄糖0.5%，氯化钠0.5%，牛肉膏0.5%，琼脂粉2.0%，pH7，配制300ml 种子培养基：牛肉膏0.5%，蛋白胨1%，氯化钠0.5%，可溶性淀粉0.5%，琼脂粉2.0%，pH7,配制300ml

发酵培养基：玉米粉 2% ，黄豆饼粉1.5 %， CaCl20.02% ， MgSO40.02 %， NaCl 0.25 %， K2HPO4 0.2 %，柠檬酸钠0.5 % ，硫酸 氨0.075（溶解后），Na2HPO4 0.2% ，校正pH7.0，发酵培养 条件为：温度37℃，装液100ml/250ml，配制200 ml 3、试剂 草酸铵结晶紫染液，95%乙醇，番红水溶液、卢戈氏碘液 4、玻璃器皿 锥形瓶（250mL）3个，培养皿40个，涂布棒1根，移液管（1mL） 10根，试管15根，烧杯（250mL）5个，盖玻片、载玻片若干，5、其他仪器及设备： 天平，pH试纸，棉花，牛皮纸，玻璃珠，超净工作台，生化培 养箱，电热干燥箱，高压蒸汽灭菌锅，水浴锅，显微镜，接种 环等 四、实验步骤 1、样本采集 ①在预埋处采取土样用塑料袋装好，不要损坏土壤的内部结构。 ②取12.5g土壤加入250ml烧杯中，再加入112ml去离子水制成土壤混悬液，加入一小层玻璃珠。在锥形瓶中加入2g的可溶性淀粉，蛋白胨0.625g，NaCL0.625g,调节PH值为7.0—7.2。在37℃摇床培养箱中培养两天，使菌体富集且产生大量芽孢。 在85℃-90℃水浴锅中加热10分钟，杀灭菌体，使芽孢得到富集。 3、初筛 将富集得到的菌体液静置5分钟，然后进行浓度梯度稀释到10-6，分别在10-1 、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6浓度下各取1mL均匀涂布在淀粉培养基上，培养皿放入37℃培养箱中培养24小时。取出培养好的平皿在长出的菌落上滴加碘液，菌落周围如有无色透明圈出现，说明淀粉被水解，即该菌株能产生淀粉酶。 4、划线分离 从初筛所得的菌落中选择菌落周围透明圈和菌落直径之比值较大的菌落，进行划线分离。将于种子培养基上划线后，再将培养皿放入37℃培养箱中培养24小时。 5、镜检 挑取一个较好的单个菌落，通过革兰氏染色制片观察，判别所选菌

淀粉酶产生菌的筛选

实验一淀粉酶产生菌的筛选 及酶活力测定 指导老师：辛树权 生命科学学院08级生物技术（三）班豆豆 同组人：xx xxx 摘要：自然界是微生物的大本营，实验室微生物几乎都是从自然界中选育出来的。我们从学校的花坛中采集一些土壤样本，拿到实验室中，进行淀粉产生菌的筛选。利用土壤制成菌液，将其涂抹在牛肉膏蛋白胨培养基上进行纯化，再用淀粉培养基培养，最后通过淀粉透明圈的大小来判断淀粉产生菌产淀粉的能力。再使用分光光度计精确测量淀粉酶的酶活力。关键词：淀粉酶；分离；纯化；透明圈；酶活力；摇瓶；分光光度计 一、实验目的： 1、学习从土壤中分离微生物的方法； 2、学习淀粉酶产生菌的筛选方法 3、了解分光光度计法测定酶活力的原理及方法。 二、实验原理： 土壤中含有大量的微生物，将土壤稀释液涂在不同类型的培养基上，在适宜的环境中培养几天，细菌或者是其他的微生物便能在平板上生长繁殖，形成菌落。将初次筛选得到的微生物接到淀粉培养基上培养，因为只有能够产生淀粉酶的细菌才能够利用培养集中的淀粉成分来完成自身的生命活动，才能够生存。故在淀粉培养基上长出的菌便是淀粉产生菌。在培养基上滴碘液，淀粉被分解掉的部分不显现蓝色，出现透明圈，可以通过透明圈的大小来初步判断菌种产淀粉的能力。

