基因敲除技术及其进展

基因敲除技术研究进展及其在代谢工程

上的应用

The Current Status of Gene Knockout and its Application in Metabolic

Engineering

天津大学化工学院

二零壹六年六月

摘要

基因敲除技术是20世纪80年代发展起来一项重要的分子生物学技术，在微生物代谢工程，动植物改造以及功能基因研究方面具有广泛的应用。本文介绍了基因敲除的策略和在代谢工程中的作用，着重介绍了四种新兴的基因敲除策略：RNAi，ZFN，TALENs以及最近研究火热的CRISPR/Cas9。并在最后展望了基因敲除技术尤其是新兴技术在相关领域的发展趋势，为基因敲除技术的进一步发展提供了参考。

关键词：基因敲除代谢工程同源重组CRISPR/Cas9

ABSTRACT

Gene Knockout is an important molecular biotechnology which has developed sine 1980. It has been proved efficient in microbial metabolic engineering, transform of nimals and plants and functional genomics. In this review, we mainly introduced the strategies of gene knockout and its application in metabolic engineering.And four new strategies RNAi, ZFN, TALENs and CRISPR/Cas9 were highlighted in detail. At last, developing frontiers and application prospects of gene knockout were further discussed.

KEY WORDS：gene knockout,metabolic engineering,homologous recombination,CRISPR/Cas9

目录

第一章基因敲除技术 (1)

1.1基因敲除相关背景 (1)

1.2基因敲除技术在代谢工程中的应用 (2)

第二章基因敲除策略 (3)

2.1传统的基因敲除策略 (3)

2.1.1利用同源重组进行基因敲除 (3)

2.1.2利用随机插入突变进行基因敲除 (4)

2.2新兴的基因敲除策略 (5)

2.2.1 利用RNA干扰引起的基因敲除 (5)

2.2.2 锌指核酸酶基因打靶技术 (5)

2.2.3 TALENs 靶向基因敲除技术 (6)

2.2.4 CRISPR/CAS9基因敲除技术 (7)

第三章前景展望 (9)

参考文献 (10)

致谢 (11)

第一章基因敲除技术

1.1基因敲除相关背景

随着测序技术的迅速发展，生物体基因功能的研究已经成为当下最热门的课题。现阶段基因功能的研究主要是通过减弱或中止某一基因表达，观察生物体整体功能变化，推测该基因的相关功能，然后将基因与生物整体功能相关联进行深入探究，为最终确定基因功能提供依据[1]。随着功能基因组学研究的深入，相关技术也得到不断地发展与完善，其中最为常用的便是基因敲除技术。

基因敲除是20世纪80年代末发展起来的一门新技术，2007年获得诺贝尔生理或医学奖[1]。该技术是以DNA同源重组技术和胚胎干细胞技术为基础，经过30余年的发展，现今已经有多种基因敲除技术被应用于分子生物学、遗传学等诸多领域[2]。而近年来新兴起了ZFNs、TALENS、Cas9等多种基因高效靶向修饰和调控技术。2012年1月基因组编辑核酸酶技术的Nature Methods杂志评选为年度研究方法[3]。2012年12月被Science杂志评为2012年度十大科学进展之一[4]。这些技术极大地提高了基因敲除的效率，且具有极高的特异性，为研究基因功能创造了新的途径必将极大地推动生物学、医学研究的发展。

基因敲除技术分为完全基因敲除和条件型基因敲除。完全基因敲除是指通过同源重组法完全消除细胞或者动物个体中的靶基因活性。条件型基因敲除是指通过定位重组系统实现特定时间和空间的基因敲除[5]。现阶段条件型基因敲除以噬菌体的Cre/Loxp系统和酿酒质粒的FLP/FRT系统应用最为广泛。基因敲除技术已从最初简单的完全敲除发展到条件敲除阶段，现正朝着特定组织基因敲除、特定时间基因敲除的可调控敲除方向发展。

然而，基因敲除也有其无法克服的缺点和不足：1）在敲除过程中，被破坏的常常只是靶基因的部分外显子而并不是整个编码区，残留的编码序列有可能组合出新的未知的功能，这将给表型分析带来麻烦；2）敲除掉某个基因并不一定就能获知该基因的功能，其原因在于许多基因在功能上是冗余的，敲除掉

一个在功能上冗余的基因，并不能造成容易识别的表型，因为基因家族的其它成员可以提供同样的功能；3）对于某些必需基因，敲除后会造成细胞死亡，也就无法研究这些必需基因的功能；4）实验费用偏高，同一个打靶载体在不同遗传背景下进行基因敲除，获得的表型差异很大[6]。

1.2基因敲除技术在代谢工程中的应用

具体而言，代谢工程是利用基因工程技术或其他物理、化学方法对细胞的代谢途径进行精确地修饰与改造，对细胞内目标物质的代谢流进行扩展、减小、阻断或构建新的代谢途径，从而有目的、有理性地改变微生物原有代谢特性，改进或者构建新的微生物表型，并与微生物基因调控、代谢调控及生化工程相结合，提高目的代谢产物活性或产量、或合成新的代谢产物的工程技术科学[7]。

代谢工程的难题就是如何使微生物的代谢主流流经理想载流途径。在发酵生产中, 为了达到这一目的，从营养物质进入细胞到产物产生通常需要从三个方面加以控制[8]，即：a. 使来自上游和各个注入分支的碳架物质能畅通地流向目的产物；b. 阻塞或去除与目的产物的形成无关或关系不大的代谢支流，使碳架物质相对集中地流向目的产物；c. 消除或削弱目的产物进一步代谢的途径。在上述各过程中，起关键作用的无疑是酶，而基因敲除技术的出现使快速失活成为现实，从而达到调节代谢流，优化代谢途径的目的。

通过基因敲除技术，可研究被敲除基因的生物学功能，还可以进行功能基因的插入及染色体基因的替换，进而可以阻断微生物细胞的代谢旁路，减弱毒/副作用，强化目标产物的产量或质量，降低能耗，从而成为具有重要工业应用价值的微生物细胞工厂研究中的重要内容[9]。

第二章基因敲除策略

以下本文将通过两个方面讲述基因敲除技术，一是传统的基因敲除策略；二是新兴的基因敲除策略。并对这些策略做一些简单介绍以及概括。

2.1传统的基因敲除策略

2.1.1利用同源重组进行基因敲除

经典的基因敲除策略是利用上述同源重组基本原理，通过体外改造一定长度/形式的基因，与细胞染色体上的靶基因发生同源重组(插入或置换)，从而改变细胞的遗传特性。

从同源重组的基本原理出发，分别针对同源重组的底物类型(单链/双链、线性/环状)、重要蛋白(RecA酶、RecBCD酶等及噬菌体中具有相似功能的酶) 和功能位点(Chi 位点) 等进行分子设计，即可开发出各种不同的基因敲除方法，根据同源重组载体的不同，可以把基因敲除方法分为线性单链DNA (ssDNA)、线性双链DNA(dsDNA) 以及环状双链DNA (质粒载体) 等3类：