淀粉酶是指一类能催化分解淀粉分子中糖苷键的酶的总称，主要包括α－淀粉酶和β-淀粉酶等，α-淀粉酶可从淀粉分子内部切断淀粉的α-1,4糖苷键，形成麦芽糖、含有6个葡萄糖单位的寡糖和带有支链的寡糖，是淀粉的粘度下降，因此又称为液化型淀粉酶。淀粉遇碘呈蓝色。这种淀粉-碘复合物在660nm处有较大的吸收峰，可用分光光度计测定。随着酶的不断分作用，淀粉长链被切断，生成小分子的糊精，使其对碘的蓝色反应逐渐消失，因此可以根据一定时间内蓝色消失的程度为指标来测定α-淀粉酶的活力。 三、实验器材及试剂： 1.、材料：长春师范学院家属楼前小菜园 2培养基： （1）分离培养基：牛肉膏蛋白胨固体培养基（牛肉膏3g、蛋白胨10g、NaCl 5g、溶于1000mL蒸馏水中，再加入15g琼脂粉，pH调至7.2，121℃灭菌15min，待冷却至50℃左右时，于超净工作台倒平板） （2）筛选培养基：淀粉培养基（可溶性淀粉 20g, 硝酸钾 1g, 磷酸氢二钾 0.5g, 氯化钠 0.5g, 硫酸镁 0.5g, 硫酸亚铁 0.01g, 琼脂 20g, 水 1000毫升，调整pH值到7.2～7.4。） （3）摇瓶培养：淀粉培养液。 3、试剂： 碘液、2%可溶性淀粉、pH6.0磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液、标准糊精溶液、 0.5mol/L乙酸、0.85%生理盐水。 4、器材： 培养皿、锥形瓶、高压灭菌锅、超净工作台、恒温水浴锅、分光光度计。

高产淀粉酶菌株的筛选

高产淀粉酶菌株的筛选 一：前言 1. 掌握从环境中采集样品并从中分离纯化某种微生物的完整操作步骤。 2. 巩固以前所学的微生物学实验技术。 3. 学会筛选高产淀粉酶菌株。 关键词：产淀粉酶、芽孢杆菌、酶活力、筛选 1.α-淀粉酶是一种液化型淀粉酶，它的产生菌芽孢杆菌，广泛分布于自然界，尤其是在含有淀粉类物质的土壤等样品中。 2. 从自然界筛选菌种的具体做法，大致可以分成以下四个步骤：采样、富集培养、初步筛选、分离纯化和性能测定。 a) 采样：即采集含菌种的样品采集含菌样品前应调查研究一下自己打算筛选的微生物在哪些地方分布最多，然后才可着手做各项具体工作。在土壤中几乎各种微生物都可以找到，因而土壤可说是微生物的大本营。例如厨房土壤、面粉加工厂和菜园土壤中淀粉的分解菌较多。 b) 富集培养：富集培养就是在所采集的土壤等含菌样品中加入某些物质，并创造一些有利于待分离微生物生长的其他条件，使能分解利用这类物质的微生物大量繁殖，从而便于我们从其中分离到这类微生物。 c) 初步筛选： i. 初筛使用选择培养基对菌种进行培养，通过培养基的特殊成分，来筛选出目的菌种，从而进行培养。 ii. 初筛利用鉴别培养基，通过添加一些特殊的试剂或成分来鉴别出目的菌种，从而筛选出来并对其进行培养。 d) 分离纯化：通过上述的筛选只能说我们要分离的目的菌种已经存在，但还要把夹杂在其中的杂菌除去，从而得到纯种的菌落。纯种分离的方法很多，主要有：平板划线分离法、稀释分离法、单孢子或单细胞分离法、菌丝尖端切割法等。 e) 性能测定：分离纯化得到的菌种之后，所分得的菌种是否具有实验所要求的性能，还必须要进行性能测定后才能决定取舍。 二、实验材料：接种环、试管、三角瓶、培养皿、移液管、高压蒸汽灭菌锅、玻璃棒、量筒、酒精灯、纱布、棉花、面线绳、恒温培养箱载玻片可见分光光度计显微镜紫外操作台 实验试剂：牛肉膏、蛋白胨、淀粉、NaCl、琼脂粉、蒸馏水、卢卡式碘液、95%乙醇、蕃红、革兰氏碘液 培养基配制：牛肉膏1.3g、蛋白胨2.5g、NaCl 1.3g、淀粉2g、溶于250mL蒸馏水中，一边加热再慢慢加入5g琼脂粉 三：实验步骤 1培养基的制备及其仪器的灭菌