1.线性单链DNA 敲除策略不但打靶载体易于构建，且其重组效率是双链

DNA的10~100倍[10]；

2.采用线性双链DNA进行同源重组，是近年来基因敲除方法的热点之一。

其优点是可以避免较为繁琐的基因克隆和质粒载体构建步骤，而直接采

用PCR方法扩增获得目标同源重组片段。然而，线性双链DNA 易于被

细胞内的RecBCD酶降解，为了解决上述问题，可以在线性双链DNA 的

两侧引入Chi位点，保护DNA不被RecBCD酶降解，并能强化RecBCD

酶介导的同源重组效率[11]。

3.构建环状质粒载体进行目标基因敲除的方法，是实现微生物基因敲除的

经典策略，主要通过微生物本身的RecA重组系统( 主要包括RecA和

RecBCD等蛋白) 发挥作用。RecA蛋白是单链结合蛋白，促进各类DNA 分子间的同源联会、配对、链交换和分支迁移RecBCD是由RecB、RecC

和RecD三个蛋白组成的复合体，它能与双链切口结合使DNA 链解开，并在Chi位点形成单链，然后由RecA蛋白促进同源重组。由于RecBCD

具有核酸外切酶V的活性，所以线性DNA 分子在细菌体内会被降解。

因此，必须通过环状质粒载体克隆来完成同源重组片段的分子设计和构

建[9]。常用的环状质粒载体敲除策略有4种[12]：

a.非复制型质粒载体敲除法

对野生菌做基因敲除，可以先考虑用非复制型载体。由于构建好的敲

除载体在受体菌中是不复制的，因此转化之后，在选择压力下，未发

生重组的转化子由于敲除载体不能复制随着菌体生长而被稀释。

b.不稳定型质粒载体敲除法

若受体菌感受态较难制备，可考虑采用不稳定型敲除载体。这种质粒

在受体菌中分配不稳定,在无压力选择或低磷条件下培养5～10代会

出现很多质粒丢失的细胞。因此转化后可先控制培养条件使敲除载体

随细胞复制以增加转化子的数目，然后再在无压力选择或低磷条件下

让质粒丢失，最后在选择压力下筛选敲除子。

c.温度敏感型( Ts型) 质粒载体敲除法

1993年，Biswas等[13]利用Ts型质粒建立了革兰氏阳性菌高效的基

因敲除系统。Biswas所用质粒pG+host5在37℃时不复制，而28℃

时以滚环模式进行复制。因此转化后在选择压力下37℃培养会导致

第一次同源重组sco(single-crossover)，之后将温度降至28℃，会促

使质粒发生滚环复制，这种复制机制会导致发生第二次

dco(double-cross-over)。重组后，目的基因或是被敲除，或是回复成

野生型。

d.结合转化敲除法

如果要进行基因敲除的目标菌不易制备感受态或感受态效率很低，则

可以通过寻找“中介菌”来完成基因转移的过程。

2.1.2利用随机插入突变进行基因敲除

大规模的随机插入突变理论上可实现在基因组范围内敲除任一基因。这项技术具有效率高、基因完全失活以及容易分离鉴定等优点。目前较为有效的方法是随机插入突变可以分为T-DNA插入突变和转座子插入突变，两者是在植物中使用广泛的基因敲除手段：

A．T-DNA插入失活技术是利用根癌农杆菌T-DNA介导转化，将一段带有报告基因的DNA序列标签整合到基因组DNA上。可以直接在植物基因组DNA中产生稳定的插入突变，而且插人位点的随机性较强，但是只适用于那些容易被

T-DNA转化的植物，且常常会引起染色体重排现象，使突变体表型与T-DNA插

入无关而难以进行遗传学分析。这种方法在拟南芥中可产生35％～40％的突变率，19％的突变体具有外观可察觉到的表型特征。

B．转座子插入突变是利用转座子在染色体上可移动的特点，当其跳跃插入到某个功能基因时，就会引起该基因的失活，并诱导产生突变型。植物特别适合于转位插入突变，因为获得的基因突变可以保留在杂合子的植株中，而通过Fl代植

株自交产生的F2代植株中可获得纯合子的突变体植株。利用转座子进行基因敲除具有很大便利，仅需已知外显子，载体构建简单，可携带多种不同抗性基因，同时处理多基因[14]。转座子插入突变只适用于存在内源活性转位子的植物种类，但这样的植物并不多。

2.2新兴的基因敲除策略

2.2.1 利用RNA干扰引起的基因敲除

RNA干扰（RNA Interference，RNAi）是指内源性或外源性双链RNA （double-stranded RNA，dsRNA）进入细胞后，在细胞内特异性降解与其同源的mRNA，从而抑制相应基因的表达，使细胞表现出特定基因缺失的表型，该现象也被称为基因沉默[15]。

dsRNA在Dicer酶的作用下可产生一系列长度为21～22 nt的siRNA(small interfefence RNA)，siRNA分子、核酸酶以及螺旋酶等结合形成RNA诱导沉默复合物(RNA—induced silencing complex，RISC)，RISC以ATP依赖的方式催化双链siRNA解旋，利用RISC内部的单链siRNA，通过碱基配对识别与之互补的靶RNA，切割靶RNA，并由RNA酶降解，从而导致目的基因的沉默。因此，通过将dsRNA分子导人细胞内，特异性地降解细胞内与其同源mRNA，封闭内源性基因的表达来失活该基因同样可以实现基因的敲除。

2.2.2 锌指核酸酶基因打靶技术

锌指核酸酶基因打靶技术(Zinc finger nucleases，ZFNs)的核心设计思想是将2个有特定功能的结构域，即特异性识别模块和功能模块融合，形成具有特定功能的蛋白[16]。单个ZFN的DNA结合结构域一般包含3～6个Cys2一His2锌指

蛋白重复单位，能特异性识别1个三联体碱基。与锌指蛋白组相连的非特异性核酸内切酶来自FokI的C端的96个氨基酸残基组成的DNA剪切域，每个FokI

单体与一个锌指蛋白组相连构成一个ZFN，识别特定的位点，当2个识别位点

相距6～8 bp距离时，2个单体ZFN相互作用产生酶切功。在此特异位点产生1

个DNA双链切口(Double strands breaks，DSB)，然后利用细胞固有的同源重组或非同源末端连接修复机制进行切口修复，从而达到精确定点修饰的目的。

图2-1 ZFN结构示意图

Figure2-1 The structure of ZFN

2.2.3TALENs靶向基因敲除技术

TALENs(Transcription Activator—like(TAL)Effector Nucleases)靶向基因敲除技术是一种崭新的分子生物学工具，被认为是基因敲除技术发展的里程碑。TALENs的设计和构建是基于植物病原体黄单胞菌(Xanthomonas)分泌的一种转录激活子样效应因子(Transcription activator—like effector，TALE)可以识别DNA 序列的原理。TALE蛋白的核酸结合域的氨基酸序列与其靶位点的核苷酸序列有恒定的对应关系，由34个氨基酸重复序列组成一个单元，重复17～18次，34个氨基酸中的第12和13个氨基酸(Repeat Variant Di—residue，RVD)对应识别1个目标碱基。。利用TAL的序列模块，可组装成特异结合任意DNA序列的模块蛋白。TALE蛋白中的DNA结合域与FokI核酸内切酶的切割域融合，在特异的位点打断目标基因，进而在该位点进行DNA操作，如敲入(Knock—in)、敲出(Knock—out)或点突变[17]。

TALENs成功解决了常规的ZENs方法不能识别任意目标基因序列，以及识别序列经常受上下游序列影响等问题，而具有与ZENs相等或更好的活性，无基因序列、细胞、物种限制，试验设计简单准确，成本低，成功率几乎可达100％，毒性低，脱靶情况少，使基因操作变得更加简单、方便。

图2-2 TALENs 靶向基因敲除技术结构图

Figure2-2 The structure of TALENs

2.2.4 CRISPR/CAS9基因敲除技术

2013年初，一种全新的人工核酸内切酶clustered regularly interspaced short palindromic repeats(CRISPR)／CRISPR—associated(Cas)9出现，主要由细菌和古细菌通过一种不断进化适应的免疫防御系统改造而成，II型CRISPR/Cas9免疫系统依赖Cas9内切酶家族靶向和剪切外源DNA。其特点是制作简单，成本低，作用高效[18]。

作为一种新的基因编辑技术，CRISPR/Cas9有靶向精确性高、试验周期短、无物种限制、具有好的活性等特点和优势。不仅如此，CRISPR/Cas系统还可以同时针对同一细胞(ES)中的多个位点能实现多靶点同时酶切，人们运用该技术成功获得斑马鱼等模式动物基因敲除模型，使得多个基因敲除、敲入成为可能。

Cas9内切酶在crRNA(CRISPRRNA )和反式激活crRNA(trans -acting CRISPRRNA，tracrRNA)的复合物的指引下，识别保守的间隔相邻基序

( protospacer adjacent motifs，PAM)，在PAM稍前几个碱基处切割，形成双链断裂的DNA，细胞启动同源重组和非同源末端连接修复机制，然后对修复位点进行修饰或插入新的遗传信息，导致基因失活。

CRISPR/Cas9 技术是继ES细胞打靶、ZFN 和TALEN 等技术后可用于定点构建基因敲除动物的第四种方法。该技术只需设计一个100bp 左右的sgRNA就可实现特异性识别，而ZFN和TALEN则需要设计改变核酸酶前面的序列以针对

不同的靶点。TALEN 技术可在几个月内得到基因敲除动物，而CRISPR/Cas9 技术则更快，只需要3～4周。

最近Tsai等改进技术，将CRISPR/Cas9技术的靶向功能与FokI核酸内切酶结合，以二聚体的形式进行切割(图2-3)，由于所切割的DNA长度比单独使用CRISPR/Cas9技术增大了两倍，提高了基因组编辑的准确性，大大降低了脱靶效应[19]。

图2-3sgRNA介导的Cas9和FokI复合系统定向基因组修饰作用示意图

Figure2-3 The function of sgRNA guided Cas9 and FoKIcombined system

第三章前景展望

第三章前景展望

综上所述，基因敲除技术从八十年代发展至今近三十年，从起始的经典基因敲除策略到如今研究火热的CRISPR/Cas9，基因敲除技术已经取得了巨大的发展。尽管利用人工核酸酶ZFN、TALENs和细菌获得性免疫系统CRISPR目前还处于研究的初期阶段，其在基因敲除方面已表现出巨大的潜力和广阔的应用前景，被认为是靶向基因修饰的革新技术。虽然这些新技术依然还有许多未知因素并没有研究透彻，但是可以相信其在微生物代谢工程以及动植物改造等方面将会发挥越来越重要的作用。

参考文献

参考文献

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致谢致谢

基因敲除技术研究新进展2011

基因敲除技术研究新进展 黄薇,严放北京大学医学部心血管研究所 gene knockout）技术是20世纪80年代发展起来的一门新技术。应用DNA同源重组技术将灭活的基因导入小鼠胚em cells，ES cells）以取代目的基因，再筛选出已靶向灭活的细胞，微注射入小鼠囊胚。该细胞参与胚胎发育形成可得到纯合基因敲除小鼠。基因敲除小鼠模型的建立使许多与人类疾病相关的新基因的功能得到阐明，使现代生物学进展。基于基因敲除技术对医学生物学研究做出的重大贡献，在该领域取得重大进展的三位科学家，70岁的美国人chi）、82岁的美国人奥利弗?史密西斯（Oliver Smithies）和66岁的英国人马丁?埃文斯（Martin Evans）分享了2 80年代末期的基因敲除技术为第一代技术，属完全性基因敲除，不具备时间和区域特异性。关于第二代区域和组织于1993年。Tsien等[1]于1996年在《Cell》首先报道了第一个脑区特异性的基因敲除动物，被誉为条件性基因敲除oxP系统为基础，Cre在哪种组织细胞中表达，基因敲除就发生在哪种组织细胞中。 imizu等[2]于《Science》报道了以时间可调性和区域特异性为标志的第三代基因敲除技术，其同样以Cre/LoxP系统re的表达。该技术使目的基因的敲除在时间上可人为控制，避免了死胎或动物出生后不久即死亡等现象的出现。 实验室Cui[3]等又报道了第四代基因工程技术，即可诱导的区域性蛋白质敲除技术，用这一技术构建的模式动物可在定蛋白质的功能，从根本上改变了前三代基因敲除技术对蛋白质代谢速度的内在依赖性，达到空前的时间精度，成组研究最先进的工具之一。 以来上述基因敲除技术只能在小鼠上完成，因为只有小鼠的ES细胞能在体外培养中无限增殖并同时保持多分化潜能以及猴等大动物模型在疾病研究中更接近于人类，大动物更有益于某些繁琐的手术操作，同时血浆及组织样本量较大家介绍近两年来基因敲除技术在大动物模型上的突破及进展。 一、大鼠ES细胞基因打靶技术 ，大鼠的生理和药理特性与人类更相近，是研究人类疾病的一种重要动物模型，在心血管疾病和糖尿病等领域的作S细胞在体外难以长期维持自我更新，用传统培养方法无法获得具有生殖传代能力的大鼠ES细胞[5]。因此在过去二物模型远不及小鼠发展迅速。2010年Tong等[6]于《Nature》报道了p53基因敲除大鼠，这在基因敲除技术上又是

基因敲除技术研究进展

兰州交通大学化学与生物工程学院综合能力训练Ⅰ——文献综述 题目：基因敲除技术研究进展 作者：王振宇 学号：201207744 指导教师：谢放 完成日期：2014-7-16

基因敲除技术研究进展 摘要基因敲除是自20世纪80年代末以来发展起来的一种新型分子生物学技术，是通过一定的途径使机体特定的基因失活或缺失的技术。在总结已有研究成果的基础上，本文对基因敲除技术的概况、原理方法应用以及近年来基因敲除技术的研究进展作一个简单的综述。 关键词基因敲除 RNA i生物模型基因置换基因打靶同源重组1. 基因敲除技术简介 基因敲除(Gene knockout)是指一种遗传工程技术，针对某个序列已知但功能未知的序列，改变生物的遗传基因，令特定的基因功能丧失作用，从而使部分功能被屏障，并可进一步对生物体造成影响，进而推测出该基因的生物学功能。 它克服了随机整合的盲目性和偶然性，是一种理想的修饰、改造生物遗传物质的方法。基因敲除借助分子生物学、细胞生物学和动物胚胎学的方法,通过胚胎干细胞这一特殊的中间环节将小鼠的正常功能基因的编码区破坏,使特定基因失活,以研究该基因的功能；或者通过外源基因来替换宿主基因组中相应部分,以便测定它们是否具有相同的功能，或将正常基因引入宿主基因组中置换突变基因以达到靶向基因治疗的目的。基因敲除是揭示基因功能最直接的手段之一。通常意义上的基因敲除主要是应用DNA同源重组原理，用设计的同源片段替代靶基因片段(即基因打靶),从而达到基因敲除的目的。随着基因敲除技术的发展,除了基因打靶技术外,近年来新的原理和技术也逐渐被应用,比较成功的有RNA干扰技术,同样也可以达到基因敲除的目的。简单的说基因敲除是指将目标基因从基因组中删除。基因敲除技术主要应用于动物模型的建立，而最成熟的实验动物是小鼠，对于大型哺乳动物的基因敲除模型还处于探索阶段。这项技术的诞生可以说是分子生物学技术上继转基因技术后的又一革命。尤其是条件性、诱导性基因打靶系统的建立，使得对基因靶位时间和空间上的操作更加明确、效果更加精确、