“产淀粉酶菌株的筛选”优秀设计

产淀粉酶（α-淀粉酶）细菌菌株筛选 一、实验目的： 1.掌握从环境中采集样品并从中分离纯化某种微生物的完整操作步骤。 2.巩固以前所学的微生物学实验技术。 3.学习淀粉酶活性的测定方法。 二、实验原理： 1.α-淀粉酶是一种液化型淀粉酶，它的产生菌芽孢杆菌，广泛分布于自然界，尤其 是在含有淀粉类物质的土壤等样品中。 2.从自然界筛选菌种的具体做法，大致可以分成以下四个步骤：采样、富集培养、初 步筛选、分离纯化和性能测定。 a)采样：即采集含菌种的样品 采集含菌样品前应调查研究一下自己打算筛选的微生物在哪些地方分布最多， 然后才可着手做各项具体工作。在土壤中几乎各种微生物都可以找到，因而土 壤可说是微生物的大本营。例如厨房土壤、面粉加工厂和菜园土壤中淀粉的分 解菌较多。 b)富集培养： 富集培养就是在所采集的土壤等含菌样品中加入某些物质，并创造一些有利于 待分离微生物生长的其他条件，使能分解利用这类物质的微生物大量繁殖，从 而便于我们从其中分离到这类微生物。 c)初步筛选： i.（选择培养基）初筛使用选择培养基对菌种进行培养，通过培养基的特殊 成分，来筛选出目的菌种，从而进行培养。 ii.（鉴别培养基）初筛利用鉴别培养基，通过添加一些特殊的试剂或成分来鉴别出目的菌种，从而筛选出来并对其进行培养。 d)分离纯化： 通过上述的筛选只能说我们要分离的目的菌种已经存在，但还要把夹杂在其中 的杂菌除去，从而得到纯种的菌落。纯种分离的方法很多，主要有：平板划线 分离法、稀释分离法、单孢子或单细胞分离法、菌丝尖端切割法等。 e)性能测定： 分离纯化得到的菌种之后，所分得的菌种是否具有实验所要求的性能，还必须 要进行性能测定后才能决定取舍。 三、实验材料： 1.培养基配制： a)培养基按以下比例配制后，加蒸馏水调至100%； b)富集培养基：可溶性淀粉1%、蛋白胨1%、葡萄糖0.5%、NaCl 0.5%、牛肉膏 0.5%、pH7.0； c)分离培养基：玉米粉2%、黄豆饼粉1.5%、琼脂粉0.8%、CaCl 0.02%、MgSO4 0.02%、 NaCl 0.25%、K2HPO40.2%、柠檬酸钠0.2%、硫酸铵0.075%（溶解后加入）、 Na2HPO40.2%、pH7.0。 2.主要试剂和溶液的配制： a)2%淀粉溶液：准确称取淀粉2g溶于100ml 0.1mol/L pH5.6的柠檬酸缓冲液中。 b)0.1mol/L的柠檬酸缓冲液、pH=1.0的盐酸