基因敲除技术

第23卷武 夷 科 学V o.l23 2007年12月WUY I SCIENCE J OURNA L D ec.2007 文章编号:1001 4276 (2007)01 0187 04 几种常用的基因敲除技术 李今煜,陈健铭,彭振坤 (福建农林大学生命科学学院,福建福州350002) 摘要: 摘要:随着功能基因组学研究的深入发展,基因敲除技术逐渐成为基因功能研究的重要手段,本文就常用的三种基因敲除技术,即同源重组、插入突变、RNA干扰各自的原理、适用的范围和优缺点作简要介绍。关键词: 基因敲除;同源重组;插入突变;RNA干扰 中图分类号: Q343.1 文献标识码: A 随着越来越多生物的全基因组被测序,功能基因组学成为时下研究的热点。研究基因功能的方法主要有两种思路,一是通过增强其表达,取得表达产物进行研究,二是减弱或者终止其表达,观察整体功能的变化,进而推测相应的基因功能。前者因为不能反映基因产物的真实表达情况,而逐渐被抛弃。后者将基因与生物的整体功能联系起来考察,并能为基因的功能提供直接证据,因而其技术不断得到发展和完善,其中最常用的就是基因敲除(gene knockou t)技术。 基因敲除技术除最早的同源重组技术外,新的原理和技术也逐渐被应用,比较成功的有基因的插入突变和RNA,i它们同样可以达到基因敲除的目的。下面就这几种基因敲除技术简要进行介绍。 1 利用同源重组进行基因敲除 基因敲除是在同源重组技术及胚胎干细胞(e mbryon i c ste m cel,l ES细胞)技术的基础上逐步完善发展起来,主要是利用DNA转化技术,将含有目的基因和靶基因同源片段的重组载体导入靶细胞,通过载体与靶细胞染色体上同源序列间的重组,将外源基因整合入内源基因组内,使外源基因得以表达。通过研究靶细胞或者个体在目的基因插入前后遗传特性的改变,达到研究基因功能的目的[1]。 基因敲除技术已从最初简单的完全敲除发展到条件敲除阶段,现正朝着特定组织基因敲除、特定时间基因敲除的可调控敲除方向发展。完全基因敲除是通过同源重组直接将靶基因在细胞或者动物个体中的活性完全消除;而条件基因敲除则是将某个基因的修饰限制于特定类型的细胞或个体发育特定的阶段,即通过位点特异的重组系统实现特定基因敲除[2],现阶段以噬菌体的C re/Loxp系统和酿酒质粒的FLP/FRT系统应用得最为广泛[3]。 虽然基因敲除技术的广泛使用使其成为研究基因功能重要的技术手段,但目前仍然存在 收稿日期:2007-09-26 基金项目:福建省自然科学基金计划资助项目(项目编号:2006J0052)。 作者简介:李金煜(1976-),女,硕士,研究方向:主要从事生物化学与分子生物学领域的研究。

CRISPR cas9基因敲除原理及其应用

CRISPR/Cas9基因敲除原理及其应用 CRISPR(clustered,regularly interspaced,short palindromic repeats)是一种来自细菌降解入侵的病毒DNA或其他外源DNA的免疫机制。在细菌及古细菌中，CRISPR系统共分成3类，其中Ⅰ类和Ⅲ类需要多种CRISPR相关蛋白（Cas蛋白）共同发挥作用，而Ⅱ类系统只需要一种Cas蛋白即可，这为其能够广泛应用提供了便利条件[1]。 目前，来自Streptococcus pyogenes的CRISPR-Cas9系统应用最为广泛。Cas9蛋白（含有两个核酸酶结构域，可以分别切割DNA两条单链。Cas9首先与crRNA及tracrRNA结合成复合物，然后通过PAM序列结合并侵入DNA，形成RNA-DNA复合结构，进而对目的DNA双链进行切割，使DNA双链断裂。 由于PAM序列结构简单（5’-NGG-3’），几乎可以在所有的基因中找到大量靶点，因此得到广泛的应用。CRISPR-Cas9系统已经成功应用于植物、细菌、酵母、鱼类及哺乳动物细胞，是目前最高效的基因组编辑系统[1]。 通过基因工程手段对crRNA和tracrRNA进行改造，将其连接在一起得到sgRNA（single guide RNA）。融合的RNA具有与野生型RNA类似的活力，但因为结构得到了简化更方便研究者使用。通过将表达sgRNA的原件与表达Cas9的原件相连接，得到可以同时表达两者的质粒，将其转染细胞，便能够对目的基因进行操作[2,3]。

目前常用的CAS9研究方法是通过普通质粒,质粒构建流程如下：Cas9质粒构建 设计2条单链oligo序列； 退火形成双链DNA pGK1.1 将双链DNA连接到载体 中 转化G10competent cell 筛选阳性克隆；测序验证 序列；质粒大提；电转染 靶细胞 在细胞内crRNA识别靶 位点，Cas9对靶位点进行 随机剪切 Cruiser TM酶切细胞池，计 算突变率；Cruiser TM酶切 初筛阳性克隆；将阳性克 隆测序验证；做敲除序列 比对分析。

分子生物学综述论文(基因敲除技术)

现代分子生物学 课程论文 题目基因敲除技术 班别生物技术10-2学号 10114040220 姓名陈嘉杰 成绩

基因敲除技术的研究进展 要摘基因敲除是自80年代末以来发展起来的一种新型分子生物学技术，是通过一定的途径使机体特定的基因失活或缺失的技术。此后经历了近20年的推广和应用，直到2007年10月8日，美国科学家马里奥?卡佩奇（Mario Capecchi）和奥利弗?史密西斯（Oliver Smithies）、英国科学家马丁?埃文斯（Martin Evans）因为在利用胚胎干细胞对小鼠基因金星定向修饰原理方面的系列发现分享了2007年诺贝尔生理学或医学奖。基因敲除技术从此得到关注和肯定，并对医学生物学研究做出了重大贡献。本文就基因敲除的研究进展作一个简单的综述。 关键词基因敲除、RNAi、生物模型、同源重组 前言 基因敲除又称基因打靶，该技术通过外源DNA与染色体DNA之间的同源重组，进行精确的定点修饰和基因改制，具有转移性强、染色体DNA可与目的片段共同稳定遗传等特点。应用DNA同源重组技术将灭活的基因导入小鼠胚胎干细胞（embryonic stem cells，ES cells）以取代目的基因，再筛选出已靶向灭活的细胞，微注射入小鼠囊胚。该细胞参与胚胎发育形成嵌合型小鼠，再进一步传代培育可得到纯合基因敲除小鼠。基因敲除小鼠模型的建立使许多与人类疾病相关的新基因的功能得到阐明，使现代生物学及医学研究领域取得了突破性进展。上述起源于80年代末期的基因敲除技术为第一代技术，属完全性基因敲除，不具备时间和区域特异性。关于第二代区域和组织特异性基因敲除技术的研究始于1993年。Tsien等[1]于1996年在《Cell》首先报道了第一个脑区特异性的基因敲除动物，被誉为条件性基因敲除研究的里程碑。该技术以Cre/LoxP系统为基础，Cre在哪种组织细胞中表达，基因敲除就发生在哪种组织细胞中。2000年Shimizu等[2]于《Science》报道了以时间可调性和区域特异性为标志的第三代基因敲除技术，其同样以Cre/LoxP系统为基础，利用四环素等诱导Cre的表达。该技术使目的基因的敲除在时间上可人为控制，避免了死胎或动物出生后不久即死亡等现象的出现。2004年该实验室Cui等又报道了第四代基因工程技术，即可诱导的区域性蛋白质敲除技术，用这一技术构建的模式动物可在几分钟内反转性地激活或敲除特定蛋白质的功能，从根本上改变了前三代基因敲除技术对蛋白质代谢速度的内在依赖性，达到空前的时间精度，成为目前功能基因组和功能蛋白质组研究最先进的工具之一。 1. 基因敲除技术简介 基因敲除是自80年代末以来发展起来的一种新型分子生物学技术，是通过一定的途径使机体特定的基因失活或缺失的技术。通常意义上的基因敲除主要是应用DNA同源重组原理，用设计的同源片段替代靶基因片段，从而达到基因敲除的目的。随着基因敲除技术的发展，除了同源重组外，新的原理和技术也逐渐被应用，比较成功的有基因的插入突变和iRNA，它们同样可以达到基因敲除的目的。 2．实现基因敲除的多种原理和方法： 2.1.1 利用基因同源重组进行基因敲除 基因敲除是80年代后半期应用DNA同源重组原理发展起来的。80年代初，胚胎干细胞（ES 细胞）分离和体外培养的成功奠定了基因敲除的技术基础。1985 年，首次证实的哺乳动物细胞中同源重组的存在奠定了基因敲除的理论基础。到1987年，Thompsson首次建立了

基因敲除技术的最新进展doc - 丁香园

基因敲除技术的最新进展　 yunfenglin 干细胞与组织工程讨论版　 【摘要】　自从上世纪80年代初的胚胎干细胞技术的成熟，在短短的20年里，关于基因敲除动物模型的报道呈几何数增长。现在的技术已经可以产生在时间和空间上都可以人为控制的，从点突变到染色体组大片段的删除和重排的各种基因突变小鼠，这样就可以让研究每个基因的具体功能成为可能。本文将首先简介基因敲除技术的技术背景、基本原理、基本步骤；然后将重点介绍现在基因敲除的常用策略及其利弊；接着将探讨基因打靶结果不理想的常见因素，包括基因背景、基因重复、基因补偿、和基因补充；最后介绍基因打靶技术的技术热点，包括组织特异性打靶、诱导性打靶。并探讨基因打靶技术在颌面外科的应用前景。 【关键词】基因敲除、条件性基因打靶、组织特异性基因打靶、诱导性基因打靶 技术背景 基因打靶技术是20世纪80年代发展起来的[1]，是建立在基因同源重组技术基础以及胚胎干细胞技术基础上的一种新分子生物学技术。所谓胚胎干细胞(Embryonic Stem cell，ES)是从着床前胚胎(孕3—5天)分离出的内细胞团(Inner cell mass，ICM)细胞[2]，它具有向各种组织细胞分化的多分化潜能，能在体外培养并保留发育的全能性。在体外进行遗传操作后，将它重新植回小鼠胚胎，它能发育成胚胎的各种组织。而基因同源重组是指当外源DNA片段大且与宿主基因片段同源性强者并互补结合时，结合区的任何部分都有与宿主的相应片段发生交换(即重组)的可能，这种重组称为同源重组。[3] 基因打靶就是通过同源重组将外源基因定点整合入靶细胞基因组上某一确定的位点，以达到定点修饰改造染色体上某一基因的目的的一种技术[4]。它克服了随机整合的盲目性和偶然性，是一种理想的修饰、改造生物遗传物质的方法。这项技术的诞生可以说是分子生物学技术上继转基因技术后的又一革命。尤其是条件性、诱导性基因打靶系统的建立，使得对基因靶位时间和空间上的操作更加明确、效果更加精确、可靠，它的发展将为发育生物学、分子遗传学、免疫学及医学等学科提供了一个全新的、强有力的研究、治疗手段，具有广泛的应用前景和商业价值。现在基因敲除技术主要应用于动物模型的建立，而最成熟的实验动物是鼠，对于大型哺乳动物的基因敲除模型还处于探索阶段。２０００年初的敲除了决定表面抗原的猪的模型的成功建立更是为异种器官移植排除了一道重要的障碍，展示了基因敲除技术的美好前景。 基本步骤 利用基因打靶技术产生转基因动物的程序一般为： ａ．ES细胞的获得：现在基因敲除一般应用于鼠，而最常用的鼠的种系是１２９及其杂合体，因为这类小鼠具有自发突变形成畸胎瘤和畸胎肉瘤的倾向，是基因敲除的理想实验动物。而其他遗传背景的胚胎干细胞系逐渐被发展应用，最近来自于C57BL/6×CBN/JNCrj F1小鼠的胚胎干细胞系成功地用于基因敲除。c57BL／6小鼠种系等已经广泛的应用于免疫学领域，并以此为背景建立了许多成功的转基因模型。[5,9,11] ｂ．基因载体的构建：把目的基因和与细胞内靶基因特异片段同源的DNA分子都重组到带有标记基因(如neo基因，TK基因等)的载体上，此重组载体即为打靶载体。因基因打靶的目的不同，此载体有不同的设计方法，可分为替换性载体和插入型载体[6,7]。如为了把某一外源基因引入染色体DNA的某一位点上，这种情况下应设计的插入型载体要包括外源

基因敲除小鼠的制作方法

.. 一、常规基因敲除鼠（Conventional Knockout） 常规基因敲除是通过基因打靶，把需要敲除的基因的几个重要的外显子或者功能区域用Neo Cassette 替换掉。这样的小鼠其全身所有的组织和细胞中都不表达该基因产物。此类基因敲除鼠一般用于研究某个基因在对小鼠全身生理病理的影响，而且这个基因没有胚胎致死性。 二、条件性基因敲除小鼠（Conditional Knockout） 条件性基因敲除小鼠是通过基因打靶，把两个loxP 位点放到目的基因一个或几个重要的外显子的两边。该小鼠和表达Cre酶小鼠杂交之前，其目的基因表达完全正常。当和组织特异性表达Cre酶的小鼠进行杂交后，可以在特定的组织或细胞中敲除该基因，而该基因在其他组织或细胞表达正常。 条件性基因敲除鼠适用范围为：（1）该基因有胚胎致死性；（2）用于研究该基因在特定的组织或细胞中的生理病理功能。 三、基因敲入小鼠（Knockin） 基因敲入小鼠是通过基因打靶，把目的基因序列敲入到小鼠的相应基因位点，使用小鼠的表达调控元件指导目的基因表达。 此类基因敲入鼠一般用于药物的筛选，信号通路的研究等。 获得嵌合体及之后品系纯化详细流程： 基因敲除其他方法： 一、ZFN技术制作基因敲除鼠 ZFN能够识别并结合指定的基因序列位点，并高效精确地切断。随后细胞利用天然的DNA 修复过程来实现DNA的插入、删除和修改，这样研究人员就能够随心所欲地进行基因组编辑。这在过去是无法想象的，传统的基因敲除技术依赖细胞内自然发生的同源重组，其效率只有百万分之一，而ZFN的基因敲除效率能达到10%。利用这些技术进行小鼠基因的定点敲除和敲入，可以把时间从一年缩短到几个月。 这项技术中设计特异性的ZFN是最关键的环节，目前研究者采用计算生物学方法设计高特异性的ZFN，但ZFN的脱靶（off target），也就是把不该切的地方切了的问题仍是一个挑战。也正因为这个原因，利用ZFN技术进行小鼠的基因修饰还无法完全取代传统技术。 二、TALEN技术制作基因敲除鼠 TALEN 技术是一种崭新的分子生物学工具。科学家发现，来自一种植物细菌的TAL蛋白的核酸结合域的氨基酸序列与其靶位点的核酸序列有恒定的对应关系。利用TAL的序列模块，可组装成特异结合任意DNA序列的模块化蛋白，从而达到靶向操作内源性基因的目的，它克服了ZFN方法不能识别任意目标基因序列，以及识别序列经常受上下游序列影响等问题，而具有ZFN相等或更好的灵活性，使基因操作变得更加简单方便。然而同样因为脱靶的问题，利用TALEN技术进行小鼠的基因修饰仍然无法取代传统技术。 ;.

基因敲除技术的原理、方法和应用

基因敲除技术的原理、方法和应用 2010-01-24 17:03:43 来源：易生物实验浏览次数：6302 网友评论 0 条 1．基因敲除概述 2．实现基因敲除的多种原理和方法： 2.1.利用基因同源重组进行基因敲除 2.2利用随机插入突变进行基因敲 除。 2.3.RNAi引起的基因敲除。 3．基因敲除技术的应用及前景 4．基因敲除技术的缺陷 关键词：基因敲除 1．基因敲除概述： 基因敲除是自80年代末以来发展起来的一种新型分子生物学技术，是通过一定的途径使机体特定的基因失活或缺失的技术。通常意义上的基因敲除主要是应用DNA同源重组原理，用设计的同源片段替代靶基因片段，从而达到基因敲除的目的。随着基因敲除技术的发展，除了同源重组外，新的原理和技术也逐渐被应用，比较成功的有基因的插入突变和iRNA，它们同样可以达到基因敲除的目的。 2．实现基因敲除的多种原理和方法： 2．1．利用基因同源重组进行基因敲除 基因敲除是80年代后半期应用DNA同源重组原理发展起来的。80年代初，胚胎干细胞（ES细胞）分离和体外培养的成功奠定了基因敲除的技术基础。1985 年，首次证实的哺乳动物细胞中同源重组的存在奠定了基因敲除的理论基础。到1987年，Thompsson首次建立了完整的ES细胞基因敲除的小鼠模型 [1]。直到现在，运用基因同源重组进行基因敲除依然是构建基因敲除动物模型中最普遍的使用方法。 2.1.1利用同源重组构建基因敲除动物模型的基本步骤(图1)： a．基因载体的构建：把目的基因和与细胞内靶基因特异片段同源的DNA 分子都重组到带有标记基因(如neo 基因，TK 基因等)的载体上，成为重组载体。基因敲除是为了使某一基因失去其生理功能，所以一般设计为替换型载体。