分离产淀粉酶的芽孢杆菌要点

微生物学设计性实验报告 项目组长＿学号＿＿成员专业＿生物科学班级＿＿实验项目名称＿土壤中微生物的分离及分类＿指导教师及职称＿＿＿开课学期至学年＿＿学期上课时间 从环境中分离产淀粉酶的芽孢杆菌 一、摘要 本文通过对土壤中细菌杀灭营养体芽孢萌发，并用由淀粉充当碳源的选择培养基培养分离，纯培养后通过镜检最后得到能产胞外淀粉酶的芽孢杆菌。 二、实验目的及要求 1、通过本实验的学习，使学生学习掌握从环境中分离产淀粉酶菌株以及菌株初步鉴定的方法； 2、巩固微生物分离纯化、细菌生理生化鉴定、染色观察等实验技能，对所学习过的微生物学实验方法进行综合技能训练； 3、培养学生综合利用微生物学、生物化学等相关知识，自行设计、实施并判断实验结果的能力。 4、要求学生根据所学知识自主设计实验方案，在实验方案通过审核后组织实施，最终要求获得产淀粉酶的菌株并对其进行初步的鉴定。 三、实验仪器设备 主要仪器：超净工作台、生化培养箱、电热干燥箱、高压蒸汽灭菌锅、水浴锅、显微镜、培养接种器具等 主要制剂：富集培养基、选择性培养基、5%的番红水溶液、卢戈氏碘液 四、实验方案设计 （一）实验原理 1、土壤中含有各种微生物，其中产胞外淀粉酶的芽孢杆菌含量在不同土壤中含量也不同，生物在适宜的的环境下生存得好，所以在淀粉厂附近的土壤中，能利用淀粉的微生物含量较高。 2、芽孢是菌体生长到一定阶段形成的一种抗逆性很强的休眠体结构，芽孢最主要的特点就是抗性强，对高温、紫外线、干燥、电离辐射和很多有毒的化学物质都有很强的抗性。它帮助菌体度过不良环境，在适宜的条件下可以重新转变成为营养态细胞。 3、在只用淀粉充当碳源的选择培养基中，只有能产保外淀粉酶利用淀粉的的菌体能成为优势菌种。在淀粉选择培养基中，产胞外淀粉酶的菌种可以得到富集及分离。 4、菌体可经简单染色后在显微镜下被判断出是否为杆菌

枯草芽孢杆菌分离及筛选实验方案

微生物设计性实验 枯 草 芽 孢 杆 菌 的 分 离 及 筛 选 第二小组 组长：杨泽升 组员：王亭亭 叶宁 霍克

枯草芽孢杆菌的分离和筛选 1 实验目的 掌握枯草芽孢杆菌的分离筛选的基本原理，熟练掌握无菌接种技术、微生物分离筛选技术和微生物形态观察技术。了解枯草芽孢杆菌的分布、营养、生长等特点，以及它所具有的产淀粉酶的功能。根据这些特点进行分离和筛选，从而得到纯菌株。 2 实验原理 枯草芽孢杆菌属革兰氏阳性菌，芽孢0.6～0.9×1.0～1.5微米，椭圆到柱状，位于菌体中央或稍偏，芽孢形成后菌体不膨大。菌落表面粗糙不透明，污白色或微黄色，在液体培养基中生长时，常形成皱醭。需氧菌。有的菌株是α-淀粉酶和中性蛋白酶的重要生产菌；有的菌株具有强烈降解核苷酸的酶系。广泛分布在土壤及腐败的有机物中，易在枯草浸汁中繁殖，故名。选择含淀粉丰富的土壤为最佳，80度的水浴处理样品1小时，目的是杀死微生物营养体，残留芽胞。利用稀释涂步法，在淀粉的培养基培养，培养1-3天后，观察。然后，进行初筛与纯化，鉴定参照《伯杰氏细菌手册》鉴定或者利用显微镜进行革兰氏染色，确认是否为枯草芽孢杆菌。再复筛，测定其淀粉酶活，最后确定菌株。 3实验材料 3.1选择培养基 本次实验进行产淀粉酶的枯草芽孢杆菌的筛选，所以应选淀粉培养基， 配方： 牛肉膏 5.0g 蛋白胨 10.0g 氯化钠 5.0g 可溶性淀粉10.0g 琼脂 20g 蒸馏水 1000ml 调整pH至7.2 配置时应先把淀粉用少量蒸馏水调成糊状，再加入到融化好的培养基中。 3.2溶液或试剂 牛肉膏 1.25g 蛋白胨 2.5g 氯化钠 1.25g 可溶性淀粉 2.5g 琼脂 5g 碘11克，碘原液2毫升，碘化钾42克，可溶性淀粉2克，磷酸氢二钠45.23克，柠檬酸8.068克，氯化钴25克，重铬酸钾3.34克， 100毫升0.01NHCL。 3.4仪器或其他用品 平板培养皿 10个、试管15支、三角瓶2个、烧杯3个、称量纸、高压蒸汽灭菌锅、干燥箱、恒温培养箱、超净工作台、无菌涂布器、电热恒温水浴、500ml 量筒、显微镜、无菌吸管、无菌培养皿、无菌刻度吸管、酒精灯、记号笔、火柴、试管架、接种钩、滴管等。 4 实验流程