基因敲除技术

基因敲除技术 顾欣徐夕陈文舒贾琳莹 基因敲除技术是一种定向改变细胞或生物个体遗传信息的实验手段。通过对生物体遗传信息的定向修饰----外源基因定位引入，并使修饰后的遗传信息在生物体内遗传，表达突变的性状，从而研究基因功能等生命科学的重大问题，以及提供相关的疾病治疗,新药筛选评价模型等。基因敲除技术的发展已使得对特定细胞，组织或动物个体的遗传物质进行修饰成为可能。它的产生和发展建立在胚胎干细胞（embryonic stem cell,ES细胞）技术和同源重组技术成就的基础之上，并促进了相关技术的进一步发展。 方法 走进21世纪，生命科学已经进入了后基因组时代。大规模的基因功能研究正式成为生命科学研究的热点。宏伟的人类基因组计划的顺利实施，完成了人类基因组及多种模式生物基因组的序列测定。基因敲除技术综合应用现代生物医学各个研究领域的高新技术及最新研究成果，提供一个研究系统使得研究者可以在生物整体水平，组织水平，细胞水平，分子水平各个层次上全面系统地研究基因的功能。在基因功能研究方面，它具有地方所难以比拟的直接性和有效性，是后基因组时代进行功能基因组学研究的重要平台技术。从第一例成功的基因敲除报道至今，在包括美国，日本和欧洲各国在内的发达国家中，基因敲除技术已成为常规性的重要生物医学研究手段。利用基因敲除技术得到特定靶基因功能获得或者缺失的小鼠突变体并进行相关表型的研究将最终有利于绘制人类基因在各种生理和病理过程中功能的立体图卷。对基因功能的深入研究和了解将有助于发现新的具有应用价值的基因和蛋白，因此，通过基因敲除进行的基因功能研究将成为今后医药产业的基础。 基因敲除技术的发展使得它可以满足大规模基因功能研究的需要。基因敲除研究结合随机化学物质（如ENU）诱变的研究也正在世界上多个小鼠基因组中心进行。除了基因完全失活的小鼠模型，携带基因功能获得或者部分基因功能丧失突变的小鼠模型将会有助于对基因功能更全面和更深入的了解。 由于人类作为研究对象的局限性，发展相应的人类疾病动物模型，对于研究人类疾病的分子机制以及研制相应的诊断，治疗药物均具有非常重要的意义。通过基因敲除研制的人类疾病小鼠已有数百种，这些模型的建立极大地丰富了人类对这些疾病相关基因功能的了解。

基因敲除技术样本

基因敲除技术 点击次数: 2605 发布日期: -5-25 来源: 本站仅供参考, 谢 绝转载, 否则责任自负 1．概述: 基因敲除是自80年代末以来发展起来的一种新型分子生物学技术, 是经过一定的途径使机体特定的基因失活或缺失的技术。一般意义上的基因敲除主要是应用DNA同源重组原理, 用设计的同源片段替代靶基因片段, 从而达到基因敲除的 目的。随着基因敲除技术的发展, 除了同源重组外, 新的原理和技术也逐渐被应用, 比较成功的有基因的插入突变和iRNA, 它们同样能够达到基因敲除的目的。2．实现基因敲除的多种原理和方法: 2．1．利用基因同源重组进行基因敲除 基因敲除是80年代后半期应用DNA同源重组原理发展起来的。80年代初, 胚胎干细胞( ES细胞) 分离和体外培养的成功奠定了基因敲除的技术基础。1985年, 首次证实的哺乳动物细胞中同源重组的存在奠定了基因敲除的理论基础。到 1987年, Thompsson首次建立了完整的ES细胞基因敲除的小鼠模型[1]。直到现在, 运用基因同源重组进行基因敲除依然是构建基因敲除动物模型中最普遍的 使用方法。 2.1.1利用同源重组构建基因敲除动物模型的基本步骤(图1):

图1.基因同源重组法敲除靶基因的基本步骤 a．基因载体的构建: 把目的基因和与细胞内靶基因特异片段同源的DNA 分子 都重组到带有标记基因(如neo 基因, TK 基因等)的载体上, 成为重组载体。基因敲除是为了使某一基因失去其生理功能, 因此一般设计为替换型载体。 b．ES 细胞的获得: 现在基因敲除一般采用是胚胎干细胞, 最常见的是鼠, 而兔, 猪, 鸡等的胚胎干细胞也有使用。常见的鼠的种系是１２９及其杂合体, 因为这类小鼠具有自发突变形成畸胎瘤和畸胎肉瘤的倾向, 是基因敲除的理想实验动物。而其它遗传背景的胚胎干细胞系也逐渐被发展应用。[2, 3] ｃ．同源重组: 将重组载体经过一定的方式(电穿孔法或显微注射)导入同源的胚胎干细胞(ES cell)中, 使外源DNA与胚胎干细胞基因组中相应部分发生同源重组, 将重组载体中的DNA序列整合到内源基因组中, 从而得以表示。一般地, 显微注射命中率较高, 但技术难度较大, 电穿孔命中率比显微注射低, 但便于使用。[4,5] ｄ．选择筛选已击中的细胞: 由于基因转移的同源重组自然发生率极低, 动物的重组概率为10－2～10-5, 植物的概率为10－4～10－5。因此如何从众多细胞中筛出真正发生了同源重组的胚胎干细胞非常重要。当前常见的方法是正负筛选法( PNS法) , 标记基因的特异位点表示法以及PCR法。其中应用最多的是PNS法。[6]

基因敲除小鼠技术共9页word资料

转基因、基因敲入/敲除动物技术已经成为现代生命科学基础研究和药物研发领域不可或缺的重要技术，该技术从上世纪七八十年代诞生以来，已有近四十年的历史，经典技术如DNA原核显微注射、胚胎干细胞显微注射技术一直以来经久不衰，并逐渐从基础研究实验室转向商业模式，成为一项 高度标准化的新兴产业 一、技术介绍与研究进展 转基因、基因敲入/敲除动物技术已经成为现代生命科学基础研究和药物研发领域不可或缺的重要技术，该技术从上世纪七八十年代诞生以来，至今已有近四十年的历史，经典技术如DNA原核显微注射、胚胎干细胞显微注射技术一直以来经久不衰，在小鼠模型构建方面日趋完善，并且如同剪切酶和抗体等常规分子生物学试剂的制备技术一样，逐渐从基础研究实验室转向商业模式，成为一项高度标准化的新兴产业，催生了数以百计的创新药物和数以千计的优秀文章。尽管如此，传统技术仍然存在一些难以克服的缺陷，如步骤繁琐、周期漫长、成功率低、费用高昂等，而ZFN和TALEN等新技术的出现，或有可能将这一局面彻底改变。

二、同源重组技术原理 基因敲除鼠技术是上世纪80年代中后期基于DNA同源重组的原理发展起来的，Capecchi和Smithies在1987年根据同源重组（homologous recombination）的原理，首次实现了ES的外源基因的定点整合（targeted integration），这一技术称为"基因打靶"（gene targeting）或"基因敲除"（gene knockout），利用这种ES的显微注射就可以制作出基因敲出小鼠（KO Mice: knockout mice）;由于这一工作，Capecchi和Smithies 于2007年与Evans分享了诺贝尔医学奖。 同源重组（homologous recombination）定义：是指发生在姐妹染色单体（sister chromatin) 之间或同一染色体上含有同源序列的DNA分子之间或分子之内的重新组合。在基因敲除小鼠制作过程中，需要针对目的基因两端特异性片段设计带有相同片段的重组载体，将重组载体导入到胚胎干细胞后外源的重组载体与胚胎干细胞中相同的片段会发生同源重组，如图1所示： 图1.基因敲除鼠制作同源重组原理示意图 三、制作流程 图2.基因敲除鼠制作过程示意图 1. Knockout载体设计与构建

基因敲除技术现状及应用

医学分子生物学杂志,2007,4(1):862 90　J Med Mol B i ol,2007,4(1):86290 通讯作者:汤华(电话:022*********,E 2mail:htang2002@yahoo 1 co m ) Corres ponding author:T ANG Hua (Tel:86222223542603, E 2mail: htang2002@yahoo 1co m ) 基因敲除技术现状及应用 万海英　综述 汤华　审阅 天津医科大学天津市生命科学中心实验室　天津市,300070 【摘要】　功能基因组学的研究进展使基因敲除技术显得尤为重要。基因敲除技术从载体构建到细胞的筛选到动物模型的建立各方面都得到了发展。其中C re 2LoxP 系统可以有效的控制打靶的发育阶段和组织类型,实现特定基因在特定时间和(或)空间的功能研究;转座子系统易于操作,所需时间短,具有高通量的特点,可以携带多种抗性标记,方便了同时进行多基因功能研究;基因捕获技术提供了获得基因敲除小鼠的高效方法,方便了进行小鼠基因组文库的研究。此外,进退策略、双置换法、标记和交换法、重组酶介导的盒子交换法也从不同方向发展了基因敲除技术。 【关键词】　基因敲除;C re 2LoxP 系统;转座子;基因捕获【中图分类号】　R34918 St a tus Quo and Appli ca ti on of Gene Knockout WAN Haiying,T ANG Hua Tianjin M edical U niversity,Tianjin L ife Science Center ,Tianjin,300070,China 【Abstract 】　Gene knockout is i m portant f or functi onal genom ics 1Great p r ogress has been made in the vect or constructi on of gene knockout,screening of ai m ed cells and ani m al models and the devel op 2ments in these fields hel p t o s olve the p r oble m s in the study of genom ic functi ons 1Cre 2LoxP syste m can effectively contr ol the devel opment stage and hist ol ogy of gene knockout,thereby making it possi 2ble t o study gene functi on in a given ti m e and /or s pace 1Trans pos on syste m is easy t o mani pulate,quick and can achieve high thr oughput,carry multi p le resistance marker gene,which makes si m ulta 2neous study of multi p le genes possible 1Gene trapp ing p r ovides a highly efficient method of obtain knockout m ice and can facilitate the research of m ice geno m ic library 1I n additi on,the techniques such as “hit and run ”,“double rep lace ment ”,“tag and exchange ”and “recombinase 2mediated cas 2sette exchange ”all contribute t o the devel opment of gene knockout technol ogy 1【Key words 】　gene knockout,Cre 2LoxP syste m,trans pos on;gene trapp ing 基因敲除又称为基因打靶,是指从分子水平上将一个基因去除或替代,然后从整体观察实验动物,推测相应基因功能的实验方法。基因敲除技术是功能基因组学研究的重要研究工具。 基因敲除技术是在20世纪80年代后半期应用DNA 同源重组原理发展起来的。胚胎干细胞(e m 2bry onic ste m cell ,ES 细胞)分离和体外培养的成功及哺乳动物细胞中同源重组的存在奠定了基因敲除 的技术基础和理论基础[1] 。基因敲除主要包括下列技术:①构建重组载体;②重组DNA 转入受体细 胞核内;③筛选目的细胞;④转基因动物。 基因敲除传统的重组载体主要有插入性载体系统和替换性载体系统。插入性载体系统构建载体时主要包括要插入的基因片段(目的基因)、同源序列片段、标志基因片段等成分,替换性载体系统主要包括同源序列片段、替换基因的启动子、报道基因等成分。基于正负双向筛选(positive and negative selecti on,P NS )策略的传统方法的基因敲除需要满足:对基因组提取处理用于构建载体;需要位于打靶区两翼的具有特异性和足够长度的同源片段,并便于用其作为探针用Southern 印迹证实;neo 基因(新霉素磷酸转移酶基因)的整合;同源重组区域外侧tk 基因(胸苷激酶基因)在随机重组时的活性;打靶结构外特异的基因探针;合适的酶切位点,

基因敲除技术

基因敲除技术 1．概述： 基因敲除是自80年代末以来发展起来的一种新型分子生物学技术，是通过一定的途径使机体特定的基因失活或缺失的技术。通常意义上的基因敲除主要是应用DNA同源重组原理，用设计的同源片段替代靶基因片段，从而达到基因敲除的目的。随着基因敲除技术的发展，除了同源重组外，新的原理和技术也逐渐被应用，比较成功的有基因的插入突变和iRNA，它们同样可以达到基因敲除的目的。 2．实现基因敲除的多种原理和方法： 2．1． 利用基因同源重组进行基因敲除 基因敲除是80年代后半期应用DNA同源重组原理发展起来的。80年代初，胚胎干细胞（ES细胞）分离和体外培养的成功奠定了基因敲除的技术基础。1985年，首次证实的哺乳动物细胞中同源重组的存在奠定了基因敲除的理论基础。到1987年，Thompsson首次建立了完整的ES细胞基因敲除的小鼠模型[1]。直到现在，运用基因同源重组进行基因敲除依然是构建基因敲除动物模型中最普遍的使用方法。 2.1.1利用同源重组构建基因敲除动物模型的基本步骤(图1)： a． 基因载体的构建：把目的基因和与细胞内靶基因特异片段同源的DNA 分子都重组到带有标记基因(如neo 基因，TK 基因等)的载体上，成为重组载体。基因敲除是为了使某一基因失去其生理功能，所以一般设计为替换型载体。 b．ES 细胞的获得：现在基因敲除一般采用是胚胎干细胞，最常用的是鼠，而兔，猪，鸡等的胚胎干细胞也有使用。常用的鼠的种系是１２９及其杂合体，因为这类小鼠具有自发突变形成畸胎瘤和畸胎肉瘤的倾向，是基因敲除的理想实验动物。而其他遗传背景的胚胎干细胞系也逐渐被发展应用。[2，3] ｃ．同源重组：将重组载体通过一定的方式(电穿孔法或显微注射)导入同源的胚胎干细胞(ES cell)中，使外源DNA与胚胎干细胞基因组中相应部分发生同源重

基因敲除技术的发现及应用

个人自主学习研究报告 本次研讨方向：掌握基因概念的本质与演变过程 本人承担的具体学习研讨主题：80年代基因敲除技术的突破 基因敲除是自20世纪80年代末以来发展起来的一种新型分子生物学技术，是通过一定的途径使机体特定的基因失活或缺失的技术。此技术是由马里奥·卡佩奇、马丁·埃文斯与奥利弗·史密斯所开发，最初是以基因敲除小鼠（knockout mouse，昵称：KO mouse）完成实验，三人并因此获得2007诺贝尔医学奖。 1. 基因敲除技术简介 基因敲除(Gene knockout)是指一种遗传工程技术，针对某个序列已知但功能未知的序列，改变生物的遗传基因，令特定的基因功能丧失作用，从而使部分功能被屏障，并可进一步对生物体造成影响，进而推测出该基因的生物学功能。 它克服了随机整合的盲目性和偶然性，是一种理想的修饰、改造生物遗传物质的方法。基因敲除借助分子生物学、细胞生物学和动物胚胎学的方法,通过胚胎干细胞这一特殊的中间环节将小鼠的正常功能基因的编码区破坏，使特定基因失活，以研究该基因的功能；或者通过外源基因来替换宿主基因组中相应部分，以便测定它们是否具有相同的功能，或将正常基因引入宿主基因组中置换突变基因以达到靶向基因治疗的目的。基因敲除是揭示基因功能最直接的手段之一。 2. 80年代实现基因敲除的原理和方法： 通常意义上的基因敲除主要是应用DNA同源重组原理，用设计的同源片段替代靶基因片段，从而达到基因敲除的目的。随着基因敲除技术的发展，基因敲除技术有很多，如同源重组法、插入突变法、RNAI法。然而，在80年代，基因敲除是应用DNA同源重组原理发展起来的。该方法通过同源重组将外源基因定点整合入靶细胞基因组某一确定的位点，以达到定点修饰改造染色体上某一基因的目的，克服了随机整合的盲目性和偶然性，是一种理想的修饰、改造生物遗传物质的方法。80年代初，胚胎干细胞（ES细胞）分离和体外培养的成功奠定了基因敲除的技术基础。1985年，首次证实的哺乳动物细胞中同源重组的存在奠定了基因敲除的理论基础。到1987年，Thompsson首次建立了完整的ES细胞基因敲除的小鼠模型。直到现在，运用基因同源重组进行基因敲除依然是构建基因敲除动物模型中最普遍的使用方法。 3. 基因敲除技术的前景 基因敲除技术现在以广泛的应用于各个领域并取得了快速的发展，应用此技术可以建立生物模型、培育新的生物品种、还可以用于疾病的分子机理研究和疾病的基因治疗等。80年代，基因工程技术是该世纪分子生物学史上的一个重大突破，而基因敲除技术则是另一重大飞跃。它为定向改造生物，培育新型生物提供了重要的技术支持。

基因敲除

基因敲除技术(组图) 一．概述： 基因敲除是自80年代末以来发展起来的一种新型分子生物学技术，是通过一定的途径使机体特定的基因失活或缺失的技术。通常意义上的基因敲除主要是应用DNA 同源重组原理，用设计的同源片段替代靶基因片段，从而达到基因敲除的目的。随着基因敲除技术的发展，除了同源重组外，新的原理和技术也逐渐被应用，比较成功的有基因的插入突变和iRNA ，它们同样可以达到基因敲除的目的。 二．实现基因敲除的多种原理和方法： 1．利用基因同源重组进行基因敲除 基因敲除是80年代后半期应用DNA 同源重组原理发展起来的。80年代初，胚胎干细胞（ES细胞）分离和体外培养的成功奠定了基因敲除的技术基础。1985年，首次证实的哺乳动物细胞中同源重组的存在奠定了基因敲除的理论基础。到1987年，Thompsson首次建立了完整的ES细胞基因敲除的小鼠模型[1]。直到现在，运用基因同源重组进行基因敲除依然是构建基因敲除动物模型中最普遍的使用方法。 (1)利用同源重组构建基因敲除动物模型的基本步骤(图1)： ①．基因载体的构建：把目的基因和与细胞内靶基因特异片段同源的DNA 分子都重组到带有标记基因(如neo 基因，TK 基因等)的载体上，成为重组载体。基因敲除是为了使某一基因失去其生理功能，所以一般设计为替换型载体。 ②．ES 细胞的获得：现在基因敲除一般采用是胚胎干细胞，最常用的是鼠，而兔，猪，鸡等的胚胎干细胞也有使用。常用的鼠的种系是１２９及其杂合体，因为这类小鼠具有自发突变形成畸胎瘤和畸胎肉瘤的倾向，是基因敲除的理想实验动物。而其他遗传背景的胚胎干细胞系也逐渐被发展应用。[2，3] ③．同源重组：将重组载体通过一定的方式(电穿孔法或显微注射)导入同源的胚胎干细胞(ES cell)中，使外源DNA 与胚胎干细胞基因组中相应部分发生同源重组，将重组载体中的DNA 序列整合到内源基因组中，从而得以表达。一般地，显微注射命中率较高，但技术难度较大，电穿孔命中率比显微注射低，但便于使用。[4,5] ④．选择筛选已击中的细胞：由于基因转移的同源重组自然发生率极低，动物的重组概率为10－2 ～10-5 ，植物的概率为10－4 ～10－5 。因此如何从众多细胞中筛出真正发生了同源重组的胚胎干细胞非常重要。目前常用的方法是正负筛选法（PNS法），标记基因的特异位点表达法以及PCR 法。其中应用最多的是PNS法。[6]

基因敲除技术

基因敲除技术研究进展综述 摘要：基因敲除在20世纪80年代发展起来后已经应用到许多领域, 如建立人类疾病的转基因动物模型(糖尿病转基因小鼠、神经缺损疾病模型等)。这些疾病模型的建立使研究者可以在动物体内进行疾病的研究: 研究发育过程中各个基因的功能, 研究治疗人类遗传性疾病的途径。 关键字：基因敲除；Cre/LoxP系统；基因载体；生物模型 1．概述： 基因敲除又称为基因打靶, 是指从分子水平上将一个基因去除或替代, 然后从整体观察实验动物,推测相应基因功能的实验方法，是功能基因组学研究的重要研究工具。是自80年代末以来发展起来的一种新型分子生物学技术。 通常意义上的基因敲除主要是应用DNA同源重组原理，用设计的同源片段替代靶基因片段，从而达到基因敲除的目的。随着基因敲除技术的发展，除了同源重组外，新的原理和技术也逐渐被应用，比较成功的有基因的插入突变和iRNA，它们同样可以达到基因敲除的目的。 基因敲除已成为当前医学和生物学研究的最热点与最前沿, 并已对生物学和医学的许多研究领域产生深刻的影响, 成为革命性的研究工具, 具有极其重要的理论意义和实践意义。 基于基因敲除技术对医学生物学研究做出的重大贡献，在该领域取得重大进展的三位科学家，70岁的美国人马里奥?卡佩奇（Mario Capecchi）、82岁的美国人奥利弗?史密西斯（Oliver Smithies）和66岁的英国人马丁?埃文斯（Martin Evans）分享了2007年诺贝尔生理学或医学奖。 2.基因敲出技术发展历史 80年代末期的基因敲除技术为第一代技术，属完全性基因敲除，不具备时间和区域特异性。关于第二代区域和组织特异性基因敲除技术的研究始于1993年。Tsien等于1996年在《Cell》首先报道了第一个脑区特异性的基因敲除动物，被誉为条件性基因敲除研究的里程碑。该技术以Cre/LoxP系统为基础，Cre在哪种组织细胞中表达，基因敲除就发生在哪种组织细胞中。 2000年Shimizu等[于《Science》报道了以时间可调性和区域特异性为标志的

基因敲除技术及其进展

基因敲除技术研究进展及其在代谢工程 上的应用 The Current Status of Gene Knockout and its Application in Metabolic Engineering 天津大学化工学院 二零壹六年六月

摘要 基因敲除技术是20世纪80年代发展起来一项重要的分子生物学技术，在微生物代谢工程，动植物改造以及功能基因研究方面具有广泛的应用。本文介绍了基因敲除的策略和在代谢工程中的作用，着重介绍了四种新兴的基因敲除策略：RNAi，ZFN，TALENs以及最近研究火热的CRISPR/Cas9。并在最后展望了基因敲除技术尤其是新兴技术在相关领域的发展趋势，为基因敲除技术的进一步发展提供了参考。 关键词：基因敲除代谢工程同源重组CRISPR/Cas9

ABSTRACT Gene Knockout is an important molecular biotechnology which has developed sine 1980. It has been proved efficient in microbial metabolic engineering, transform of nimals and plants and functional genomics. In this review, we mainly introduced the strategies of gene knockout and its application in metabolic engineering.And four new strategies RNAi, ZFN, TALENs and CRISPR/Cas9 were highlighted in detail. At last, developing frontiers and application prospects of gene knockout were further discussed. KEY WORDS：gene knockout,metabolic engineering,homologous recombination,CRISPR/Cas9